Biz personel içinde Enstitüsü, insan genetiği NGS Kütüphane hazırlık ve sıralama için teşekkür ederim. Einat Snir genomik Kütüphanesi parçaları burada yapılan Y2H plazmid Kütüphane için hazırlarken onun uzmanlık alanı için teşekkür ediyoruz. Bu eser Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenmiştir: NIH R21 EB021870-01A1 ve NSF araştırma projesi hibe: 1517110.

<ol>
	<li>Fields, S., Song, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+genetic+system+to+detect+protein-protein+interactions.">A novel genetic system to detect protein-protein interactions.</a> Nature. 340 (6230), 245-246 (1989).</li><li>Bruckner, A., Polge, C., Lentze, N., Auerbach, D., Schlattner, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+two-hybrid,+a+powerful+tool+for+systems+biology.">Yeast two-hybrid, a powerful tool for systems biology.</a> International Journal of Molecular Sciences. 10 (6), 2763-2788 (2009).</li><li>Vidal, M., Fields, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yeast+two-hybrid+assay:+still+finding+connections+after+25+years.">The yeast two-hybrid assay: still finding connections after 25 years.</a> Nature Methods. 11 (12), 1203-1206 (2014).</li><li>Pashkova, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DEEPN+as+an+Approach+for+Batch+Processing+of+Yeast+2-Hybrid+Interactions.">DEEPN as an Approach for Batch Processing of Yeast 2-Hybrid Interactions.</a> Cell Reports. 17 (1), 303-315 (2016).</li><li>Rajagopala, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+Protein-Protein+Interactome+Networks+Using+Yeast+Two-Hybrid+Screens.">Mapping the Protein-Protein Interactome Networks Using Yeast Two-Hybrid Screens.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 883, 187-214 (2015).</li><li>Weimann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Y2H-seq+approach+defines+the+human+protein+methyltransferase+interactome.">A Y2H-seq approach defines the human protein methyltransferase interactome.</a> Nature Methods. 10 (4), 339-342 (2013).</li><li>Yachie, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pooled-matrix+protein+interaction+screens+using+Barcode+Fusion+Genetics.">Pooled-matrix protein interaction screens using Barcode Fusion Genetics.</a> Molecular Systems Biology. 12 (4), 863 (2016).</li><li>Trigg, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CrY2H-seq:+a+massively+multiplexed+assay+for+deep-coverage+interactome+mapping.">CrY2H-seq: a massively multiplexed assay for deep-coverage interactome mapping.</a> Nature Methods. , (2017).</li><li>Estojak, J., Brent, R., Golemis, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+of+two-hybrid+affinity+data+with+in+vitro+measurements.">Correlation of two-hybrid affinity data with in vitro measurements.</a> Molecular and Cellular Biology. 15 (10), 5820-5829 (1995).</li><li>Rajagopala, S. V., Hughes, K. T., Uetz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Benchmarking+yeast+two-hybrid+systems+using+the+interactions+of+bacterial+motility+proteins.">Benchmarking yeast two-hybrid systems using the interactions of bacterial motility proteins.</a> Proteomics. 9 (23), 5296-5302 (2009).</li><li>James, P., Halladay, J., Craig, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+libraries+and+a+host+strain+designed+for+highly+efficient+two-hybrid+selection+in+yeast.">Genomic libraries and a host strain designed for highly efficient two-hybrid selection in yeast.</a> Genetics. 144 (4), 1425-1436 (1996).</li><li>Barbas, C. F., Burton, D. R., Scott, J. K., Silverman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+DNA+and+RNA.">Quantitation of DNA and RNA.</a> CSH Protoc. 2007, pdb ip47 (2007).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SDS-Polyacrylamide+Gel+Electrophoresis+of+Proteins.">SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis of Proteins.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (4), (2006).</li><li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets:+procedure+and+some+applications.">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li><li>Alegria-Schaffer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+blotting+using+chemiluminescent+substrates.">Western blotting using chemiluminescent substrates.</a> Methods in Enzymology. 541, 251-259 (2014).</li><li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments.">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> Journal of Visualized Experiments. (62), (2012).</li><li>Harper, J. W., Adami, G. R., Wei, N., Keyomarsi, K., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+p21+Cdk-interacting+protein+Cip1+is+a+potent+inhibitor+of+G1+cyclin-dependent+kinases.">The p21 Cdk-interacting protein Cip1 is a potent inhibitor of G1 cyclin-dependent kinases.</a> Cell. 75 (4), 805-816 (1993).</li></ol>

Yazarlar ifşa yoktur

Burada bir rehber en iyi duruma getirilmiş yöntemleri kullanarak toplu iş iş işlemde Y2H deneyleri gerçekleştirmeye ilişkin sağlamak. Halkın seçimi altında gelebileceğini söyledi Maya başlangıç Kütüphane temsilcisidir ve yeterli başlangıç Maya nüfusun bu değişkenliği sınırlamak için seçim geçmesi için kullanılan emin olmak için yordamda birkaç kritik adım vardır . Önemlisi, bu kriterler geleneksel bir Y2H yöntemi, böylece bu yaklaşım çoğu laboratuvarlar için standart moleküler biyoloji donatılmış erişilebilir yapmak için malzeme ve Yöntemler adapte yanı sıra elde nispeten kolaydır. DEEPN aynı av Kütüphane popülasyondan farklı yem plazmid kullanırken seçimi sağlar. Bu nedenle, bir yem vs. başka bir Y2H etkileşim üretmek etkileşen adayları kümesini doğrudan karşılaştırılabilir. Derin sıralama kullanıldığından, bir başlangıç Kütüphane kompozisyon her yem özel Maya nüfus için doğrulamak ve her aday av gen kütüphanede zenginleştirme bağımsız olarak izleyin. Toplu iş işleme aynı kitaplığa farklı yemler karşı bir istatistiksel sıralaması4hesaplamak sağlar yarı nicel bir şekilde sorgulama sağlar.
Bu protokol başarı için kritik olan birkaç adım vardır. Biri çok sayıda diploitler yeterli Y2H av Kütüphane gösterimi faiz her yem plazmid ile karıştırılır sağlamak için alınması gerekir. Burada açıklanan çiftleşme yordam parametreleri çeşitli değişen tarafından optimize edilmiştir. Kötü genel olarak, ancak ev ticari Y2H kütüphaneler dostum bazı suşları, 2 x 106- izlendiğinde, 2 x 107 diploitler burada anlatılan çiftleşme yordam oluşturabilirsiniz Y2H yeterli ve tekrarlanabilir transferini sağlayan bulduk nüfus kütüphaneye. Başka bir önemli bir özelliği, yordamı yem plazmid ilgi olumlu Y2H etkileşim, kendi oluşturmak değil veya boş Gal4 harekete geçirmek etki alanı ile plazmid av sağlamaktır. Y2H etkileşim seçme Yöntem onda olumlu Y2H etkileşim indükler hücreleri izin vermek için HIS3 , transkripsiyon histidin yokluğunda büyüme talep ediyor onun +. Geleneksel Y2H deneyleri arka plan büyüme azaltmak veya diğer gazetecilere3 , zayıf Y2H etkileşimleri içeren hücreleri büyüyebilir ne zaman en iyi bu yordamı çalışır ve böylece sıkılık büyüme için artan rekabet inhibitörü 3AT rutin ekleyebileceğiniz ve sadece güçlü Y2H etkileşimleri içeren hücreler için seçme belirlenebilir av plazmid repertuar sınırlar. Başka bir önemli bir özelliği başlangıç diploit nüfus büyük miktarda hata4 örnekleme evrimsel performans sorunlarını önlemek için seçici ve selektif olmayan koşullar altında büyümek için kullanılan emin olmaktır. Kültür birimleri ve hücre aşağıdaki numaraları burada belirtilen tekrarlanabilirlik sağlamak ve gürültü azaltmak yardımcı olacaktır.
DEEPN yaklaşım güçlü olmasının nedenlerinden kapsamlı bir şekilde onların yetenek faiz yem ile etkileşim için verilen AV kitaplığındaki tüm plazmid takip edebilirsiniz biri. Böylece, DEEPN sınırlamalar kullanılan kitaplık karmaşıklığı biridir. Biz kullanılan burada olanlar gibi ticari kütüphanelerin bazıları için iyi niyetli Gal4 harekete geçirmek etki alanı aynı okuma çerçevede olan ORF's 3-6 x 10 arasında cDNA parçaları kodlamak plazmid sayısını bulduk4 temsil ~ 6000 - 8,00 0 farklı genler. Biz yaklaşık %75 Bu kütüphanelerin yalnızca 3' kodlama DNA dizisi (CD/ORF) olduğunu cDNA bölgelere karşılık gelen parçaları içerdiği bulundu. Ayrıca, neredeyse üçte biri kütüphanede parçaları vardı genler bu bölgelere ORF veya ORF, ters yönde denk yoktu.
DEEPN yöntemine üç başka değişiklikler yapmış. Yeni bir MATalpha gerginlik, 'TRP1 plazmid ve o arkadaşları Y187 gibi bazı ticari olarak mevcut kütüphane içeren suşları daha iyi içinde yer alan kütüphaneler av' taşıyabilir biri. Bu ilgi her yem için Kütüphane nüfusun tam transferi sağlar. Ayrıca yeni bir 'değişken kopya 2µ tabanlı omurga10kullanın yukarıda açıklanan plazmid farklı ifade plazmid yem' yaptı. Burada biz bir düşük-kopya CEN plazmid (pTEF-GBD) tarif ve tek bir yuvarlak seçici büyüme bulmak için etkileşen av plazmid zenginleştirmek için yeterli. Son olarak, biz bir aerodinamik 'av' Kütüphane vektör inşa ve yüksek yoğunluklu parçası rasgele genomik Y2H Kütüphane Saccharomces cerevisiaeiçin hangi-meli var olmak içinde belgili tanımlık gelecek keşfetmek ve etkileşimleri amonst karakterize için yararlı üretmek için kullanılan maya proteinleri. Genel olarak, malzeme ve (eşlik eden çalışmalarında başlığı altında açıklanan) Biyoinformatik araçlarını gelişmeler, kapsamlı ve karşılaştırmalı Y2H ekranlar gerçekleştirme erişilebilir, uygun ve verimli bir şekilde yaklaşım DEEPN olun.

Hücre biyolojik süreçlerin tam bir anlayış moleküler mekanizmaları altında yatan protein etkileşim ağları bulmaya dayanır. Protein etkileşimleri tanımlamak için bir yaklaşım iki protein etki alanı ilgi bir başkasına1bind sonra işleyen chimeric transkripsiyon faktörü birleştirerek çalışır Maya 2-hibrid (Y2H) tahlil olduğunu. Tipik bir Y2H ekran etkileşen proteinler transkripsiyon harekete geçirmek için erimiş kodlama plazmidler her iki bir kütüphane evler Maya nın nüfusu oluşturularak gerçekleştirilir (Örn., 'füzyon protein av') ve protein oluşan bir verilen 'yem' plazmid bir DNA bağlayıcı etki alanına (Örneğin, Gal4 ters yönde aktive dizisine bağlar Gal4 DNA'ya bağlanıcı etki alanı) ilgi erimiş. Y2H yaklaşım ana avantajlarından biri nispeten kolay ve ucuz tipik bir laboratuarda yapmak rutin moleküler biyolojik iş2için donatılmış olmasıdır. Ancak, geleneksel olarak gerçekleştirildiğinde, bir kullanıcı seçimi olumlu Y2H etkileşimi için üzerine ortaya çıkan bireysel kolonileri örnekler. Bu ciddi bir şekilde anket Kütüphane 'av' klonlar sayısını sınırlar. Belirli bir etkileşen av bolluğu diğerleri düşük bereket av plazmid müdahalesini algılama şansı azalan göre çok yüksek olduğunda bu sorunu bileşik olduğunu.
Proteom kapsamlı kapsama Y2H ilkesini kullanarak için bir çözüm neyin bilinen tek tek av plazmid içeren bir dizi dijital olarak sorguya bir matris biçimli yaklaşım kullanımıdır. Ancak, böyle bir yaklaşım proteinler veya etki alanları3az sayıda interactome tanımlamada ilgilenen bireysel araştırmacılar için kolayca erişilebilir veya maliyet-etkin değil bir altyapı gerektirir. Ayrıca, birden çok parçaya etkileşen proteinlerin kodlamak çok karmaşık av kitaplıkları için pratik boyutları böyle matris dizileri boyutunu artıracağı. Deneyleri karmaşık kütüphaneler ile toplu olarak gerçekleştirmek ve etkileşen klon massive paralel yüksek üretilen iş sıralama4kullanan olup olmadığını değerlendirmek için bir alternatiftir. Bu tipik bir kullanarak birden çok koloniler halinde ortaya av plazmidlerin varlığı tahlil uygulanabilir Y2H biçimlendirilmiş hangi Maya hücreleri füzyon protein etkileşen bir çifti konut üzerinde plaka5,6büyümeye izin yaklaşım. Bu genel bir fikir sorgu her iki birden fazla yem artırmak ve bileşenleri aynı saat7,8av vurgulu.
Yine de, birçok araştırmalar daha kolay bir henüz daha fazla çaba sadece birkaç protein 'yemler üzerinde' odaklı gerektirir ve daha ayrıntılı ve yarı kantitatif sorgusu, bir tek karmaşık av kütüphane tarafından yararlanabilir. Biz geliştirdik ve geniş ölçekli protein etkileşim çalışmaları toplu biçimi4' te bir Y2H ilkesini kullanarak gerçekleştirmek için bir yaklaşım doğrulanmış. Bu belirli av plazmid genişleme hızı Y2H etkileşim9göreli gücü için bir proxy sunucu olarak kullanır. Bir nüfus içinde tüm plazmid derin sıralama için normal büyüme tabi veya seçici büyüme koşulları üreten güçlü ve zayıf Y2H etkileşimleri verim klonların tam bir harita. İnteractors repertuar elde edilen ve doğrudan birden fazla yem plazmid karşılaştırılır. DEEPN (Protein ağları değerlendirme için dinamik zenginleştirme) olarak adlandırdığı elde edilen iş akışı böylece fark interactomes proteinler, vs. başka bir protein arasında karşılaştırma izin tanımlamak için aynı av kitaplıklarındaki tanımlamak için kullanılabilir.
Burada, biz DEEPN göstermek ve hangi Şekil 1' de özetlenen onun kullanımını kolaylaştırmak laboratuvar yöntemleri gelişmeler tanıtmak. Önemli iyileştirmeler şunlardır:
Av Maya nüfus nesil. Bir DEEPN anahtar gereksinimleri Maya plazmid av kütüphanelerin aynı dağıtım var farklı yem Plasmid'ler ile nüfus oluşturuyor. Av plazmid Kütüphane eşdeğer taban çizgisi nüfus farklı yemler interactomes arasında doğru karşılaştırmaları yapmak için gereklidir. Bu en iyi zaman bir kütüphane plazmid zaten haploit Maya nüfus içinde yer alan ve verilen yem plazmid nüfus hareketli bir diploid üretmek için çiftleşme tarafından elde elde edilir. Burada, nasıl böyle nüfus haploit Maya yer alan ticari kitaplıklarını kullanma yapmak bir net rehber sağlamak. Her ne kadar diploitler yüksek bir sayı üretmek yöntemleri bulduk, bu ticari kitaplığı içeren maya suşları genel çiftleşme verimliliğini düşüktü. Bu nedenle, biz tepki çiftleşme başına çok daha fazla diploitler verimleri av kitaplıkları ev yeni bir yük inşa.
Yeni yem plazmidler ayarla. Oluşan 'yem' füzyon protein faiz ve DNA'ya bağlanıcı etki alanı protein Hızlı birçok geçerli plazmid 2µ onları onların kopya sayısını yükseltmek için izin, tabanlıdır. Bu kopya sayısı oldukça değişken nüfus ve değişkenlik Y2H transkripsiyon yanıt yol. Bu sırayla yetenek seçimi altında hücre büyüme yanıtı dayalı bir verilen protein etkileşimin gücünü ölçmek için çarpık. Bu kısmen bazıları daha önce piyasada bulunan pDEST3210gibi tarif var bir düşük kopya plazmid kullanarak adres olabilir. Biz Gal4 DNA'ya bağlanıcı etki alanı füzyon proteinler de yem parçaları her iki akıntıya karşı klonlama sağlar Kanr direnç geni taşıyan bir TRP1 düşük kopya şeması tabanlı plazmid içinde üreten yeni bir yem plazmid (pTEF-GBD) inşa ve Gal4 DNA'ya bağlanıcı etki alanının aşağı akım.
Yeni yüksek yoğunluklu Y2H parçasını kitaplık. Biz ev Y2H av kitaplıklara yeni bir plazmid inşa ve rastgele yamultulmuş genomik DNA parçaları Saccharomyces cerevisiaeyapılan son derece karmaşık bir Y2H kütüphane oluşturmak için kullanılır. Dizi analizi bu kitaplığın 1 milyondan fazla farklı elemanları, yukarıda açıklanan Maya genomik Y2H plazmid kitaplıkları11çok daha karmaşık olduğunu göstermiştir. Bu yeni kütüphane ile DEEPN iş akışı karmaşık kütüphaneleri güvenilir ve tekrarlanabilir bir şekilde pek çok farklı Plasmid'ler ile karşılamak için güçlü olduğunu göstermek başardık.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Illumina HiSeq 4000</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td>deep sequencing platform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal anti-HA antibodies</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>901514</td>
			<td>Primary Antibody to detect expression of HA in pGal4AD constructs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal anti-myc antibodies</td>
			<td>QED Biosciences Inc</td>
			<td>18826</td>
			<td>Primary Antibody to detect expression of MYC in pTEF-GBD constructs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NarI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0191S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRI-HF</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R3101S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BamHI-HF</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R3236S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XhoI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0146S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Glycol 3350, powder</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>U2211-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salmon Sperm DNA</td>
			<td>Trevigen, Inc sold by Fisher Scientific</td>
			<td>50-948-286</td>
			<td>carrier DNA for yeast transformation section 3.2.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin Monosulfate</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>K22000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LE Agarose</td>
			<td>GeneMate</td>
			<td>E-3120-500</td>
			<td>used for making DNA agarose gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>S23025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>T60060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sorbitol</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>S23080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium Acetate Dihydrate</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>155256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>C79</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA Sodium Salt</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>E57020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract Powder</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>Y20020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Nitrogen Base (ammonium sulfate) w/o amino acids</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>Y20040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSM-Trp-Leu+40ADE</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>DCS0789</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSM-Trp-Leu-His+40ADE</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>DCS1169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSM-Leu-Met</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>DCS0549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSM-Trp-Met</td>
			<td>Bio 101, Inc</td>
			<td>4520-922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Methionine</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>DOC0168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenine</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>A11500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>G32045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>BD</td>
			<td>214010</td>
			<td>used for making media plates in section 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>P20240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-amino-1,2,4 Triazole</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoehanol (BME)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymolyase 100T</td>
			<td>USBiological</td>
			<td>Z1004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol:Chloroform:IAA</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>238074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Decon Laboratories, INC</td>
			<td>2716</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse A</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>EN0531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>U20200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>L22010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15506-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bromophenol blue</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>449</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibson Assembly Cloning Kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E5510S</td>
			<td>Rapid assembly method for cloning of plasmids in section 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master Mix</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0541S</td>
			<td>Used for amplification of products for Gibson Assembly in Section 2.3 as well assample preparation for DEEPN deep sequencing in section 6.2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium Bromide</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0492-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR purification kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td>Used for purification of pcr products in section 6.2.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiaquick DNA Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td>Used for purification of digested pTEF-GBD in section 2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA Hyper Prep kit</td>
			<td>KAPA Biosystems</td>
			<td>KK8500</td>
			<td>preparation kit for deep sequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Codon optimization</td>
			<td>http://www.jcat.de</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Codon optimization</td>
			<td>https://www.idtdna.com/CodonOpt</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gBlocks</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td></td>
			<td>DNA fragments used for cloning in Section 2.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strings</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td></td>
			<td>DNA fragments used for cloning in Section 2.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenCatch Plasmid DNA mini-prep Kit</td>
			<td>EPOCH Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td>Used to prepare quantities of DNA in Section 2.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Covaris E220</td>
			<td>Covaris</td>
			<td></td>
			<td>high performance ultra-sonicator in section 7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligo nucelotide 5&#8217;- CGGTCTT 
			CAATTTCTCAAGTTTCAG -3&#8217;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies or Thermofisher</td>
			<td></td>
			<td>used for pcr amplification and sequencing 5&#39; insert pTEF-GBD during plasmid construction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligo nucelotide 5&#8217;-GAGTAACG 
			ACATTCCCAGTTGTTC-3&#8217;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies or Thermofisher</td>
			<td></td>
			<td>used for pcr amplification and sequencing 5&#39; insert pTEF-GBD during plasmid construction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligo nucelotide 5&#8217;-CACCGTAT 
			TTCTGCCACCTCTTCC-3&#8217;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies or Thermofisher</td>
			<td></td>
			<td>used for pcr amplification and sequencing 3&#39; insert pTEF-GBD during plasmid construction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligo nucelotide 5&#8217;-GCAACCGC 
			ACTATTTGGAGCGCTG-3&#8217;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies or Thermofisher</td>
			<td></td>
			<td>used for pcr amplification and sequencing 3&#39; insert pTEF-GBD during plasmid construction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligonucleotide 5&#8217;-GTTCCGATG 
			CCTCTGCGAGTG-3&#8217;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies or Thermofisher</td>
			<td></td>
			<td>5&#39; Pimer used for insert amplification of pGAL4AD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligonucelotide 5&#8217;-GCACATGCT 
			AGCGTCAAATACC-3&#8217;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies or Thermofisher</td>
			<td></td>
			<td>3&#39; Pimer used for insert amplification of pGAL4AD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligonucelotide 5&#8217;-ACCCAAGCA 
			GTGGTATCAACG-3&#8217;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies or Thermofisher</td>
			<td></td>
			<td>5&#39; Pimer used for insert amplification of pGADT7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligonucelotide 5&#8217;- TATTTAGA 
			AGTGTCAACAACGTA -3&#8217;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies or Thermofisher</td>
			<td></td>
			<td>3&#39; Pimer used for insert amplification of pGADT7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PJ69-4A MatA yeast strain</td>
			<td>http://depts.washington.edu/yeastrc/ James P, Halladay J, Craig EA: Genomic Libraries and a host strain designed for highly efficient two-hybrid selection in yeast. GENETICS 1996 144:1425-1436</td>
			<td></td>
			<td>MATA leu2-3,112 ura3-52 trp1-901 his3-200 gal4D, gal80D, GAL-ADE2 lys2::GAL1-HIS3 met2::GAL7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pTEF-GBD</td>
			<td>Dr. Robert Piper Lab</td>
			<td></td>
			<td>Gal4-DNA binding doimain expression plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLY5725 MATalpha yeast strain</td>
			<td>Dr. Robert Piper Lab</td>
			<td></td>
			<td>MATalpha his3&#8710;1 leu2&#8710;0 lys2&#8710;0 ura3&#8710;0 gal4&#8710; trp1&#8710; Gal80&#8710;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGal4AD (pPL6343)</td>
			<td>Dr. Robert Piper Lab</td>
			<td></td>
			<td>Gal4-activation domain expression plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm petri dishes</td>
			<td>Kord-Vallmark sold by VWR</td>
			<td>2900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>125 mL PYREX Erlenmeyer flask</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S63270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 mL PYREX Erlenmeyer flask</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S63271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,000 mL PYREX Erlenmeyer flask</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S63274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,000 mL PYREX Erlenmeyer flask</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S63275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 X 150 mm Disposable Culture Tube</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>14-961-33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipet-aid</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>4-000-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Serological Pipette</td>
			<td>Denville</td>
			<td>P7127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Serological Pipette</td>
			<td>Denville</td>
			<td>P7128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL Serological Pipette</td>
			<td>Denville</td>
			<td>P7129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,000 mL PYREX Griffin Beaker</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-540P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,000 mL PYREX Reuasable Media Storage Bottle</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-414-1D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,000 mL graduated cylinder</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-572-6G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax 190</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>used to measure the Optical Density of cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td>Spectrophotometer used to quantify amount of DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic UV transilluminator</td>
			<td>Ultra Lum</td>
			<td>MEB 20</td>
			<td>used to visualize DNA in an Ethidium Bromide agarose gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1000 Gilson PIPETMAN</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>F123602G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P200 Gilson PIPETMAN</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>F123601G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P20 Gilson PIPETMAN</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>F123600G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P10 Gilson PIPETMAN</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>F144802G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1250 &#181;L Low Retention Pipette Tips</td>
			<td>GeneMate</td>
			<td>P-1236-1250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;LLow Retention Pipette Tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10017-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L XL Low Retention Pipette Tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10017-042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>490001-627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>490001-621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell scraper</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>TC9310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Microcentrifuge tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1615-5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Fluka Analytical</td>
			<td>318949-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>5674-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wooden applicators</td>
			<td>Solon Care</td>
			<td>55900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf microcentrifuge 5424</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-400-005</td>
			<td>microcentrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall ST16R</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75004381</td>
			<td>benchtop centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham ECL Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab (from donkey)</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>NA934-1ML</td>
			<td>Secondary Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham ECL Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (from sheep)</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>NA931-1ML</td>
			<td>Secondary Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>34080</td>
			<td>ECL detection solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotemp Incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mutitron 2</td>
			<td>INFORS HT</td>
			<td></td>
			<td>Shaking incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotemp Digital-Control Water Bath Model 205</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>water bath</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y2H mouse cDNA library in Y187 (pan tissue)</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>630482</td>
			<td>commercially available cDNA Library</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y2H mouse cDNA library in Y187 (mouse brain)</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>630488</td>
			<td>commercially available cDNA Library</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGADT7 AD Vector</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>630442</td>
			<td>commercially available AD Vector housing many cDNA libraries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGBKT7 DNA-BD Vector</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>630443</td>
			<td>commercially available DNA-BD Vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biolase DNA Polymerase</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-21042</td>
			<td>DNA polymerase used for section 2.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneMate GCL-60 Thermal Cycler</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td>P-6050-60</td>
			<td>pcr machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TempAssure 0.5 mL PCR tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1405-8100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a yeast 2-hybrid screen in batch to compare protein interactions

Maya 2-hibrid tahlil kullanarak protein-protein etkileşimleri için tarama uzun etkili bir araç olmuştur ama kullanımı büyük ölçüde son derece etkileşen adaylar Kütüphanesi'ndeki zenginleştirilmiş yüksek benzeşme interactors keşfi için sınırlı olmuştur. Geleneksel bir biçimde düşük benzeşme interactors bulunduğu düşük sıkılık yürütülen çözümlemek için çok fazla kolonileri Maya 2-hibrid tahlil yol açabilir. Ayrıca, farklı yem plazmid karşı aynı Kütüphanesi bir kapsamlı ve eksiksiz sorgulama karşılaştırmalı bir analiz elde edilemez. Her ne kadar bazı bu sorunları dizilmiş av kütüphaneleri kullanarak ele alınabileceği böyle ekranlar çalışması için gereken altyapı ve maliyetini engelleyici olabilir. Alternatif olarak, aynı anda geçici düzinelerce ortaya çıkarmak için Maya 2-hibrid tahlil adapte olması ve bir strateji kullanarak tek bir ekran içinde statik protein etkileşimler olarak adlandırdığı DEEPN (dinamik zenginleştirme değerlendirme Protein ağları için), hangi yüksek işlem hacmi DNA sıralama ve hesaplama etkileşen ortakları kodlamak plazmid nüfusu evrimi takip içerir. Burada, özelleştirilmiş reaktifler ve kolayca ve uygun maliyetli yürütülecek bir DEEPN ekran izin iletişim kurallarını açıklar.

Y2H tahlil protein: protein etkileşimleri bulmak için yaygın olarak kullanılmaktadır ve çeşitli uyarlamalar ve sistemleri geliştirilmiştir. Çoğunlukla, bu önceki yaklaşımlar ile başarı sağlamak aynı konuları DEEPN için önemlidir. Bazı önemli kriterler şunlardır: Füzyon protein, sahte düşük bir arka plan onun + ilgi bir boş av plazmid, yem yüksek bir çiftleşme verimliliği ile yem içeren diploitler artış sağlanması ifade DNA'ya bağlanıcı etki alanının sağlanması MATA Maya ile Kütüphane içeren içeren MATalpha Maya ve son olarak, birçok olumlu Y2H reaksiyonlar için seçin koşullar altında büyümeye nüfus izin düşük-sıkılık koşullar hatta olanlar o üretmek düşük seviyelerde His3 etkinliği ve zayıf bir Y2H transkripsiyon yanıt.
DEEPN kritik yönlerini tekrarlanarak Y2H Kütüphane farklı yem plazmid içeren suşları tanıtmak ve güvenilir bir şekilde bu nüfus için olumlu Y2H etkileşim oluşturduğunuzda bu kütüphane plazmid seçmek için biridir. Farklı başlangıç popülasyonlar arasında yeterli tüm kitaplığı transferini sağlamak daha zor olduğundan Y2H Kütüphane karmaşıklığını artırır daha zor olur. Buna ek olarak, seçimi koşulları ve sıralama derinliği altında büyümeye seçilen nüfus büyüklüğü güvenilir gerçek pozitif Y2H etkileşimleri tanımlamak için Y2H plazmid bileşiminde tekrarlanabilir değişiklikleri gözlemlemek için yeterli büyüklükte olması gerekecek. Önceki çalışmalarda piyasada bulunan Y2H cDNA kitaplıkları kullanılır. Biz Y2H Kütüphane dağıtım aynı yem plazmid taşıyan ayrı nüfus arasında değişkenlik seçimden önce iki ilk nüfus arasında bir overdispersion ile düşük bulundu < 0,01 genellikle ve 0,35 - 0,55 ayrı nüfus sonra seçimi4. Ancak, bazı bu piyasada bulunan Y2H kütüphanelerin karmaşıklığı oldukça düşüktür (Şekil 7). Buna ek olarak, çoğu (~ %60) içinde klonların tamamen 3' daha da onların yeni sınırlar kodlama bölgesi olan cDNA parçaları yapılır. Yukarıdaki yöntemler daha karmaşık Y2H kütüphaneler accomodating yeteneğine sahip olduğu, biz yeni Y2H oluşturulan bir kütüphane akıcı 'av' plazmid vektörde göstermek için (pGal4AD) içeren Saccaromyces cerevisiae (zorlanma dan genomik DNA'ın parçaları PLY5725). Genomik DNA SacCer_TAB Y2H kitaplığı (Şekil 8) oluşturmak için adaptörler ile değiştirilmiş ve pGal4AD eklenen 600-1500 BP, aralıklar için seçilen kesme, boyutu tarafından parçalanmış. Kütüphanede sonra yalnız pTEF-GBD plazmid taşıyan PJ69-4A MATA örnekleri ayırmak için şeklindeki bir Maya nüfus üretilen PLY5725 dönüştü. Yinelenen diploit nüfus non-selektif ve seçici koşullar altında yetiştirilmiştir. Y2H plazmid kitaplığı ekler derin sıralama tarafından analiz edildi. Ne zaman 100 kapsayan genomik DNA eşlenen kan basıncı upstream ve downstream bölge (tüm genom % 84) desteği her protein bulduk > Maya ~1.35 milyon farklı kütüphanede bir tahmini toplam boyutu için kütüphanede 1.1 milyon farklı plazmid Plazmid. Bir karşılaştırma, biz de bir yukarıda açıklanan Maya genomik Y2H Kütüphane11 (PJ_C1, C2, C3 Y2H Kütüphane)'MATalpha Maya değiştirdi ve yukarıdaki gibi aynı analiz tabi. Rasgele parçası Maya Y2H Kütüphane karmaşıklığı çok daha yüksek ve çok daha fazla plazmidler her gen daha önceden yayınlanmış Kütüphane (Şekil 9) çerçeve parçaları kodlama vardı bulduk. Önemlisi, ilk Kütüphane diploit nüfus içeren nesil bir overdispersion çok tekrarlanabilir < 0,01 (Şekil 10). Ayrıca, iki ayrı Maya nüfus sahip tekrarlanabilirlik üretmek plazmid benzer yapılan sonra olumlu Y2H etkileşimleri için seçme 0,3 bir overdispersion verimli çok iyi oldu. Böylece, yöntemleri burada daha büyük Y2H kütüphaneler daha önce kullanılan daha yüksek karmaşıklık karşılamak.
DEEPN kolaylığı artırmak açısından, biz yapmak gen sentez kullanarak faiz yem protein için kodlama ekler tercih ederim. Bu Kodlayıcı bölgeler protein etki alanları, chimeras ve kolayca Y2H yem plazmid dahil olacak mutantlar için verir, ancak aynı zamanda onların kodon S. cerevisiaeifade için optimize sağlar. İki farklı Gal4 DNA'ya bağlanıcı etki alanı füzyon protein ifadesi Şekil 3' te gösterilmiştir. İki yem füzyon protein birini ifade iki farklı Maya transformants kurumlara ve SDS-sayfa ve anti-myc antikorlar ile immunoblotting tabi. Not ifade Gal4 DNA'ya bağlanıcı etki alanı boş vektör yalnız göre yem proteinlerin seviyeleri. Bulduk sadece yem füzyon proteinin ifade doğrulamak için aynı zamanda ifade genişletmek ve av kitaplığı içeren Maya için dostum için kullanılan tam MATA Maya transformant koloni doğrulamak için önemlidir. Bir kez bir transformant tespit etti, aşağı dondur ve daha sonra kullanmak üzere saklamak mümkündür.
Şekil 4 nerede bir seri seyreltme diploit hücrelerinin kaplama CSM-Leu-Trp (+ onun), kendi kendine harekete geçirmek için bir test gösterir CSM-Trp-Leu-O'nun (-onun) ve CSM-Trp-Leu-onun + 3AT (-onun + 3AT) tabaklar ve 30 ° C'de 3 gün boyunca büyümeye izin. İstenilen sonuç büyüme gözlemlemektir varlığı ancak histidin bakılmaksızın yokluğu 3AT olduğunu. Bu CSM-Trp-Leu-O'nun için Maya olumlu Maya 2-hibrid etkileşim ile seçmek için kullanımına izin verir. CSM-Leu-Trp-O'nun plakalar üzerinde büyüme ise, o zaman bir Y2H seçim hala büyüme engeller 3AT en düşük konsantrasyon kullanılarak elde edilebilir. Biz büyüme CSM-Trp-Leu-O'nun + 0.1 mM 3AT bloke edilebilir, sonra DEEPN tahlil Y2H etkileşimleri için seçmek için bu durum kullanarak devam edebilirsiniz olduğunu bulmak. Ancak, pGal4AD veya diğer boş av plazmid ve pTEF GBD yem füzyon plazmid içeren diploitler büyüme inhibisyonu 3AT daha yüksek konsantrasyonlarda gerektiriyorsa, DEEPN yordam ve farklı yem plazmid performansını uzlaşma olacak alınmalı. Onun + büyüme pozitif Y2H etkileşimi için tek seçim olduğuna dikkat edin. Biz bu Y2H etkileşimleri toplu iş iş iş için zenginleştirmek için yeterli bulduk.
DEEPN iş akışı içinde en önemli yordamlardan birini Y2H av Kütüphane taşıyan MATalpha Maya ile yem plazmid taşıyan MATA Maya yüksek verim çiftleşme ulaşmaktır. Biz piyasada bulunan cDNA kitaplıkları konut bazı suşları (Örneğin, Y187)18, bulundu, nispeten yoksul çiftleşme verimlilik. Bu nedenle, biz Y2H kitaplıklar taşımak büyük bir yük mühendislik. Bu zorlanma BY4742, S288c bir türevi dayanmaktadır. Bu zorlanma GAL4, GAL80, TRP1, LEU2ve HIS3yoksun. Bir hibrid Gal4 protein ne de (Örneğin, LexA-VP16) farklı bir melez duyarlı yok gazetecilere içerir. Bunun yerine, Y2H kaynaklı His3 üretim kaynak belirli yem plazmid taşıyacak MATA zorlanma içinde yer alır. Bu sistem basitleştirir ve bir daha fazla esneklik aynı kitaplığı içeren MATalpha hücreler LexA-yem füzyon proteini ve LexA(UAS) -HIS3 muhabir veya Gal4-DBD-yem füzyon protein ve bir Gal4 ifade bir gerilme ile çiftleşmek için kullanabilirsiniz sağlar (UAS)-HIS3 muhabir.
Bir kez bir yem plazmid ve Kütüphane taşıyan diploit nüfus oluşturulur, onlar seyreltilmiş ve adil seçme koşullar altında her iki plazmid (Örneğin, CSM-Trp-Leu) veya plazmit ve olumlu Y2H etkileşim için büyümeye izin bu His3 üretim sürücüler (Örneğin, CSM-Leu-Trp-O'nun). İle başlayan bir evrimsel 'Bu darboğaz' önlemek için başlangıç nüfusun büyük miktarda pozitif Y2H etkileşimi için seçimden sonra sonuç nüfus çarpık önemlidir. Böylece, bizim yordamı 750 mL taze CSM-Leu-Trp-O'nun medya bu sorunu önlemek için yetiştirilmeye 500 mL diploit nüfus kültürünün dışında 20 mL kullanarak belirtir. PTEF-GBD ile yem plazmid olarak, biz bir turu seyreltme ve büyüme bilgilendirici bir popülasyon gelişmeye için yeterli olduğunu ortaya koymuştur. Daha önce farklı yem plazmid kullanarak, seyreltme ve büyüme, 750 mL, içine bir ilk 20 mL iki tur kullandık ve 75 mL sulandırılmış kültür bundan 2 mL doymuş. Şekil 6 Kütüphane ekler seçici olmayan koşullar altında yanı sıra birinci ve ikinci ardışık yuvarlak seyreltme ve büyüme seçici durumu için iki farklı yetiştirilen diploit nüfus için PCR güçlendirme sonuçlarını gösterir Plazmid yem. Seçim ile orada PCR ürünlerinin genelleştirilmiş bir smear parçaları karmaşık ve nispeten iyi normalleştirilmiş karışımı gösterge açıktır. Seçim, bu modeli, tek tek grup ayırt edilebilir böylece büyük ölçüde zenginleştirici bazı türler ile değiştirir. Bantlama bir ölçüde başarılı denemeleri defa yapılan normaldir, henüz bir karalama desen bir bantlama deseni yerine veya ek olarak av ekler karmaşık bir karışımı göstergesidir ve bir aday sayısı en üst düzeye çıkarmak istiyorsa arzu edilir DEEPN algılar. PCR ürünün en bulunduğu 1-3 bantlarında, çok güçlü bantlama deseni sıralama veri çoğunu yalnızca 1-3 av ekler tarafından hakim olacağını gösterir. Biri bunun için kısmen bu örnekten daha fazla okuma ithaf tarafından telafi edebilirsiniz. Bir nüfus seyreltilmiş ve daha fazla (bkz. Şekil 5' seçilen d2') yetiştirilen, bantlama deseni daha belirgin, belirli bir kaç av ise zayıf ama otantik Y2H etkileşimleri veriyor plazmid azalır bu av gösteren görebilirsiniz Plazmid onların bereket artmaktadır. Art arda gelen seyreltme ve büyüme bu aşırı düzeye ters potansiyel adaylar ve bu nedenle burada protokolü ile en büyük sayı yakalamak amacı için kabul, biz tavsiye seyreltme ve büyüme bir tur var olmak kullanılmış.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57801/57801fig1.jpg"> Şekil 1: iş akışının DEEPN şematik. Laboratuvar işlemleri genel hatları ile birlikte ilgili görevi tamamlamak için gereken yaklaşık zaman soldaki gösterilmiştir. Sağ tarafta, DEEPN ve Stat_Maker yazılım paketleri kullanarak Biyoinformatik akışıdır. <a href="/files/ftp_upload/57801/57801fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57801/57801fig2.jpg"> Resim 2: pTEF-GBD şematik. TRP1-düşük kopya Gal4 DNA'ya bağlanıcı etki alanı füzyon protein ifade plazmid içeren gösterilir. O şekil bir bünye TEF1 organizatörü, myc epitope etiketi, Gal4 DNA bağlayıcı etki T7 RNA polimeraz bağlama sitesi, polylinker ve PRM9 Sonlandırıcı bir şeması (CEN) içinde takip-plazmid dayalı. Bu plazmid da sefaloridin direnç ve çoğaltma ColE1 bakteriyel kökenli taşır. <a href="/files/ftp_upload/57801/57801fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57801/57801fig3.jpg"> Şekil 3: ifade Gal4-yem füzyon proteinlerin. Lysates pTEF-GBD içinde ifade Gal4 DNA'ya bağlanıcı etki alanına erimiş farklı yem proteinler ifade Maya dan SDS-sayfa ve anti-myc antikorlar ile immunoblotting tabi tutuldu. pTEF-GBD sadece Gal4-DNA-bindng alan'ın yalnız ifade eder; pTEF-GBD-bait1 bir RhoA C-terminal prenilasyon sitesinde eksik ve bir mutasyon GTP bağlı uyum kilitleyerek konut için erimiş Gal4-DNA-bindng etki alanı ifade eder; pTEF-GBD-bait2 bir RhoA C-terminal prenilasyon sitesinde eksik ve bir GSYİH bağlı uyum kilitleyerek bir mutasyon konut için erimiş Gal4-DNA-bindng etki alanı ifade eder. <a href="/files/ftp_upload/57801/57801fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57801/57801fig4.jpg"> Şekil 4: kendi kendine harekete geçirmek test Belirtilen yem plazmid taşıyan PJ69-4A hücreleri ve PLY5725 hücreleri belirtilen av plazmid taşıyan yapılmış diploitler seri olarak seyreltilmiş ve CSM-Leu-Trp tabaklar, CSM-Leu-Trp-O'nun plakaları ve CSM benekli-Leu-Trp-onun + 3AT plakaları ve 3 gün için yetiştirilen 30 ° C Çiftleşme için kullanılan PJ69-4A transformants Şekil 3' te gösterilen her çifti ilk edildi. <a href="/files/ftp_upload/57801/57801fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57801/57801fig5.jpg"> Şekil 5: Y187 vs PLY5725 verimliliğini çiftleşme. PJ69-4A bir TRP1içeren arasında çiftleşme tepki-yem vektör ve Y187 veya PLY5725 taşıma av plazmid içeren gerçekleştirilen. 1:10,000 dilutions diploitler için seçmek için CSM-Trp-Leu üzerine kaplama. PLY5725 gerilme Y187 gerilme ~ 10 kat daha fazla kolonileri üretilen ile daha yüksek bir çiftleşme verimliliği gösterir. <a href="/files/ftp_upload/57801/57801fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57801/57801fig6.jpg"> Şekil 6: PCR av kitaplığı ekler. DNA diploit Maya seçici olmayan koşullarda (CSM-Leu-Trp medya) büyüdü bir av kitaplığı içeren yalıtılmış veya koşulları için bir olumlu Y2H etkileşim (CSM-Leu-Trp-O'nun medya) seçerek. PCR Kütüphane arasında seçili ekler repertuar farklılıkları ortaya ekler. İki tur seçime bağlı büyüme kullanılmıştır. Seçici CSM-Leu-Trp medya 750 mL ve seçici büyüme (d1) bir ilk turu için CSM-Leu-Trp-O'nun medya 750 mL içine başka bir 20 mL içine diploit kültür 500 mL 20 mL sulandrarak yapılan büyüme ilk turunda. Bu büyüme (d2) d1 kültür 2 mL alarak ve seçmeli medya 75 mL sulandrarak yapılan ek bir tur izledi CSM-Leu-Trp-O'nun. <a href="/files/ftp_upload/57801/57801fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57801/57801fig7.jpg"> Şekil 7: karmaşıklık Y2H cDNA Kütüphanesi. Ticari olarak mevcut fare cDNA Y2H av kitaplıkları içerik analizi: cDNA fare beyin ve birden çok fare doku birinden bir kütüphaneden. <a href="/files/ftp_upload/57801/57801fig7large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57801/57801fig8.jpg"> Şekil 8: Y2H Maya genomik parça Kütüphanesi nesil. A. Maya genomik parçası Kütüphane şematik açıklayan derleme içine pGal4AD. Genomik DNA zorlanma PLY5725 rastgele nın yaşadığı belirtilen Y-adaptörler ile bakmaksızın ve SFII kesimli pGal4AD bakmaksızın. D verim 2.2 x 106 bağımsız kolonileri kombine ve onların plazmid DNA SacCer_TAB Y2H Kütüphane oluşturan yalıtım önce yetiştirilen bakterilere dönüştürülmüştür. B. LEU2-transkripsiyon harekete geçirmek etki alanı gösterilir Gal4 konut plazmid (pGal4AD) içeren. <a href="/files/ftp_upload/57801/57801fig8large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57801/57801fig9.jpg"> Şekil 9: Y2H Maya genomik Kütüphanesi karmaşıklığını. SacCer_TAB genomik Kütüphanesi PLY5725 MATalpha zorlanma ve PJ_C1, C2, C3 Maya genomik Kütüphanesi Υ187 ΜΑΤalpha süzün dönüştürülmüş oldu içine dönüştü. Bu nüfusun diploitler PJY69-4A zorlanma için çiftleşme tarafından yapılmıştır. Nüfus 10 nesiller için yetiştirilen ve PCR güçlendirilmiş av parçaları yüksek üretilen iş sıralama ve analiz için tabi tutuldu. A. okuma Maya genom sıralama tarafından bulundu gen başına bölünen Y2H kütüphanelerde okuma her gen başına rütbe sırasını gösterir. Her gen eşdeğer bolluğu göz önüne alındığında, her Gen 1 değeri olurdu. B. bölge (ORF) desteği protein ve uygun translasyonel okuma çerçevesi içinde bir parça encode benzersiz plazmid gen başına sayısını gösteren çubuk grafik. C. karşılaştırma Maya genler kodlamak farklı plazmidler her kütüphane sayısı ve oranı bu ve doğru translasyonel okuma çerçevesi içinde değildir veya geriye doğru eklenir. ö gösteren pozisyonları ve bereket için plazmidler her kitaplıkta bulunan örnek genler (VPS8 ve VPS16) eşleştirmek kavşak çizer. Plazmid doğru translasyonel okuma çerçevesi olan gen füzyon ile mavi atanır. <a href="/files/ftp_upload/57801/57801fig9large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57801/57801fig10.jpg"> Şekil 10: tekrarlanabilirlik karmaşık Y2H Maya genomik kütüphanesi ile DEEPN. A. dört farklı Maya diploit nüfus PLY5725 içinde yer alan, seçici olmayan koşullar altında yetiştirilen ve sıralı SacCer_TAB Y2H Kütüphane ile çiftleşme tarafından oluşturuldu. Okuma başına gen her nüfus için ayrı ayrı karşıdan karşıya tüm örneğin alınma olasılığını ortalama sipariş rütbe değeri bir fonksiyonu olarak çizilir. B. okuma gen olumlu Y2H etkileşimler için seçimden sonra iki örnek arasında başı gösterir. <a href="/files/ftp_upload/57801/57801fig10large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Yeast 2-Hybrid Screen in Batch to Compare Protein Interactions at JoVE.com

A Yeast 2-Hybrid Screen in Batch to Compare Protein Interactions

Bir Maya 2-melez ekran Protein etkileşimleri karşılaştırmak için bir toplu iş

Toplu işleme Maya 2-hibrid ekranlarının birden fazla yem protein etkileşim profilleri av füzyon protein son derece karmaşık bir dizi doğrudan karşılaştırma sağlar. Burada, rafine yöntemleri, yeni reaktifler ve bunların kullanımı böyle ekranlar için nasıl açıklar.

Screening for protein-protein interactions using the yeast 2-hybrid assay has long been an effective tool, but its use has largely been limited to the ...

a-yeast-2-hybrid-screen-in-batch-to-compare-protein-interactions

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

13.2K Görüntüleme.  University of Iowa. Toplu işleme Maya 2-hibrid ekranlarının birden fazla yem protein etkileşim profilleri av füzyon protein son derece karmaşık bir dizi doğrudan karşılaştırma sağlar. Burada, rafine yöntemleri, yeni reaktifler ve bunların kullanımı böyle ekranlar için nasıl açıklar.

Video: A Yeast 2-Hybrid Screen in Batch to Compare Protein Interactions

Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is necessary to characterize it at the structural and mechanistic level. Several biochemical and biophysical methods exist for such purpose. Among them, fluorescence anisotropy is a powerful technique particularly used when the fluorescence intensity of a fluorophore-labeled protein remains constant upon protein-protein interaction. In this technique, a fluorophore-labeled protein is excited with vertically polarized light of an appropriate wavelength that selectively excites a subset of the fluorophores according to their relative orientation with the incoming beam. The resulting emission also has a directionality whose relationship in the vertical and horizontal planes defines anisotropy (r) as follows: r=(IVV-IVH)/(IVV+2IVH), where IVV and IVH are the fluorescence intensities of the vertical and horizontal components, respectively. Fluorescence anisotropy is sensitive to the rotational diffusion of a fluorophore, namely the apparent molecular size of a fluorophore attached to a protein, which is altered upon protein-protein interaction. In the present text, the use of fluorescence anisotropy as a tool to study protein-protein interactions was exemplified to address the binding between the protein mutated in the Shwachman-Diamond Syndrome (SBDS) and the Elongation factor like-1 GTPase (EFL1). Conventionally, labeling of a protein with a fluorophore is carried out on the thiol groups (cysteine) or in the amino groups (the N-terminal amine or lysine) of the protein. However, SBDS possesses several cysteines and lysines that did not allow site directed labeling of it. As an alternative technique, the dye 4&#39;,5&#39;-bis(1,3,2 dithioarsolan-2-yl) fluorescein was used to specifically label a tetracysteine motif, Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cys, genetically engineered in the C-terminus of the recombinant SBDS protein. Fitting of the experimental data provided quantitative and mechanistic information on the binding mode between these proteins.

Protein interactions are at the heart of a cell&#39;s function. Calorimetric and spectroscopic techniques are commonly used to characterize them. Here we describe fluorescence anisotropy as a tool to study the interaction between the protein mutated in the Shwachman-Diamond Syndrome (SBDS) and the Elongation factor-like 1 GTPase (EFL1).

Protein-protein etkileşimleri çalışmak için aracı olarak floresan Anizotropi

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is ...

Biyokimya

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating these studies, reincorporation of detergent-solubilized membrane proteins into liposomes is a stochastic process where protein topology is impossible to enforce. This paper offers an alternative method to these challenging techniques that utilizes a liposome-based scaffold. Protein solubility is enhanced by deletion of the transmembrane domain, and these amino acids are replaced with a tethering moiety, such as a His-tag. This tether interacts with an anchoring group (Ni2+ coordinated by nitrilotriacetic acid (NTA(Ni2+)) for His-tagged proteins), which enforces a uniform protein topology at the surface of the liposome. An example is presented wherein the interaction between Dynamin-related protein 1 (Drp1) with an integral membrane protein, Mitochondrial Fission Factor (Mff), was investigated using this scaffold liposome method. In this work, we have demonstrated the ability of Mff to efficiently recruit soluble Drp1 to the surface of liposomes, which stimulated its GTPase activity. Moreover, Drp1 was able to tubulate the Mff-decorated lipid template in the presence of specific lipids. This example demonstrates the effectiveness of scaffold liposomes using structural and functional assays and highlights the role of Mff in regulating Drp1 activity.

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

This paper describes a method for assessing the interactions and assemblies of integral membrane proteins in vitro with various partner factors in a lipid-proximal environment.

İskele Lipozomlar kullanarak Lipid-proksimal protein-protein etkileşimleri Sulandırın için<em&gt; İn Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. Hydrogen-Deuterium Exchange (HDX) measured at rapid time scales is uniquely suited to detect structures and hydrogen bonding networks that are briefly populated, allowing for the characterization of transient conformers in native ensembles. Coupling of HDX to mass spectrometry offers several key advantages, including high sensitivity, low sample consumption and no restriction on protein size. This technique has advanced greatly in the last several decades, including the ability to monitor HDX labeling times on the millisecond time scale. In addition, by incorporating the HDX workflow onto a microfluidic platform housing an acidic protease microreactor, we are able to localize dynamic properties at the peptide level. In this study, Time-Resolved ElectroSpray Ionization Mass Spectrometry (TRESI-MS) coupled to HDX was used to provide a detailed picture of residual structure in the tau protein, as well as the conformational shifts induced upon hyperphosphorylation.

Conformational flexibility plays a critical role in protein function. Herein, we describe the use of time-resolved electrospray ionization mass spectrometry coupled to hydrogen-deuterium exchange for probing the rapid structural changes that drive function in ordered and disordered proteins.

Zaman çözülmesi elektro sprey iyonizasyon Hidrojen-döteryum Değişim Kütle Spektrometre Protein Yapısı ve Dinamikleri incelenmesi için

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

A Modified Yeast-one Hybrid System for Heteromeric Protein Complex-DNA Interaction Studies

Over the years, the yeast one-hybrid assay has proven to be an important technique for the identification and validation of physical interactions between proteins such as transcription factors (TFs) and their DNA target. The method presented here utilizes the underlying concept of the Y1H but is modified further to study and validate protein complexes binding to their target DNA. Hence, it is referred to as the modified yeast one-hybrid (Y1.5H) assay. This assay is cost effective and can be easily performed in a regular laboratory setting. Albeit using a heterologous system, the described method could be a valuable tool to test and validate the heteromeric protein complex binding to their DNA target(s) for functional genomics in any system of study, especially plant genomics.

The modified yeast one-hybrid assay described here is an extension of the classical yeast one-hybrid (Y1H) assay to study and validate the heteromeric protein complex-DNA interaction in a heterologous system for any functional genomics study.

Heteromerik Protein Kompleksi-DNA Etkileşim Çalışmaları İçin Modifiye Maya-Bir Hibrid Sistem

Over the years, the yeast one-hybrid assay has proven to be an important technique for the identification and validation of physical interactions between ...

Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The modification presented includes the combination of this technique with cell-penetrating sequences. We propose to design cell-penetrating baits that can be incubated with living cells instead of cell lysates and therefore the interactions found will reflect those that occur within the intracellular context. Connexin43 (Cx43), a protein that forms gap junction channels and hemichannels is down-regulated in high-grade gliomas. The Cx43 region comprising amino acids 266-283 is responsible for the inhibition of the oncogenic activity of c-Src in glioma cells. Here we use TAT as the cell-penetrating sequence, biotin as the pull-down tag and the region of Cx43 comprised between amino acids 266-283 as the target to find intracellular interactions in the hard-to-transfect human glioma stem cells. One of the limitations of the proposed method is that the molecule used as bait could fail to fold properly and, consequently, the interactions found could not be associated with the effect. However, this method can be especially interesting for the interactions involved in signal transduction pathways because they are usually carried out by intrinsically disordered regions and, therefore, they do not require an ordered folding. In addition, one of the advantages of the proposed method is that the relevance of each residue on the interaction can be easily studied. This is a modular system; therefore, other cell-penetrating sequences, other tags, and other intracellular targets can be employed. Finally, the scope of this protocol is far beyond protein-protein interaction because this system can be applied to other bioactive cargoes such as RNA sequences, nanoparticles, viruses or any molecule that can be transduced with cell-penetrating sequences and fused to pull-down tags to study their intracellular mechanism of action.

This is a protocol to study intracellular protein-protein interactions based on the biotin-avidin pull-down system with the novelty of combining cell-penetrating sequences. The main advantage is that the target sequence is incubated with living cells instead of cell lysates and therefore the interactions will occur within the cellular context.

İntraselüler Protein-protein etkileşimleri çalışmaya Biotinylated hücre Penetran peptidler

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring cells. Of interest, only few assays are capable of specifically probing such interactions directly in living cells. Here, we present an assay to measure the binding of proteins expressed at the surfaces of neighboring cells, at cell-cell contacts. This assay consists of two steps: mixing of cells expressing the proteins of interest fused to different fluorescent proteins, followed by fluorescence fluctuation spectroscopy measurements at cell-cell contacts using a confocal laser scanning microscope. We demonstrate the feasibility of this assay in a biologically relevant context by measuring the interactions of the amyloid precursor-like protein 1 (APLP1) across cell-cell junctions. We provide detailed protocols on the data acquisition using fluorescence-based techniques (scanning fluorescence cross-correlation spectroscopy, cross-correlation number and brightness analysis) and the required instrument calibrations. Further, we discuss critical steps in the data analysis and how to identify and correct external, spurious signal variations, such as those due to photobleaching or cell movement.
In general, the presented assay is applicable to any homo- or heterotypic protein-protein interaction at cell-cell contacts, between cells of the same or different types and can be implemented on a commercial confocal laser scanning microscope. An important requirement is the stability of the system, which needs to be sufficient to probe diffusive dynamics of the proteins of interest over several minutes.

This protocol describes a fluorescence fluctuation spectroscopy-based approach to investigate interactions among proteins mediating cell-cell interactions, i.e. proteins localized in cell junctions, directly in living cells. We provide detailed guidelines on instrument calibration, data acquisition and analysis, including corrections to possible artefact sources.

Bir floresan dalgalanma spektroskopisi tahlil Protein-Protein etkileşimlerinin hücre-hücre kişiler

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

A Fluorogenic Peptide Cleavage Assay to Screen for Proteolytic Activity: Applications for coronavirus spike protein activation

Enveloped viruses such as coronaviruses or influenza virus require proteolytic cleavage of their fusion protein to be able to infect the host cell. Often viruses exhibit cell and tissue tropism and are adapted to specific cell or tissue proteases. Moreover, these viruses can introduce mutations or insertions into their genome during replication that may affect the cleavage, and thus can contribute to adaptations to a new host. Here, we present a fluorogenic peptide cleavage assay that allows a rapid screening of peptides mimicking the cleavage site of viral fusion proteins. The technique is very flexible and can be used to investigate the proteolytic activity of a single protease on many different substrates, and in addition, it also allows exploration of the activity of multiple proteases on one or more peptide substrates. In this study, we used peptides mimicking the cleavage site motifs of the coronavirus spike protein. We tested human and camel derived Middle East Respiratory Syndrome coronaviruses (MERS-CoV) to demonstrate that single and double substitutions in the cleavage site can alter the activity of furin and dramatically change cleavage efficiency. We also used this method in combination with bioinformatics to test furin cleavage activity of feline coronavirus spike proteins from different serotypes and strains. This peptide-based method is less labor- and time intensive than conventional methods used for the analysis of proteolytic activity for viruses, and results can be obtained within a single day.

We present a fluorogenic peptide cleavage assay that allows a rapid screening of the proteolytic activity of proteases on peptides representing the cleavage site of viral fusion peptides. This method can also be used on any other amino acid motif within a protein sequence to test for the protease activity.

Bir Fluorogenic peptid bölünme tahlil için proteolitik aktivite ekran: coronavirus uygulamalarda spike protein etkinleştirme

Enveloped viruses such as coronaviruses or influenza virus require proteolytic cleavage of their fusion protein to be able to infect the host cell. Often ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and the degradation of target proteins in live cells. By using short (pulse) radiolabeling times (&lt;30 min) and tightly controlled chase times, it is possible to label only a small fraction of the total protein pool and follow its folding. When combined with nonreducing/reducing SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and immunoprecipitation with (conformation-specific) antibodies, folding processes can be examined in great detail. This system has been used to analyze the folding of proteins with a huge variation in properties such as soluble proteins, single and multi-pass transmembrane proteins, heavily N- and O-glycosylated proteins, and proteins with and without extensive disulfide bonding. Pulse-chase methods are the basis of kinetic studies into a range of additional features, including co- and posttranslational modifications, oligomerization, and polymerization, essentially allowing the analysis of a protein from birth to death. Pulse-chase studies on protein folding are complementary with other biochemical and biophysical methods for studying proteins in vitro by providing increased temporal resolution and physiological information. The methods as described within this paper are adapted easily to study the folding of almost any protein that can be expressed in mammalian or insect-cell systems.

Here we describe a protocol for a general pulse-chase method that allows the kinetic analysis of folding, transport, and degradation of proteins to be followed in live cells.

Protein katlanması, taşıma ve canlı hücreler radyoaktif darbe Chase tarafından bozulması Analizi

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA is a novel transcription activator found specifically in the obligate intracellular bacterial pathogen Chlamydia. Protein pulldown assays using affinity beads have revealed that GrgA binds two &#963; factors, namely &#963;66 and &#963;28, which recognize different sets of promoters for genes whose products are differentially required at developmental stages. We have used BLI to confirm and further characterize the interactions. BLI demonstrates several advantages over pulldown: 1) It reveals real-time association and dissociation between binding partners, 2) It generates quantitative kinetic parameters, and 3) It can detect bindings that pulldown assays often fail to detect. These characteristics have enabled us to deduce the physiological roles of GrgA in gene expression regulation in Chlamydia, and possible detailed interaction mechanisms. We envision that this relatively affordable technology can be extremely useful for studying transcription and other biological processes.

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Interactions of transcription factors (TFs) with the RNA polymerase are usually studied using pulldown assays. We apply a Biolayer Interferometry (BLI) technology to characterize the interaction of GrgA with the chlamydial RNA polymerase. Compared to pulldown assays, BLI detects real-time association and dissociation, offers higher sensitivity, and is highly quantitative.

Transkripsiyon protein-protein etkileşimlerini Incelemek için Biolayer Interferometri (BLı) uygulaması

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...

Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane trafficking, signal transduction and cytoskeletal remodeling. Classic tools for measuring such interactions include surface plasmon resonance (SPR) and isothermal titration calorimetry (ITC). While powerful tools, these approaches have setbacks. ITC requires large amounts of purified protein as well as lipids, which can be costly and difficult to produce. Furthermore, ITC as well as SPR are very time consuming, which could add significantly to the cost of performing these experiments. One way to bypass these restrictions is to use the relatively new technique of microscale thermophoresis (MST). MST is fast and cost effective using small amounts of sample to obtain a saturation curve for a given binding event. There currently are two types of MST systems available. One type of MST requires labeling with a fluorophore in the blue or red spectrum. The second system relies on the intrinsic fluorescence of aromatic amino acids in the UV range. Both systems detect the movement of molecules in response to localized induction of heat from an infrared laser. Each approach has its advantages and disadvantages. Label-free MST can use untagged native proteins; however, many analytes, including pharmaceuticals, fluoresce in the UV range, which can interfere with determination of accurate KD values. In comparison, labeled MST allows for a greater diversity of measurable pairwise interactions utilizing fluorescently labeled probes attached to ligands with measurable absorbances in the visible range as opposed to UV, limiting the potential for interfering signals from analytes.

Microscale thermophoresis obtains binding constants quickly at low material cost. Either labeled or label free microscale thermophoresis is commercially available; however, label free thermophoresis is not capable of the diversity of interaction measurements that can be performed using fluorescent labels. We provide a protocol for labeled thermophoresis measurements.