Yazar Ulusal son finansmanı için Sağlık Enstitüleri ve teşekkür Michael R. Green oligonucleotides sentezleme için.

Not: Resim 1 phosphorothioate mutagenesis genel bir bakış sağlar ve işleminin temel adımları özetlemektedir.
1. nesil bir kütüphane mutantların — DNA şablon vahşi türü nükleotit ile Doping
<ol><li>T7 astar sentez (5'-GTAATACGACTCACTATAG-3') bir DNA synthesizer üzerinde kimyasal sentez tarafından.</li>
	<li>Katkılı oligonükleotid (iplikçik) protein bağlayıcı siteye karşılık gelen bir DNA synthesizer üzerinde kimyasal sentez tarafından sentez. Phosphoramidites uygun bir karışımı olarak vahşi türü nükleotit (bkz: Bu oran daha fazla ayrıntı için temsilcisi sonuçları) doping (X aşağıdaki) her site vahşi tipi nükleotid olarak % 90'a ve T % 10 oranında için kimyasal sentez sırasında kullanın. Not: Katkılı oligonükleotid dizisi 5'-GTTCACTACACTXGAXAXAXAXCAXCXAXAXGXTGCCCTATAGTGAGTCGTATTAC-3 burada '. Altı çizili sıra SXL protein bağlayıcı sitesi, artı faydalı kontroller RNA her değişiklik için yükleme kontrolleri olmasının yanı sıra bağlayıcı etkiler onaylayan sağlamak ek nükleotit bağlama sitesi dışında ters tamamlayıcıdır Karşılaştırma ve normalleştirme nükleotit bağlama site içinde. SXL-bağlama sitesi sıra trafo pre-mRNA14,15,16,17' mevcut olan UUUUUGUUGUUUUUUUU, önerilen metodoloji hazırlamak için kullanıldı. İtalik sırayla T7 astar dizisine tamamlayıcı ve vitro transkripsiyon T7 organizatörü.</li>
</ol>2. RNA sentezi
<ol><li>
Yukarıda açıklanan18olarak 20 µL transkripsiyon tepki RNA sentez.
	<ol>
<li>Mix T7 transkripsiyon tampon ve 1 µM T7 oligonükleotid, 1 µM katkılı oligonükleotid, 10 mM dithiothreitol (DTT), 2 mM GTP, 1 mM ATP, CTP ve UTP (guanozin, adenozin, sitidin ve üridin trifosfat) ve 2 U/µL T7 RNA polimeraz.</li>
		<li>Ekleme, iki ayrı microcentrifuge tüplerde 0,167 mM α-thio ATP veya 0.05 mM α-thio UTP (bkz: Şekil 2' deki şemaları) phosphorothioates RNA'ların dahil etmek. Not: alternatif iletişim kuralları için 0.2 mM α-thio CTP veya 0.2 mM α-thio GTP nükleotit oyuncu değişikliği kalan iki test etmek için bir katkılı oligonükleotid içeren uygun transkripsiyon reaksiyon ekleyin.</li>
		<li>RNA sentezi tepki karışımı 37 ° C'de 2 h için kuluçkaya</li>
	</ol>
</li>
	<li>2.5 µL ısı değişken alkalen fosfataz ve 2.5 µL 10xphosphatase tampon RNA örnek ekleyin. Bu 25 µL reaksiyon 10 – 30 dk 37 ° C'de 5' fosfatlar kaldırmak için kuluçkaya.</li>
	<li>Alkalen fosfataz enzim Isıtma için 2-5 dk 80 ° C'de tarafından devre dışı bırakabilirsiniz.</li>
	<li>5' ucuna dephosphorylated RNA'ın radiolabel (5 pmole) 1 µL T4 polinükleotit kinaz ve 1 µL γ -32P ATP 10 µL tepki birimindeki kullanarak. Reaksiyon karıştırmak için 30-60 dk 37 ° C'de kuluçkaya</li>
	<li>T4 polinükleotit kinaz enzim Isıtma için 20-30 dk 65 ° C'de tarafından devre dışı bırakabilirsiniz.</li>
	<li>Jel Elektroforez % 10 polyacrylamide jel denaturing tarafından RNA arındırmak. RNA üzerinde jel autoradiography tarafından bulun. Radiolabeled RNA içeren jel dilim tüketim, pipet ucu ile duvarlara basarak microcentrifuge tüpte ezmek ve İndinavir K (PK) arabellek (100 mM Tris, pH 7.5, 12,5 mM EDTA, 150 mM NaCl, % 1 Sodyum Lauryl Sülfat) emmek. Gece için 2 h oda sıcaklığında tüp döndürün.</li>
	<li>Jel Bulamaç santrifüj kapasitesi, jel atmak ve arabellek çözüm toplamak.</li>
	<li>Fenol kloroform eşit hacmi ile iki kez ve bir kez kloroform ile çözüm ayıklamak ve sulu faz toplamak.</li>
	<li>Sodyum asetat, pH 5.2, taşıyıcı 3 M sulu faz 0.1 birim eklemek tRNA veya glikojen ve etanol 2.5 hacmi. Örnek 1 h için-80 ° C'de tutun.</li>
	<li>Örnek için bir yüksek hızlı microcentrifuge 16,873 x g, 5-10 dk santrifüj kapasitesi. Arabellek/etanol çözüm RNA Pelet bozmadan dikkatli bir şekilde çıkarın.</li>
	<li>Pelet % 70 etanol ile yıkama ve 2-5 dk. Kaldır etanol için dikkatle santrifüj kapasitesi. Pelet hava kuru.</li>
	<li>Pelet 20 – 50 µL dietil pyrocarbonate (DEPC) resuspend-tedavi su. -20 ° C'de kullanmak kadar saklamak. Not: radyoaktivite korumak için uygun önlemleri ve Pleksiglas kalkan kullanarak radiolabeled RNA ile tüm adımları gerçekleştirin. Halen, spin sütunları jel arıtma RNA'ın alternatif olarak adi radyoaktivite, daha yaygın olarak kullanılan ve kaldırmak daha kolay olur.</li>
</ol>3. protein bağlayıcı tepki ve bağımlı RNA ayrılması
<ol><li>Rekombinant protein hızlı ve E. coliarındırmak.</li>
	<li>Rekombinant protein konsantrasyonu spectrophotometry veya bir SDS-polyacrylamide jel bir bilinen protein standart, Sığır serum albumin (BSA) yanındaki ayıran tahmin ediyoruz. Faiz ve standart BSA proteini jel Coomassie parlak mavi R-250 ile boyama tarafından görselleştirin. İle karşılaştırıldığında BSA dilutions aynı jel üzerinde bilinen miktarda protein quantitate. Not: 0.2 mM Ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA), % 0.05, - 80 ° C kadar kullanım ve 20 mm 4-(2-Hydroxyethyl) seyreltik piperazin-1-ethanesulfonic asit (HEPES), pH 8.0, 1 mM dithiothreitol (DTT), Rekombinant protein depolamak NP-40, % 20 gliserol. Kullanım 0.5-1.0 mM proteaz inhibitörü phenylmethane Sülfanil florür (PMSF) isteğe bağlı.</li>
	<li>RNA-bağlama tepki (20-100 µL) 10 mM Tris-HCl, pH 7.5 olarak gerçekleştirmek, 1 mM DTT, 50 mM KCl, 0.5 birim/µL RNase inhibitörü, 0.09 µg/µL acetylated Sığır serum albümin, 1 mM EDTA, 0.15 µg/µL tRNA, 5'-son radiolabeled RNA ve uygun konsantrasyon (bir 6 µL konsantrasyon RNA'ın % ~ 50 protein bağlar) protein. Not: Bu bağlayıcı arabelleğe üç RNA – proteinler için çalışır (SXL, U2AF65ve PTB), faiz bir protein için standart olacak ama. Protein konsantrasyonu ampirik olarak, yaklaşık 50 %'si almak için gereken bir verilen protein hazırlık için çeşitli dilutions kullanarak tahmin RNA bağlama. Bu koşul veya Kd RNA-bağlama eğrisi en hassas bölümünü temsil eder.</li>
	<li>20-30 dk 25 ° c (veya buz) protein bağlayıcı tepki kuluçkaya.</li>
	<li>
Protein bağımlı RNA kesir iki yaklaşımdan birini kullanarak ilişkisiz kesir ayırmak:
	<ol>
<li>Nitroselüloz filtre bağlama<ol>
<li>Bağlama reaksiyon (20-100 µL) Oda sıcaklığında bir vakum manifold bağlı nitroselüloz filtre uygula. Not: Sadece RNA-protein kompleksi üzerinde filtre korunur ve RNA akar filtreden ilişkisiz. Filtre bağlama yaklaşım bağımlı RNA'ın yüksek kurtarma sağlar ve jel hareketlilik üst karakter tahlil için daha hızlı ve daha basit, karşılaştırılır. DEAE membran altında nitroselüloz filtre yerleştirerek ilişkisiz RNA kesir toplamak veya ilişkili kesir ile karşılaştırma için RNA ücretsiz mümkündür.</li>
			<li>Tutulan içeren nitroselüloz filtre bölümünü kesip radyoaktif RNA küçük parçalara microcentrifuge tüp içine sığacak şekilde filtre parçaları sokmak için yeterli PK arabellekte (300-500 µL içeren 10-20 µg PK) emmek ve RNA filtresinden elute 2-3 saat veya gece boyunca için.</li>
			<li>Fenol-kloroform ile kloroform, hulâsa ve sulu faz toplamak. Sodyum asetat ve etanol ekleyin ve, dondurucu kuluçka sonra santrifüj kapasitesi, yıkama, Kuru ve RNA DEPC tedavi suda resuspend. Adımda 2.10-2,14 yukarıda ayrıntılı olarak aşağıdaki adımları izleyin.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Jel hareketlilik üst karakter<ol>
<li>Hazırlamak ve % 5 yerli polyacrylamide jel polimerize (60:1 Acrylamide:bis-akrilamid) 0.5 içinde filtre bağlama yöntemi alternatif olarak bağlama tepki başlamadan önce x TBE (Standart Tris-bor-EDTA arabellek).</li>
			<li>15dk için jel 250 V (4 ° C) soğuk bir odada önceden çalıştırın.</li>
			<li>Her bağlama reaksiyon (üstte) Yukarıdaki ön çalışma jel ayrı kuyu yükleyin. Not: Örnek yükleme kuyu içine için yeterli gliserol protein depolama arabellek sağlar.</li>
			<li>Jel Elektroforez belirli protein ve RNA boyutu bağlı olarak 1-2 h için 250 V soğuk bir odada tarafından protein bağımlı RNA ayırın.</li>
			<li>Autoradiography tarafından RNA-protein kompleksi jel üzerinde konumunu bulun. RNA-protein kompleksi içeren jel dilim tüketim. Jel dilim kırma ve PK arabellekte nemlendirici jel dilim üzerinden RNA elute.</li>
			<li>Fenol-kloroform ile kloroform, hulâsa ve sulu faz toplamak. Sodyum asetat ve etanol ekleyin ve, dondurucu kuluçka sonra santrifüj kapasitesi, hava kuru, yıkama ve RNA DEPC tedavi suda resuspend. Adımda 2.10-2,14 yukarıda ayrıntılı olarak aşağıdaki adımları izleyin.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. analiz Mutant nükleotit pozisyonlar algılanması için iyot i ciddi Phosphorothioate ürünlerin
<ol><li>1 mM iyot bir 20 µL DEPC tedavi su ilâ 10 µg taşıyıcı içeren eklemek tRNA phosphorothioate birleşme yerlerinde (ilişkili ve toplam RNA'ların) RNA'ların ayırmak için. 5 min için oda sıcaklığında kuluçkaya. Not: Daha fazla iyot bölünme biraz farklı koşulları ile ilgili ayrıntılar — %7 (v/v) iodoethanol, 95 ° c 3 dk Isıtma — Gish & Eckstein 198819' bulunabilir.</li>
	<li>İ ciddi RNA sodyum asetat/etanol, ekleyerek yukarıda açıklandığı gibi çökelti. Jelleri denaturing için bir yükleme boya resuspend. Isı ve örnek tarafından % 15-20 denaturing polyacrylamide jel elektroforez RNA parçaları ayırmak için yük.</li>
	<li>Polyacrylamide jel bir röntgen filmi için maruz.</li>
	<li>Grup autoradiography kullanma toplam havuz ile ilişkili kesir tespit edebilir. Not: bir yormak kukuleta iyot ile tüm adımları gerçekleştirin. Burada gösterilen RNA ayrılması için bir kama şeklindeki jel, istihdam hangi tarafından iki katına her iki çubukları alt jel plakaların kalınlığı jel alt kısmında bir ekstra inç uzunluğundaki spacer ekleyerek elde edilir. Bu şekli daha kısa RNA parçaları arasında daha fazla tek tip veya daha yakın aralığını sağlar. Alternatif olarak, bir phosphorimager algılama ve radyoaktivite Nefelometri için röntgen filmleri yerine kullanılabilir.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Schutt, C., Nothiger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure,+function+and+evolution+of+sex-determining+systems+in+Dipteran+insects.">Structure, function and evolution of sex-determining systems in Dipteran insects.</a> Development. 127 (4), 667-677 (2000).</li><li>Mahowald, A. P., Wei, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex+determination+of+germ+cells+in+Drosophila.">Sex determination of germ cells in Drosophila.</a> Ciba Found. Symp. 182, 193-202 (1994).</li><li>Steinmann-Zwicky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+do+germ+cells+choose+their+sex?+Drosophila+as+a+paradigm.">How do germ cells choose their sex? Drosophila as a paradigm.</a> Bioessays. 14 (8), 513-518 (1992).</li><li>Salz, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex,+stem+cells+and+tumors+in+the+Drosophila+ovary.">Sex, stem cells and tumors in the Drosophila ovary.</a> Fly (Austin). 7 (1), 3-7 (2013).</li><li>Gawande, B., Robida, M. D., Rahn, A., Singh, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Sex-lethal+protein+mediates+polyadenylation+switching+in+the+female+germline.">Drosophila Sex-lethal protein mediates polyadenylation switching in the female germline.</a> Embo J. 25 (6), 1263-1272 (2006).</li><li>Robida, M. D., Rahn, A., Singh, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+identification+of+alternatively+spliced+mRNA+targets+of+specific+RNA-binding+proteins.">Genome-wide identification of alternatively spliced mRNA targets of specific RNA-binding proteins.</a> PLoS One. 2 (6), e520 (2007).</li><li>Samuels, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+binding+by+Sxl+proteins+in+vitro+and+in+vivo.">RNA binding by Sxl proteins in vitro and in vivo.</a> Mol. Cell. Biol. 14 (7), 4975-4990 (1994).</li><li>Fujii, S., Amrein, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+expressed+in+the+Drosophila+head+reveal+a+role+for+fat+cells+in+sex-specific+physiology.">Genes expressed in the Drosophila head reveal a role for fat cells in sex-specific physiology.</a> EMBO J. 21 (20), 5353-5363 (2002).</li><li>Kelley, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+msl-2+causes+assembly+of+dosage+compensation+regulators+on+the+X+chromosomes+and+female+lethality+in+Drosophila.">Expression of msl-2 causes assembly of dosage compensation regulators on the X chromosomes and female lethality in Drosophila.</a> Cell. 81 (6), 867-877 (1995).</li><li>Hager, J., Cline, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+female+Sex-lethal+RNA+splicing+in+male+germ+cells:+implications+for+Drosophila+germline+sex+determination.">Induction of female Sex-lethal RNA splicing in male germ cells: implications for Drosophila germline sex determination.</a> Development. 124 (24), 5033-5048 (1997).</li><li>Vied, C., Halachmi, N., Salzberg, A., Horabin, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antizyme+is+a+target+of+sex-lethal+in+the+Drosophila+germline+and+appears+to+act+downstream+of+hedgehog+to+regulate+sex-lethal+and+cyclin+B.">Antizyme is a target of sex-lethal in the Drosophila germline and appears to act downstream of hedgehog to regulate sex-lethal and cyclin B.</a> Dev Biol. 253 (2), 214-229 (2003).</li><li>Chau, J., Kulnane, L. S., Salz, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex-lethal+facilitates+the+transition+from+germline+stem+cell+to+committed+daughter+cell+in+the+Drosophila+ovary.">Sex-lethal facilitates the transition from germline stem cell to committed daughter cell in the Drosophila ovary.</a> Genetics. 182 (1), 121-132 (2009).</li><li>Chau, J., Kulnane, L. S., Salz, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex-lethal+enables+germline+stem+cell+differentiation+by+down-regulating+Nanos+protein+levels+during+Drosophila+oogenesis.">Sex-lethal enables germline stem cell differentiation by down-regulating Nanos protein levels during Drosophila oogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (24), 9465-9470 (2012).</li><li>Singh, R., Valcarcel, J., Green, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+binding+specificities+and+functions+of+higher+eukaryotic+polypyrimidine+tract-binding+proteins.">Distinct binding specificities and functions of higher eukaryotic polypyrimidine tract-binding proteins.</a> Science. 268 (5214), 1173-1176 (1995).</li><li>Singh, R., Banerjee, H., Green, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+recognition+of+the+polypyrimidine-tract+by+the+general+splicing+factor+U2AF65+and+the+splicing+repressor+sex-lethal.">Differential recognition of the polypyrimidine-tract by the general splicing factor U2AF65 and the splicing repressor sex-lethal.</a> RNA. 6 (6), 901-911 (2000).</li><li>Sakashita, E., Sakamoto, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+RNA+binding+specificity+of+the+Drosophila+sex-+lethal+protein+by+in+vitro+ligand+selection.">Characterization of RNA binding specificity of the Drosophila sex- lethal protein by in vitro ligand selection.</a> Nucleic Acids Res. 22 (20), 4082-4086 (1994).</li><li>Kanaar, R., Lee, A. L., Rudner, D. Z., Wemmer, D. E., Rio, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+the+sex-lethal+RNA+binding+domains+with+RNA.">Interaction of the sex-lethal RNA binding domains with RNA.</a> EMBO J. 14 (18), 4530-4539 (1995).</li><li>Milligan, J. F., Uhlenbeck, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+small+RNAs+using+T7+RNA+polymerase.">Synthesis of small RNAs using T7 RNA polymerase.</a> Methods Enzymol. 180, 51-62 (1989).</li><li>Gish, G., Eckstein, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+and+RNA+sequence+determination+based+on+phosphorothioate+chemistry.">DNA and RNA sequence determination based on phosphorothioate chemistry.</a> Science. 240 (4858), 1520-1522 (1988).</li></ol>

Yazar hiçbir rakip mali çıkarlarının bildirir.

Mutagenesis uzun protein bağlayıcı siteleri niteleyen kullanılmaya başlanmıştır. İlk olarak, mutantlar bir dizi inşa ve deneyleri benzeşme bağlama üzerinde onların etkilerini incelemek için bağlama içinde tek tek test. Ise standart mutagenesis yaklaşım çeşitli serileri analiz etmek için bir yol sağlar, birden çok adımı mutantlar oluşturmak ve tepkiler her mutant için bağlayıcı bir dizi performans gibi standart yaklaşım, dahil, zahmetli ve zaman alıcı ve olmayabilir özellikle uzun serileri için Doygunluk mutagenesis izin verir. İkinci olarak, bir dizi randomize ve havuzun birden fazla bağlama ve polimeraz zincir reaksiyonu devredir (PCR) amplifikasyon kullanılır. Protein bağlamak bu dizilere klonlanmış ve tanımlamak ve fikir birliği serisinden bir bağlama site doğrulamak için sıralı olacaktır. Yine de, bu yinelemeli bağlama ve güçlendirme seçenek birden çok adımdan oluşur ve bağlama site içinde önemli kalıntılar teşhis etmek için zahmetli. Ayrıca, yinelenen sıra arttırımlar PCR için doğal sırası önyargı ile tanıştırayım. Üçüncü olarak, rasgele havuzundan seçili sıraları nispeten pahalı olmasına rağmen yüksek işlem hacmi sıralama, daha hızlı bir seçeneği kullanarak sıralı. Bu nedenle, birden çok adımı, zahmetli ve/veya pahalı Yöntemler, bu sınırlamaları aşmak için biz daha hızlı bir icat, ucuz ve en önemlisi bir tek adımlı Yöntem, doygunluk mutagenesis bir bağlama sitesinin (PTM) gerçekleştirmek için burada, açıklanan.
Bu yaklaşım önemli adımlar kimlik veya non-vahşi türü nucleotide(s) etiketleme içerir. Biz phosphorothioate nükleotit fosfat oxygens hangi bir omurga Kükürt ile konulur, açıklanan (Şekil 2) kullanılır. Iyot kimyasal olarak phosphorothioate nükleotit omurgası ayırmak için kullanılabilir avantajdır. Böylece, bir phosphorothioate omurga içeren RNA substrat iyot bölünme nerede site dekolte bir proxy veya etiket bir dört varlığı için o konumda üsleri bir sıralama tipi merdiven oluşturur. İlişkisiz ve toplam kesirler karşılaştırılması tercihen ilişkili kesir hariç tutulur ve protein bağlama için önemli olan artıkları tanımlar. Buna ek olarak, bağlama için önemli değildir artıkları arasında iki kesirler eşit dağıtılmış kalır. Bu yaklaşım için herhangi bir RNA-bağlayıcı protein bağlayıcı siteleri tanımlamak için kullanılabilir.
Özet olarak, bu tek adımlı doygunluk mutagenesis yaklaşım, phosphorothioates ve iyot bölünme, doping birleştirerek, RNA herhangi bir bağlama sitedeki karakterizasyonu için güçlü bir araç sunar. Ancak, bu yaklaşım bağlama site zaten mutagenesis önce bilinen gerektirir. Ayrıca, protein-bağlayıcı koşulları optimize için her protein gerekir. Aşağıdaki önlemleri vurguladı gerek. Eldivenler, çözümleri ve arabellekleri suda DEPC tedavi, ısıyla pipet ipuçları ve tüpler, hazırlanması ve ekipman için RNA ithaf sadece RNAses önlemek için kullanmak gibi önlemler RNA işleme için uygulanmalıdır. Benzer şekilde, radyoaktif kalkanlar, radyoaktif malzeme kullanılması esastır ederken izleme radyoaktif içeren bakım ve çok yormak kukuleta kullanımı tehlikeli kimyasallar kullanırken gereklidir.

Gen düzenlemesi, biyolojide önemli bir rol oynar. Genlerin transkripsiyon, pre-mRNA'ın porno versiyonunu, 3' uç oluşumu, RNA verme, çeviri, mRNA yerelleştirme, çürüme, translasyonel modifikasyon/istikrar, vb her iki DNA ve RNA bağlayıcı proteinler gen anahtar rol oynarlar düzeyinde düzenlenmiş olması Yönetmelik. Moleküler Genetik analizlerle çok sayıda düzenleyici proteinler belirledik iken, yalnızca küçük bir alt kümesini ile karakterize tamamen hücresel işlevlerinin veya bağlama siteleri içinde vivoiçin. Filogenetik dizi analizi ve mutagenesis DNA veya RNA protein etkileşimleri niteleyen tamamlayıcı yaklaşımlar sunuyor.
RNA bağlanıcı proteinler cinsel farklılaşma da dahil olmak üzere gelişim süreçlerinde önemli. Drosophila protein seks-öldürücü (SXL) veya ana seks-anahtar protein yoktur erkek, ama şimdiki içinde dişi. Uridine zengini diziler veya pirimidin-yolları aşağı akım pre-mRNA hedefler (trafo, seks öldürücüve erkek özgü lethal2) somatik hücreler1,2'deki belirli splice sitelere bitişik tanır ,3,4. Buna ek olarak, uridine zengini Poliadenilasyon artırıcı dizileri artırıcı, ilkel (e(r)) transkript5,6bağlama yaparak geçiş Poliadenilasyon sitesi düzenler. SXL büyük olasılıkla olmak üzere kalan kadın germline ek hedefleri düzenleyen1,7,8,9,10,11, tespit 12 , 13.
Genellikle, bir bağlama sitesini karakterizasyonu mutagenesis, örneğin, silme veya değiştirme tek veya birden çok nükleotit tarafından içerir. Her mutant bağlama siteye göre yaban tipi RNA dizisinin sonra onun bağlama benzeşme belirlemek için bir dizi protein konsantrasyonları kullanılarak analiz (Kd veya denge ayrılma Sabit) protein ilgi; Kd protein konsantrasyonu % 50 RNA bağlama almak için gerekli olduğunu. Detaylı mutagenesis Bu emek yoğun işlem üretimi ve çok sayıda mutantlar analizini içerir — üç vahşi türü nükleotit bağlama sitedeki her pozisyon için. Böylece, daha basit ve ucuz doygunluk mutagenesis protein bağlayıcı sitelerin RNA için alternatif bir yaklaşım için bir ihtiyaç vardır.
Burada, doygunluk mutagenesis RNA bir protein bağlayıcı sitesinin sağlar bir tek adımlı yaklaşım tarif. Bu DNA şablon bağlama site, her phosphorothioate nükleotit ile ayrı RNA'ların sentezi ve yalıtım kuluçka protein ile takip ilişkili fraksiyonunun içinde vahşi tipi nükleotit ile doping içerir. Vahşi tipi nükleotit müdahalelerden protein bağlı kesir Tercihli onların hariç sonuçlanır. Bu jel elektroforez ile iyot fosfodiester tahvil phosphorothioates (phosphorothioate mutagenesis veya PTM) içeren seçmeli kimyasal bölünme takip tarafından izlenir. Bu tek adım doygunluk mutagenesis yaklaşım herhangi bir protein bağlayıcı sitedeki RNA karakterizasyonu için geçerlidir.

<table><tbody><tr><td>Uridine 5&amp;rsquo; a-thio triphosphate</td><td>NEN (Boston, Massachusetts)</td><td>NLP-017</td><td></td></tr><tr><td>Adenosine 5&amp;rsquo; a-thio triphosphate</td><td>NEN (Boston, Massachusetts)</td><td>NLP-016</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum manifold</td><td>Fisher Scientific</td><td>XX1002500</td><td>Millipore&amp;nbsp;25&amp;nbsp;mm Glass Microanalysis Vacuum Filter</td></tr><tr><td>Vacuum manifold</td><td>Millipore</td><td>XX2702552</td><td>1225 Sampling Vacuum Manifold</td></tr><tr><td>Nitrocellulose</td><td>Millipore</td><td>HAWP</td><td></td></tr><tr><td>Nitrocellulose</td><td>Schleicher &amp;amp; Schuell</td><td>PROTRAN</td><td></td></tr><tr><td>Dephosphorlyation Kit</td><td>NEB</td><td>M0508</td><td></td></tr><tr><td>T4 Polynucleotide Kinase</td><td>NEB</td><td>M0201S</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>NEB</td><td>P8107S</td><td></td></tr><tr><td>T7 RNA polymerase</td><td>NEB</td><td>M0251S</td><td></td></tr><tr><td>RNasin</td><td>Promega</td><td></td><td>RNase inhibitor</td></tr><tr><td>Glass Plates</td><td>Standard</td><td>Standard</td><td></td></tr><tr><td>Gel Electrophoresis equipment</td><td>Standard</td><td>Standard</td><td></td></tr><tr><td>X-ray films</td><td>Standard</td><td>Standard</td><td></td></tr><tr><td>Polyacrylamide gel solutions</td><td>Standard</td><td>Standard</td><td></td></tr></tbody></table>

a novel saturation mutagenesis approach: single step characterization of regulatory protein binding sites in rna using phosphorothioates

Gen düzenlemesi gelişiminde önemli bir rol oynar. Çok sayıda DNA ve RNA bağlayıcı proteinler onların hedef sıraları gen ekspresyonu denetlemek için yüksek özgüllük ile bağlayın. Bu düzenleyici proteinler gen ekspresyonu ya DNA (transkripsiyon) düzeyinde veya RNA (pre-mRNA'ın porno versiyonunu, Poliadenilasyon, mRNA taşıma, çürüme ve çeviri) düzeyini kontrol eder. Düzenleyici diziler tanımlaması sadece açık veya kapalı bir gen nasıl açık, ama hangi aşağı akım genler tarafından belirli bir düzenleyici protein Ayrıca düzenlenir anlamanıza yardımcı olur. Burada, doygunluk mutagenesis RNA bir protein bağlayıcı sitesinin sağlar bir tek adımlı yaklaşım tarif. Bu DNA şablon bağlama site, her phosphorothioate nükleotit ile ayrı RNA'ların sentezi ve yalıtım kuluçka protein ile takip ilişkili fraksiyonunun içinde vahşi tipi nükleotit ile doping içerir. Vahşi tipi nükleotit müdahalelerden protein bağlı kesir Tercihli onların hariç sonuçlanır. Bu jel elektroforez ile iyot fosfodiester tahvil phosphorothioates (phosphorothioate mutagenesis veya PTM) içeren seçmeli kimyasal bölünme takip tarafından izlenir. Bu tek adım doygunluk mutagenesis yaklaşım herhangi bir protein bağlayıcı sitedeki RNA karakterizasyonu için geçerlidir.

Doping kullanarak doygunluk mutagenesis prensibi:
Eğer sadece analiz edilecek bir konumdur bir uygun molar oranı vahşi-türü ve diğer nükleotit için tüm dört nükleotit eşit bir karışımı kullanın. Ancak, aynı anda birden fazla pozisyonları incelenir, oranı, non-vahşi türü yaban tipi nükleotit için ayarlanması gerekir, azaltılmış yani . Aksi takdirde, hangi isteniyorsa, tek oyuncu değişikliği ek olarak, ayrıca olacak şablonlar tek nükleotid oyuncu değişikliği etkisini analiz iyileştirmelerden bir molekül içinde birden çok vahşi türü nükleotit ile. Bu nedenle, kural olarak bir oranı, non-vahşi türü için vahşi tipi nükleotid 1/n, n çözümlenmesi için pozisyonların sayısını nerede kullanın. Burada, aynı anda 10 pozisyonları analiz ve vahşi-türü nükleotit yüzde 90'ını ve DNA şablon doping için vahşi türü nükleotit yüzde 10'u içeren bir karışımı kullanılır. Her transkripsiyon tepki dört phosphorothioates biri ile gerçekleştirildiği ayrı transkripsiyon reaksiyonlar yapılır. Böylece, her reaksiyon katkılı pozisyonlarda belirli bir nükleotit izler.
Parazit nedeniyle bölümleme prensibi:
Mutagenesis yaklaşım, burada sunulan RNA'ların bir ortalama molekül başına daha az bir phosphorothioate kalıntı vardır. Bağlama, RNA molekülleri bölüm arasında protein bağlı kesir ve ilişkisiz kesir işlemi sırasında. Belirli bir nükleotit bir phosphorothioate bağlantı bağlı olduğu phosphorothioate omurga bağlantı bölünme o konumdaki belirli bir nükleotit varlığı bir okuma. Verilen herhangi bir konumundaki bir nükleotit değiştiğinde bağlama üzerinde bir etkisi de olabilir veya bağlama, kısmen veya tamamen inhibe ki bekleniyor. Belirli bir nükleotit varlığı bağlama üzerinde bir etkisi yoktur, aynı derecede protein ilişkili ve ilişkisiz kesirler bölümü. Ancak, belirli bir konumdaki belirli bir nükleotit protein bağlama ile müdahale Eğer protein bağlı kesir tercihen dışlanır. Girişim derecesini kantitatif her biri de aynı tepkiyi jel elektroforez aşağıdaki konumlarda için takip edilebilir. Bu kavram bir şematik (Şekil 3) gösterilmektedir. Toplam RNA kesir (lane T), Grup yoğunluğu tüm katkılı pozisyonlar (Grup 1, 3 – 7) için yaklaşık olarak eşittir. Protein bağımlı RNA kesir (lane B), pozisyonlarda 1, 4 ve 7, nükleotit bağlama üzerinde bir etkisi vardır. Ancak, pozisyonlarda 3 ve 6, bağlama ile uğratır ve böylece ilişkili kesir söz konusu değildir. 5 konumda girişim kısmi. Böylece, dört eşleştirilmiş yolları, T ve B her nükleotit için karşılaştırmalar tüm dört nükleotit analiz için izin verir. Olması gerektiği için varsa kükürt RNA omurgasında protein bağlayıcı üzerinde etkisi, belirli bir konumu yansıtır bu vahşi tipi nükleotit kaydetti.
Eşlik eden autoradiograph (Şekil 4) iki çift (α-thio A ve α-thio U) üzerinden denaturing bir jel (T toplam havuzu için) ve ilişkili kesir için B şerit gösterir. Birkaç gözlemler yoğunluklarda gruplarından her pozisyonda şerit (T ve B) her çifti arasında karşılaştırma tarafından yapılabilir. İlki, sinyal çoğunluğu bu jel, Yani, uncleaved ürün için her iki α-thio üstündeki lane ve α-thio U lane. İkinci olarak, α-thio A çift şerit için birkaç grup (iyot bölünme ürünleri) bağlı ve toplam RNA kesirler 1 Yukarıdaki örneğin, bantları arasında aynıdır; α-thio bir lane için bağlama sitedeki ilgili grup başvurusu için numara verilir. Üçüncü olarak, jel altındaki bantları daha yakından aralıklı (Örneğin, bantları 6 altında) bir sıralama jel için her zamankinden daha. Dördüncü olarak, çeşitli grupların toplam RNA kesir mevcut ama yok ya da önemli ölçüde azaltılmış bağımlı RNA kesir (Örneğin, Grup 1, 2, 3 ve 5). Çoğu grup toplam ve ilişkili yolları arasında karşılaştırılabilir beşinci olarak, α-thio U lane çifti için bazı Grup ilişkili kesir (Örneğin, bantları 7 ve 8) nispeten daha az yoğun iken.
Bu gözlemler bu yeni yöntem ve aşağıdaki sonuçlara yol başarılı gelişimi için kanıt: çünkü çoğu RNA'ın uncleaved yolları, α-thio A çift şerit ve α-thio U eşleştirmek için ilk olarak, bu kanıt sadece küçük bir kısmını sağlar RNA içeren değiştirilmiş veya phosphorothioate artıkları. Bu önemli çünkü RNA molekülleri birden fazla phosphorothioate kalıntı içeren yaptýklarýylaçakýþmadýklarýndan. İkinci, aynı veya benzer yoğunluklarda için α-thio A ve α-thio U, iki şerit arasında bağlama sitesinin dışındaki çeşitli gruplar için yükleme yolları arasında kolay karşılaştırma izin her iki şerit için karşılaştırılabilir olduğunu ispat. Üçüncüsü, daha yakından aralıklı bantları, α-thio A ve böylece daha uzun sıra okuma analiz izin ve daha yüksek çözünürlük sunan α-thio U, jel (ince üst ve kalın alt), kama şeklinde tarafından elde edilir. Genellikle, daha kısa parçaları daha yaygın bir jel ile Tekdüzen kalınlığı aralıklı vardır. Dördüncü olarak, ortadan kalkması veya azaltılmış yoğunluğuna bağlı kesir belirli bantlarında vahşi tipi nükleotit tercihen ilişkili kesir (α-thio A) söz konusu değildir gösterir. İlişkili sokağın içindeki farklı grupların göreli yoğunluklarda de vahşi türü artıkları farklı yerlerde müdahalelerden ölçüde hakkında kantitatif bilgi sunar. Başka bir deyişle, mutant veya vahşi türü nükleotit belirli konumlarda protein bağlama ile engel. Son olarak, omurga kükürt ikame (phosphorothioate) etkisi olmayan köprüleme oxygens (α-thio U) birinde test, üç pozisyon omurga sulfurs (Örneğin, 6, 7 ve 7 aşağıdaki) ikincil etkilerinden show gösterir. Bizim kombine sonuçlar bağlama site içinde çeşitli kademelerde Tercihli ortadan kalkması gösterme veya ilişkili kesir belirli gruplarından yoğunluklarda azaltılmış gösterir. Bu protein etkileşimleri (α-thio A) bağlama sitesindeki belirli üsleri ile gösteren omurga yerine Bankası ikame kaynaklanmaktadır. Bu arada, α-thio C ortaklığın bir kesişim deseni α-thio A. karşılaştırılabilir gösterir Ancak, sadece 3-4 α-thio G oyuncu değişikliği küçük göstermek ama algılanabilir girişim etrafında, merkezli Örneğin, numaralandırılmış 2 ve 3 (veri gösterilmez) konumlandırır. Bu yöntem nasıl alışılageldik önleyici SXL ve genel alışılageldik faktör U2 snRNP yardımcı faktör (U2AF65) farklı şekilde15 aynı pre-mRNA alışılageldik sinyal dizisi için (polypyrimidine-yolu) bağlamak farklılıklar ortaya çıkarmak için kullanılan .
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57816/57816fig1.jpg"> Şekil 1: akış şeması anahtar adımlar phosphorothioate mutagenesis (PTM). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57816/57816fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57816/57816fig2.jpg"> Şekil 2: kimyasal olarak iyot tarafından i ciddi iki nükleotitler arasındaki bir phosphorothioate bağlantı şematik. Kükürt sigara köprüleme fosfat oxygens biri yerini alır. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57816/57816fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57816/57816fig3.jpg"> Şekil 3: parazit nedeniyle bölümleme prensibi. Varsayımsal RNA temsilcisi α-thio nükleotit bir protein bağlayıcı sitesi de dahil olmak üzere altı pozisyonlarda içerir. Protein bağlayıcı takiben, RNA iyot tarafından phosphorothioate birleşme sitelerinde i ciddi. Durum 1-7 içinde ve çevresinde bağlama site referans metin için keyfi olarak numaralandırılır. Pozisyonu 2 veya eksik grup yok phosphorothioate birleşme veya sigara katkılı nükleotit temsil eder. Lane T toplam RNA ve lane B protein bağımlı RNA. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57816/57816fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57816/57816fig4.jpg"> Şekil 4: Phosphorothioate mutagenesis (PTM) yaklaşım sağlar doygunluk mutagenesis bir polypyrimidine-yolu/3 ' site mevcut trafo pre-mRNA splice. Lane T toplam RNA ve lane B protein bağımlı RNA. Α-thio temsil RNA α-thio ATP huzurunda sentezlenmiş ve α-thio adenosines katkılı konumlarla sıradaki tanımlar. Üç güçlü grup adenosines bu konumlarda sırayla karşılık gelir. Α-thio U α-thio UTP huzurunda sentezlenmiş RNA temsil eder ve katkılı pozisyonlarda sırası da dahil olmak üzere tüm uridines tanımlar. Sol dikey çizgi SXL bağlama sitesi işaretler. Pozisyonları 1 – 8 bağlama site içinde başvuru amacıyla ve sonuçlar bölümünde Açıklama kolaylığı için numaralandırılmıştır. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57816/57816fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Novel Saturation Mutagenesis Approach: Single Step Characterization of Regulatory Protein Binding Sites in RNA Using Phosphorothioates at JoVE.com

A Novel Saturation Mutagenesis Approach: Single Step Characterization of Regulatory Protein Binding Sites in RNA Using Phosphorothioates

Belirli RNA dizilere protein gen ekspresyonu önemli rol oynarlar. Bu bağlama sitelerin detaylı karakterizasyonu gen düzenlemesi bizim anlamak için önemlidir. Burada, bir tek adım yaklaşım doygunluk mutagenesis RNA protein bağlayıcı sitelerin için kullanılmıştır. Bu yaklaşım RNA içinde tüm protein bağlayıcı siteleri için geçerlidir.

Bir roman doygunluk Mutagenesis yaklaşım: Tek adım karakterizasyonu düzenleyici protein RNA Phosphorothioates kullanarak siteleri bağlama

Gene regulation plays an important role in development. Numerous DNA- and RNA-binding proteins bind their target sequences with high specificity to ...

a-novel-saturation-mutagenesis-approach-single-step-characterization

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

6.5K Görüntüleme.  University of Colorado at Boulder. Belirli RNA dizilere protein gen ekspresyonu önemli rol oynarlar. Bu bağlama sitelerin detaylı karakterizasyonu gen düzenlemesi bizim anlamak için önemlidir. Burada, bir tek adım yaklaşım doygunluk mutagenesis RNA protein bağlayıcı sitelerin için kullanılmıştır. Bu yaklaşım RNA içinde tüm protein bağlayıcı siteleri için geçerlidir.

Video: A Novel Saturation Mutagenesis Approach: Single Step Characterization of Regulatory Protein Binding Sites in RNA Using Phosphorothioates

Novel RNA-Binding Proteins Isolation by the RaPID Methodology

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern biology. Only a few in vitro and in vivo methods enable the identification of RBPs associated with a particular target mRNA. However, their main limitations are the identification of RBPs in a non-cellular environment (in vitro) or the low efficiency isolation of RNA of interest (in vivo). An RNA-binding protein purification and identification (RaPID) methodology was designed to overcome these limitations in yeast and enable efficient isolation of proteins that are associated in vivo. To achieve this, the RNA of interest is tagged with MS2 loops, and co-expressed with a fusion protein of an MS2-binding protein and a streptavidin-binding protein (SBP). Cells are then subjected to crosslinking and lysed, and complexes are isolated through streptavidin beads. The proteins that co-purify with the tagged RNA can then be determined by mass spectrometry. We recently used this protocol to identify novel proteins associated with the ER-associated PMP1 mRNA. Here, we provide a detailed protocol of RaPID, and discuss some of its limitations and advantages.

RNA-protein interactions lie at the heart of many cellular processes. Here, we describe an in vivo method to isolate specific RNA and identify novel proteins that are associated with it. This could shed new light on how RNAs are regulated in the cell.

Rapid Metodoloji tarafından Roman RNA Bağlayıcı Proteinler İzolasyon

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern ...

Genetik

Oligopeptide Competition Assay for Phosphorylation Site Determination

Protein phosphorylation at specific sites determines its conformation and interaction with other molecules. Thus, protein phosphorylation affects biological functions and characteristics of the cell. Currently, the most common method for discovering phosphorylation sites is by liquid chromatography/mass spectrometry (LC/MS) analysis, a rapid and sensitive method. However, relatively labile phosphate moieties are often released from phosphopeptides during the fragmentation step, which often yields false-negative signals. In such cases, a traditional in vitro kinase assay using site-directed mutants would be more accurate, but this method is laborious and time-consuming. Therefore, an alternative method using peptide competition may be advantageous. The consensus recognition motif of 5&#39; adenosine monophosphate-activated protein kinase (AMPK) has been established1 and was validated using a positional scanning peptide library assay2. Thus, AMPK phosphorylation sites for a novel substrate could be predicted and confirmed by the peptide competition assays. In this report, we describe the detailed steps and procedures for the in vitro oligopeptide-competing kinase assay by illustrating AMPK-mediated nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (Nrf2) phosphorylation. To authenticate the phosphorylation site, we carried out a sequential in vitro kinase assay using a site-specific mutant. Overall, the peptide competition assay provides a method to screen multiple potential phosphorylation sites and to identify sites for validation by the phosphorylation site mutants.

Peptide competition assays are widely used in a variety of molecular and immunological experiments. This paper describes a detailed method for an in vitro oligopeptide-competing kinase assay and the associated validation procedures, which may be useful to find specific phosphorylation sites.

Fosforilasyon Saha Tespiti İçin Oligopeptide Rekabet Testi

Protein phosphorylation at specific sites determines its conformation and interaction with other molecules. Thus, protein phosphorylation affects ...

Biyokimya

An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding of an RNA binding protein (RBP) to the initiation region of the mRNA, which interferes with ribosome binding. In the presented method, we utilize this blocking phenomenon to quantify the binding affinity of RBPs to their cognate and non-cognate binding sites. To do this, we insert a test binding site in the initiation region of a reporter mRNA and induce the expression of the test RBP. In the case of RBP-RNA binding, we observed a sigmoidal repression of the reporter expression as a function of RBP concentration. In the case of no-affinity or very low affinity between binding site and RBP, no significant repression was observed. The method is carried out in live bacterial cells, and does not require expensive or sophisticated machinery. It is useful for quantifying and comparing between the binding affinities of different RBPs that are functional in bacteria to a set of designed binding sites. This method may be inappropriate for binding sites with high structural complexity. This is due to the possibility of repression of ribosomal initiation by complex mRNA structure in the absence of RBP, which would result in lower basal reporter gene expression, and thus less-observable reporter repression upon RBP binding.

In this method, we quantify the binding affinity of RNA binding proteins (RBPs) to cognate and non-cognate binding sites using a simple, live, reporter assay in bacterial cells. The assay is based on repression of a reporter gene.

Bakterilerde protein RNA bağlayıcı ölçümü için bir tahlil

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding ...

Exploring Sequence Space to Identify Binding Sites for Regulatory RNA-Binding Proteins

Gene regulation plays an important role in all cells. Transcriptional, post-transcriptional (or RNA processing), translational, and post-translational steps are used to regulate specific genes. Sequence-specific nucleic acid-binding proteins target specific sequences to control spatial or temporal gene expression. The binding sites in nucleic acids are typically characterized by mutational analysis. However, numerous proteins of interest have no known binding site for such characterization. Here we describe an approach to identify previously unknown binding sites for RNA-binding proteins. It involves iterative selection and amplification of sequences starting with a randomized sequence pool. Following several rounds of these steps-transcription, binding, and amplification-the enriched sequences are sequenced to identify a preferred binding site(s). Success of this approach is monitored using in vitro binding assays. Subsequently, in vitro and in vivo functional assays can be used to assess the biological relevance of the selected sequences. This approach allows identification and characterization of a previously unknown binding site(s) for any RNA-binding protein for which an assay to separate protein-bound and unbound RNAs exists.

Sequence specificity is critical for gene regulation. Regulatory proteins that recognize specific sequences are important for gene regulation. Defining functional binding sites for such proteins is a challenging biological problem. An iterative approach for identification of a binding site for an RNA-binding protein is described here and is applicable to all RNA-binding proteins.

Düzenleyici RNA Bağlayıcı Proteinler için Bağlayıcı Siteleri Belirlemek için Sıra Alanını Keşfetmek

Gene regulation plays an important role in all cells. Transcriptional, post-transcriptional (or RNA processing), translational, and post-translational ...

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in DNA to investigate the interaction between small non-coding ribonucleic acid (sRNA) molecules and target messenger RNAs (mRNAs). In addition, site-directed mutagenesis is used to map specific protein binding sites to RNA. A 2-step and 3-step PCR based introduction of mutations is described. The approach is relevant to all protein-RNA and RNA-RNA interaction studies. In short, the technique relies on designing primers with the desired mutation(s), and through 2 or 3 steps of PCR synthesizing a PCR product with the mutation. The PCR product is then used for cloning. Here, we describe how to perform site-directed mutagenesis with both the 2- and 3-step approach to introduce mutations to the sRNA, McaS, and the mRNA, csgD, to investigate RNA-RNA and RNA-protein interactions. We apply this technique to investigate RNA interactions; however, the technique is applicable to all mutagenesis studies (e.g., DNA-protein interactions, amino-acid substitution/deletion/addition). It is possible to introduce any kind of mutation except for non-natural bases but the technique is only applicable if a PCR product can be used for downstream application (e.g., cloning and template for further PCR).

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in deoxyribonucleic acid (DNA). This protocol describes how to do site-directed mutagenesis with a 2-step and 3-step polymerase chain reaction (PCR) based approach, which is applicable to any DNA fragment of interest.

Site yönettiği Mutagenesis in Vitro ve Escherichia Coli etkileşimlerde RNA ile örneği Vivo deneyler için

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in DNA to investigate the interaction between small non-coding ribonucleic ...

Nonradioactive Assay to Measure Polynucleotide Phosphorylation of Small Nucleotide Substrates

Polynucleotide kinases (PNKs) are enzymes that catalyze the phosphorylation of the 5&#39; hydroxyl end of DNA and RNA oligonucleotides. The activity of PNKs can be quantified using direct or indirect approaches. Presented here is a direct, in vitro approach to measure PNK activity that relies on a fluorescently-labeled oligonucleotide substrate and polyacrylamide gel electrophoresis. This approach provides resolution of the phosphorylated products while avoiding the use of radiolabeled substrates. The protocol details how to set up the phosphorylation reaction, prepare and run large polyacrylamide gels, and quantify the reaction products. The most technically challenging part of this assay is pouring and running the large polyacrylamide gels; thus, important details to overcome common difficulties are provided. This protocol was optimized for Grc3, a PNK that assembles into an obligate pre-ribosomal RNA processing complex with its binding partner, the Las1 nuclease. However, this protocol can be adapted to measure the activity of other PNK enzymes. Moreover, this assay can also be modified to determine the effects of different components of the reaction, such as the nucleoside triphosphate, metal ions, and oligonucleotides.

This protocol describes a nonradioactive assay to measure kinase activity of polynucleotide kinases (PNKs) on small DNA and RNA substrates.

Küçük Nükleotit Substratlarının Polinükleotid Fosforilasyonunun Ölçülmesini Radyoaktif Olmayan Tsay

Polynucleotide kinases (PNKs) are enzymes that catalyze the phosphorylation of the 5&#39; hydroxyl end of DNA and RNA oligonucleotides. The activity of ...

A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins (RNPs) on Human pre-mRNA

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding location often influences function of a splicing factor.  However, as with any sampling strategy the chance of identifying an RNA bound to a splicing factor is proportional to its cellular abundance.  We have developed a novel in vitro approach for surveying binding specificity on otherwise transient pre-mRNA. This approach utilizes a specifically designed oligonucleotide pool that tiles across introns, exons, splice junctions, or other pre-mRNA.  The pool is subjected to some kind of molecular selection. Here, we demonstrate the method by separating the oligonucleotide into a bound and unbound fraction and utilize a two color array strategy to record the enrichment of each oligonucleotide in the bound fraction. The array data generates high-resolution maps with the ability to identify sequence-specific and structural determinates of ribonucleoprotein (RNP) binding on pre-mRNA.  A unique advantage to this method is its ability to avoid the sampling bias towards mRNA associated with current IP and SELEX techniques, as the pool is specifically designed and synthesized from pre-mRNA sequence. The flexibility of the oligonucleotide pool is another advantage since the experimenter chooses which regions to study and tile across, tailoring the pool to their individual needs.  Using this technique, one can assay the effects of polymorphisms or mutations on binding on a large scale or clone the library into a functional splicing reporter and identify oligonucleotides that are enriched in the included fraction.  This novel in vitro high-resolution mapping scheme provides a unique way to study RNP interactions with transient pre-mRNA species, whose low abundance makes them difficult to study with current in vivo techniques.  



A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins RNPs on Human pre-mRNA

Due to the transient nature of pre-mRNA, it can be difficult to isolate and study in vivo. Here, we present a novel in vitro approach to investigate RNA-protein interactions using a synthetic oligo pool that tiles across selected regions of pre-mRNA.

İnsan pre-mRNA üzerinde Haritalama Ribonucleoproteins Hızlı Yüksek verim için Yöntemi (RNPs)

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding ...

Biyoloji

PAR-CliP - A Method to Identify Transcriptome-wide the Binding Sites of RNA Binding Proteins

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ribonucleoprotein complexes (miRNPs) that are often expressed in a cell-type dependently. To understand how the interplay of these RNA-binding factors affects the regulation of individual transcripts, high resolution maps of in vivo protein-RNA interactions are necessary1.
A combination of genetic, biochemical and computational approaches are typically applied to identify RNA-RBP or RNA-RNP interactions. Microarray profiling of RNAs associated with immunopurified RBPs (RIP-Chip)2 defines targets at a transcriptome level, but its application is limited to the characterization of kinetically stable interactions and only in rare cases3,4 allows to identify the RBP recognition element (RRE) within the long target RNA. More direct RBP target site information is obtained by combining in vivo UV crosslinking5,6 with immunoprecipitation7-9 followed by the isolation of crosslinked RNA segments and cDNA sequencing (CLIP)10. CLIP was used to identify targets of a number of RBPs11-17. However, CLIP is limited by the low efficiency of UV 254 nm RNA-protein crosslinking, and the location of the crosslink is not readily identifiable within the sequenced crosslinked fragments, making it difficult to separate UV-crosslinked target RNA segments from background non-crosslinked RNA fragments also present in the sample.
We developed a powerful cell-based crosslinking approach to determine at high resolution and transcriptome-wide the binding sites of cellular RBPs and miRNPs that we term PAR-CliP (Photoactivatable-Ribonucleoside-Enhanced Crosslinking and Immunoprecipitation) (see Fig. 1A for an outline of the method). The method relies on the incorporation of photoreactive ribonucleoside analogs, such as 4-thiouridine (4-SU) and 6-thioguanosine (6-SG) into nascent RNA transcripts by living cells. Irradiation of the cells by UV light of 365 nm induces efficient crosslinking of photoreactive nucleoside-labeled cellular RNAs to interacting RBPs. Immunoprecipitation of the RBP of interest is followed by isolation of the crosslinked and coimmunoprecipitated RNA. The isolated RNA is converted into a cDNA library and deep sequenced using Solexa technology. One characteristic feature of cDNA libraries prepared by PAR-CliP is that the precise position of crosslinking can be identified by mutations residing in the sequenced cDNA. When using 4-SU, crosslinked sequences thymidine to cytidine transition, whereas using 6-SG results in guanosine to adenosine mutations. The presence of the mutations in crosslinked sequences makes it possible to separate them from the background of sequences derived from abundant cellular RNAs.
Application of the method to a number of diverse RNA binding proteins was reported in Hafner et al.18

RNA transcripts are subject to extensive posttranscriptional regulation that is mediated by a multitude of trans-acting RNA-binding proteins (RBPs). Here we present a generalizable method to identify precisely and on a transcriptome-wide scale the RNA binding sites of RBPs.

PAR-Klip - RNA Cilt Proteinler Transcriptome geniş Cilt Siteleri Belirlemek Amacıyla Bir Yöntem

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ...

Probing RNA Structure with Dimethyl Sulfate Mutational Profiling with Sequencing In Vitro and in Cells

The role of RNA structure in virtually any biological process has become increasingly evident, especially in the past decade. However, classical approaches to solving RNA structure, such as RNA crystallography or cryo-EM, have failed to keep up with the rapidly evolving field and the need for high-throughput solutions. Mutational profiling with sequencing using dimethyl sulfate (DMS) MaPseq is a sequencing-based approach to infer the RNA structure from a base&#39;s reactivity with DMS. DMS methylates the N1 nitrogen in adenosines and the N3 in cytosines at their Watson-Crick face when the base is unpaired. Reverse-transcribing the modified RNA with the thermostable group II intron reverse transcriptase (TGIRT-III) leads to the methylated bases being incorporated as mutations into the cDNA. When sequencing the resulting cDNA and mapping it back to a reference transcript, the relative mutation rates for each base are indicative of the base&#39;s &#34;status&#34; as paired or unpaired. Even though DMS reactivities have a high signal-to-noise ratio both in vitro and in cells, this method is sensitive to bias in the handling procedures. To reduce this bias, this paper provides a protocol for RNA treatment with DMS in cells and with in vitro transcribed RNA.

Probing RNA Structure with Dimethyl Sulfate Mutational Profiling with Sequencing In Vitro and in Cells

The protocol provides instruction for modifying RNA with dimethyl sulfate for mutational profiling experiments. It includes in vitro and in vivo probing with two alternative library preparation methods.

RNA Yapısının Dimetil Sülfat Mutasyonel Profillemesi ile İn Vitro ve İn Hücre Dizilimi ile İncelenmesi

The role of RNA structure in virtually any biological process has become increasingly evident, especially in the past decade. However, classical ...

An Optimized Quantitative Pull-Down Analysis of RNA-Binding Proteins Using Short Biotinylated RNA

Protein-RNA interactions regulate gene expression and cellular functions at transcriptional and post-transcriptional levels. For this reason, identifying the binding partners of an RNA of interest remains of high importance to unveil the mechanisms behind many cellular processes. However, RNA molecules might interact transiently and dynamically with some RNA-binding proteins (RBPs), especially with non-canonical ones. Hence, improved methods to isolate and identify such RBPs are greatly needed.
To identify the protein partners of a known RNA sequence efficiently and quantitatively, we developed a method based on the pull-down and characterization of all interacting proteins, starting from cellular total protein extract. We optimized the protein pull-down using biotinylated RNA pre-loaded on streptavidin-coated beads. As a proof of concept, we employed a short RNA sequence known to bind the neurodegeneration-associated protein TDP-43 and a negative control of a different nucleotide composition but the same length. After blocking the beads with yeast tRNA, we loaded the biotinylated RNA sequences on the streptavidin beads and incubated them with the total protein extract from HEK 293T cells. After incubation and several washing steps to remove nonspecific binders, we eluted the interacting proteins with a high-salt solution, compatible with the most commonly used protein quantification reagents and with sample preparation for mass spectrometry. We quantified the enrichment of TDP-43 in the pull-down performed with the known RNA binder compared to the negative control by mass spectrometry. We used the same technique to verify the selective interactions of other proteins computationally predicted to be unique binders of our RNA of interest or of the control. Finally, we validated the protocol by western blot via the detection of TDP-43 with an appropriate antibody. 
This protocol will allow the study of the protein partners of an RNA of interest in near-to-physiological conditions, helping uncover unique and unpredicted protein-RNA interactions.

Here, we present an optimized in vitro method to uncover, quantify, and validate protein interactors of specific RNA sequences, using total protein extract from human cells, streptavidin beads coated with biotinylated RNA, and mass spectrometry analysis.

Kısa Biyotinile RNA Kullanan RNA Bağlayıcı Proteinlerin Optimize Edilmiş Kantitatif Aşağı Çekme Analizi

Protein-RNA interactions regulate gene expression and cellular functions at transcriptional and post-transcriptional levels. For this reason, identifying ...