1. S. cerevisiae kültür ve Protein ifade
Not: Aβ türevleri farklı göreli toplama eğilimlerini de Aβ42 peptid (Şekil 1A) 19 (Phe19) konumunu tek bir kalıntı bir mutasyon nedeniyle sergi. Bu peptid çeşitleri bir toplama muhabir (Şekil 1)29davranan floresan yeşil protein (GFP), ile etiketlenir.
<ol><li>Maya hücreleri BY4741 ebeveyn arka plan (MATa onun3Δ1 leu2Δ0 bir araya geldi15Δ0 ura3Δ0)30ile 20 Aβ42-GFP türevleri için kodlama plazmid dönüşümü. Her plazmid GFP için GSSGSSG bağlayıcı tarafından erimiş bir Aβ42 mutant için kodlar. Plazmid pESC(-URA) ve seçilebilir işaret URA329içerir.<ol>
<li>Sentetik tam orta urasil (SC-URA) aşağıdaki bileşenleri içeren olmadan hazırlamak: 1.9 g/L Maya azot urasil, 5 g/L amonyum sülfat ve 900 mL GKD2O temel kombine ile 100 mL % 20 (w/v) glikoz.</li>
		<li>Dönüştürülmüş Maya hücreleri bir koloni % 2 glikoz içeren SC-URA orta 20 mL koymak ve kültürler gecede 30 ° C'de ajitasyon 210 devirde altında büyür.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ertesi gün, yeni Maya hücreleri kültürleri 5 mL taze SC-URA orta de aşı 100 µL gecede kültür tarafından büyümek.</li>
	<li>Bir OD590 0,5, 3000 x g 4 dk için de kültürler santrifüj kapasitesi, süpernatant atmak ve aynı birimin taze SC-URA Orta % 2 raffinose içeren hücrelerde resuspend.</li>
	<li>30 dk için 210 devirde ajitasyon altında 30 ° C'de kuluçkaya. Sonra 4 dk 3000 x g de hücreleri santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın. Taze SC-URA orta Rekombinant protein ifade ikna etmek için % 2 galaktoz içeren hücrelerde resuspend.</li>
	<li>16 h SC-URA Orta % 2 galaktoz içeren protein ifadede inducing sonra Santrifüjü 3000 x g 4 dk için de tarafından 1 mL steril microcentrifuge tüpler indüklenen hücre hasat. Not: 16 h. Induced Maya hücreleri Aβ42-GFP türevleri ifade bir indüksiyon döneminde Rekombinant protein dağıtım hücrelere (Şekil 2B) belirlemek için floresans mikroskobu tarafından görüntülenmiştir sonra en alakalı farklılıklar ortaya.</li>
</ol>2. hücre boyama
Not: Taze sigara kaynaklı hücreler bir FC çözümleme sırasında bir floresan eşiği belirlemek için bir negatif kontrol olarak gereklidir.
<ol><li>16 h kaynaklı Maya hücreleri almak ve 590 optik onların yoğunluğuna belirlemek nm (OD590). Onları steril fosfat tamponlu tuz (PBS) 0.1 OD590 için sulandırmak.<ol>
<li>1 fosfat tamponlu tuz x aşağıdaki gibi hazırlamak: NaCl, KCl, Na2HPO4, 1.44 g 0.2 g 8 g ekleyin ve KH2PO4 GKD2O. 800 ml 0,24 g doldurun 1 L-GKD2O kadar çözüm pH 7.4 için ayarladıktan sonra HCl. ile arabellek 0.2 µm filtreden filtre.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Uygun şekilde etiketlenmiş tüpler (12 × 75 mm yuvarlak alt Polistiren) ifade hücre süspansiyonlar aktarmak ve onları ışıktan korumak. Akış Sitometresi Analizi, Sigara kaynaklı ve lekeli olmayan hücreleri ile birlikte için üzerinde yüklü olması için hazır olduklarından emin olun.</li>
	<li>Her örnek 5 mikron son bir konsantrasyon, oksidatif stres sonda (Örneğin, CellROX derin kırmızı) ekleyin ve karanlıkta 30 dk 30 ° C'de hücreler kuluçkaya.</li>
	<li>Kuluçka sonra 3 kez 1 x PBS içeren hücreleri yıkama ve onları arabellek onların analiz FC tarafından daha önce aynı hacmine resuspend.</li>
</ol>3. Akış Sitometresi Analizi
Not: bir FC Kur uygun lazerler ve filtreler ile GFP ve oksidatif stres sonda floresans sinyal algılamak için kullanır. GFP tespiti için 488 nm mavi lazer ve oksidatif stres sonda floresans tespiti için 635 nm kırmızı lazer ile donatılmış bir akış sitometresi kullanılabilir. Emisyon floresans GFP ve oksidatif stres sonda edinimi yapılır 530/30 nm BP filtre ve 660/20 BP filtrenin sırasıyla (Tablo 1).
<ol><li>Yeni çalışma sayfası panelini açma tıklayın ve aşağıdaki edinme nokta araziler oluşturun.<ol>
<li>Araç çubuğundan Dağılım çizim aracı seçin ve bir komplo ile yan dağılım-alan (SSC-A) y ekseni vs üzerinde ileri dağılım alanı (FSC-A) x ekseni üzerinde doğrusal bir ölçek değişkenlerinin.</li>
		<li>Araç çubuğundan Dağılım çizim aracını tıklatın ve x ekseni vsFL1-alan (FITC) değişkenleri ile bir çizim oluşturma. Fl3-alan (APC) y ekseni Logaritmik bir ölçekte.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aletleri ayarları simgesini tıklatın. Tazminat sekmesini tıklatın ve tüm tazminat düzeyleri ayarlayın. Satın alma sekmesinde tıklatın ve kaydedilecek 20.000 olayların toplam sayısı seçin.</li>
	<li>Akış hızı düşükolarak geçmek için Akış hızı simgesini tıklatın.</li>
	<li>Sigara kaynaklı, günahı hücreleri yayınlanmaya başlaması için Al sekmesini tıklatın ve nüfus orta-sol çeyreğinde dağıtılır kadar ileri Araç ayarları ve yan dağılım gerilim ayarlayın.<ol>
<li>Hücre popülasyonu hücre artıkları dışında bir bölgesini R1 ayarlamak için Çokgen ikonuna tıklayın ve bu geçişli nüfus P1 kullanın R1 = tüm floresan nokta araziler ve çubuk grafik gösterimleri (Şekil 3).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Floresans sinyalinin Devresel_ödeme gerilimi ayarlamak için hücreleri içinde sol alt çeyrekte dağıtılır kadar kazanç Araç ayarı sekmesinde ayarlama FL1-FL3 nokta Arsa günahı hücreleri çalıştırın.</li>
	<li>Örnek GFP floresans ölçmek için indüklenen hücrelere değiştirin. Nüfus sağ alt çeyreğinde dağıtıldığında Araç ayarı sekmesinde kazanç FSC-A vs FL1 (FITC) olarak ayarlayın. Bir kapı (Gate P2) ile pozitif hücre nüfus tanımlayın.</li>
	<li>Değişiklik olmayan indüklenen için örnek bir FSC-A vs FL3 (APC) nokta arsa üzerinde floresans tarafından oksidatif stres görüntülemek için hücreleri lekeli. Hücre popülasyon sol üst çeyreğinde dağıtılır kadar kazanç ayarlayın. P3 pozitif hücre kalabalıkta bir kapı.</li>
	<li>Hücre floresans temsil etmek için iki çubuk grafik bir cenaze dört nikah çubuk grafik simge olun. Floresan yoğunluğu temsil etmek için FL1 (FITC GFP floresans temsil eden) x ekseni ise FL3 (APC) Floresan temsil eden y ekseni, P2 ve P3 nüfusu sırasıyla logaritmik bir ölçekte uygulama emin olun. Not: Histogram bindirmeleri floresans profilleri farklı Aβ türevleri ifade hücre arasındaki farkları göstermek için iyi bir yoldur.</li>
</ol>4. rekombinant Protein Immunodetection
<ol><li>Protein ifade düzeylerini belirlemek için Santrifüjü 4.000 x g 6 min için de 16 h için indüklenen maya kültürleri hasat ve hücre granül-80 ° C'de depolayın<ol>
<li>16 h PBS için Rekombinant protein ifade kendine hakim hücre resuspend. 200 µL hücre süspansiyonlar, her Aβ42-GFP mutant bir OD590 20 için hazırlayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Toplam protein fraksiyonu analiz, her mutant 100 µL Santrifüjü 14.000 x g 20 dk için de tarafından hasat ve Maya lizis arabellek Y aynı birim hücre granül resuspend-(50 mM Tris-HCl pH 8.0, % 1 DMSO, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA içeren 10 mg/mL SB3-14 (en düşük ücret istyl sulfobetaine) takıma 1 mM phenylmethylsulfonyl florür (PMSF)).<ol>
<li>Örnekleri hafif ajitasyon altında oda sıcaklığında 20 dk için kuluçkaya.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Protein özü konsantrasyon Bradford tahlil kullanarak belirleyin. % 15 akrilamid SDS-sayfa Elektroforez jel ve leke üzerine polivinilidin difluoride (PVDF) membran 100 V 60 dk için her örneğinin protein ekstresinin 5 µg yükleyin.<ol>
<li>Bir Bradford reaktifi ile Coomassie parlak mavi G-250 100 mg 50 mL % 95 etanol çözünmüş ve 100 mL % 85 (w/v) fosforik asit ekleyin hazırlayın. O zaman, boya tamamen çözüldüğünde, GKD2O 1 m'ye karışımla sulandırmak ve selüloz filtre kağıdı kullanmadan önce aracılığıyla filtre. Not: Bradford reaktifi olmak hafif kahverengi.</li>
		<li>Sığır serum albumin (BSA) 1.000 µL Bradford reaktif proteinin 5-100 µg arasında değişen bir standartta hazırlayın.</li>
		<li>1-10 µL protein Bradford reaktifi 1 mL için ayıklamak ve 5 min için oda sıcaklığında karışımı kuluçkaya ekleyin.</li>
		<li>Standartları ve protein özü örnekler, OD595absorbans ölçmek.</li>
		<li>Analiz için bir arsa için standartlar vselde absorbans değerleriyle olun. µg protein. Standart eğri dayalı, protein, miktarı üzerinden orijinal örnekleri konsantrasyonları hacmi ve seyreltme, varsa göz önünde bulundurarak belirleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Membran ile 1 x Tris arabelleğe alınmış serum fizyolojik (TBS), % 0,1 durulama ara 20 (TTBS) ve %5 (w/v) yağsız Kuru süt 1 x TTBS kullanarak engelleyiniz.<ol>
<li>10 x TBS 1 litre hazırlamak için 24 g Tris temel ve NaCl 88 g H2Odd 900 ml dağıtılması ve pH 7,6 için ayarlayın. GKD2O 1 L. son bir birime ekleme 1 x çözüm için 10 x hisse senedi, 1 kısım GKD2O. 9 parçaları ile karıştırın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Membran bir birincil β-amiloid antikor seyreltilmiş 6E10 1:1,000 ile 1 h için kuluçkaya ve ikincil antikor keçi ile Oda sıcaklığında 1 h için 1:10, 000 Anti-fare IgG-HRP eşlenik seyreltilmiş.</li>
	<li>1 mL Luminata floresan reaktif kullanarak membranlar geliştirmek ve grup tarafından densitometric analiz 5.2 adımda anlatıldığı gibi ölçmek.</li>
</ol>5. veri analizi
<ol><li>FC tarafından elde edilen verileri analiz etmek için Ortalama floresan yoğunluğu (MFI) görüntüleyen bir tablo oluşturmak ve onun karşılık gelen standart hata ve/veya GFP floresans ve oksidatif stres düzeyleri farkı (MF) katsayısı ile ortalama Floresans.<ol>
<li>Müfettiş sekmesini ve her kanal için gerekli olan istatistiksel verileri özelleştirmek için İstatistikleri simgesini tıklatın. Not: protein türevleri karşılaştırılırken, katlanır arka plan veya çözünürlük metrik (RD) Floresan veri değerleri dönüştürür: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57470/57470eq1.jpg"> Bu ölçüm, sorun örneklerinin ortalama floresans kötü örnek olduğunu, bir denetim olarak kullanılan hücre ortalama floresans ortalama denetimidir ve SD ortalama floresans standart sapmasıdır. Sadece örnekleri aynı zamanda veri yaymak için hesapları arasındaki farkı hesaplar gibi RD faktör MFI değerden daha doğru bir dizindir. Zaman içinde farklı deneyler gelen verilere karşılaştırma yürütülen bu hesaplama özellikle uygundur. RDs hesaplanan bir kez bir istatistiksel test kullanımı protein çeşitleri arasında gözlenen farklılıklar önemini onaylamak için tavsiye edilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Protein immunodetection için ImageJ yazılım kullanarak Western blot tarafından Rekombinant protein düzeyleri ölçmek.<ol>
<li>Dansitometresi analiz daha önce geliştirilen membran orijinal raw görüntüleri JPEG dosya biçimi ve gri tonlama moduna dönüştürün.</li>
		<li>Çözümle menüsünde demek grideğerine Ayarla ölçümler kısmında ayarlayın.</li>
		<li>ImageJ dikdörtgen aracını tıklatın ve grup Dansitometresi analiz için tutarlı boyutu ile bir bölgesi (ROI) ilgi tanımlamak. Membran görüntü oluşturulan dikdörtgen çerçeve içindeki her band merkezi ve ölçüm Ctrl + M (ölçü komutu) kullanarak tek tek kaydedin.</li>
		<li>Aynı YG alan uygulama her grup için bitişik yerel arka plan ölçmek. Ölçüm sonra tek tek her gruptan karşılık gelen yerel arka plan çıkarma.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Frydman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folding+of+newly+translated+proteins+in+vivo:+the+role+of+molecular+chaperones.">Folding of newly translated proteins in vivo: the role of molecular chaperones.</a> Annual Review of Biochemistry. 70, 603-647 (2001).</li><li>Hartl, F. U., Bracher, A., Hayer-Hartl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+chaperones+in+protein+folding+and+proteostasis.">Molecular chaperones in protein folding and proteostasis.</a> Nature. 475, 324-332 (2011).</li><li>Wong, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+determinants+of+selective+clearance+of+protein+inclusions+by+autophagy.">Molecular determinants of selective clearance of protein inclusions by autophagy.</a> Nature Communications. 3, (2012).</li><li>Winkler, J., Tyedmers, J., Bukau, B., Mogk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chaperone+networks+in+protein+disaggregation+and+prion+propagation.">Chaperone networks in protein disaggregation and prion propagation.</a> Journal of Structural Biology. 179, 152-160 (2012).</li><li>Glickman, M. H., Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin-proteasome+proteolytic+pathway:+destruction+for+the+sake+of+construction.">The ubiquitin-proteasome proteolytic pathway: destruction for the sake of construction.</a> Physiological Reviews. 82, 373-428 (2002).</li><li>Dobson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+out+of+shape.">Getting out of shape.</a> Nature. 418, 729-730 (2002).</li><li>Chiti, F., Dobson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+misfolding,+functional+amyloid,+and+human+disease.">Protein misfolding, functional amyloid, and human disease.</a> Annual Review of Biochemistry. 75, 333-366 (2006).</li><li>Aguzzi, A., O'Connor, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+aggregation+diseases:+pathogenicity+and+therapeutic+perspectives.">Protein aggregation diseases: pathogenicity and therapeutic perspectives.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 9, 237-248 (2010).</li><li>Rapezzi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transthyretin-related+amyloidoses+and+the+heart:+a+clinical+overview.">Transthyretin-related amyloidoses and the heart: a clinical overview.</a> Nature Reviews Cardiology. 7, 398-408 (2010).</li><li>Deas, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha-synuclein+oligomers+interact+with+metal+ions+to+induce+oxidative+stress+and+neuronal+death+in+Parkinson's+disease.">Alpha-synuclein oligomers interact with metal ions to induce oxidative stress and neuronal death in Parkinson's disease.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 24, 376-391 (2016).</li><li>Brundin, P., Melki, R., Kopito, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prion-like+transmission+of+protein+aggregates+in+neurodegenerative+diseases.">Prion-like transmission of protein aggregates in neurodegenerative diseases.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11, 301-307 (2010).</li><li>Frost, B., Diamond, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prion-like+mechanisms+in+neurodegenerative+diseases.">Prion-like mechanisms in neurodegenerative diseases.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11, 155-159 (2009).</li><li>Arrasate, M., Mitra, S., Schweitzer, E. S., Segal, M. R., Finkbeiner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inclusion+body+formation+reduces+levels+of+mutant+huntingtin+and+the+risk+of+neuronal+death.">Inclusion body formation reduces levels of mutant huntingtin and the risk of neuronal death.</a> Nature. 431, 805-810 (2004).</li><li>Ross, C. A., Poirier, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opinion:+what+is+the+role+of+protein+aggregation+in+neurodegeneration?.">Opinion: what is the role of protein aggregation in neurodegeneration?.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, 891-898 (2005).</li><li>Mishra, R., Sj&#246;lander, D., Hammarstr&#246;m, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectroscopic+characterization+of+diverse+amyloid+fibrils+in+vitro+by+the+fluorescent+dye+Nile+red.">Spectroscopic characterization of diverse amyloid fibrils in vitro by the fluorescent dye Nile red.</a> Molecular BioSystems. 7, 1232-1240 (2011).</li><li>Klunk, W. E., Jacob, R. F., Mason, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+amyloid+by+congo+red+spectral+shift+assay.">Quantifying amyloid by congo red spectral shift assay.</a> Methods in Enzymology. 309, 285-305 (1999).</li><li>Khurana, V., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+neurodegeneration+in+Saccharomyces+cerevisiae:+why+cook+with+baker's+yeast?.">Modelling neurodegeneration in Saccharomyces cerevisiae: why cook with baker's yeast?.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11, 436-449 (2010).</li><li>Tenreiro, S., Outeiro, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+is+good:+yeast+models+of+neurodegeneration.">Simple is good: yeast models of neurodegeneration.</a> FEMS Yeast Research. 10, 970-979 (2010).</li><li>Moosavi, B., Mousavi, B., Macreadie, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+model+of+amyloid-&#946;+and+Tau+aggregation+in+Alzheimer's+disease.">Yeast model of amyloid-&#946; and Tau aggregation in Alzheimer's disease.</a> Journal of Alzheimer's Disease. 47, 9-16 (2015).</li><li>Tenreiro, S., Munder, M. C., Alberti, S., Outeiro, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+the+power+of+yeast+to+unravel+the+molecular+basis+of+neurodegeneration.">Harnessing the power of yeast to unravel the molecular basis of neurodegeneration.</a> Journal of Neurochemistry. 127, 438-452 (2013).</li><li>Yang, J., Hao, X., Cao, X., Liu, B., Nystr&#246;m, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+sequestration+and+detoxification+of+huntingtin+by+the+ribosome+quality+control+complex.">Spatial sequestration and detoxification of huntingtin by the ribosome quality control complex.</a> eLife. 5, (2016).</li><li>Braun, R. J., B&#252;ttner, S., Ring, J., Kroemer, G., Madeo, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nervous+yeast:+modeling+neurotoxic+cell+death.">Nervous yeast: modeling neurotoxic cell death.</a> Trends in Biochemical Sciences. 35, 135-144 (2010).</li><li>Figley, M. D., Gitler, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+genetic+screen+reveals+novel+therapeutic+strategy+for+ALS.">Yeast genetic screen reveals novel therapeutic strategy for ALS.</a> Rare Diseases. 1, e24420 (2013).</li><li>Cooper, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha-synuclein+blocks+ER-Golgi+traffic+and+Rab1+rescues+neuron+loss+in+Parkinson's+models.">Alpha-synuclein blocks ER-Golgi traffic and Rab1 rescues neuron loss in Parkinson's models.</a> Science. 313, 324-328 (2006).</li><li>Johnson, B. S., McCaffery, J. M., Lindquist, S., Gitler, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+yeast+TDP-43+proteinopathy+model:+exploring+the+molecular+determinants+of+TDP-43+aggregation+and+cellular+toxicity.">A yeast TDP-43 proteinopathy model: exploring the molecular determinants of TDP-43 aggregation and cellular toxicity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 6439-6444 (2008).</li><li>Bharathi, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+ade1+and+ade2+mutations+for+development+of+a+versatile+red/white+color+assay+of+amyloid-induced+oxidative+stress+in+saccharomyces+cerevisiae.">Use of ade1 and ade2 mutations for development of a versatile red/white color assay of amyloid-induced oxidative stress in saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 33, 607-620 (2016).</li><li>Pallar&#232;s, I., Ventura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+the+prediction+of+protein+aggregation+propensity.">Advances in the prediction of protein aggregation propensity.</a> Current Medicinal Chemistry. , (2017).</li><li>Villar-Piqu&#233;, A., Ventura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+aggregation+propensity+is+a+crucial+determinant+of+intracellular+inclusion+formation+and+quality+control+degradation.">Protein aggregation propensity is a crucial determinant of intracellular inclusion formation and quality control degradation.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1833, 2714-2724 (2013).</li><li>Navarro, S., Villar-Piqu&#233;, A., Ventura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+against+toxic+aggregation-prone+protein+sequences+in+bacteria.">Selection against toxic aggregation-prone protein sequences in bacteria.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1843, 866-874 (2014).</li><li>Morell, M., de Groot, N. S., Vendrell, J., Avil&#233;s, F. X., Ventura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linking+amyloid+protein+aggregation+and+yeast+survival.">Linking amyloid protein aggregation and yeast survival.</a> Molecular BioSystems. 7, 1121-1128 (2011).</li><li>Conchillo-Sol&#233;, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AGGRESCAN:+a+server+for+the+prediction+and+evaluation+of+&amp;#34;hot+spots&amp;#34;+of+aggregation+in+polypeptides.">AGGRESCAN: a server for the prediction and evaluation of &amp;#34;hot spots&amp;#34; of aggregation in polypeptides.</a> BMC Bioinformatics. 8, 65 (2007).</li><li>Fernandez-Escamilla, A. M., Rousseau, F., Schymkowitz, J., Serrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+sequence-dependent+and+mutational+effects+on+the+aggregation+of+peptides+and+proteins.">Prediction of sequence-dependent and mutational effects on the aggregation of peptides and proteins.</a> Nature Biotechnology. 22, 1302-1306 (2004).</li><li>Renner, M., Melki, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+aggregation+and+prionopathies.">Protein aggregation and prionopathies.</a> Pathologie Biologie.(Paris). 62, 162-168 (2014).</li><li>Carija, A., Navarro, S., de Groot, N. S., Ventura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+aggregation+into+insoluble+deposits+protects+from+oxidative+stress.">Protein aggregation into insoluble deposits protects from oxidative stress.</a> Redox Biology. 12, 699-711 (2017).</li></ol>

Çok çeşitli hastalıklar misfolded proteinleri birikimi hücresel mevduat6,7,8,33içine bağlıdır. Birçok çabaları rapor protein konsantrasyonları almayın, Hesaplamalı yaklaşımları kullanarak bu hastalıkların başlangıcı tetiklemek moleküler mekanizmaları çözmeye gelmiş yapılmış veya vitro yaklaşımları, içinde protein konsantrasyonu reaksiyon sırasında s...

Proteostasis hücre fitness ve yaşlanma süreçlerinin temel bir belirleyici olduğunu. Hücrelerde, protein homeostazı sofistike protein kalite kontrol doğru misfolded protein conformers chaperones ve/veya onların hedeflenen proteolizis tarafından birkaç iyi korunmuş mekanizmalarıyla1 refolding emin olmak için ağlar amaçlayan tarafından yapılmaktadır ,2,3,4,5. Çok sayıda çalışmalar başlangıçlı ve geniş bir insan hastalıkları ve proteostasis, protein misfolding ve toplama için önde gelen başarısızlık arasındaki bağlantı için destek sağlar. Örneğin, protein mevduat varlığı çok nörodejeneratif hastalıkları, Alzheimer, Parkinson, gibi ve Huntington hastalıkları6,7,8patolojik damgasını olarak kabul edilir, prionogenic hastalıklar ve sigara dejeneratif amyloidoses9. Toplama tepki erken oligomeric ve protofibrillar derlemelerde diğer proteinler ile anormal etkileşim içinde kalabalık hücresel ortamı10kurulması ana elicitors, sitotoksisite, çoğu sürülmüştür. Buna ek olarak, protein kapanımlar (PI) onların toksik etkisi11,12yayılıyor hücreler arasında aktarılabilir. Bu nedenle, PI oluşumu gerçekten tehlikeli toplanan türlerin varlığı belirli konumlara hücresinde, nerede onlar olabilir işlenen veya önemli yan etkileri olmadan birikmiş kısıtlar detoxifying bir mekanizma teşkil olabilir 13 , 14.
Standart vitro biyokimyasal yaklaşımlar toplama reaksiyonlar ve onların özellikleri15,16doldurmak farklı türlerin önemli anlayışlar hazırladık. Ancak, bu deneyleri içinde kullanılan koşulları açıkça farklı hücre içinde meydana gelen ve bu nedenle, kendi fizyolojik alaka soru. Protein kalite kontrol, autophagy veya Düzenleme Ökaryotlar19,20,21 arasında hücresel redoks devlet17,18 , gibi hücresel yolları önemli korunması nedeniyle ,22,23, tomurcuklanma Maya Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) protein toplama moleküler belirleyicileri çalışmaya ayrıcalıklı basit bir hücresel model çıkmıştır ve ilişkili sitotoksik etkisini de biyolojik olarak uygun ortamlar24,25,26.
Protein toplama eğilimi doğal olarak birincil sırada kodlanmış bir özelliktir. Böylece, amiloid benzeri yapıların oluşumu kimlik ve toplama teşvik potens değerlendirilmesi dayalı tahmin edilebilir polipeptitler27bölgelerde. Ancak, protein sequences vitro toplama özelliklerini tahmin etmek için bioinformatic algoritmaları başarı rağmen bunlar hala bu eğilimlerini vivo içinde sitotoksik etki nasıl tercüme tahmini çok uzak. Belirli bir protein toplanan durumunu ve onun ilişkili hücresel hasarı arasındaki bağlantıyı sistematik bir şekilde ele alan çalışmalar Hesaplamalı bu sınırlamayı aşmak için yardımcı olabilir. Bu bağlantı yalnızca tek bir kalıntı farklı ama toplama eğilimlerini vivo içinde28sürekli bir dizi görüntüleme β-amiloid peptid Aβ42 türevleri büyük bir set yararlanarak bu da çalışmanın, yöneliktir. Maya hücreleri toplama eğilimli proteinler tarafından elde edildi oksidatif hasar için muhasebe konformasyon türler tanımlamak için FC dayalı bir yaklaşım özellikle de açıklanmıştır. Metodoloji basitlik, yüksek üretilen iş yetenekleri ve doğru nicel ölçüm gibi birçok avantaj sağlar. Bu yaklaşım o PI oksidatif strese karşı koruyucu bir rol oynar teyit mümkün kıldı.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Yeast cells BY4741&#160;</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>201388</td>
			<td>Genotype: MATa his3&#916;1 leu2&#916;0 met15&#916;0 ura3&#916;0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pESC(-Ura) plasmid&#160;</td>
			<td>Agilent Genomics</td>
			<td>217454</td>
			<td>Yeast expression plasmid with a Gal promotor. Selectable marker URA3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Y1501</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Nitrogen Base Without Amino Acids</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Y0626</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Raffinose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R7630</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7021</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Galactose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G0750</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP3991&#160;</td>
			<td>Solution 10X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellROX Deep Red Reagent&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>C10422</td>
			<td>Free radical cell-permeant fluorescent sensor, non-fluorescent while in a reduced state, and exhibits bright fluorescence upon oxidation by reactive oxygen species (ROS), with absorption/emission maxima at 644/665 nm.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-PER protein extraction reagent&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>78990</td>
			<td>Liquid cell lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide/Bis-acrylamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6050</td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford dye reagent</td>
			<td>Bio-Rad&#160;</td>
			<td>5000205</td>
			<td>Dye reagent for one-step determination of protein concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-amyloid antibody 6E10&#160;</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>803001</td>
			<td>Mouse IgG1. The epitope lies within amino acids 3-8 of beta amyloid (EFRHDS).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG-HRP conjugate&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1721011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane Immobilon-P, PVDF</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminata forte</td>
			<td>Merk</td>
			<td>WBLUF0100</td>
			<td>Premixed, ready to use chemiluminescent HRP detection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethanesulfonyl fluoride solution (PMSF)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>93482</td>
			<td>Protease inhibitor. Dissolved at 0.1 M in ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSCanto flow cytometer&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>657338</td>
			<td>Equipped with a 488&#160;nm blue laser for the detection of GFP, and 635&#160;nm red laser / 530/30 nm BP filter and 660/20 BP filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Trans-Blot Electrophoresis Transfer cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1703930</td>
			<td>Protein transference system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN Tetra Handcast Systems</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1658000FC</td>
			<td>Electrophoresis system</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of the impact of protein aggregation on cellular oxidative stress in yeast

Protein misfolding ve toplama amiloid biçimler içine başlangıçlı ve ilerleme çeşitli nörodejeneratif hastalıklar ile ilgili olduğu. Ancak, hala çok az bilgi var hakkında nasıl çözünmez protein toplamları onların toksik etkileri içinde vivouygulamayın. Basit prokaryotik ve ökaryotik canlılar, bakteri ve Maya, gibi önemli ölçüde mevcut anlayışımız mekanizmaları hücre içi amiloid dil oluşumu, toplamları yayma ve toksisite arkasında katkıda bulunmuştur. Bu protokol için maya kullanımı protein toplamları oluşumu ve hücresel oksidatif stres üzerindeki etkileri arasındaki ilişkiyi incelemek için bir model olarak tanımlanıyor. Yöntem bir amyloidogenic protein çözünür/toplanan hücre içi durumunu algılama akış sitometresi (FC) kullanarak kendi ifadeden kaynaklanan hücresel oksidatif hasar miktar ile birleştirir. Bu basit, hızlı ve nicel yaklaşımdır. Çalışma tekniği β-amiloid peptid türevleri ile onların anılan sıraya göre iç Toplama eğilimlerini büyük bir set neden hücresel oksidatif stres birleştiriliyor tarafından gösterilmektedir.

Bu iletişim kuralı 20 değişik-in nereye Phe19 için tüm doğal proteinogenic amino asitler28mutasyona uğrattı Aβ42 peptid topluluğu istihdam edileceğini açıklar. Bu proteinlerin teorik toplama eğilimlerini iki farklı bioinformatic algoritmaları (AGGRESCAN ve TANGO31,32) kullanılarak analiz edilebilir. Her iki durumda da, bu analiz ascribing, genel bir kural olarak, en yüksek değerleri hidr...

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of the Impact of Protein Aggregation on Cellular Oxidative Stress in Yeast at JoVE.com

Evaluation of the Impact of Protein Aggregation on Cellular Oxidative Stress in Yeast

Protein toplama Maya hücresel oksidatif stres üzerinde etkisi değerlendirilmesi

Protein toplama hücresel oksidatif stres ortaya çıkarır. Bu iletişim kuralı amyloidogenic proteinlerin hücre içi Birleşik ve onlarla akış sitometresi kullanarak ilişkili oksidatif stres izlemek için bir yöntem açıklanır. Yaklaşım β-amiloid peptid çözünür ve toplama eğilimli türevleri davranışını incelemek için kullanılır.

Protein misfolding and aggregation into amyloid conformations have been related to the onset and progression of several neurodegenerative diseases. ...

evaluation-impact-protein-aggregation-on-cellular-oxidative-stress

Research

JoVE Journal

Biochemistry

7.2K Görüntüleme.  Universitat Autònoma de Barcelona. Protein toplama hücresel oksidatif stres ortaya çıkarır. Bu iletişim kuralı amyloidogenic proteinlerin hücre içi Birleşik ve onlarla akış sitometresi kullanarak ilişkili oksidatif stres izlemek için bir yöntem açıklanır. Yaklaşım β-amiloid peptid çözünür ve toplama eğilimli türevleri davranışını incelemek için kullanılır.

Video: Evaluation of the Impact of Protein Aggregation on Cellular Oxidative Stress in Yeast

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this technique is also frequently referred to as immunoprecipitation. Affinity capture can be applied in a bench-scale and in a high-throughput context. When coupled with protein mass spectrometry, affinity capture has proven to be a workhorse of interactome analysis. Although there are potentially many ways to execute the numerous steps involved, the following protocols implement our favored methods. Two features are distinctive: the use of cryomilled cell powder to produce cell extracts, and antibody-coupled paramagnetic beads as the affinity medium. In many cases, we have obtained superior results to those obtained with more conventional affinity capture practices. Cryomilling avoids numerous problems associated with other forms of cell breakage. It provides efficient breakage of the material, while avoiding denaturation issues associated with heating or foaming. It retains the native protein concentration up to the point of extraction, mitigating macromolecular dissociation. It reduces the time extracted proteins spend in solution, limiting deleterious enzymatic activities, and it may reduce the non-specific adsorption of proteins by the affinity medium. Micron-scale magnetic affinity media have become more commonplace over the last several years, increasingly replacing the traditional agarose- and Sepharose-based media. Primary benefits of magnetic media include typically lower non-specific protein adsorption; no size exclusion limit because protein complex binding occurs on the bead surface rather than within pores; and ease of manipulation and handling using magnets.

Here we describe protocols to disrupt mammalian cells by solid-state milling at a cryogenic temperature, produce a cell extract from the resulting cell powder, and isolate protein complexes of interest by affinity capture upon antibody-coupled micron-scale paramagnetic beads.

Cryomilled memeli hücrelerinden protein kompleksi olan ele geçirme kapasitesini

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Biyokimya

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. Hydrogen-Deuterium Exchange (HDX) measured at rapid time scales is uniquely suited to detect structures and hydrogen bonding networks that are briefly populated, allowing for the characterization of transient conformers in native ensembles. Coupling of HDX to mass spectrometry offers several key advantages, including high sensitivity, low sample consumption and no restriction on protein size. This technique has advanced greatly in the last several decades, including the ability to monitor HDX labeling times on the millisecond time scale. In addition, by incorporating the HDX workflow onto a microfluidic platform housing an acidic protease microreactor, we are able to localize dynamic properties at the peptide level. In this study, Time-Resolved ElectroSpray Ionization Mass Spectrometry (TRESI-MS) coupled to HDX was used to provide a detailed picture of residual structure in the tau protein, as well as the conformational shifts induced upon hyperphosphorylation.

Conformational flexibility plays a critical role in protein function. Herein, we describe the use of time-resolved electrospray ionization mass spectrometry coupled to hydrogen-deuterium exchange for probing the rapid structural changes that drive function in ordered and disordered proteins.

Zaman çözülmesi elektro sprey iyonizasyon Hidrojen-döteryum Değişim Kütle Spektrometre Protein Yapısı ve Dinamikleri incelenmesi için

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages for identifying biologically active chemical structures that can modify complex phenotypes such as lifespan. Described here is a simple protocol for producing hundreds of 96-well culture plates with fairly consistent numbers of C. elegans in each well. Next, we specified how to use these cultures to screen thousands of chemicals for effects on the lifespan of the nematode C. elegans. This protocol makes use of temperature sensitive sterile strains, agar plate conditions, and simple animal handling to facilitate the rapid and high throughput production of synchronized animal cultures for screening.

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Here we describe a simple protocol for rapidly producing hundreds of nematode growth media agar, 96-well culture plates with consistent numbers of Caenorhhabditis elegans per well. These cultures are useful for the phenotypic screening of whole organisms. We focus here on using these cultures to screen chemicals for pro-longevity effects.

Yüksek işlem hacmi Caenorhabditis Elegans kimyasal tarama için basit bir yöntem

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

A Yeast 2-Hybrid Screen in Batch to Compare Protein Interactions

Screening for protein-protein interactions using the yeast 2-hybrid assay has long been an effective tool, but its use has largely been limited to the discovery of high-affinity interactors that are highly enriched in the library of interacting candidates. In a traditional format, the yeast 2-hybrid assay can yield too many colonies to analyze when conducted at low stringency where low affinity interactors might be found. Moreover, without a comprehensive and complete interrogation of the same library against different bait plasmids, a comparative analysis cannot be achieved. Although some of these problems can be addressed using arrayed prey libraries, the cost and infrastructure required to operate such screens can be prohibitive. As an alternative, we have adapted the yeast 2-hybrid assay to simultaneously uncover dozens of transient and static protein interactions within a single screen utilizing a strategy termed DEEPN (Dynamic Enrichment for Evaluation of Protein Networks), which incorporates high-throughput DNA sequencing and computation to follow the evolution of a population of plasmids that encode interacting partners. Here, we describe customized reagents and protocols that allow a DEEPN screen to be executed easily and cost-effectively.

Batch processing of yeast 2-hybrid screens allows for direct comparison of the interaction profiles of multiple bait proteins with a highly complex set of prey fusion proteins. Here, we describe refined methods, new reagents, and how to implement their use for such screens.

Bir Maya 2-melez ekran Protein etkileşimleri karşılaştırmak için bir toplu iş

Screening for protein-protein interactions using the yeast 2-hybrid assay has long been an effective tool, but its use has largely been limited to the ...

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

Many aspects of the fundamental spatiotemporal organization of cells are governed by reaction-diffusion type systems. In vitro reconstitution of such systems allows for detailed studies of their underlying mechanisms which would not be feasible in vivo. Here, we provide a protocol for the in vitro reconstitution of the MinCDE system of Escherichia coli, which positions the cell division septum in the cell middle. The assay is designed to supply only the components necessary for self-organization, namely a membrane, the two proteins MinD and MinE and energy in the form of ATP. We therefore fabricate an open reaction chamber on a coverslip, on which a supported lipid bilayer is formed. The open design of the chamber allows for optimal preparation of the lipid bilayer and controlled manipulation of the bulk content. The two proteins, MinD and MinE, as well as ATP, are then added into the bulk volume above the membrane. Imaging is possible by many optical microscopies, as the design supports confocal, wide-field and TIRF microscopy alike. In a variation of the protocol, the lipid bilayer is formed on a patterned support, on cell-shaped PDMS microstructures, instead of glass. Lowering the bulk solution to the rim of these compartments encloses the reaction in a smaller compartment and provides boundaries that allow mimicking of in vivo oscillatory behavior. Taken together, we describe protocols to reconstitute the MinCDE system both with and without spatial confinement, allowing researchers to precisely control all aspects influencing pattern formation, such as concentration ranges and addition of other factors or proteins, and to systematically increase system complexity in a relatively simple experimental setup.

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

We provide a protocol for in vitro self-organization assays of MinD and MinE on a supported lipid bilayer in an open chamber. Additionally, we describe how to enclose the assay in lipid-clad PDMS microcompartments to mimic in vivo conditions by reaction confinement.

Vitro Sulandırma Protein kalıpları üzerinde desteklenen Lipid Bilayers kendi kendini düzenleme

Many aspects of the fundamental spatiotemporal organization of cells are governed by reaction-diffusion type systems. In vitro reconstitution of such ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and functions. It gave us the opportunity to explore a multiplicity of biophysical mechanisms, e.g., how bacterial adhesins bind to host surface receptors in more detail. Among other factors, the success of SMFS experiments depends on the functional and native immobilization of the biomolecules of interest on solid surfaces and AFM tips. Here, we describe a straightforward protocol for the covalent coupling of proteins to silicon surfaces using silane-PEG-carboxyls and the well-established N-hydroxysuccinimid/1-ethyl-3-(3-dimethyl-aminopropyl)carbodiimid (EDC/NHS) chemistry in order to explore the interaction of pilus-1 adhesin RrgA from the Gram-positive bacterium Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae) with the extracellular matrix protein fibronectin (Fn). Our results show that the surface functionalization leads to a homogenous distribution of Fn on the glass surface and to an appropriate concentration of RrgA on the AFM cantilever tip, apparent by the target value of up to 20% of interaction events during SMFS measurements and revealed that RrgA binds to Fn with a mean force of 52 pN. The protocol can be adjusted to couple via site specific free thiol groups. This results in a predefined protein or molecule orientation and is suitable for other biophysical applications besides the SMFS.

This protocol describes the covalent immobilization of proteins with a heterobifunctional silane coupling agent to silicon-oxide surfaces designed for the atomic force microscopy based single molecule force spectroscopy which is exemplified by the interaction of RrgA (pilus-1 tip adhesin of S. pneumoniae) with fibronectin.

Proteinler kovalent immobilizasyon için tek molekül kuvvet spektroskopisi

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and the degradation of target proteins in live cells. By using short (pulse) radiolabeling times (&lt;30 min) and tightly controlled chase times, it is possible to label only a small fraction of the total protein pool and follow its folding. When combined with nonreducing/reducing SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and immunoprecipitation with (conformation-specific) antibodies, folding processes can be examined in great detail. This system has been used to analyze the folding of proteins with a huge variation in properties such as soluble proteins, single and multi-pass transmembrane proteins, heavily N- and O-glycosylated proteins, and proteins with and without extensive disulfide bonding. Pulse-chase methods are the basis of kinetic studies into a range of additional features, including co- and posttranslational modifications, oligomerization, and polymerization, essentially allowing the analysis of a protein from birth to death. Pulse-chase studies on protein folding are complementary with other biochemical and biophysical methods for studying proteins in vitro by providing increased temporal resolution and physiological information. The methods as described within this paper are adapted easily to study the folding of almost any protein that can be expressed in mammalian or insect-cell systems.

Here we describe a protocol for a general pulse-chase method that allows the kinetic analysis of folding, transport, and degradation of proteins to be followed in live cells.

Protein katlanması, taşıma ve canlı hücreler radyoaktif darbe Chase tarafından bozulması Analizi

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions largely depend on intracellular protein&#8211;protein interactions. Therefore, research regarding these interactions is indispensable to facilitating the understanding of physiologic processes. Co-precipitation of associated proteins, followed by mass spectrometry (MS) analysis, enables the identification of novel protein interactions. In this study, we have provided details of the novel technique of immunoprecipitation-liquid chromatography (LC)-MS/MS analysis combined with on-membrane digestion for the analysis of protein&#8211;protein interactions. This technique is suitable for crude immunoprecipitants and can improve the throughput of proteomic analyses. Tagged recombinant proteins were precipitated using specific antibodies; next, immunoprecipitants blotted onto polyvinylidene difluoride membrane pieces were subjected to reductive alkylation. Following trypsinization, the digested protein residues were analyzed using LC-MS/MS. Using this technique, we were able to identify several candidate associated proteins. Thus, this method is convenient and useful for the characterization of novel protein&#8211;protein interactions.

Here, we present a protocol for an on-membrane digestion technique for the preparation of samples for mass spectrometry. This technique facilitates the convenient analysis of protein&#8211;protein interactions.

Bir on-membran sindirim tekniği kullanılarak protein-protein etkileşimlerinin değerlendirilmesi

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...

Examining the Dynamics of Cellular Adhesion and Spreading of Epithelial Cells on Fibronectin During Oxidative Stress

The adhesion and spreading of cells onto the extracellular matrix (ECM) are essential cellular processes during organismal development and for the homeostasis of adult tissues. Interestingly, oxidative stress can alter these processes, thus contributing to the pathophysiology of diseases such as metastatic cancer. Therefore, understanding the mechanism(s) of how cells attach and spread on the ECM during perturbations in redox status can provide insight into normal and disease states. Described below is a step-wise protocol that utilizes an immunofluorescence-based assay to specifically quantify cell adhesion and spreading of immortalized fibroblast cells on fibronectin (FN) in vitro. Briefly, anchorage-dependent cells are held in suspension and exposed to the ATM kinase inhibitor Ku55933 to induce oxidative stress. Cells are then plated on FN-coated surface and allowed to attach for predetermined periods of time. Cells that remain attached are fixed and labeled with fluorescence-based antibody markers of adhesion (e.g., paxillin) and spreading (e.g., F-actin). Data acquisition and analysis are performed using commonly available laboratory equipment, including an epifluorescence microscope and freely available Fiji software. This procedure is highly versatile and can be modified for a variety of cell lines, ECM proteins, or inhibitors in order to examine a broad range of biological questions.

This method is useful for quantifying the early dynamics of cellular adhesion and spreading of anchorage-dependent cells onto the fibronectin. Furthermore, this assay can be used to investigate the effects of altered redox homeostasis on cell spreading and/or cell adhesion-related intracellular signaling pathways.

Oksidatif Stres Sırasında Fibronektin Üzerine Hücresel Adezyon Dinamiğinin İncelenmesi ve Epitel Hücrelerinin Yayılması

The adhesion and spreading of cells onto the extracellular matrix (ECM) are essential cellular processes during organismal development and for the ...

Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae

Despite recent advances in the characterization of yeast mitochondrial proteome, the submitochondrial localization of a significant number of proteins remains elusive. Here, we describe a robust and effective method for determining the suborganellar localization of yeast mitochondrial proteins, which is considered a fundamental step during mitochondrial protein function elucidation. This method involves an initial step that consists of obtaining highly pure intact mitochondria. These mitochondrial preparations are then subjected to a subfractionation protocol consisting of hypotonic shock (swelling) and incubation with proteinase K (protease). During swelling, the outer mitochondrial membrane is selectively disrupted, allowing the proteinase K to digest proteins of the intermembrane space compartment. In parallel, to obtain information about the topology of membrane proteins, the mitochondrial preparations are initially sonicated, and then subjected to alkaline extraction with sodium carbonate. Finally, after centrifugation, the pellet and supernatant fractions from these different treatments are analyzed by SDS-PAGE and western blot. The submitochondrial localization as well as the membrane topology of the protein of interest is obtained by comparing its western blot profile with known standards.

Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae

Despite recent advances, many yeast mitochondrial proteins still remain with their functions completely unknown. This protocol provides a simple and reliable method to determine the submitochondrial localization of proteins, which has been fundamental for the elucidation of their molecular functions.

Tomurcuklanan Maya Sakkaromices cerevisiae'de Submitochondrial Protein Lokalizasyonunun Değerlendirilmesi

Despite recent advances in the characterization of yeast mitochondrial proteome, the submitochondrial localization of a significant number of proteins ...