Bu eser University of Nevada, Reno fonlarından başlangıç ve Ulusal Sağlık Enstitüsü grant numarası P20 GM103650 altında NIGMS tarafından desteklenmiştir.

1. bir davranış Arena inşa ve donanım Optogenetic stimülasyon davranış arenada etkinleştirmek için hazırlanıyor
<ol><li>Bir ışık yoksun davranış arena inşa için 89 x 61 x 66 cm3 boyutta bir kutu oluşturmak (35" L x 24" W x 26" H) (bkz: Malzemeler tablo) siyah renkli pleksiglas akrilik levhalar (3 mm kalınlığında) yaptı. Böyle bir kutu oluşturmak için malzemeleri yerel donanım mağazalarında mevcut olmalıdır. Bu kutusunu masa üstü davranış odasında (şekil 1A) yerleştirin.</li>
	<li>Tek renkli bir USB 3.0 CCD kamera ile donatılmış bir IR uzun taramalı 830 nm filtre ve bir 8 mm F1.4 C-mount lens ile Dağı ( Tablo malzemelerigörmek) kara kutu tavan ortasına. Yer iki kızılötesi LED ( Tablo malzemelerigörmek) (Resim 1A) karanlık arenada larva aydınlatmak için masa üstü şeritler.</li>
	<li>LED platform oluşturmak için bir 22 cm × 22 cm kare alüminyum levha (tercihen sprey herhangi bir yansımaları ortadan kaldırmak için siyah mat ile boyalı) edinin. Plaka Merkezi'ndeki CCD kamera sığmayacak kadar büyük bir delik bir metal kesici kullanarak.</li>
	<li>(Bkz. Tablo reçetesi) kırmızı LED şerit ışıklar ile metal plaka kapak. Serisi LED ışık şerit teller lehim ve şerit kablo ahududu Pi 2B mikro işlemcisi tarafından denetlenen bir optocoupler geçiş içine yem ( Tablo malzemelerigörmek) (Resim 1B ve 2).</li>
	<li>Yükleyin ve optocoupler geçiş için LED şeritler bağlanmadan önce ahududu Pi işlemci üzerinde Ubuntu dostum/Raspian Jesse/Linux esaslı iş sistem yapılandırın. Güç LED şeritler ve optocoupler (Şekil 2) için bir güç kaynağına takın (bkz. Tablo malzeme). CCD kamera (şekil 1B) çevresinde LED platformu bağlayın. Not: Ubuntu dostum v16.04 işletim sistemi serbestçe kullanılabilir. Basit temel Python komut LED ışık uyaranlara (sözdizimi dosyasına bakın) programı alışkanlıkları kolayca adapte edilebilir.</li>
	<li>Homojen olma davranışı arenada çeşitli noktalarda olun. Arena yüzeyi bir Spektrometre yardımıyla mutlak olma ölçmek ve ~1.3 W/m2 arena yüzeyi boyunca olmasını belirler. Not: Bu yoğunlukta deneyler boyunca sıcaklığında hiçbir önemli değişiklikler gözlendi. Başka bir çalışmada10 ~1.9 W/m2 bir daha yüksek olma kullanılan ve hiçbir değişiklik sıcaklık deneyleri boyunca gözlendi.</li>
</ol>2. davranış analizleri için Drosophila larva hazırlanması
<ol><li>Standart sinek Gıda sinekler korumak ( Tablo malzemelerigörmek) 25 ° C, % 50-60 RH ve 12 h/12 h açık/koyu döngüsü.</li>
	<li>
CsChrimson ORNs tek bir çift hızlı için bakire kadın UAS-IVS-CsChrimson bir OrX-Gal4 satırından erkekler için çizgiyi ('X' 21 larva koku reseptör birine karşılık gelen (ya da) her birinde benzersiz olarak ifade edilir genler ORNs 21 çiftlerini)9,11.
	<ol>
<li>Alternatif olarak, CsChrimson tüm 21 larva ORNs içinde hızlı için çapraz bir UAS-IVS-CsChrimson bakire kadın erkekler için ('Orco' tüm 21 ORNs ifade edilen ortak reseptör olduğu) bir Orco-Gal4 satırından satır.</li>
		<li>UAS-IVS-CsChrimson çizgi kendisi tarafından bir denetim bu deneyler olarak kullanın. Not: burada listelenen sinek stokları Bloomington Drosophila hisse senedi merkezinde mevcut tüm bulunmaktadır ( Tablo malzemelerigörmek).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Sonra erkek ve dişi sinekler çapraz dostum ve 48 h için yumurtalarını bırakmak için izin verilir, yetişkinler için taze bir şişe aktarın.
	<ol>
<li>Yumurta içeren gıda şişe yüzeye 400 µL Dimetil sülfoksit (DMSO) çözünmüş 400 µM all-trans retinal (ATR) ve distile suda 89 mM Sükroz içeren bir karışımı ekleyin. Not: Sükroz az miktarda larva ATR çözümünün beslenme teşvik etmektedir. ATR bir kofaktör CsChrimson ifade9,10etkinleşmiş için gerekli olduğunu. ATR ışığa duyarlı olduğunu.</li>
		<li>ATR yumurta içeren gıda şişeleri eklendikten sonra bir ek 72 h için karanlık şişeleri kuluçkaya. Not: Bu çalışma ve yukarıdaki iki çalışmaları nedeniyle ATR besleme larva davranışı üzerindeki etkileri gözlemledik değil iken, ATR ATR içermiyor yukarıdaki karışımı aynı miktarda sınama satırlarındaki subjecting tarafından besleme etkileri için kontrol önerilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Üçüncü-biçim larva (~ 120 yumurta döşeme sonra h) bir yüksek yoğunluklu (% 15) Sükroz çözüm kullanarak yüzen tarafından sinek gıda yüzeyinden ayıklayın. Bir P1000 kullanarak micropipette 1000 mL cam kabı içine Sükroz çözüm yüzeyinde yüzen larva ayırın.</li>
	<li>Larvalar 3-4 kez her zaman 800 mL distile su cam ölçek değiştirerek yıkayın. Larvalar 10 dakikadır davranış tahlil tabi önce dinlenmek izin verir.</li>
</ol>3. davranış tahlil
<ol><li>(22-25 ° C arasında) tutarlı ısısını korumak ve davranış odasında (50 ile %60 RH) nem.</li>
	<li>
Larva gezinme orta 22 cm x 22 cm kare Petri kabına içine erimiş özel (% 1.5) tarafından dökme 150 mL hazırlayın. Bir Petri kabına tahlil, 8 – 10 deneme deneme başına her deneme için dökülür. Özel kuvvetlendirmek ve 1-2 h Petri yemekler için davranış assay olarak kullanmadan önce soğumaya izin.
	<ol>
<li>En fazla 20 hazırlandı üçüncü-biçim larva Merkezi, Petri yemek için (Resim 1C) aktarın. Petri kabına kapağı ile kapak. CCD kamera altında davranış arenada Petri kabına yerleştirin. Not: bağlı olarak deneme, davranış deneyleri genellikle 3-5 min için yapılmaktadır. Bir propil rehberlik yardım sağlamak için tahlil kullandıysanız, ortaya çıkan koku degrade için yaklaşık15 dk sabit kalır gözlenmiştir. Uzun tahlil kez tavsiye edilmez. Larva su kaybı nedeniyle veya uzun süreli 630 nm kırmızı ışık pozlama üzerinde zararlı etkileri bu zaman noktaları içinde gözlenen değil.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Larva video görselleştirmek için turn ON 850 nm kızılötesi LED ışık kaynağı. Larva hareketi kaydetmek üzere CCD kamerayla başlatın.</li>
	<li>Ahududu Pi işlemci, program uygun desen kırmızı ışık stimülasyon yönetmek için bu yordamı ile ilişkili yazılım kullanarak. Not: Bir basit dayalı Python komut kümesi LED ışık uyaranlara (sözdizimi dosyasına bakın) programı desenleri kolayca adapte edilebilir.</li>
</ol>4. veri işleme ve analiz
<ol><li>Kaydedilen videoyu her deneme Matlab gibi kullanılabilir herhangi bir programlama yazılım alın.</li>
	<li>Bir film her larva XY koordinatları bir fonksiyonu olarak elde edilir. İzleme yazılımı sınırlamalar dayalı, 15-20 üçüncü-biçim larva bir tek film1,8' izlenebilir. Not: Bir dizi (sözdizimi dosyasına bakın) uygun koşullarına uygun kolayca adapte edilebilir basit Matlab kodları ('Tracklarva') sağlanır. Bu program tüm denemeler bir deneyde birleştirir ve her larva XY koordinatları assay süresi boyunca verir (bkz: kod sözdizimi aşağıda). Alternatif olarak, araştırmacılar için serbestçe kullanılabilir çeşitli açık kaynak tabanlı programlar ihtiyacım var. Örneğin JAABA (http://jaaba.sourceforge.net/)12.</li>
	<li>
Oluşturulan XY koordinatları larva yörüngeleri çizilecek ve larva hareket daha ileri düzeyde çözümlemek için kullanın.
	<ol>
<li>Davranış analizleri için hız, yol eğriliği, başlık açı, gibi seyir istatistikleri çalışır ve döner dizileri alternatif içine bireysel larva yörüngeleri segmentlere ayırmak için kullanın.</li>
		<li>İshal sürekli dönemlerinde ileri hareketi tanımlanır. Sırayla art arda gelen ishal ayırın. Döner bayraklı değişiklikleri yörünge yönlendirme açılarla yaşındayken > 45° (sözdizimi dosyasına bakın).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Çalışma hızı, uzunluk, çalışma yönü ve diğer parametreleri gerektiği gibi çalışması için ortalama değerleri hesaplar. Not: 'İshal' ve 'durur' larva yörüngeleri ayıklamak için basit sözdizimi bir dizi sağlanan (sözdizimi dosyasına bakın). Basit Matlab veya Excel tabanlı işlevleri uzunluğu hesaplamak değerleri 'çalışma hızı', 'çalıştırmak için ' ayıklanan veriler için uygulanabilir vs.</li>
	<li>± SEM Yani davranış her ölçüm için veri temsil etmek</li>
</ol>

<ol>
	<li>Mathew, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+diversity+among+sensory+receptors+in+a+Drosophila+olfactory+circuit.">Functional diversity among sensory receptors in a Drosophila olfactory circuit.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 2134-2143 (2013).</li><li>Ramaekers, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular+maps+without+cellular+redundancy+at+successive+levels+of+the+Drosophila+larval+olfactory+circuit.">Glomerular maps without cellular redundancy at successive levels of the Drosophila larval olfactory circuit.</a> Current biology : CB. 15, 982-992 (2005).</li><li>Couto, A., Alenius, M., Dickson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular,+anatomical,+and+functional+organization+of+the+Drosophila+olfactory+system.">Molecular, anatomical, and functional organization of the Drosophila olfactory system.</a> Current biology : CB. 15, 1535-1547 (2005).</li><li>Kreher, S. A., Kwon, J. Y., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+basis+of+odor+coding+in+the+Drosophila+larva.">The molecular basis of odor coding in the Drosophila larva.</a> Neuron. 46, 445-456 (2005).</li><li>Kreher, S. A., Mathew, D., Kim, J., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translation+of+sensory+input+into+behavioral+output+via+an+olfactory+system.">Translation of sensory input into behavioral output via an olfactory system.</a> Neuron. 59, 110-124 (2008).</li><li>Hallem, E. A., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coding+of+odors+by+a+receptor+repertoire.">Coding of odors by a receptor repertoire.</a> Cell. 125, 143-160 (2006).</li><li>Monte, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+larval+olfactory+response+in+Drosophila+and+its+genetic+basis.">Characterization of the larval olfactory response in Drosophila and its genetic basis.</a> Behav Genet. 19, 267-283 (1989).</li><li>Gershow, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+airborne+cues+to+study+small+animal+navigation.">Controlling airborne cues to study small animal navigation.</a> Nature methods. 9, 290-296 (2012).</li><li>Klapoetke, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Independent+optical+excitation+of+distinct+neural+populations.">Independent optical excitation of distinct neural populations.</a> Nature methods. 11, 338-346 (2014).</li><li>Hernandez-Nunez, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse-correlation+analysis+of+navigation+dynamics+in+Drosophila+larva+using+optogenetics.">Reverse-correlation analysis of navigation dynamics in Drosophila larva using optogenetics.</a> eLife. 4, (2015).</li><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes.">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118, 401-415 (1993).</li><li>Kabra, M., Robie, A. A., Rivera-Alba, M., Branson, S., Branson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JAABA:+interactive+machine+learning+for+automatic+annotation+of+animal+behavior.">JAABA: interactive machine learning for automatic annotation of animal behavior.</a> Nature methods. 10, 64-67 (2013).</li><li>Newquist, G., Novenschi, A., Kohler, D., Mathew, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+contributions+of+Olfactory+Receptor+Neurons+in+a+Drosophila+olfactory+circuit.">Differential contributions of Olfactory Receptor Neurons in a Drosophila olfactory circuit.</a> eNeuro. 3, (2016).</li><li>Schulze, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamical+feature+extraction+at+the+sensory+periphery+guides+chemotaxis.">Dynamical feature extraction at the sensory periphery guides chemotaxis.</a> eLife. 4, (2015).</li><li>Tastekin, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+Subesophageal+Zone+in+Sensorimotor+Control+of+Orientation+in+Drosophila+Larva.">Role of the Subesophageal Zone in Sensorimotor Control of Orientation in Drosophila Larva.</a> Current Biology. 25, 1448-1460 (2015).</li><li>Famiglietti, E. V., Kolb, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+ON-and+OFF-center+responses+in+retinal+ganglion+cells.">Structural basis for ON-and OFF-center responses in retinal ganglion cells.</a> Science. 194, 193-195 (1976).</li><li>Luo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+thermotaxis+in+Caenorhabditis+elegans+is+mediated+by+distinct+sensorimotor+strategies+driven+by+the+AFD+thermosensory+neurons.">Bidirectional thermotaxis in Caenorhabditis elegans is mediated by distinct sensorimotor strategies driven by the AFD thermosensory neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 2776-2781 (2014).</li><li>Berck, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+wiring+diagram+of+a+glomerular+olfactory+system.">The wiring diagram of a glomerular olfactory system.</a> eLife. 5, (2016).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Burada, Drosophila larva davranış aynı anda optogenetic harekete geçirmek koku nöronların karşılık olarak ölçülmesi için izin veren bir yöntem açıklanmıştır. Daha önce açıklanan larva izleme yöntemleri1,8 farklı koku teslim teknolojisini kullanıyor ORNs harekete geçirmek. Ancak, bu yöntemleri özgüllük veya zamansal desenleri ORN etkinleştirme için kontrol edemiyorum. Bizim yöntem bu açıkları ORN harekete geçirmek daha hassas kontrol için koku uyaranlara yerine hafif bir çekim gücü kullanarak üstesinden gelir.
Davranış arena oluşturmak için gerekli malzemeler yerel donanım mağazasında kolayca elde edilebilir ve toplantısındaki en az çaba gerektirir. Optogenetics modülü hazırlamak için gerekli olan elektronik de kolayca kullanılabilir ve inşa için. Yöntem tanımlamak burada kırmızı ışık kırmızı kaymıştır kanal rhodopsin etkinleştirmek için kullanılan (CsChrimson) belirli nöronlarda dile getirdi. Karşılık gelen ORN harekete geçirmek yanıt olarak ortaya çıkan larva davranış bir CCD kamera kullanarak ve burada sağlanan özel yazılı yazılımını kullanarak ölçülen kaydedilir. Araştırmacılar daha önce mümkün olmayan bazı soruların yanıtlarını sormak bizim yöntem sağlar: 1) farklı koku uyarıcı desenleri bir koku doğru gezinmek için hayvanın yeteneği üzerinde etkisi nedir? 2) orada özellikle koku uyaranlara artışa koku uyaranlara yanıt ORNs ek olarak bir düşüş yanıt ORNs ON-Merkezi ve OFF-Merkezi ganglion hücrelerinin memeli retina16, benzer? Son olarak, bizim yöntemi gelecekteki uygulamalar, koku devre (PNs ve Ins) aşağı akım nöronlarda etkisini ölçme de dahil olmak üzere çeşitli larva gezinti için izin verir.
Bizim yöntemin birkaç avantajları olmakla birlikte, bazı sınırlamalar anıyoruz. O olup olmadığını odorants ile gözlenen konsantrasyon etkileri kolayca bu sistemi kullanarak çoğaltılabilir belirsizdir. Bizim mevcut bu izin vermez iken, optogenetics modülü kolayca artar veya hafif uyarıcı yoğunluğunu düşüşler içerecek şekilde değişiklik. Gelecekte, değişen ışık uyarıcı yoğunluğunu odorants konsantrasyon etkilerini taklit eder olup olmadığını görmek için kontrol eder. Basit sinek genetik teknikler CsChrimson ORNs (Orco-Gal4 kullanarak) ya da tüm 21 çift veya tek bir çift ORNs (bireysel veya Gal4s kullanarak) ifade etmek için kullanılabilir. Ancak, karmaşık genetik CsChrimson ' 1'de ifade etmek için gerekli olacaktır < n < 21' nöronlar. Bu nedenle, nerede karışımı tek tek bileşenlerini birden fazla ORN yanıtlarını temin koku karışımları ile gözlenen etkileri çoğaltmak zor olurdu. Larva gezinme davranışı bir düşük boyutlu davranış olarak kabul edilir olsa da, bizim larva izleme programı daha da gelecekte üzerinde hayvan duruş dayalı ek davranış tanımlayıcıları göz önünde bulundurarak geliştirilebilir olduğunu kabul (Örneğin olasılık başın döner, vücut kıvrımları vb)8,17. Bizim çalışma ilk sipariş larva duyusal nöronlarda sınırlı oldu. İkinci sırada projeksiyon neurons ve beyin18beyin lobu bölgesi gömülü yerel nöronlar için bizim yöntem uygulanmadan önceki daha fazla araştırma gereklidir.
Özet olarak, bizim yöntem her ORN Drosophila larva basit, uysal koku devre fonksiyonunun teşrih olanağı sunar. Böylece, bizim yöntem geliştirme koku sinyalleri farklı davranış çıktılarının nasıl dönüştürüleceğini açıklar daha kesin Hesaplamalı modellerin sağlayacaktır.

Drosophila larva'nın ortamında koku bilgilerine yalnızca 21 işlevsel olarak farklı ORNs, faaliyetleri hangisini sonuçta larva davranış1,2,3,4belirlemek hissettim. Henüz, nispeten az hangi tarafından bu 21 ORNs faaliyetlerine duyusal bilgi kodlanmış mantığı hakkında bilinir. Böylece her larva ORN davranış için fonksiyonel katkılarıyla deneysel olarak ölçmek için gerek yoktur.
Drosophila larva ORNs tüm repertuar duyusal yanıt profilini ayrıntılı1,4,5, bireysel ORNs koku devre ve dolayısıyla katkılarıyla eğitim gördü, ancak gezinme davranışı büyük ölçüde bilinmeyen kalır. Zorluklar larva davranış çalışmaları, şimdiye kadar dağınık şekilde ve geçici tek ORNs etkinleştirmek için yetersizlik nedeniyle ortaya çıkmaktadır. Özellikle 19 21 Drosophila larva ORNs'harekete geçirmek odorants oluşan bir panel son zamanlarda açıklanan1idi. Her propil panelde, düşük konsantrasyonlarda, onun soydaş ORN sadece fizyolojik bir yanıt aydınlığa çıkartıyor. Ancak, normalde geleneksel davranış deneyleri için kullanılan yüksek konsantrasyonları her propil birden çok ORNs1,5,6fizyolojik yanıt aydınlığa çıkartıyor. Ayrıca, odorants Bu bölmedeki istikrarlı koku degradeler7,8oluşumu üzerinde bağlı davranış çalışmalar yorumlanması karmaşık hale volatilities çeşitli var. Son olarak, doğal olarak meydana gelen koku uyaranlara laboratuvar koşullarında çoğaltmak zordur zamansal bir bileşen var. Bu nedenle larva davranış aynı anda kayma ve zamansal bir şekilde tek tek ORNs etkinleştirilirken ölçebilen bir yöntem geliştirmek önemlidir.
Burada, yukarıda açıklanan larva izleme üzerinde avantajları vardır bir yöntem1,8deneyleri göstermektedir. Gershow ve ark. içinde açıklanan izleme tahlil elektronik kontrollü vanalar koku davranış arena8istikrarlı bir degrade korumak için kullanır. Ancak, karmaşık mühendislik koku uyarıcı kurulum oluşturmak ilgili düzeyi nedeniyle, bu yöntem diğer laboratuvarlarda çoğaltmak zordur. Ayrıca, özellikle tek ORNs etkinleştirmek için odorants kullanılmasıyla ilgili konuları çözülmemiş kalır. Mathew vd içinde açıklanan izleme tahlil daha basit bir koku iletim sistemi kullanır, ancak ortaya çıkan koku degrade test propil volatilite bağlıdır ve tahlil1uzun süreler için kararsız. Böylece, koku bir çekim gücü ile hafif bir çekim gücü yerine, bizim yöntem özgüllük avantajları ve ORN etkinleştirme kesin zamansal bir denetim vardır ve farklı güçlü koku degradeler oluşumu üzerinde bağımlı değildir.
Bizim yöntem kurmak kolaydır ve araştırmacılar Drosophila larva gezinti yönlerini ölçme baktılar için uygundur. Araştırmacı kendi favori sistemin neuron(s) tercih CsChrimson ifadede sürücü yapabiliyor olması koşuluyla bu tekniği diğer sistemleri modellemek için adapte. CsChrimson kanal rhodopsin, kırmızı kaymıştır bir sürümüdür. Larva'nın fototaksis sisteme görünmez dalga boylarında, aktif. Biz bu nedenle nöronların özgüllük, güvenilirlik ve tekrarlanabilirlik9ile faaliyet manipüle edebiliyoruz. Özel yazılım konuların boyut değişiklikleri için hesap yazılı değiştirerek, bu yöntem kolayca gezinme larvaları diğer böcek türleri için adapte olabilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:925px;" width="924">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:359px;">Video camera to capture larval movement</td>
			<td style="width:296px;"></td>
			<td style="width:208px;"></td>
			<td style="width:63px;"></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">CCD Camera&#160;</td>
			<td style="width:296px;">Edmund Optics</td>
			<td style="width:208px;">106215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">M52 to M55 Filter Thread Adapter</td>
			<td style="width:296px;">Edmund Optics</td>
			<td>59-446</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">2&#34; Square Threaded Filter Holder for Imaging Lenses&#160;</td>
			<td style="width:296px;">Edmund Optics</td>
			<td>59-445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">RG-715, 2&#34; Sq. Longpass Filter</td>
			<td style="width:296px;">Edmund Optics</td>
			<td>46-066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Electronics for optogenetic setup</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Raspberry Pi 2B</td>
			<td>RASPBERRY-PI.org</td>
			<td>RPI2-MODB-V1.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">3 Channel programmable power supply</td>
			<td>newegg.com</td>
			<td>9SIA3C62037092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">8 Channel optocoupler relay</td>
			<td>amazon.com</td>
			<td>6454319</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">630nm Quad-row LED strip lights</td>
			<td>environmentallights.com</td>
			<td>red3528-450-reel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:359px;">850nm LED strips</td>
			<td>environmentallights.com</td>
			<td>wp-4000K-CC5050-60x2-kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:359px;">Software&#160;</td>
			<td style="width:296px;"></td>
			<td style="width:208px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:359px;">Matlab</td>
			<td>Mathworks Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:359px;">Ubuntu MATE v16.04</td>
			<td>Nubuntu</td>
			<td>https://github.com/yslo/nubuntu</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Other items</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Plexiglass black acrylic</td>
			<td>Home Depot</td>
			<td style="width:208px;">MC1184848bl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Fly food and other reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Nutrifly fly food</td>
			<td style="width:296px;">Genesee Scientific</td>
			<td>66-112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Agarose powder</td>
			<td style="width:296px;">Genesee Scientific</td>
			<td>20-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">22cm X 22cm square petri-dish</td>
			<td style="width:296px;">VWR Inc.</td>
			<td>25382-327</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>84097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">All trans-retinal</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Flies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">UAS-IVS-CsChrimson&#160;</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>55134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:359px;">Orco-Gal4</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>26818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Or42a-Gal4</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>9970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Or7a-Gal4</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>23907</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tracking drosophila larval behavior in response to optogenetic stimulation of olfactory neurons

Böcekler koku kaynakları doğru gezinme olanağı onların birinci dereceden koku reseptör nöronlar (ORNs) faaliyetleri üzerinde temel alır. Hatırı sayılır miktarda bilgi ile ilgili ORN yanıt odorants için oluşturulan, davranışsal yanıt sürüş belirli ORNs rolü kötü anlaşılır kalır. Bireysel ORNs, birden çok ORNs tek odorants ve koku uyaranlara kullanarak doğal olarak gözlenen zamansal değişimleri çoğaltılıyor zorluk tarafından aktive etkinleştirmek odorants farklı volatilities nedeniyle davranış analizlerde komplikasyonlar ortaya geleneksel koku-teslimat yöntemlerinin laboratuvarda. Burada, yanıt olarak kendi ORNs aynı anda optogenetic uyarılması Drosophila larva davranış analiz eder bir protokol açıklayın. Burada kullanılan optogenetic teknoloji ORN harekete geçirmek özgüllük ve ORN etkinleştirme zamansal kalıplarının hassas kontrol sağlar. Karşılık gelen larva hareketi izlenir, dijital olarak kaydedilmiş ve özel yazılım yazılı kullanılarak analiz. Koku uyaranlara ışık uyaranlara ile değiştirerek, bu yöntem için daha kesin bir denetim bireysel ORN etkinleştirme larva davranış üzerindeki etkilerini incelemek için izin verir. Bizim yöntem daha fazla etkisi ikinci dereceden projeksiyon nöronların (PNs) yerel nöronlar (Ins) yanı sıra larva davranış çalışma için uzun olabilir. Nasıl koku nöron faaliyetleri tamamlayıcı çalışmalar içinde davranış yanıt-e doğru çevirmek ve bu yöntem böylece koku devre işlevi kapsamlı bir diseksiyon sağlayacak.

ORN harekete geçirmek özgüllük göstermek için bizim yöntem başarıyla iki farklı ORN (ORN::7a & ORN::42a) etkisini belirlemek için uygulandı (Or7a veya Or42a ifade ORNs) etkinleştirme larva davranış (şekil 3). Son çalışmalar bireysel ile tutarlı larva ORNs işlevsel olarak farklı1,10,13, CsChrimson ifade ORN::7a ışık tarafından uyardığında vardı bizim temsilcisi veri gösterir bir Çalışma uzunluğu kontrol hayvanlara kıyasla önemli azalma. Diğer taraftan, ışık tarafından CsChrimson ifade ORN::42a uyardığında vardı önemli bir artış çalışma uzunluğu kontrol hayvanlar (şekil 3) göre. Toplu veri analiz ~ 100-120 larva parça elde (n = 8) denemeler gerçekleştirilen her genotip için. Hata çubukları SEM temsil Biz burada sadece bir tek davranış parametresi (çalışma uzunluğu) tarif ederken, larva her parça daha fazla hız, yol eğriliği, parametrelerini hesaplamak için analiz edilebilir ve vücut1,8,13kıvıran unutmayın, 14,15. Daha fazla parametre başlık açı gibi yön ile ilgili çalışma uzunluğu ve hız doğru çalışır ve bir koku kaynağı arena1,8,13bir tarafında sağlanıyorsa kokuları uzak elde edilebilir.
ORN etkinleştirme zamansal desenleri değiştirmek için bizim yöntemin yeteneğini göstermek için bizim uyarıcı ışıkları KAPATIP arasında geçiş için çeşitli. Biz CsChrimson UAS -ORN::42a üç farklı zamansal desen ışık uyaranlara için ışıklar ON döneminde (0,04 Hz, 1 Hz ve Sabit) ifade larva tabi. Sonra ışıklar kapalı → ON aşamasında ve ışıkları sırasında → OFF faz üzerinde gerçekleşmesi davranış parametreleri değişiklikleri ölçülür. Biz ORN::42a için farklı davranışsal tepkiler (şekil 4) ışık stimülasyon farklı zamansal desenler elde edildi bulundu. Bu tür değişiklikleri UAS-CsChrimson herhangi bir ORNs. içinde ifade değil kontrol larvaları içinde gözlenen değil Bu sonuçları ORN etkinleştirme nasıl zamansal desen anlayışı önemini vurgulamak için hayvan davranış katkıda bulunur.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57353/57353fig1.jpg"> Resim 1 : Davranış arena ve larva gezinme orta. (A) ön kara kutu davranış arena görünümünü. Açık kapı arenanın kutusunun tavana bir CCD kamera ortaya koymaktadır. (B) alt görünümü optogenetic elektrodlar için kullanılan kırmızı LED ışık şeritleri içeren bir metal platformu CCD kamera monte edilir. (C) görünümü assay olarak kullanılan larva gezinme orta üst. Larva hareket kayıt başlamadan önce ~ 20 yıkanmış larva bir 22 cm x 22 cm Petri kabına Merkezi koyulur % 1.5 özel ile katmanlı. Larva içeren Petri kabına arena altında CCD kamera ve kamera için bir ışık kaynağı olarak kullanılan iki kızılötesi LED ışık şeritler arasında ortasına yerleştirilir. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57353/57353fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57353/57353fig2.jpg"> Resim 2 : Optogenetics Kur. Optogenetics kurulum için elektronik düzenleme gösterilen bir Infographic. Kısaca, LED ışık (630 nm) prizine serisi ve teller şeritler gelen bir ahududu PI 2B mikro işlemciye bağlı bir optocoupler içine beslenen. LED ışık şeritler ve optocoupler bir güç kaynağından güç. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57353/57353fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57353/57353fig3.jpg"> Şekil 3 : Hafif harekete geçirmek-in bireysel ORNs larva davranışı üzerinde etkisi. CsChrimson ORN::7a ve ORN::42a ifade larva çalışma uzunluğu farklı ışık etkinleştirme üzerine larva denetlemek için karşılaştırıldığında etkilendi. Her çubuk ortalama RI ± SEM temsil eder (n = 8). ORN::7a etkinleştirildiğinde larva çalışma uzunluğu kontrol önemli ölçüde daha düşük. ORN::42a etkinleştirildiğinde larva çalışma uzunluğu kontrol anlamlı olarak daha yüksek. Çubuklar gösterir ortalama ± SEM (n = 8, Öğrenci t-Testi; "*" p < 0,05, "**" p < 0,001). <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57353/57353fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57353/57353fig4.jpg"> Şekil 4 : ORN etkinleştirme larva davranışı üzerinde farklı zamansal kalıplarının etkisi. (A) ORNs etkinleştirmek için kullanılan uyaranların üç zamansal desen. Uyarıcı a: 1 dk sabit sırasında uyarıcı b: 0,04 Hz ışık stimülasyon, uyarıcı c: 1 Hz ışık stimülasyon sırasında LED ON dakika 2 dönemde hafif. (B) larvaları ışık uyaranların A'da açıklanan üç farklı desen için tabi tutuldu Hafif harekete geçirmek için OFF ON iken açıldığında her nokta ışık uyaranların, her model altında larva davranış değişikliği temsil eder. 'Koşmak uzunluğu' değişim (çalışma uzunluğu (kapalı) - Av. çalışma uzunluğu (ON) Av.) x ekseni üzerinde çizilen. 'Koşmak hız' değişim (koşmak Hız (kapalı) - Av. koşmak Hız (ON) Av.) y ekseninde çizilir. Sol grafik (gri nokta) ölçümleri kontrol larvaları üzerinden ve CsChrimson ORN::42a içinde ifade larvaları üzerinden ölçümleri doğru grafik (kırmızı nokta) temsil eder. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57353/57353fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Final Code PDF" src="/files/ftp_upload/57353/57353code.jpg"> Ek dosya sözdizimi: bir dizi uygun koşullarına uygun kolayca adapte edilebilir basit Matlab kodları ('Tracklarva'). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57353/Final_Code.pdf" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons at JoVE.com

Koku Nöronlarının Optogenetik Uyarımına Yanıt Olarak Drosophila Larva Davranışının Takibi | Sinirbilim | Video

Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

Bu iletişim kuralı Drosophila larva yanıt onun koku nöronlar eşzamanlı optogenetic uyarılması için gezinme davranışını analiz eder. 630 nm dalga boyunda ışık kırmızı kaymıştır kanal rhodopsin ifade bireysel koku nöronlar etkinleştirmek için kullanılır. Larva hareketi aynı anda izlenir, dijital olarak kaydedilmiş ve özel olarak yazılmış yazılım kullanılarak analiz.

Yanıt koku nöronlar Optogenetic uyarılması olarak Drosophila larva davranışını izlemek

The ability of insects to navigate toward odor sources is based on the activities of their first-order olfactory receptor neurons (ORNs). While a ...

tracking-drosophila-larval-behavior-response-to-optogenetic

Nanyang Technological University

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Neuroscience

Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

Ecology

Behavior

SCIENTISTS IN ACTION

7.2K Görüntüleme.  University of Nevada. Bu iletişim kuralı Drosophila larva yanıt onun koku nöronlar eşzamanlı optogenetic uyarılması için gezinme davranışını analiz eder. 630 nm dalga boyunda ışık kırmızı kaymıştır kanal rhodopsin ifade bireysel koku nöronlar etkinleştirmek için kullanılır. Larva hareketi aynı anda izlenir, dijital olarak kaydedilmiş ve özel olarak yazılmış yazılım kullanılarak analiz.

Video: Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed in sensory hairs called sensilla, which cover the surface of olfactory organs. The surface of each sensillum is covered with tiny pores, through which odorants pass and dissolve in a fluid called sensillum lymph, which bathes the sensory dendrites of the OSNs housed in a given sensillum. The OSN dendrites express odorant receptor (OR) proteins, which in insects function as odor-gated ion channels4, 5. The interaction of odorants with ORs either increases or decreases the basal firing rate of the OSN. This neuronal activity in the form of action potentials embodies the first representation of the quality, intensity, and temporal characteristics of the odorant6, 7.
Given the easy access to these sensory hairs, it is possible to perform extracellular recordings from single OSNs by introducing a recording electrode into the sensillum lymph, while the reference electrode is placed in the lymph of the eye or body of the insect. In Drosophila, sensilla house between one and four OSNs, but each OSN typically displays a characteristic spike amplitude. Spike sorting techniques make it possible to assign spiking responses to individual OSNs. This single sensillum recording (SSR) technique monitors the difference in potential between the sensillum lymph and the reference electrode as electrical spikes that are generated by the receptor activity on OSNs1, 2, 8. Changes in the number of spikes in response to the odorant represent the cellular basis of odor coding in insects. Here, we describe the preparation method currently used in our lab to perform SSR on Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae, and show representative traces induced by the odorants in a sensillum-specific manner.

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

Electrophysiological responses of olfactory sensory neurons to odorants can be measured in insects using single sensillum recordings. In this video article we will demonstrate how to perform single sensillum recordings in the antennae of the vinegar fly (Drosophila melanogaster) and the maxillary palps of the malaria mosquito (Anopheles gambiae).

Böcekler Tek Sensillum Kayıtlar Drosophila melanogaster Ve Anofel gambiae</em

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed ...

Nörobilim

Visualization of Larval Segmental Nerves in 3rd Instar Drosophila Larval Preparations

Drosophila melanogaster is emerging as a powerful model system for studying the development and function of the nervous system, particularly because of its convenient genetics and fully sequenced genome. Additionally, the larval nervous system is an ideal model system to study mechanisms of axonal transport as the larval segmental nerves contain bundles of axons with their cell bodies located within the brain and their nerve terminals ending along the length of the body. Here we describe the procedure for visualization of synaptic vesicle proteins within larval segmental nerves. If done correctly, all components of the nervous system, along with associated tissues such as muscles and NMJs, remain intact, undamaged, and ready to be visualized. 3rd instar larvae carrying various mutations are dissected, fixed, incubated with synaptic vesicle antibodies, visualized and compared to wild type larvae. This procedure can be adapted for several different synaptic or neuronal antibodies and changes in the distribution of a variety of proteins can be easily observed within larval segmental nerves.

Visualization of Larval Segmental Nerves in 3rd Instar Drosophila Larval Preparations

Drosophila melanogaster larvae provide an ideal model system to investigate the mechanisms of axonal transport within larval segmental nerves. Using this procedure, 3rd instar larvae carrying various mutations can be compared to wild type larvae.

3 Larvaların segmental sinirler Görselleştirme Rd Instar Drosophila Larvaların Hazırlıkları

Drosophila melanogaster is emerging as a powerful model system for studying the development and function of the nervous system, particularly because of ...

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells in the walls of the lateral ventricle give rise to neuroblasts that migrate for several millimeters along the rostral migratory stream (RMS) to reach and incorporate into the olfactory bulb. To study the different steps and the impact of adult-born neuron integration into preexisting olfactory circuits, it is necessary to selectively label and manipulate the activity of this specific population of neurons. The recent development of optogenetic technologies offers the opportunity to use light to precisely activate this specific cohort of neurons without affecting surrounding neurons4,5. Here, we present a series of procedures to virally express Channelrhodopsin2(ChR2)-YFP in a temporally restricted cohort of neuroblasts in the RMS before they reach the olfactory bulb and become adult-born neurons. In addition, we show how to implant and calibrate a miniature LED for chronic in vivo stimulation of ChR2-expressing neurons.

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Adult-born neurons of the olfactory bulb can be optogenetically controlled using Channelrhodopsin2-expressing lentiviral injection in the rostral migratory stream and chronic photostimulation with an implanted miniature LED.

Kronik Yetişkin doğmuş Koku Nöronlar Seçici Viral İletimi In vivo Optogenetic Uyarım

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells ...

Methods to Assay Drosophila Behavior

Drosophila melanogaster, the fruit fly, has been used to study molecular mechanisms of a wide range of human diseases such as cancer, cardiovascular disease and various neurological diseases1. We have optimized simple and robust behavioral assays for determining larval locomotion, adult climbing ability (RING assay), and courtship behaviors of Drosophila. These behavioral assays are widely applicable for studying the role of genetic and environmental factors on fly behavior. Larval crawling ability can be reliably used for determining early stage changes in the crawling abilities of Drosophila larvae and also for examining effect of drugs or human disease genes (in transgenic flies) on their locomotion. The larval crawling assay becomes more applicable if expression or abolition of a gene causes lethality in pupal or adult stages, as these flies do not survive to adulthood where they otherwise could be assessed. This basic assay can also be used in conjunction with bright light or stress to examine additional behavioral responses in Drosophila larvae. Courtship behavior has been widely used to investigate genetic basis of sexual behavior, and can also be used to examine activity and coordination, as well as learning and memory. Drosophila courtship behavior involves the exchange of various sensory stimuli including visual, auditory, and chemosensory signals between males and females that lead to a complex series of well characterized motor behaviors culminating in successful copulation. Traditional adult climbing assays (negative geotaxis) are tedious, labor intensive, and time consuming, with significant variation between different trials2-4. The rapid iterative negative geotaxis (RING) assay5 has many advantages over more widely employed protocols, providing a reproducible, sensitive, and high throughput approach to quantify adult locomotor and negative geotaxis behaviors. In the RING assay, several genotypes or drug treatments can be tested simultaneously using large number of animals, with the high-throughput approach making it more amenable for screening experiments.

Methods to Assay Drosophila Behavior

Drosophila melanogaster is a genetically and behaviorally tractable model system that has been used to understand the molecular and cellular basis of many important biological processes for over a century 1. Drosophila has been well exploited to gain insights into the genetic basis of fly behavior.

Test için Yöntemler Drosophila Davranış

Drosophila melanogaster, the fruit fly, has been used to study molecular mechanisms of a wide range of human diseases such as cancer, cardiovascular ...

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

In the following we describe the methodological details of appetitive associative olfactory learning in Drosophila larvae. The setup, in combination with genetic interference, provides a handle to analyze the neuronal and molecular fundamentals of specifically associative learning in a simple larval brain.
Organisms can use past experience to adjust present behavior. Such acquisition of behavioral potential can be defined as learning, and the physical bases of these potentials as memory traces1-4. Neuroscientists try to understand how these processes are organized in terms of molecular and neuronal changes in the brain by using a variety of methods in model organisms ranging from insects to vertebrates5,6. For such endeavors it is helpful to use model systems that are simple and experimentally accessible. The Drosophila larva has turned out to satisfy these demands based on the availability of robust behavioral assays, the existence of a variety of transgenic techniques and the elementary organization of the nervous system comprising only about 10,000 neurons (albeit with some concessions: cognitive limitations, few behavioral options, and richness of experience questionable)7-10.
Drosophila larvae can form associations between odors and appetitive gustatory reinforcement like sugar11-14. In a standard assay, established in the lab of B. Gerber, animals receive a two-odor reciprocal training: A first group of larvae is exposed to an odor A together with a gustatory reinforcer (sugar reward) and is subsequently exposed to an odor B without reinforcement 9. Meanwhile a second group of larvae receives reciprocal training while experiencing odor A without reinforcement and subsequently being exposed to odor B with reinforcement (sugar reward). In the following both groups are tested for their preference between the two odors. Relatively higher preferences for the rewarded odor reflect associative learning - presented as a performance index (PI). The conclusion regarding the associative nature of the performance index is compelling, because apart from the contingency between odors and tastants, other parameters, such as odor and reward exposure, passage of time and handling do not differ between the two groups9.

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

Drosophila larvae are able to associate odor stimuli with gustatory reward. Here we describe a simple behavioral paradigm that allows the analysis of appetitive associative olfactory learning.

In iştahlı İlişkilendirilebilir Olfaktör Öğrenme<em&gt; Drosophila</em&gt; Larva

In the following we describe the methodological  details of appetitive associative olfactory learning in Drosophila larvae. The setup, in combination with ...

Drosophila Adult Olfactory Shock Learning

Drosophila have been used in classical conditioning experiments for over 40 years, thus greatly facilitating our understanding of memory, including the elucidation of the molecular mechanisms involved in cognitive diseases1-7. Learning and memory can be assayed in larvae to study the effect of neurodevelopmental genes8-10 and in flies to measure the contribution of adult plasticity genes1-7. Furthermore, the short lifespan of Drosophila facilitates the analysis of genes mediating age-related memory impairment5,11-13. The availability of many inducible promoters that subdivide the Drosophila nervous system makes it possible to determine when and where a gene of interest is required for normal memory as well as relay of different aspects of the reinforcement signal3,4,14,16.
Studying memory in adult Drosophila allows for a detailed analysis of the behavior and circuitry involved and a measurement of long-term memory15-17. The length of the adult stage accommodates longer-term genetic, behavioral, dietary and pharmacological manipulations of memory, in addition to determining the effect of aging and neurodegenerative disease on memory3-6,11-13,15-21.
Classical conditioning is induced by the simultaneous presentation of a neutral odor cue (conditioned stimulus, CS+) and a reinforcement stimulus, e.g., an electric shock or sucrose, (unconditioned stimulus, US), that become associated with one another by the animal1,16. A second conditioned stimulus (CS-) is subsequently presented without the US. During the testing phase, Drosophila are simultaneously presented with CS+ and CS- odors. After the Drosophila are provided time to choose between the odors, the distribution of the animals is recorded. This procedure allows associative aversive or appetitive conditioning to be reliably measured without a bias introduced by the innate preference for either of the conditioned stimuli. Various control experiments are also performed to test whether all genotypes respond normally to odor and reinforcement alone.

Drosophila Adult Olfactory Shock Learning

The method to measure adult Drosophila associative memory is described. The assay is based on the ability of the fly to associate an odor presented with a negative reinforcer (electric shock) and then recall this information at a later time, allowing memory to be measured.

Drosophila Yetişkin Koku Şok Öğrenme

Drosophila have been used in classical conditioning experiments for over 40 years, thus greatly facilitating our understanding of memory, including the ...

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

A growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive manipulation of the neural activity of specific neurons in Drosophila melanogaster1. Chief among these are optogenetic tools, which enable the activation or silencing of specific neurons in the intact and freely moving animal using bright light. Channelrhodopsin (ChR2) is a light-activated cation channel that, when activated by blue light, causes depolarization of neurons that express it. ChR2 has been effective for identifying neurons critical for specific behaviors, such as CO2 avoidance, proboscis extension and giant-fiber mediated startle response2-4. However, as the intense light sources used to stimulate ChR2 also stimulate photoreceptors, these optogenetic techniques have not previously been used in the visual system. Here, we combine an optogenetic approach with a mutation that impairs phototransduction to demonstrate that activation of a cluster of loom-sensitive neurons in the fly's optic lobe, Foma-1 neurons, can drive an escape behavior used to avoid collision. We used a null allele of a critical component of the phototransduction cascade, phospholipase C-&beta;, encoded by the norpA gene, to render the flies blind and also use the Gal4-UAS transcriptional activator system to drive expression of ChR2 in the Foma-1 neurons. Individual flies are placed on a small platform surrounded by blue LEDs. When the LEDs are illuminated, the flies quickly take-off into flight, in a manner similar to visually driven loom-escape behavior. We believe that this technique can be easily adapted to examine other behaviors in freely moving flies.

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

Genetically encoded optogenetic tools enable noninvasive manipulation of specific neurons in the Drosophila brain. Such tools can identify neurons whose activation is sufficient to elicit or suppress particular behaviors. Here we present a method for activating Channelrhodopsin2 that is expressed in targeted neurons in freely walking flies.

Yılında Escape Davranış Optogenetic Uyarım<em&gt; Drosophila melanogaster</em

A  growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive  manipulation of the neural activity of specific neurons in ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

In Koku Reseptör Nöronlar Tüm Dağı ile immün<em&gt; Drosophila</em&gt; Anten

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

Kemirgen Santral Sinir Sistemi vivo optogenetic Stimülasyon içinde

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Optogenetic Stimulation of the Auditory Nerve

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted deaf subjects1-6. Nonetheless, sound coding with current CIs has poor frequency and intensity resolution due to broad current spread from each electrode contact activating a large number of SGNs along the tonotopic axis of the cochlea7-9. Optical stimulation is proposed as an alternative to electrical stimulation that promises spatially more confined activation of SGNs and, hence, higher frequency resolution of coding. In recent years, direct infrared illumination of&#160;the cochlea has been used to evoke responses in the auditory nerve10. Nevertheless it requires higher energies than electrical stimulation10,11 and uncertainty remains as to the underlying mechanism12. Here we describe a method based on optogenetics to stimulate SGNs with low intensity blue light, using transgenic mice with neuronal expression of channelrhodopsin 2 (ChR2)13 or virus-mediated expression of the ChR2-variant CatCh14. We used micro-light emitting diodes (&#181;LEDs) and fiber-coupled lasers to stimulate ChR2-expressing SGNs through a small artificial opening (cochleostomy) or the round window. We assayed the responses by scalp recordings of light-evoked potentials (optogenetic auditory brainstem response: oABR) or by microelectrode recordings from the auditory pathway and compared them with acoustic and electrical stimulation.

Cochlear implants (CIs) enable hearing by direct electrical stimulation of the auditory nerve. However, poor frequency and intensity resolution limits the quality of hearing with CIs. Here we describe optogenetic stimulation of the auditory nerve in mice as an alternative strategy for auditory research and developing future CIs.

İşitsel Sinir optogenetic uyarılması

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted ...