Ringraziamo Anne Dodson e Stephanie Heinrich per consigli su come ottimizzare il protocollo smFISH, Xavier Darzacq per aiutare con la piattaforma di analisi, Haiyan Huang per suggerimenti sull'analisi statistica. Questo lavoro è stato sostenuto dal March of Dimes (5-FY15-99), Pew Charitable Trusts (00027344), Damon Runyon Cancer Research Foundation (35-15) e Glenn Foundation a EÜ e un NSF Graduate Research Fellowship Grant No. DGE-1106400 JC.

Nota: Tutti i buffer e i media utilizzati in questo protocollo sono elencati nella tabella 1. Le informazioni sul fornitore per i reagenti è elencati nella Tabella materiali.
1 giorno/1 e 2 giorno:
Nota: Per cultura vegetativo, far crescere cellule a un OD600 di 0,4 e 0,6 in un mezzo comodo. Per cultura meiotica, indurre le cellule per subire la meiosi utilizzando un metodo preferito (in genere la coltura in un OD600 di 1.85).
1. la fissazione e la digestione del campione
<ol><li>Difficoltà un totale di ~3.5 OD600 delle cellule in 3% di formaldeide.<ol>
<li>Per cultura vegetativo, aggiungere mL 5,52 della cultura a 480 µ l di formaldeide al 37% in provette coniche da 15 mL.</li>
		<li>Per cultura meiotica, µ l 1840 di cultura a 160 µ l di formaldeide al 37% in 2 mL microcentrifuga. Capovolgere ~ 5 volte per mescolare. Attenzione: La formaldeide è tossica. Gestire e smaltire secondo le normative istituzionali.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Inserire le provette su un rullo di tamburo a temperatura ambiente per 20 min. Per campioni meiotici, dopo aver sistemato a temperatura ambiente per 20 min, continuano a fissaggio durante la notte a 4 ˚ c, rotazione. Nota: La fissazione durante la notte aumenta la riproducibilità e la qualità dei dati smFISH ottenuti per i campioni meiotici. Tempo di fissaggio deve essere ottimizzato.</li>
	<li>Mentre i campioni sono di fissaggio, scongelare 200 mM Vanadyl Ribonucleoside complessi (VRC) a 65 ˚ c per almeno 10 min.</li>
	<li>Preparare il mix master digestione in una provetta da 15 mL: per 1 campione, mescolare 425 µ l di tampone B con 40 µ l di 200mm VRC (riscaldato a 65 ˚ c); per 5 campioni, mescolare 2125 µ l di tampone B con 200 µ l di 200mm VRC (riscaldato a 65 ˚ c). Vortice ~ 5 s per risospendere completamente il VRC prima di aggiungere il mix master, che apparirà verde brunastro chiaro dopo aggiunta di VRC. Nota: Aggiunta di VRC durante la digestione migliora l'uniformità dei risultati smFISH, potenzialmente inibendo il contaminante di nucleasi introdotto dalla miscela di zymolyase, che è purificata dal greggio estratto. La quantità di VRC necessaria a questo punto dovrebbe essere ottimizzata.</li>
	<li>Per i campioni vegetativi, centrifugare le provette a ~ 1057 x g per 3 min. Per campioni meiotici (dopo la fissazione durante la notte), centrifugare a 21.000 x g per un minimo di 1,5 decantare o aspirare il supernatante a rifiuti di formaldeide. Nota: Tutte le fasi di centrifugazione vengono eseguite a temperatura ambiente.</li>
	<li>Risospendere le cellule in 1,5 mL di tampone freddo B pipettando su e giù o invertendo i tubi e sfogliando per mescolare. Trasferire campioni vegetativi 2 mL provette dopo la risospensione.</li>
	<li>Centrifuga a 21.000 x g per un minimo di 1,5 rimuovere la maggior parte del liquido tramite aspirazione a vuoto o di pipettaggio, lasciando dietro di sé ~ 100 µ l.</li>
	<li>Risospendere le cellule in 1,5 mL di tampone freddo B.</li>
	<li>Centrifuga a 21.000 x g per un minimo di 1,5 rimuovere la maggior parte del liquido tramite aspirazione a vuoto o di pipettaggio, lasciando dietro di sé ~ 100 µ l.</li>
	<li>Risospendere le cellule in 1,5 mL di freddo Buffer B. Centrifugare a 21.000 x g per un minimo di 1,5 aspirato il liquido completamente dal vuoto o di pipettaggio.</li>
	<li>Risospendere le cellule in 425 µ l di mix master di digestione e brevemente vortice per risospendere. Aggiungere 5 µ l di 100T 10mg/mL zymolyase ad ogni provetta. Nota: Vortex zymolyase ogni volta prima aggiunta ai tubi. Zymolyase aggiungere ad ogni provetta individualmente, invece di aggiungere al mix master. Entrambi i passaggi aiutano a mantenere la coerenza di digestione tra tubi perché zymolyase precipita rapidamente.</li>
	<li>Vortice 2-3 s per mescolare. Posizionare i tubi su un tamburo rullo e digerire a 30 ˚ c per 15-30 min. Per cellule vegetative e prime fasi meiotic, prende solitamente ~ 15 min e per Profase Meiotica e divisioni meiotiche, prende solitamente ~ 30 min. Nota: Verificare sul microscopio ogni 5 min dopo 15 min ed interrompere la digestione quando ~ 80% delle cellule appaiono non trasparente e rifrangente. Da questo punto in poi, le cellule sono molto fragili. Gestire le celle delicatamente ed evitare tramite aspirazione a vuoto o tramite vortex.
</li>
	<li>Centrifugare le provette a ~ 376 x g per 3 minuti rimuovere il liquido completamente pipettando.</li>
	<li>Risospendere delicatamente le cellule con 1 mL di tampone B pipettando su e giù 1 - 2 volte per mescolare.</li>
	<li>Centrifugare le provette a ~ 376 x g per 3 min liquido rimuovere Buffer B pipettando. Risospendere delicatamente le cellule in 1 mL di etanolo al 70% (diluito con acqua priva di RNasi).</li>
	<li>Incubare a temperatura ambiente per 3,5-4 ore.</li>
</ol>2. ibridazione
<ol><li>Portare la formammide a temperatura ambiente (per aliquota di 50 mL, ci vogliono ~ 30 min in bagno d'acqua). Nota: Non aprire la bottiglia di formammide fino a quando la bottiglia raggiunge la temperatura ambiente per evitare l'ossidazione della formammide. Attenzione: Formammide è tossica. Gestire e smaltire secondo le normative istituzionali.</li>
	<li>Preparare il tampone di lavaggio di formammide 10% in una provetta conica da 15 mL.</li>
	<li>Centrifugare le provette a ~ 376 x g per 3 minuti rimuovere 500 µ l di etanolo al 70% di pipettaggio. Pipetta da delicatamente su e giù per risospendere le cellule rimanenti e quindi trasferire le cellule ai tubi a bassa aderenza. Nota: Utilizzando i tubi a bassa aderenza notevolmente riduce la perdita di cellule durante i lavaggi successivi.</li>
	<li>Centrifugare le provette nuovamente a ~ 376 x g per 3 min. Rimuovi tutte l'etanolo di pipettaggio.</li>
	<li>Aggiungere 1 mL di tampone di lavaggio di 10% formammide e delicatamente dispensare su e giù 2 - 3 volte per risospendere le cellule.</li>
	<li>Permettono alle cellule di riposare a temperatura ambiente per ~ 20 min durante la preparazione della soluzione di ibridazione. Per 1 campione, mescolare 50 µ l di tampone di ibridazione (camera Temp.), 5 µ l di 200mm VRC (riscaldato a 65 ˚ c) e 1 µ l di ciascuna sonda (200 nM finale). Per 5 campioni, mescolare 250 µ l di tampone di ibridazione (camera Temp.), 25 µ l di 200mm VRC (riscaldato a 65 ˚ c) e 5 µ l di ciascuna sonda (200 nM finale).<ol>
<li>Scongelare il tampone di ibridazione (congelato a-20 ° c) a temperatura ambiente prima dell'apertura del tubo per impedire l'ossidazione di formammide.</li>
		<li>Dopo aver aggiunto il 200mm VRC, vortexare per 5-10 s prima di aggiungere le sonde, che sono progettati e acquistati commercialmente e ricostituiti secondo le istruzioni del produttore.</li>
		<li>Se due sonde sono co-incubate, aggiungere 1 µ l del 01:10 diluizione di stock sonda #1, come pure 1 µ l del 01:10 diluizione dello stock sonda #2, per fare una diluizione finale di ~ 1: 500 per ogni sonda. La concentrazione necessaria per il migliore rapporto di segnale-rumore deve essere ottimizzato (vedi discussione per dettagli).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Centrifugare i campioni a ~ 376 x g per 3 minuti rimuovere il surnatante in rifiuti pericolosi pipettando.</li>
	<li>Aggiungere almeno 50 µ l di soluzione di ibridazione ad ogni provetta. Scorri i tubi per mescolare.</li>
	<li>Incubare a 30 ˚ c su un tamburo rullo per almeno 16 ore al buio.</li>
</ol>Giorno 2/3 giorno
3. lavaggio e imaging
<ol><li>Portare formammide a temperatura ambiente.</li>
	<li>Preparare il tampone di lavaggio di 10% formammide (FWB) in una provetta conica da 15 mL.</li>
	<li>Togliere le provette dal tamburo rullo e metterli in una scatola rivestita di lamina al riparo dalla luce.</li>
	<li>Centrifugare i campioni a ~ 376 x g per 3 minuti rimuovere il surnatante in rifiuti pericolosi pipettando.</li>
	<li>Risospendere in 1 mL di 10% FWB pipettando delicatamente su e giù 2 - 3 volte.</li>
	<li>Incubare a 30 ˚ c per 30 min (non rotante) nella casella coperto di stagnola.</li>
	<li>Centrifugare i campioni a ~ 376 x g per 3 minuti rimuovere il surnatante per rifiuti pericolosi pipettando e lasciare ~ 50 µ l.</li>
	<li>Nel frattempo, preparare DAPI/FWB in una provetta conica da 15 mL: per 1 esempio, mescolare 1000 µ l di tampone di lavaggio di 10% formammide con 1 µ l di 5 mg/mL DAPI. Per 10 campioni, mescolare 10 mL di tampone di lavaggio 10% formammide con 10 µ l di 5 mg/mL DAPI. Risospendere in 1 mL di DAPI/FWB pipettando delicatamente su e giù 2 - 3 volte.</li>
	<li>Incubare a 30 ˚ c per 30 min (non rotante) nella casella coperto di stagnola.</li>
	<li>Scongelare i reagenti anti-candeggina sul ghiaccio.</li>
	<li>Centrifugare i campioni a ~ 376 x g per 3 minuti rimuovere il surnatante completamente pipettando. Se necessario, centrifugare nuovamente per rimuovere tutti del surnatante.</li>
	<li>Per i campioni che non sono imaged immediatamente, risospendere il pellet in 50 µ l di tampone di GLOX senza enzimi. Dispensare su e giù 3 - 4 volte per mescolare.<ol>
<li>Mantenere tutti i campioni unimaged nella finestra coperto di stagnola a 4 ˚ c fino al momento dell'immagine. Quando si è pronti all'immagine, centrifugare i campioni a ~ 376 x g per 2 minuti e rimuovere il surnatante completamente pipettando. Risospendere in GLOX con enzimi come di seguito.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Per i campioni essere imaged immediatamente, aggiungere 15-20 µ l di tampone GLOX con enzimi. Pipetta da delicatamente su e giù per mescolare. Nota: Il volume aggiunto può variare a seconda della dimensione del pellet cellulare. Si consiglia di risospendere il pellet in 15 µ l di tampone GLOX con enzimi e controlla la densità delle cellule al microscopio. Se le cellule sono troppo dense (cellule che ragruppa una sopra l'altra), aggiunta tampone GLOX extra con enzimi. Se le celle sono troppo radi, centrifugare il campione e rimuovere ~ 5 µ l di tampone.</li>
	<li>Pipettare 5 µ l su un vetrino coprioggetti (18 mm x 18 mm, n ° 1) e mettere il vetrino coprioggetto in una diapositiva.</li>
	<li>Mettere un panno di laboratorio sopra la diapositiva dove sono collocato il vetrino coprioggetti. Premere delicatamente il panno di laboratorio per impostare diapositiva (dovrebbe vedere liquido venuta fuori da tutti e quattro i bordi del coprivetrino).</li>
	<li>Trasferire la diapositiva alla Camera microscopio in una scatola rivestita con foglio di alluminio.</li>
	<li>Immagine utilizzando un microscopio a fluorescenza grandangolari con alto ingrandimento (60-100x) e apertura numerica elevata. Nota: Per raccogliere il massimo numero di fotoni emessi dalle sonde smFISH, microscopi confocali non sono consigliate, come limitare significativamente la quantità di luce per essere raccolti. Qui, i dati sono stati raccolti su un microscopio equipaggiato con un 100 X, 1,4 obiettivo NA, usando filtri CY5 (EX632/22, EM679/34) ripreso a 1.3 s, 100% T; TRITC (EX542/27, EM597/45), 1.3 s, 100% T; e DAPI (EX390/18, EM435/48), 0.05-0.1 s, T. 32% - 50% Dovrebbe essere acquisita anche un'immagine di riferimento di campo chiaro. Acquisire fette di 15-25 con una dimensione di passaggio di 0.1-0.2 µm, da interamente sotto il fuoco del campo di vista interamente sopra, al fine di garantire che tutti i punti di RNA sono contabilizzati.</li>
</ol>4. image Analysis
<ol><li>Analizzare i dati di smFISH con smFISH pubblicati tra gli strumenti di analisi come pesce-quant17 e StarSearch2, o con programmi personalizzati, a seconda dei requisiti esatti dell'esperimento. Nota: Una pipeline di buona analisi dovrebbe consentire agli utenti di determinare una soglia per separare il vero spot di RNA dallo sfondo e statistiche quali le coordinate X, Y e Z (facoltative) e l'intensità di ogni spot, il numero di punti in ogni cella di output e possibilmente raccordo parametri come un modo per filtrare i falsi rilevamenti.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+single+RNA+transcripts+in+situ.">Visualization of single RNA transcripts in situ.</a> Science. 280 (5363), 585-590 (1998).</li><li>Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+individual+mRNA+molecules+using+multiple+singly+labeled+probes.">Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes.</a> Nat Methods. 5 (10), 877-879 (2008).</li><li>Rahman, S., Zenklusen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+resolution+fluorescent+in+situ+hybridization+(smFISH)+in+the+yeast+S.+cerevisiae.">Single-molecule resolution fluorescent in situ hybridization (smFISH) in the yeast S. cerevisiae.</a> Methods Mol Biol. 1042, 33-46 (2013).</li><li>Gaspar, I., Ephrussi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strength+in+numbers:+quantitative+single-molecule+RNA+detection+assays.">Strength in numbers: quantitative single-molecule RNA detection assays.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 4 (2), 135-150 (2015).</li><li>Vargas, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+imaging+of+transcriptionally+coupled+and+uncoupled+splicing.">Single-molecule imaging of transcriptionally coupled and uncoupled splicing.</a> Cell. 147 (5), 1054-1065 (2011).</li><li>Waks, Z., Klein, A. M., Silver, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-to-cell+variability+of+alternative+RNA+splicing.">Cell-to-cell variability of alternative RNA splicing.</a> Mol Syst Biol. 7, 506 (2011).</li><li>Zenklusen, D., Larson, D. R., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-RNA+counting+reveals+alternative+modes+of+gene+expression+in+yeast.">Single-RNA counting reveals alternative modes of gene expression in yeast.</a> Nat Struct Mol Biol. 15 (12), 1263-1271 (2008).</li><li>Raj, A., Peskin, C. S., Tranchina, D., Vargas, D. Y., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+mRNA+synthesis+in+mammalian+cells.">Stochastic mRNA synthesis in mammalian cells.</a> PLoS Biol. 4 (10), e309 (2006).</li><li>Senecal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factors+modulate+c-Fos+transcriptional+bursts.">Transcription factors modulate c-Fos transcriptional bursts.</a> Cell Rep. 8 (1), 75-83 (2014).</li><li>Levesque, M. J., Ginart, P., Wei, Y., Raj, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+SNVs+to+quantify+allele-specific+expression+in+single+cells.">Visualizing SNVs to quantify allele-specific expression in single cells.</a> Nat Methods. 10 (9), 865-867 (2013).</li><li>Hansen, C. H., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allele-specific+detection+of+single+mRNA+molecules+in+situ.">Allele-specific detection of single mRNA molecules in situ.</a> Nat Methods. 10 (9), 869-871 (2013).</li><li>Ginart, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+allele-specific+expression+in+single+cells+reveals+epigenetic+mosaicism+in+an+H19+loss-of-imprinting+mutant.">Visualizing allele-specific expression in single cells reveals epigenetic mosaicism in an H19 loss-of-imprinting mutant.</a> Genes Dev. 30 (5), 567-578 (2016).</li><li>Long, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mating+type+switching+in+yeast+controlled+by+asymmetric+localization+of+ASH1+mRNA.">Mating type switching in yeast controlled by asymmetric localization of ASH1 mRNA.</a> Science. 277 (5324), 383-387 (1997).</li><li>Park, H. Y., Trcek, T., Wells, A. L., Chao, J. A., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+unbiased+analysis+method+to+quantify+mRNA+localization+reveals+its+correlation+with+cell+motility.">An unbiased analysis method to quantify mRNA localization reveals its correlation with cell motility.</a> Cell Rep. 1 (2), 179-184 (2012).</li><li>Jourdren, L., Delaveau, T., Marquenet, E., Jacq, C., Garcia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CORSEN,+a+new+software+dedicated+to+microscope-based+3D+distance+measurements:+mRNA-mitochondria+distance,+from+single-cell+to+population+analyses.">CORSEN, a new software dedicated to microscope-based 3D distance measurements: mRNA-mitochondria distance, from single-cell to population analyses.</a> RNA. 16 (7), 1301-1307 (2010).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetochore+inactivation+by+expression+of+a+repressive+mRNA.">Kinetochore inactivation by expression of a repressive mRNA.</a> eLife. 6, e27417 (2017).</li><li>Mueller, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FISH-quant:+automatic+counting+of+transcripts+in+3D+FISH+images.">FISH-quant: automatic counting of transcripts in 3D FISH images.</a> Nat Methods. 10 (4), 277-278 (2013).</li><li>Brar, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+view+of+the+yeast+meiotic+program+revealed+by+ribosome+profiling.">High-resolution view of the yeast meiotic program revealed by ribosome profiling.</a> Science. 335 (6068), 552-557 (2012).</li><li>Carlile, T. M., Amon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiosis+I+is+established+through+division-specific+translational+control+of+a+cyclin.">Meiosis I is established through division-specific translational control of a cyclin.</a> Cell. 133 (2), 280-291 (2008).</li><li>Benjamin, K. R., Zhang, C., Shokat, K. M., Herskowitz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+landmark+events+in+meiosis+by+the+CDK+Cdc28+and+the+meiosis-specific+kinase+Ime2.">Control of landmark events in meiosis by the CDK Cdc28 and the meiosis-specific kinase Ime2.</a> Genes Dev. 17 (12), 1524-1539 (2003).</li><li>Dodson, A. E., Rine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heritable+capture+of+heterochromatin+dynamics+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Heritable capture of heterochromatin dynamics in Saccharomyces cerevisiae.</a> eLife. 4, e05007 (2015).</li><li>Trcek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-mRNA+counting+using+fluorescent+in+situ+hybridization+in+budding+yeast.">Single-mRNA counting using fluorescent in situ hybridization in budding yeast.</a> Nat Protoc. 7 (2), 408-419 (2012).</li><li>Youk, H., Raj, A., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+single+mRNA+molecules+in+yeast.">Imaging single mRNA molecules in yeast.</a> Methods Enzymol. 470, 429-446 (2010).</li></ol>

Gli autori non hanno alcun conflitto di interessi di divulgare.

Il protocollo presentato qui è derivato da altri protocolli pubblicati smFISH2,3,21,22,23ed è specificamente ottimizzato per lo sfondo del ceppo di lievito SK1. I parametri ottimizzati incluso il numero di cellulare, durata di fissazione, velocità di centrifugazione e durata, durata di digestione, buffer di digestione, sonda concentrazione e tampone di ibridazione. Altri parametri come la temperatura di ibridazione e durata non sono state ottimizzate. In questa sezione, condividiamo alcune note che aiuterebbero a adattare il presente protocollo a qualsiasi sfondo del ceppo di lievito e le condizioni di crescita di interesse.
La parete cellulare del lievito è una grande sfida contro ottenere immagini di alta qualità smFISH in lievito perché la parete cellulare impedisce la penetrazione della sonda. La digestione incompleta della parete delle cellule di zymolyase conduce alla inefficiente ibridazione del probe e alta variabilità della cellula--cellula nel segnale. Tuttavia, digestione eccessiva può rendere le cellule troppo fragile, portando a significativi cella perdita durante le fasi di lavaggio e delle cellule di scoppio durante la preparazione del vetrino per l'imaging. Così, ottimizzando la durata della digestione è cruciale. Si consiglia di condurre un esperimento pilota smFISH digerendo lo stesso campione per diverse quantità di tempo. Nel nostro caso, abbiamo ottenuto i migliori dati di smFISH se ci siamo fermati la digestione quando ~ 80% delle cellule è diventato non-rifrangente. In genere, per la stessa condizione di crescita, diversi ceppi mutanti genetici possono essere digeriti con tempi simili. Tuttavia, la durata della digestione differisce rispetto tra le diverse condizioni di crescita e le diverse fasi della meiosi nel lievito gemmante. Una volta determinata la tempistica, la qualità del smFISH è riproducibile. Nota che ceppi mutanti con la sintesi della parete cellulare difettoso e/o composizione, digestione potrebbe essere completata in meno di 15 minuti di uso di diversi lotti di zymolyase cambiano anche leggermente i tempi di digestione.
Concentrazione ottimale sonda è necessario per raggiungere un elevato rapporto segnale-rumore. Abbiamo progettato e acquistato le nostre sonde smFISH commercialmente. Buone sonde (spesso 20-mers) dovrebbero avere una percentuale di GC che vanno dal 35% al 45%, una distanza minima di 2 paia di basi tra sonde e bassa reattività crociata. Abbiamo usato una finestra di progettazione web-based sonda dal produttore per generare un elenco di sonde, e se c'erano abbastanza sonde da scegliere, useremmo l'algoritmo BLAST nel Database del genoma di Saccharomyces per eliminare le sonde con più di 17 coppie di basi sovrapposte con altre regioni genomiche. Abbiamo scelto il più fotostabile colorante fluorescente (CAL Fluor 590) per il set di sonda che accoppia alla regione unica di NDC80luti (CF 590) perché in questo set, il numero di sonde che ha soddisfatto tutti i criteri di cui sopra (20 Sonde) era inferiore al numero minimo consigliato dal produttore (~ 25 sonde). Dopo ricostituzione la soluzione della sonda seguendo le istruzioni del produttore, abbiamo fatto un 01:10 diluizione della soluzione di riserva e memorizzato la soluzione diluita in aliquote di 5-µ l a-20 ˚ c. Ogni aliquota è stata usata solo una volta. Per l'ottimizzazione, uno dovrebbe fare seriale diluizioni dal 01:10 diluito soluzione e prova che la concentrazione produce il miglior rapporto segnale-rumore. Si consiglia di effettuare una serie di diluizione di 1: 250, 1: 500, 1: 1000 e 1: 2000 dallo stock originale. Nel nostro caso, un fattore di diluizione di 1: 500 ha provocato il miglior rapporto segnale-rumore, per il CF 590 e la Q 670 set sonda.
Tempo di fissaggio ottimale è anche critico per il successo smFISH in lievito. Abbiamo trovato quella fissazione durante la notte a 4 ˚ c, anziché fissaggio a temperatura ambiente per 20 min, ha migliorato significativamente la coerenza e la qualità dei risultati smFISH per campioni meiotici. Anche se non è stato testato come una notte fissazione potrebbe avere un impatto campioni vegetativi, fissazione a temperatura ambiente ha funzionato bene per questa condizione di crescita. Così, per ottimizzare il protocollo smFISH per nuovi ceppi o condizioni di crescita, si consiglia a partire con il tempo breve fissazione a temperatura ambiente e aumentando il tempo di fissazione se alta variabilità del segnale viene rilevato.
Rispetto ad altri protocolli pubblicati3,22,23, il nostro protocollo utilizza l'inibitore di RNAsi VRC durante digestione e una maggiore concentrazione di VRC durante l'ibridazione. Aggiunta di VRC in questi due passaggi migliorato la consistenza dei risultati smFISH, possibilmente con una migliore conservazione molecole di RNA contro attività di nucleasi, che possono essere introdotti mediante il mix di zymolyase (l'enzima è purificata da estratti grezzi e può contenere RNasi contaminanti). Pertanto, si consiglia di utilizzare la quantità di VRC come elencati nel nostro protocollo o persino più alte concentrazioni di VRC per l'ottimizzazione.
Una parte significativa delle cellule può essere persa durante le fasi di lavaggio in tampone B e il tampone di lavaggio di formammide. Per ridurre la perdita di cellule, uno potrebbe aumentare la velocità di centrifugazione. Nel nostro caso, usando un'ad alta velocità (21.000 x g) per appallottolare i nostri campioni durante il tampone B lava perdita delle cellule significativamente ridotta. Tuttavia, le cellule diventano molto fragili dopo zymolyase digestione, quindi non è consigliabile modificare la velocità di centrifugazione. Al contrario, si consiglia di utilizzare i tubi di bassa aderenza da scientifica USA, che molto utile per agglomerare le cellule durante i lavaggi in tampone di lavaggio di formammide. Nel complesso, il nostro protocollo è in grado di generare costantemente un monostrato di cellule abbastanza dense per l'imaging efficiente. In genere, 7 campi di vista dovrebbe produrre > 130 celle adatte per la quantificazione.
Infine, è importante determinare i parametri ottimali per e le uscite necessarie da analisi dell'immagine. Per rilevare punti di smFISH, programmi di analisi pubblicata filtrare le immagini raw con kernel gaussiano per rimuovere il segnale di fondo e chiedono agli utenti di determinare il rapporto segnale-rumore da utilizzare per ogni set di immagini2,17. Purtroppo, non c'è attualmente un unico standard con cui vengono determinati i parametri appropriati, e così alcune prove empiriche di queste diverse impostazioni è necessaria. Per impostare i parametri necessari per ognuno di questi passaggi, è necessario in modo iterativo diversi set di parametri di input e controllare quanto bene i risultati ottenuti da ogni insieme che corrisponde dal conteggio manuale in alcune cellule rappresentante. Una volta che viene trovato un set di parametri, può essere utilizzato per la maggior parte delle immagini ottenute nonostante le diverse condizioni di crescita e di ambiti di provenienza genetici.
Inoltre, uno può testare se-intensità massima di proiezione delle immagini smFISH può essere eseguita prima di quantificazione22. Questo passaggio semplifica l'algoritmo di rilevamento spot e riduce notevolmente i tempi di formazione immagini, anche se a costo di alcune informazioni potenzialmente utili su singoli punti, ad esempio la loro localizzazione subcellulare. Nel nostro caso, il numero di molecole di mRNA prodotta dal gene NDC80 era abbastanza basso che le macchie erano ben separate dopo questa elaborazione (non è rara per le trascrizioni in erba lievito3,7). In casi dove la colocalizzazione analisi è critico, la pipeline di analisi ha bisogno determinare la posizione di ogni spot di smFISH in ogni canale per valutare colocalizzazione. In base alle specifiche domande viene chiesto, altre informazioni come l'intensità di ogni spot possono anche bisogno di essere estratto dalla pipeline per ulteriori analisi. Ottimizzando la chiave interviene il protocollo e la pipeline di analisi di immagine è fondamentale per ottenere alta qualità di smFISH dati per studiare la questione di interesse.

Regolazione dinamica dell'espressione genica guida lo sviluppo di un organismo, come pure la sua risposta a stress ambientali, infezione ed i cambiamenti nel metabolismo. Gli studi che si concentrano sulla regolazione trascrizionale si basano su tecnologie che misurano abbondanza di RNA. Un tale metodo, definito ibridazione di singola molecola fluorescenza in situ (smFISH), è utilizzato per il rilevamento delle singole molecole di RNA in cellule singole1,2. Questo metodo consente la misurazione della cellula--cellula variabilità nell'espressione genica e la determinazione della localizzazione intracellulare di RNA.
La tecnica più comunemente utilizzati smFISH, rilevazione di una singola molecola di RNA richiede sonde di DNA breve multiple (spesso ~ 48 20-mer sonde) che sono complementari a RNA dell'obiettivo e sono coniugati alla stessa tintura fluorescente. Associazione di una singola sonda fluorescente si traduce in segnale debole, ma il segnale dall'insieme di tutte le sonde è robusto. Questa caratteristica migliora notevolmente il rapporto segnale-rumore, perché anche se una singola sonda può esibire fuori bersaglio associazione, tale segnale dovrebbe essere molto debole rispetto a quella del bersaglio RNA molecola3. All'interno di errore di rilevazione, il numero di molecole di RNA può essere contato e confrontato tra diverse condizioni di crescita e tra diversi mutanti.
Dal suo primo sviluppo, smFISH è stato adattato per studiare vari aspetti dell' espressione genica4, come trascrizione allungamento1,2,5,6, trascrizionale scoppio7 di splicing , 8 , 9, espressione allelica intracellulare10,11,12e RNA localizzazione13,14,15. Recentemente, abbiamo usato questo metodo per studiare l'espressione delle due isoforme di trascrizione del gene stesso, in cui l'isoforma breve trascrizione (NDC80ORF) ha la sua intera sequenza ha condiviso con l'isoforma lunga (NDC80luti )16. Per identificare in modo univoco le due isoforme di mRNA, abbiamo usato due sonda set: un set è specifico per la sequenza univoca di NDC80luti, e l'altro insieme, coniugato a un altro colorante fluorescente, si lega alla regione comune delle due isoforme. NDC80luti RNA viene identificato come un posto colocalized con entrambi i segnali fluorescenti, considerando che la NDC80ORF RNA è quella che contiene solo il segnale dal set sonda comune. Poiché il numero della NDC80ORF trascrizioni è calcolato con un metodo di "sottrazione", ad alta efficienza dell'ibridazione della sonda e un alto rapporto segnale-rumore sono necessari con fiducia smFISH macchie di identificare e ridurre l'errore propagazione.
Questo articolo descrive un protocollo ottimizzato per l'esecuzione di smFISH nel lievito Saccharomyces cerevisiae. In questo protocollo, il numero di cellulare, tempo di fissazione, tempo di digestione, digestione buffer, sonda concentrazione e ibridazione buffer utilizzato per gli esperimenti di smFISH sono state ottimizzate per lo sfondo di SK1 ceppo di Saccharomyces cerevisiae in fase vegetativo crescita o meiosi. Tuttavia, notiamo anche in questo manoscritto: (1) il metodo per controllare la qualità dei dati di smFISH dopo l'acquisizione dell'immagine e (2) i passaggi nel protocollo che potrebbero richiedere ulteriore ottimizzazione per gli sfondi di ceppo diverso e le condizioni di crescita.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:881px;" width="881">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">BSA, RNase-free (50 mg/mL)</td>
			<td style="width:99px;">Ambion</td>
			<td style="width:87px;">AM2616</td>
			<td style="width:491px;">Store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Catalase</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:87px;">C3515</td>
			<td style="width:491px;">Store at 4 &#176;C for short-term. Vortex before use.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">DAPI</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:87px;">D9564</td>
			<td style="width:491px;">Store at -20 &#176;C after reconstitution in water. Protect from light.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">50% Dextran Sulfate</td>
			<td style="width:99px;">Milli Pore</td>
			<td style="width:87px;">S4030</td>
			<td style="width:491px;">Store at room temperature. Very viscous liquid. Handle with patience.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">E. coli tRNA</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:87px;">R4251</td>
			<td style="width:491px;">Store at -20 &#176;C in aliquots after reconstitution in water.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Ethanol (100%, 200 proof)</td>
			<td style="width:99px;">various</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:491px;">Flammable.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">37% Formaldehyde</td>
			<td style="width:99px;">Fisher</td>
			<td>F79-500</td>
			<td style="width:491px;">Store at room temperature. Toxic. Use and dispose with caution.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:205px;">Formamide</td>
			<td style="width:99px;">Ambion</td>
			<td style="width:87px;">AM9342</td>
			<td style="width:491px;">Store at 4 &#176;C. Open after the temperature equilibrates to room temperature in order to prevent oxidation. Toxic. Use and dispose with caution.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Glucose</td>
			<td style="width:99px;">various</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:491px;">Store at 4 &#176;C after dissolving in nuclease-free water.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Glucose oxidase</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:87px;">G2133</td>
			<td style="width:491px;">Store at -20 &#176;C in aliquots after reconstitution in 50 mM NaOAc, pH 5.</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:205px;">Nuclease-free water</td>
			<td style="width:99px;">Ambion</td>
			<td style="width:87px;">AM9932</td>
			<td style="width:491px;">Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:205px;">Potassium phosphate (monobasic and dibasic)</td>
			<td style="width:99px;">various</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:491px;">Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:205px;">Probe library, diluted in TE, pH 8.0&#160;</td>
			<td style="width:99px;">Biosearch Technologies</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:491px;">Store at -20 &#176;C in aliquots (5 &#181;L) after reconstitution in TE pH 8.0, following the instructions from the manufacturer. Protect from light.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Sorbitol</td>
			<td style="width:99px;">various</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:491px;">Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:205px;">20X SSC</td>
			<td style="width:99px;">Ambion</td>
			<td style="width:87px;">AM9763</td>
			<td style="width:491px;">Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:205px;">TE, pH 8.0</td>
			<td style="width:99px;">Ambion</td>
			<td style="width:87px;">AM9849</td>
			<td style="width:491px;">Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;width:205px;">1 M Tris, pH 8.0</td>
			<td style="width:99px;">Ambion</td>
			<td style="width:87px;">AM9856</td>
			<td style="width:491px;">Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:205px;">Trolox</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:87px;">238813</td>
			<td style="width:491px;">Store at -20 &#176;C in aliquots.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:205px;">200 mM Vanadyl ribonucleoside complex (VRC)</td>
			<td style="width:99px;">NEB</td>
			<td style="width:87px;">S1402S</td>
			<td style="width:491px;">Store at -20 &#176;C in aliquots after reconstitution, following the instructions from the manufacturer.</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:205px;">Zymolyase 100T</td>
			<td style="width:99px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:87px;">08320932</td>
			<td style="width:491px;">Store at -20 &#176;C in aliquots after reconstitution in water.</td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Low-adhesion tubes</td>
			<td style="width:99px;">USA Scientific</td>
			<td>1415-2600</td>
			<td style="width:491px;">Store at room temperature.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single molecule fluorescence in situ hybridization (smfish) analysis in budding yeast vegetative growth and meiosis

Ibridazione di singola molecola fluorescenza in situ (smFISH) è una tecnica potente per studiare l'espressione genica in cellule singole grazie alla sua capacità di rilevare e contare le singole molecole di RNA. Complementari ai metodi basati su sequenziamento profondi, smFISH fornisce informazioni circa la variazione della cellula--cellula in abbondanza di trascrizione e la localizzazione subcellulare di un determinato RNA. Recentemente, abbiamo usato smFISH per studiare l'espressione del gene NDC80 durante la meiosi nel lievito gemmante, in cui trascrizione due isoforme esiste e l'isoforma breve trascrizione ha sua intera sequenza ha condiviso con l'isoforma lunga. Per identificare con sicurezza ogni isoforma di trascrizione, abbiamo ottimizzato smFISH noti protocolli ed abbiamo ottenuto alta consistenza e qualità dei dati di smFISH per i campioni acquisiti durante in erba lievito meiosi. Qui, Descriviamo questo protocollo ottimizzato, i criteri che utilizziamo per determinare se si ottiene alta qualità di dati di smFISH e alcuni suggerimenti per l'implementazione di questo protocollo in altri ceppi di lievito e le condizioni di crescita.

Watch this Scientific Journal Video about Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis at JoVE.com

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Questa singola molecola fluorescenza in situ di ibridazione protocollo è ottimizzato per quantificare il numero di molecole di RNA in lievito durante la meiosi e crescita vegetativa.

Singola molecola l'ibridazione In Situ (smFISH) analisi in crescita vegetativa lievito germogliante e meiosi

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

single-molecule-fluorescence-situ-hybridization-smfish-analysis

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

19.1K Views.  University of California, Berkeley. Questa singola molecola fluorescenza in situ di ibridazione protocollo è ottimizzato per quantificare il numero di molecole di RNA in lievito durante la meiosi e crescita vegetativa.

Video: Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization (mFISH) and Spectral Karyotyping (SKY) in Irradiated Mice

Ionizing radiation (IR) induces numerous stable and unstable chromosomal aberrations. Unstable aberrations, where chromosome morphology is substantially compromised, can easily be identified by conventional chromosome staining techniques. However, detection of stable aberrations, which involve exchange or translocation of genetic materials without considerable modification in the chromosome morphology, requires sophisticated chromosome painting techniques that rely on in situ hybridization of fluorescently labeled DNA probes, a chromosome painting technique popularly known as fluorescence in situ hybridization (FISH). FISH probes can be specific for whole chromosome/s or precise sub-region on chromosome/s. The method not only allows visualization of stable aberrations, but it can also allow detection of the chromosome/s or specific DNA sequence/s involved in a particular aberration formation. A variety of chromosome painting techniques are available in cytogenetics; here two highly sensitive methods, multiple fluorescence in situ hybridization (mFISH) and spectral karyotyping (SKY), are discussed to identify inter-chromosomal stable aberrations that form in the bone marrow cells of mice after exposure to total body irradiation. Although both techniques rely on fluorescent labeled DNA probes, the method of detection and the process of image acquisition of the fluorescent signals are different. These two techniques have been used in various research areas, such as radiation biology, cancer cytogenetics, retrospective radiation biodosimetry, clinical cytogenetics, evolutionary cytogenetics, and comparative cytogenetics.

Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization mFISH and Spectral Karyotyping SKY in Irradiated Mice

The present protocol describes the usefulness of multiple fluorescence in situ hybridization (mFISH) and spectral karyotyping (SKY) in identifying inter-chromosomal stable aberrations in the bone marrow cells of mice after exposure to total body irradiation.

Rilevazione di Inter-aberrazioni cromosomiche stabili per fluorescenza multipla<em&gt; In Situ</em&gt; Ibridazione (mFISH) e spettrale cariotipo (SKY) in topi irradiati

Ionizing radiation (IR) induces numerous stable and unstable chromosomal aberrations. Unstable aberrations, where chromosome morphology is substantially ...

Ricerca

Genetica

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting mutant alleles reside at their endogenous genomic sites and no exogenous DNA sequences are left in the genome following the procedure. Since in haploid yeast cells each of the four core histone proteins is encoded by two non-allelic genes with highly homologous open reading frames (ORFs), targeting mutagenesis specifically to one of two genes encoding a particular histone protein can be problematic. The strategy we describe here bypasses this problem by utilizing sequences outside, rather than within, the ORF of the target genes for the homologous recombination step. Another feature of this system is that the regions of DNA driving the homologous recombination steps can be made to be very extensive, thus increasing the likelihood of successful integration events. These features make this strategy particularly well-suited for histone gene mutagenesis, but can also be adapted for mutagenesis of other genes in the yeast genome.

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A strategy for generating mutations in histone genes at their endogenous location in Saccharomyces cerevisiae is presented.

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The described RNA in situ hybridization protocol allows the detection of RNA in whole Drosophila embryos or dissected tissues. Using 96-well microtiter plates and tyramide signal amplification, transcripts can be detected at high resolution, sensitivity, and throughput, and at a relatively low cost.

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Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for example, during cellular differentiation, morphogenesis, and functional stimulation (such as activation of immune cells), or after exposure to drugs and other factors from the local environment. Depending on the stimulus and cell type, these changes occur rapidly and at any possible level of gene regulation. Displaying all molecular processes of a responding cell to a certain type of stimulus/drug is one of the hardest tasks in molecular biology. Here, we describe a protocol that enables the simultaneous analysis of multiple layers of gene regulation. We compare, in particular, transcription factor binding (Chromatin-immunoprecipitation-sequencing (ChIP-seq)), de novo transcription (4-thiouridine-sequencing (4sU-seq)), mRNA processing, and turnover as well as translation (ribosome profiling). By combining these methods, it is possible to display a detailed and genome-wide course of action.
Sequencing newly transcribed RNA is especially recommended when analyzing rapidly adapting or changing systems, since this depicts the transcriptional activity of all genes during the time of 4sU exposure (irrespective of whether they are up- or downregulated). The combinatorial use of total RNA-seq and ribosome profiling additionally allows the calculation of RNA turnover and translation rates. Bioinformatic analysis of high-throughput sequencing results allows for many means for analysis and interpretation of the data. The generated data also enables tracking co-transcriptional and alternative splicing, just to mention a few possible outcomes.
The combined approach described here can be applied for different model organisms or cell types, including primary cells. Furthermore, we provide detailed protocols for each method used, including quality controls, and discuss potential problems and pitfalls.

This protocol describes the combinatorial use of ChIP-seq, 4sU-seq, total RNA-seq, and ribosome profiling for cell lines and primary cells. It enables tracking changes in transcription-factor binding, de novo transcription, RNA processing, turnover and translation over time, and displaying the overall course of events in activated and/or rapidly changing cells.

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Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Infectious diseases transmitted by arthropod vectors continue to pose a significant threat to human health worldwide. The pathogens causing these diseases, do not exist in isolation when they colonize the vector; rather, they likely engage in interactions with resident microorganisms in the gut lumen. The vector microbiota has been demonstrated to play an important role in pathogen transmission for several vector-borne diseases. Whether resident bacteria in the gut of the Ixodes scapularis tick, the vector of several human pathogens including Borrelia burgdorferi, influence tick transmission of pathogens is not determined. We require methods for characterizing the composition of the bacteria associated with the tick gut to facilitate a better understanding of potential interspecies interactions in the tick gut. Using whole-mount in situ hybridization to visualize RNA transcripts associated with particular bacterial species allows for the collection of qualitative data regarding the abundance and distribution of the microbiota in intact tissue. This technique can be used to examine changes in the gut microbiota milieu over the course of tick feeding and can also be applied to analyze expression of tick genes. Staining of whole tick guts yield information about the gross spatial distribution of target RNA in the tissue without the need for three-dimensional reconstruction and is less affected by environmental contamination, which often confounds the sequencing-based methods frequently used to study complex microbial communities. Overall, this technique is a valuable tool that can be used to better understand vector-pathogen-microbiota interactions and their role in disease transmission.

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

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Infectious diseases transmitted by arthropod vectors continue to pose a significant threat to human health worldwide. The pathogens causing these ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell type-specific fashion. AS expression patterns are typically analyzed by RT-PCR and RNA-seq using RNA samples isolated from a population of cells. In situ examination of AS expression patterns for a particular biological structure can be carried out by RNA in situ hybridization (ISH) using exon-specific probes. However, this particular use of ISH has been limited because alternative exons are generally too short to design exon-specific probes. In this report, the use of BaseScope, a recently developed technology that employs short antisense oligonucleotides in RNA ISH, is described to analyze AS expression patterns in mouse brain sections. Exon 23a of neurofibromatosis type 1 (Nf1) is used as an example to illustrate that short exon-exon junction probes exhibit robust hybridization signals with high specificity in RNA ISH analysis on mouse brain sections. More importantly, signals detected with exon inclusion- and skipping-specific probes can be used to reliably calculate the percent spliced in values of Nf1 exon 23a expression in different anatomical areas of a mouse brain. The experimental protocol and calculation method for AS analysis are presented. The results indicate that BaseScope provides a powerful new tool to assess AS expression patterns in situ.

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

An in situ hybridization (ISH) protocol that uses short antisense oligonucleotides to detect alternative pre-mRNA splicing patterns in mouse brain sections is described.

Analisi quantitativa di impionbatura alternativo Pre-mRNA nelle sezioni del cervello del Mouse usando analisi di RNA In Situ di ibridazione

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

micro-RNAs (miRNAs) are single-stranded RNA transcripts that bind to messenger RNAs (mRNAs) and inhibit their translation or promote their degradation. To date, miRNAs have been implicated in a large number of biological and disease processes, which has signified the need for the reliable detection methods of miRNA transcripts. Here, we describe a detailed protocol for digoxigenin-labeled (DIG) Locked Nucleic Acid (LNA) probe-based miRNA detection, combined with protein immunostaining on mouse heart sections. First, we performed an in situ hybridization technique using the probe to identify miRNA-182 expression in heart sections from control and cardiac hypertrophy mice. Next, we performed immunostaining for cardiac Troponin T (cTnT) protein, on the same sections, to co-localize miRNA-182 with the cardiomyocyte cells. Using this protocol, we were able to detect miRNA-182 through an alkaline phosphatase based colorimetric assay, and cTnT through fluorescent staining. This protocol can be used to detect the expression of any miRNA of interest through DIG-labeled LNA probes, and relevant protein expression on mouse heart tissue sections.

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

micro-RNAs (miRNAs) are short and highly homologous RNA sequences, serving as post-transcriptional regulators of messenger RNAs (mRNAs). Current miRNA detection methods vary in sensitivity and specificity. We describe a protocol that combines in situ hybridization and immunostaining for concurrent detection of miRNA and protein molecules on mouse heart tissue sections.

Tessuto-specifici miRNA Expression Profiling in Mouse cuore sezioni mediante ibridazione In Situ

micro-RNAs (miRNAs) are single-stranded RNA transcripts that bind to messenger RNAs (mRNAs) and inhibit their translation or promote their degradation. To ...

Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives each year. Effective treatment options able to halt disease progression are lacking. Despite the extensive sequencing efforts in large patient populations, the majority of ALS and PD cases remain unexplained by genetic mutations alone. Epigenetics mechanisms, such as the post-translational modification of histone proteins, may be involved in neurodegenerative disease etiology and progression and lead to new targets for pharmaceutical intervention. Mammalian in vivo and in vitro models of ALS and PD are costly and often require prolonged and laborious experimental protocols. Here, we outline a practical, fast, and cost-effective approach to determining genome-wide alterations in histone modification levels using Saccharomyces cerevisiae as a model system. This protocol allows for comprehensive investigations into epigenetic changes connected to neurodegenerative proteinopathies that corroborate previous findings in different model systems while significantly expanding our knowledge of the neurodegenerative disease epigenome.

This protocol outlines experimental procedures to characterize genome-wide changes in the levels of histone post-translational modifications (PTM) occurring in connection with the overexpression of proteins associated with ALS and Parkinson&#39;s disease in Saccharomyces cerevisiae models. After SDS-PAGE separation, individual histone PTM levels are detected with modification-specific antibodies via Western blotting.

Alterazioni di modificazione post-traduzionale istone caratterizzante nel lievito Neurodegenerative Proteinopathy modelli

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives ...

Use of Single Molecule Fluorescent In Situ Hybridization (SM-FISH) to Quantify and Localize mRNAs in Murine Oocytes

Current methods routinely used to quantify mRNA in oocytes and embryos include digital reverse-transcription polymerase chain reaction (dPCR), quantitative, real-time RT-PCR (RT-qPCR) and RNA sequencing. When these techniques are performed using a single oocyte or embryo, low-copy mRNAs are not reliably detected. To overcome this problem, oocytes or embryos can be pooled together for analysis; however, this often leads to high variability amongst samples. In this protocol, we describe the use of fluorescence in situ hybridization (FISH) using branched DNA chemistry. This technique identifies the spatial pattern of mRNAs in individual cells. When the technique is coupled with Spot Finding and Tracking&#160;computer software, the abundance of mRNAs in the cell can also be quantified. Using this technique, there is reduced variability within an experimental group and fewer oocytes and embryos are required to detect significant differences between experimental groups. Commercially available branched-DNA SM-FISH kits have been optimized to detect mRNAs in sectioned tissues or adherent cells on slides. However, oocytes do not effectively adhere to slides and some reagents in the kit were too harsh resulting in oocyte lysis. To prevent this lysis, several modifications were made to the FISH kit. Specifically, oocyte permeabilization and wash&#160;buffers designed for the immunofluorescence of oocytes and embryos replaced the proprietary buffers. The permeabilization, washes, and incubations with probes and amplifier were performed in 6-well plates and oocytes were placed on slides at the end of the protocol using mounting media. These modifications were able to overcome the limitations of the commercially available kit, in particular, the oocyte lysis. To accurately and reproducibly count the number of mRNAs in individual oocytes, computer software was used. Together, this protocol represents an alternative to PCR and sequencing to compare the expression of specific transcripts in single cells.

Use of Single Molecule Fluorescent In Situ Hybridization SM-FISH to Quantify and Localize mRNAs in Murine Oocytes

To reproducibly count the numbers of mRNAs in individual oocytes, single molecule RNA fluorescence in situ hybridization (RNA-FISH) was optimized for non-adherent cells. Oocytes were collected, hybridized with the transcript specific probes, and quantified using an image quantification software.