Bu eser CREST JST (grant sayı JPMJCR14W4), toplum için promosyon, bilim (JSP'ler) KAKENHI (grant sayı 25600060, 16 K 16386), MEXT ve JST, proje anahtar değerlendirme teknoloji geliştirme odaklı yenilik Program Merkezi tarafından desteklenmiştir Tıbbi araştırma ve geliştirme, AMED, Mizuho temel bilimler tanıtımı için Japonya Ajansı. Microfabrication Kyoto Üniversitesi Nano teknoloji Hub tarafından desteklenmiştir.

1. mikrosıvısal aygıt kalıp imalatı
<ol><li>Piyasada bulunan yazılım kullanarak mikrosıvısal aygıt desen tasarım (Clewin5 veya AutoCAD 2016, vs.). Clewin5 işlevi için (http://manualzz.com/doc/7159150/clewin-user-s-manual) kullanım kılavuzuna başvurun. Not: Tasarım dosyası ek dosya 1' de kullanılabilir.</li>
	<li>Bir mikro desen jeneratör için tasarım dosya transferi ve olumlu fotorezist ile kaplı bir krom maske aracı yükleyin.</li>
	<li>Bir mikro Desen Oluşturucu'yu kullanmamanızı desen alanında pozitif fotorezist maruz.</li>
	<li>Geliştirici (Tablo reçetesi) kullanarak pozitif fotorezist geliştirmek ve maskeyi deiyonize (DI) su ile durulayın.</li>
	<li>Krom etchant (Malzeme tablo) kullanarak, nerede olumlu fotorezist kaldırıldı açık alan içinde krom etch. Maskeyi DI su ile durulayın.</li>
	<li>Fotorezist aseton kullanarak maske üzerinde kalan kaldırın. Not: Saydamlık maskesi Cr maskesi için bir alternatif olabilir.</li>
	<li>Temiz silikon gofret hazırlamak (4 inç, P(100)) ve spin kat hexamethyldisilazane (HMDS) 3000 devirde 30 s.</li>
	<li>120 ° C ve serin gofret oda sıcaklığında 5 min için 5 min için Softbake HMDS.</li>
	<li>Spincoat negatif fotorezist (tablo malzemelerin) 10 s 500 devir/dakika ve 30 için 1200 devir/dakika, s. Not: Spin kaplama koşulu fotorezist katmanları gofret üzerinde yaklaşık 100 µm kalınlığında fotolitografi sonra verim.</li>
	<li>95 ° C'de 45 dk için negatif fotorezist ppost ve gofret için oda sıcaklığında 60 dk serin.</li>
	<li>Her denemede UV ışık yoğunluğunu kontrol edin ve toplam pozlama enerji dozu 250 mW/cm2çekim hızı hesaplamak. Photomask (Adım 1.1-1.6) üzerinde gofret yerleştirin ve UV ışığına karşılaşmazlar.</li>
	<li>1 dk. 65 ° c ve 95 ° C'de 5 min için negatif fotorezist postbake Oda sıcaklığında 1 dakika soğumasını gofret ver.</li>
	<li>Negatif fotorezist katmanı 15dk ilk geliştirici (Tablo reçetesi) banyoda ve ikinci banyoda 2 min için geliştirmek. 10 için ilk isopropanol (IPA) banyoda gofret durulama s ve 10 ikinci IPA banyoda s.</li>
	<li>Hardbake negatif fotorezist 200 ° C ve serin gofret için oda sıcaklığında 5 dk, 30 dk için.</li>
	<li>Bir yüzey profiler kullanarak negatif fotorezist katman kalınlığını ölçmek.</li>
	<li>Bir vakum pompası bağlı bir desiccator gofret yerleştirin ve silane (trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane)., 200 µL ekleyin 10 dk için pompa açmak sonra kapatmak ve gofret 4 h için desiccator unutmayın.</li>
</ol>2. üretim adımları ve PDMS katmanları montajı
<ol><li>Polydimethylsiloxane (PDMS) ön polimer döküm (PDMS Bankası: Ajan kür 10:1 (w/w) =) ve 2 h için bir vakum odasında degas.</li>
	<li>Bir hava Bacalı fırın gecede 80° C'de PDMS kesin çözüm.</li>
	<li>Silikon gofret üzerinden PDMS akasındaki.</li>
	<li>Delik 1A - 3B yumruk (şekil 1) ve küresel kültür iyi. 3B ve 1 mm çapında küresel için de yumruk - 2 mm çapında yumruk delikleri 1A için kullanın.</li>
	<li>PDMS levha ve cam kapak kayma (24 mm × 24 mm) yapışkan bant ile tekrar tekrar yapışmasını ve bandı peeling temizleyin. Hava plazma 40 ile PDMS levha tedavi s (40 mW, 50 sccm).</li>
	<li>PDMS levha üzerine herhangi bir hava kabarcıkları PDMS levha ve kapak astarlı ve tedavi için en az 12 h 80 ° c arasında yüzeyinden çıkarmak için cam kapak Not bağ.</li>
</ol>3. küresel hazırlık
Not: kırmızı floresan protein insan göbek ifade çalışmada, damar endotel hücreleri (RFP-HUVECs) ve yeşil flüoresan protein ifade HUVECs (GFP-HUVECs) küresel ve mikro, sırasıyla, kökeni ayırt etmek için kullanılır HUVECs sonra perfusable vasküler ağ. HUVECs kökeni gerekmiyorsa, etiketlenmemiş HUVECs deney için yeterlidir.
<ol><li>RFP-HUVECs (3.0 × 105 hücreleri/flakon) ve insan akciğer fibroblast (hLF) (1,0 × 106 hücreler/flakon) çözülme ve endotel hücreleri ve fibroblast hücreleri, orta 10 mL içine sırasıyla ekleyin (Malzemeler tablo). Onları CO2 37 ° C ve %5 100-mm tabak içinde 2-3 gün boyunca alt Konfluent RFP-HUVECs ve hLFs için kültür. Bu hazırlık ~ 200 pulcuklarının ortaya çıkarır.</li>
	<li>RFP-HUVECs ve hLFs yemeklerin 2 mL % 0.05 tripsin-EDTA ile bağlantısını kesin ve DMEM % 10 (v/v) fetal sığır serum (FBS) ve %1 (v/v) penisilin/streptomisin içeren tripsin tepki 4 mL ile durdurmak.</li>
	<li>Santrifüjü vasıl 220 x g 3 dk sonra süpernatant kaldırmak ve RFP-HUVECs ve hLFs sırasıyla son hücre konsantrasyonları 2.5 × 104 ve 1,0 × 105 hücre/mL, endotel orta resuspend.</li>
	<li>Yavaşça iyi başına hücre süspansiyon (RFP HUVECs için 5000 hücreleri) ve hLFs için 20.000 hücreleri 200 µL Ultra düşük bağlama yüzeyli bir 96-şey plaka ekleyin.</li>
	<li>96-şey plaka CO2 37 ° C ve %5 2-4 günlük bir süre için kuluçkaya. Not: Kültür süresi ve ilk cep numarasını 96-şey plaka üzerinde küresel çapı bağlı olduğundan, bu iki parametre tarafından denetlenebilir.</li>
</ol>4. hücre mikrosıvısal cihazda tohumlama
Not: Delikleri, kanalları ve küresel için adlandırma kuralı de gösterdi şekil 1' de. Biz gün 0 zaman mikrosıvısal cihazın içine hücre hasat bitmiş gün tanımlar. Deneysel zaman çizelgeleri şeması Şekil 2' de gösterilmiştir.
<ol><li>Gün – 1) küresel yükleme Not: Aşağıdaki adımı buza jelleşme kollajen ve fibrin önlemek için yapılmalıdır.<ol>
<li>Fibrinojen fosfat tamponlu tuz (PBS) 2.80 mg/mL nihai bir konsantrasyon için geçiyoruz.</li>
		<li>Etkisiz kollajen (3.0 mg/mL PBS) üreticinin protokolüne göre hazırlayın.</li>
		<li>107.2 µL fibrinojen çözüm (2.80 mg/mL), 8.0 µL etkisiz kollajen (3.0 mg/mL) ve aprotinin tepki bir tüp (5 U/mL) 3.6 µL birleştirir. Bu çözüm "ana mix çözüm" etiketli (MS). Not: Bir küresel yükleme için yeterli birimdir. Birden fazla küresel ise, her birim pulcuklarının sayısı ile çarpın.</li>
		<li>50 U/mL nihai bir konsantrasyon için PBS içinde Trombin geçiyoruz. Not: 50 U/mL Trombin (20 µL/tüp) Aliquots −30 ° C saklanır ve her deneme önce çözdürülen.</li>
		<li>Biyogüvenlik kabini içinde pulcuklarının içeren 96-şey tabak koyun.</li>
		<li>Biyogüvenlik dolap, bir tabak üzerinde buz (çanak 1) ve benchtop (dish 2) üzerinde diğer çanak içinde iki 35-mm Petri yemekler hazırlamak. Damlalıklı 99 µL of MS çanak 1 (bir damlacık oluşturmak içinşekil 3a) ortasına.</li>
		<li>İpuçları (10-100 µL) 2 sarı trim ve 3 pulcuklarının pulcuklarının cihazın içine enjekte ve medya cihazın içine enjekte MS, hassas pulcuklarının topluluğu ile Trombin karıştırma 96-şey plaka topluluğu için pipet İpuçları (1-100 µL) temizleyin , sırasıyla. İpucu gözenek boyutu biraz delik 1A - 3B Kanal 1 ve 3 çapından daha büyük olmalıdır veya küresel su kuyusu içinde Kanal 2 bir rahat için uygun. Not: Bundan sonra aksi belirtilmediği sürece, bu adımda kesmek pipet ipuçlarını kullanın. Kesme ipuçları fotoğraf şekil 4' te kullanılabilir.</li>
		<li>Bir küresel orta 100 µL ile 96-şey plaka toplayabilir ve çanak 2 (şekil 3a) ekleyebilir.</li>
		<li>Küresel medya dish 2 üzerinden en küçük birim ile almak. Pipettor dik tutarak, küresel yerçekimi tarafından damlalıklı ipucu dibe doğru hareket etmeliyiz. Küresel damlalıklı ipucu tabak 1 (şekil 3a) MS damlacık Menisküs üzerine dokunarak dışarı atmak. Not: Aşağıdaki adımları 4.1.10 & 4.1.11 hızlı bir şekilde yapılmalıdır.</li>
		<li>Trombin (50 U/mL) 1 µL ekleyin ve karışımı yavaşça sarı damlalıklı ucu ile.</li>
		<li>7 µL ayarla pipet ile küresel kadar almak ve yavaş yavaş küresel kuyuya (şekil 3b) yerleştirin.</li>
		<li>Fibrin jelleşme için 37 ° C'de 15 dakika kuluçkaya.</li>
		<li>Yavaş yavaş delik 1A ve 3A ve dolgu Kanal 1 ve 3 endotel ortamından medya ile enjekte (20 ~ 30 µL/kanal).</li>
		<li>Aygıtın aygıt (şekil 3 c) ortamdan buharlaşma önlemek için ıslak bir Kimwipe ile 100 mm çanak yerleştirin.</li>
		<li>Aygıt için medya ve fibrin arasında arayüz kabarcıklar kaldırmak 24 h 37 ° C ve % 5 CO2 yerleştirin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>0 gün) HUVECs yükleme<ol>
<li>GFP-HUVECs (3.0 x 105 hücreleri/şişe) çözülme ve endotel orta 10 mL ekleyin. Onları 100-mm bulaşık 37 ° C ve % 5 CO2 alt-confluency ulaşmak 2-3 gün içinde kültür. Bir tabak alt Konfluent GFP-HUVECs 8-10 cihazların hazırlama için yeterli.</li>
		<li>GFP-HUVECs 2 mL % 0.05 tripsin-EDTA ile yemeklerin bağlantısını kesin ve DMEM % 10 (v/v) fetal sığır serum (FBS) ve %1 (v/v) penisilin/streptomisin içeren tripsin tepki 4 mL ile durdurmak.</li>
		<li>220 x g 3 dk de aralıklarla sonra GFP HUVECs 5.0 x 106 hücre/mL, endotel ortamda resuspend.</li>
		<li>HUVECs hücre süspansiyon Kanal 1 delik 1B aracılığıyla içine enjekte (20 µL/kanal).</li>
		<li>Mikrosıvısal aygıt 90 ° yatırmayı, yanına koyun ve HUVECs Kanal 2 fibrin uymasını sağlamak 30 dk 37 ° C'de kuluçkaya.<ol>
<li>HUVECs eki fibrin üzerinde onaylayın. Jel ve orta arasında arayüz, bağlı HUVECs sayısı yeterli olmadığı zaman damarlara vasküler kökündeki aygıt kültür (şekil 5) bir kaç gün sonra bağlantısı kesilmiş olabilir. İletişim kuralında, perfüzyon başarı oranı olduğunu > % 50.</li>
		</ol>
</li>
		<li>4.2.4 4.2.5 kanal 3 aygıtlarından.</li>
		<li>37 ° C ve % 5 CO2 7-14 gün boyunca nemli bir Kimwipe ile 100 mm çanak kültür hücreleri.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gün 1 ~) ortam değişimi<ol>
<li>Kanal 1 ve 3 medyada yarısı her gün değişimi.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. çekirdek boyama
<ol><li>%4 paraformaldehyde (PFA) PBS hazırlayın.</li>
	<li>Kanal 1 ve 3 medyayı çıkarın ve 20 µL % 4'lük eklemek PFA kanal başına. %4 çözümde değiştirmek için İngiltere'de yılın, tekrar çözüm aygıtınızdan kaldırdığınızda ve % 4 ekleyerek PFA üç kez.</li>
	<li>Cihazın 4 ° C'de gecede kuluçkaya.</li>
	<li>% 4 kaldırma aygıt ve yıkama PFA kanalları üç kez PBS ile.</li>
	<li>10 µg/ml floresan boyalar (Tablo reçetesi) 20 µL hücresel çekirdeği leke kanal başına ekleyin. Cihazın çözümde değişimi için çözüm aygıtınızdan kaldırdığınızda ve 10 µg/mL ekleyerek floresan boya üç kez tekrarlayın.</li>
	<li>4 ° C'de 24 h için aygıt depolar.</li>
</ol>6. sıvı perfüzyon bir küresel
<ol><li>Küresel fazla 7 gün içinde belgili tanımlık aygıt 37 ° C ve % 5 CO2 sürekli bir damar yolu tamamlanması için kültür sonra hazırlayın.</li>
	<li>Orta delik 1A, 1B, 3A ve 3B kaldırın.</li>
	<li>Floresein isothiocyanate (FITC) 10 µM çözüm 10 µL tanıtmak-PBS içinde dextran delik 1A ve 1B.</li>
	<li>Lastikteki veya ters bir mikroskop altında FITC boya akışını izlemek.</li>
</ol>7. Filiz uzunluğu miktar
Not: ImageJ ver 1.49 yazılım tüm bu çalışmada görüntü analizi için kullanılır.
<ol><li>GFP-HUVECs gün 0, 1, 3, 5 ve 7 görüntülerin üst üste geliyor.</li>
	<li>Damarlara Günün İpucu'nu 0, 1, 3, 5 ve 7 gün çekilen görüntüleri aynı konumdan konumunu çıkarma.</li>
	<li>Kök konumu (şekil 6) vasküler ucundan büyüme belirlemek. Vasküler ipucu ve kök arasındaki mesafe (şekil 7b) Bu çalışmada Filiz uzunluğu olarak tanımlanmıştır.</li>
</ol>8. miktar vasküler açıların
Not: damar Açı açı oluşuyordu damar açı, kök ve küresel (Şekil 7 c) merkezi olarak tanımlanmıştır.
<ol><li>RFP-HUVECs içeren coculture küresel floresan görüntülerini binarize ve ImageJ analiz fonksiyonu tarafından "centroid" konum ölçmek. Bu çalışmada, ölçülen "centroid" konumu (şekil 6) küresel merkezi olarak tanımlanır.</li>
	<li>7. adımda aynı şekilde vasküler ipuçları ve kökleri konumunu belirleyin.</li>
	<li>ImageJ yazılımında analiz işlevini kullanarak vasküler açıları ölçmek.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Abbott, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+culture:+Biology's+new+dimension.">Cell culture: Biology's new dimension.</a> Nature. 424 (6951), 870-872 (2003).</li><li>Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+third+dimension+bridges+the+gap+between+cell+culture+and+live+tissue.">The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).</li><li>Shamir, E. R., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+organotypic+culture:+experimental+models+of+mammalian+biology+and+disease.">Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).</li><li>Abu-Absi, S. F., Friend, J. R., Hansen, L. K., Hu, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+polarity+and+functional+bile+canaliculi+in+rat+hepatocyte+spheroids.">Structural polarity and functional bile canaliculi in rat hepatocyte spheroids.</a> Experimental Cell Research. 274 (1), 56-67 (2002).</li><li>Bissell, M. J., Radisky, D. C., Rizki, A., Weaver, V. M., Petersen, O. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+organizing+principle:+microenvironmental+influences+in+the+normal+and+malignant+breast.">The organizing principle: microenvironmental influences in the normal and malignant breast.</a> Differentiation. 70 (9-10), 537-546 (2002).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+role+for+netrins+in+regulating+epithelial+behavior+during+lung+branching+morphogenesis.">Novel role for netrins in regulating epithelial behavior during lung branching morphogenesis.</a> Current Biology. 14 (10), 897-905 (2004).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-U147 (2009).</li><li>Torisawa, Y. S., Shiku, H., Kasai, S., Nishizawa, M., Matsue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation+assay+on+a+silicon+chip+applicable+for+tumors+extirpated+from+mammalians.">Proliferation assay on a silicon chip applicable for tumors extirpated from mammalians.</a> International Journal of Cancer. 109 (2), 302-308 (2004).</li><li>Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid+culture+as+a+tool+for+creating+3D+complex+tissues.">Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues.</a> Trends in Biotechnology. 31 (2), 108-115 (2013).</li><li>Sutherland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+And+Environment+Interactions+In+Tumor+Microregions+-+The+Multicell+Spheroid+Model.">Cell And Environment Interactions In Tumor Microregions - The Multicell Spheroid Model.</a> Science. 240 (4849), 177-184 (1988).</li><li>Rothbauer, M., Zirath, H., Ertl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+microfluidic+technologies+for+cell-to-cell+interaction+studies.">Recent advances in microfluidic technologies for cell-to-cell interaction studies.</a> Lab on a Chip. , (2017).</li><li>Matsuura, K., Utoh, R., Nagase, K., Okano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+sheet+approach+for+tissue+engineering+and+regenerative+medicine.">Cell sheet approach for tissue engineering and regenerative medicine.</a> Journal of Controlled Release. 190, 228-239 (2014).</li><li>Esch, E. W., Bahinski, A., Huh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organs-on-chips+at+the+frontiers+of+drug+discovery.">Organs-on-chips at the frontiers of drug discovery.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 14 (4), 248-260 (2015).</li><li>Bhatia, S. N., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+organs-on-chips.">Microfluidic organs-on-chips.</a> Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).</li><li>Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organogenesis+in+a+dish:+Modeling+development+and+disease+using+organoid+technologies.">Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies.</a> Science. 345 (6194), (2014).</li><li>Hirschhaeuser, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicellular+tumor+spheroids:+An+underestimated+tool+is+catching+up+again.">Multicellular tumor spheroids: An underestimated tool is catching up again.</a> Journal of Biotechnology. 148 (1), 3-15 (2010).</li><li>Lancaster, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+organoids+model+human+brain+development+and+microcephaly.">Cerebral organoids model human brain development and microcephaly.</a> Nature. 501 (7467), 373 (2013).</li><li>Takebe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascularized+and+functional+human+liver+from+an+iPSC-derived+organ+bud+transplant.">Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant.</a> Nature. 499 (7459), 481 (2013).</li><li>Taguchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redefining+the+In+Vivo+Origin+of+Metanephric+Nephron+Progenitors+Enables+Generation+of+Complex+Kidney+Structures+from+Pluripotent+Stem+Cells.">Redefining the In Vivo Origin of Metanephric Nephron Progenitors Enables Generation of Complex Kidney Structures from Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 14 (1), 53-67 (2014).</li><li>Takasato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kidney+organoids+from+human+iPS+cells+contain+multiple+lineages+and+model+human+nephrogenesis.">Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis.</a> Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).</li><li>Auger, F. A., Gibot, L., Lacroix, D., Yarmush, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 15, 177-200 (2013).</li><li>Inamori, M., Mizumoto, H., Kajiwara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Approach+for+Formation+of+Vascularized+Liver+Tissue+by+Endothelial+Cell-Covered+Hepatocyte+Spheroid+Integration.">An Approach for Formation of Vascularized Liver Tissue by Endothelial Cell-Covered Hepatocyte Spheroid Integration.</a> Tissue Engineering Part A. 15 (8), 2029-2037 (2009).</li><li>Kunz-Schughart, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+of+fibroblasts+to+regulate+the+formation+of+three-dimensional+vessel-like+structures+from+endothelial+cells+in+vitro.">Potential of fibroblasts to regulate the formation of three-dimensional vessel-like structures from endothelial cells in vitro.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 290 (5), C1385-C1398 (2006).</li><li>Rouwkema, J., De Boer, J., Van Blitterswijk, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cells+assemble+into+a+3-dimensional+prevascular+network+in+a+bone+tissue+engineering+construct.">Endothelial cells assemble into a 3-dimensional prevascular network in a bone tissue engineering construct.</a> Tissue Engineering. 12 (9), 2685-2693 (2006).</li><li>Kim, S., Lee, H., Chung, M., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+functional,+perfusable+3D+microvascular+networks+on+a+chip.">Engineering of functional, perfusable 3D microvascular networks on a chip.</a> Lab on a Chip. 13 (8), 1489-1500 (2013).</li><li>Moya, M. L., Hsu, Y. H., Lee, A. P., Hughes, C. C. W., George, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Perfused+Human+Capillary+Networks.">In Vitro Perfused Human Capillary Networks.</a> Tissue Engineering Part C-Methods. 19 (9), 730-737 (2013).</li><li>Nashimoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+perfusable+vascular+networks+with+a+three-dimensional+tissue+in+a+microfluidic+device.">Integrating perfusable vascular networks with a three-dimensional tissue in a microfluidic device.</a> Integrative Biology. 9 (6), 506-518 (2017).</li><li>Huang, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+microscale+cellular+niches+for+three-dimensional+multicellular+co-cultures.">Engineering microscale cellular niches for three-dimensional multicellular co-cultures.</a> Lab on a Chip. 9 (12), 1740-1748 (2009).</li><li>Newman, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Stromal+Cell+Secretomes+Reveals+a+Critical+Role+for+Stromal+Cell-Derived+Hepatocyte+Growth+Factor+and+Fibronectin+in+Angiogenesis.">Analysis of Stromal Cell Secretomes Reveals a Critical Role for Stromal Cell-Derived Hepatocyte Growth Factor and Fibronectin in Angiogenesis.</a> Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 33 (3), 513 (2013).</li><li>Newman, A. C., Nakatsu, M. N., Chou, W., Gershon, P. D., Hughes, C. C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+requirement+for+fibroblasts+in+angiogenesis:+fibroblast-derived+matrix+proteins+are+essential+for+endothelial+cell+lumen+formation.">The requirement for fibroblasts in angiogenesis: fibroblast-derived matrix proteins are essential for endothelial cell lumen formation.</a> Molecular Biology of the Cell. 22 (20), 3791-3800 (2011).</li><li>Griffith, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion+limits+of+an+in+vitro+thick+prevascularized+tissue.">Diffusion limits of an in vitro thick prevascularized tissue.</a> Tissue Engineering. 11 (1-2), 257-266 (2005).</li><li>Zheng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+in+Liquid+Tumors:+An+In+Vitro+Assay+for+Leukemic-Cell-Induced+Bone+Marrow+Angiogenesis.">Angiogenesis in Liquid Tumors: An In Vitro Assay for Leukemic-Cell-Induced Bone Marrow Angiogenesis.</a> Advanced Healthcare Materials. 5 (9), 1014-1024 (2016).</li><li>Osaki, T., Sivathanu, V., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crosstalk+between+developing+vasculature+and+optogenetically+engineered+skeletal+muscle+improves+muscle+contraction+and+angiogenesis.">Crosstalk between developing vasculature and optogenetically engineered skeletal muscle improves muscle contraction and angiogenesis.</a> Biomaterials. 156, 65-76 (2018).</li></ol>

Yazar ilan hiçbir rakip mali çıkarlarının zorundalar.

Önceki raporları hLFs angiopoietin-1, angiogenin, hepatosit büyüme faktörü, büyüme faktör-α, tümör nekrozis faktör ve bazı hücre dışı matriks proteinleri29dönüşüm gibi birden çok anjiogenik faktörlerin bir kokteyl salgılar göstermek, 30. Bu tahlil anjiogenik salgı ilgili kısıtlama tekniği, coculture küresel hLFs üzerinden kullanır. Bu nedenle, coculture küresel ve Kanal 1 ve 3 HUVECs arasındaki mesafe kısaltılmış bir kuyunun dibinde bir coculture küresel ayarlamak istikrarlı bir damar oluşumu için önemlidir. Böylece daha kısa mesafe istikrarlı damar oluşumu için avantajlı fibroblastlar gelen damar uzunluğu endotel hücreleri ile fibroblastlar31arasındaki mesafe ters orantılıdır. Ancak, bir küresel delik (1 mm çapında) zarar veren Kanal 1 ve 3 açmak için 1.5 mm Kanal 2 minimum genişliği oldu.
Her ne kadar küresel Kuyunun dibinde yerleşir, vasküler kökleri microposts veya mikro (şekil 5) Zaman zaman kesildi. Bu durumda, hiçbir reaktif vasküler Lümen mikro (Kanal 1 veya 3) üzerinden ulaşabilir. Her ne kadar biz bu sorunu tamamen çözmek olabilir değil, sorun HUVECs yetersiz sayıda fibrin jel (Adım 4.2.1-4.2.6) yüzeyine, kaynaklanmaktadır varsayıyorum. Stabil Kanal 2 yan duvar eklemek HUVECs emin olun.
Kuyunun içine bir küresel başarılı enjeksiyon doğru iç ve dış çap micropipette ipuçları adım 4.1.7 en iyi duruma getirme önemlidir: 1) iç çap küresel daha büyük olmalıdır. 2) dış dimeter böylece hiçbir sızıntı jel kuyunun başında enjeksiyon sırasında oluşur ve belgili tanımlık uç-ebilmek var olmak kolayca çıkarmak jel enjeksiyon sonra kuyu kenarına oturur. Mevcut içinde iyi bir küresel (φ1 mm), yaklaşık 700 µm enjekte edilebilir küresel için maksimum çapı iletişim kuralıdır. Eğer iyi çapı daha büyük iç çapları için belgili tanımlık uç kesilmiş çünkü bu protokol için daha büyük pulcuklarının enjekte büyük ressam. Küresel çapı 96-şey plaka hasat cep numarasını değiştirerek kolaylıkla kontrol edilebilir.
Bu iletişim kuralı öncelikle roman mikrosıvısal platform bir küresel perfusable bir damar ağı oluşturmak için gösterir. Her ne kadar HUVECs ile coculture içinde bir küresel18,23,24gemi benzeri yapıların oluşumu sağlar, bunlar lumina çıkmaz nedeniyle perfusable değildi. Çünkü fibroblast hücreleri coculture küresel bir vaskülarizasyon pulcuklarının çeşitli bir tür bazı hedefleme diğer hücrelere eklenmesiyle çok yönlü dokularda (kemik, adipocyte ve kanser, vb), mevcut beklenebilir, hangi içinde taklit edebilir vivo ortamı geleneksel küresel kültür daha iyi. Teknik uygulama genişletmek için yapılacak çalışmalar pulcuklarının olmadan fibroblast hücreleri ilavesi vaskülarizasyon yer alacak. Bazı son çalışır rapor kemik iliği stromal hücreler32 ve kas hücreleri33 angiogenez mikrosıvısal cihazlarda tetikleyebilir. Fibroblast hücreleri yerine stromal veya kas hücreleri kullanan mikrosıvısal cihazda skarların doku sayısını artıracak. Bu iletişim kuralı bir uzun zamandır beklenen teknik üç boyutlu kültür alanında olduğu doku vaskülarizasyon için temel bir platform sağlar.

Üç boyutlu bir kültüre monolayer (iki boyutlu) kültüründen değişen motive yaşayan hücresel işlevlerini taklit kültür modelleri ile çalışması gerektiğinden dokular1,2,3. Düz ve sert plastik yüzeylerde yaygın olarak kullanılan hücre kültüründe insan vücudu hücre dışı ortamlarda çoğu benzer değil. Aslında, birçok çalışma o üç boyutlu kültür yeniden doku özgü mimari, mekanik ve biyokimyasal ipuçları ve hücre-hücre iletişim, geleneksel iki boyutlu kültür4' tegözlenen değil göstermek, 5,6,7,8.
Bir çok hücreli agrega veya küresel, bir bu üç boyutlu kültür9,10gerçekleştirmek için en umut verici teknikleri biridir. Hücreleri hücre dışı Matriks (ECM) salgılar ve diğerleri ile küresel etkileşim kurabilir. Her ne kadar bazı diğer Biyomühendislik gibi hücre istifleme,11,12,13,14, yaklaşımlar başarıyla insan vücudunun kayma karmaşıklık çoğaltmak, yalnızca iki veya üç bu yaklaşımlar var hücreler analiz kolaylığı ve hedef organlar üzerinde duruldu yalnızca bir işlev için türlü. Buna ek olarak, pulcuklarının hücrelerde besinler, oksijen ve parakrin ve küresel olarak sinyal otokrin heterojen temini nedeniyle küresel konumlarına bağlı olarak farklı kültür ortamlara maruz kalır. Bu özelliği pulcuklarının, kısmen vivo içinde kültür durumu ve olanaklı kılmak çok daha karmaşık, organize doku oluşturmak için pulcuklarının hücrelerde vitro bu yığın doku9', kültürlü yapısı taklit eder 15 , 16. bir küresel tek bir hücre oluşur, küresel hücrelerde işlevi nedeniyle küresel türdeş olmayan ortamda tek tip olmadığını unutmayın. Son birkaç yıl içinde küresel kültürler embriyonik kök hücreleri (ESCs), indüklenen pluripotent kök hücreler (iPSCs) veya doku yerleşik kök hücre içinde vivo gelişimsel dizileri taklit ve mini-organ beyin17gibi yeniden girebilir, karaciğer18ve böbrek19,20.
Küresel kültür teknikleri önemli ilerlemeye rağmen hala uzun bir süre için büyük pulcuklarının kültür problemlidir. Üç boyutlu bir doku hücreleri oksijen ve besin21sınırlı kaynağı nedeniyle bir kan damarı 150-200 µm içinde bulunduğu gerekir. Küresel içinde damar ağları arasında kan ve doku içinde vivoalışverişi maddeler özetlemek gereklidir. Bunu başarmak için diğer gruplar endotel hücreleri hedef hücre22,23,24 ile birlikte kültürlü veya pluripotent hücreler farklılaşma CD31 pozitif hücreler20içine indüklenen. Yine de, bildirilen gemi benzeri yapıları lumina oksijen ve besin küresel ortasına sağlamak için açık uçları var mı. Üç boyutlu kültür hücrelerde besleyen damar rol taklit etmek için açık uçlu ve perfusable damar ağı içinde küresel geliştirilmelidir.
Son birkaç yıl içinde bazı araştırma grupları microengineering alanındaki kendiliğinden bir mikrosıvısal cihazda anjiogenik faktörler cocultured fibroblast hücreleri25 kullanarak oluşturduğu bir perfusable vasküler ağ oluşturmak için yöntemleri bildirdi. ,26. Vasküler bu şebekeler için in vivo meslektaşlarına benzer görünümdeki ve vasküler fonksiyonlar bir küresel kültür taklit için uygundur çevresel faktörler tarafından yenilenmiş. Bu iletişim kuralının amacı bir mikrosıvısal platformu27kullanarak bir küresel perfusable vasküler ağlarda oluşturmaktır. Böylece bir küresel dahil edilebilir mikrosıvısal aygıt daha önce bildirilen aygıt25 değiştirilir. Bir küresel fibroblast hücrelerinde üzerinden anjiogenik salgı mikro endotel hücreleri yönlendirerek tarafından anjiogenik ile küresel anastomosed mikro üzerinden lahanası ve perfusable bir damar ağı kurdu. Bu yöntem, floresan molekülleri ve damar ağları ile uzun vadeli bir doku kültürü için çerçeve sağlar bir küresel iç içine mikrometre ölçekli boncuk gibi maddeleri geniş bir doğrudan teslim sağlar.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AutoCAD 2017</td>
			<td>Autodesk</td>
			<td>AutoCAD 2017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A chromium mask coated with AZP 1350.</td>
			<td>CLEAN SURFACE TECHNOLOGY</td>
			<td>CBL2506Bu-AZP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro pattern generator</td>
			<td>Heidelberg</td>
			<td>uPG101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MF CD-26 developer</td>
			<td>Rohm and haas electronic materials</td>
			<td>-</td>
			<td>Developer in protocol 1.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S-Clean</td>
			<td>Sasaki Chemical</td>
			<td>S-24</td>
			<td>Chromium etchant in protocol 1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aceton</td>
			<td>Wako</td>
			<td>012-00343</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon Wafer</td>
			<td>Canosis</td>
			<td>SiJ-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin Coater</td>
			<td>MIKASA</td>
			<td>1H-D7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexamethyldisilazane (HMDS)</td>
			<td>Tokyo Ohka Kogyo</td>
			<td>H0089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 3050</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td>-</td>
			<td>Negative photoresist in protocol 1.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Exposure</td>
			<td>Nanometric Technology Inc</td>
			<td>LA310s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 Developer</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td>Y020100</td>
			<td>Developer for the negative photoresist in protocol 1.13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-propanol</td>
			<td>Wako</td>
			<td>163-04841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surhace profiler</td>
			<td>Vecco</td>
			<td>Veeco Dektak XT-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>448931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane (PDMS)</td>
			<td>Dow Corning Toray</td>
			<td>184W/C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy Punch (1.0mm)&#160;</td>
			<td>Kai Industries</td>
			<td>BP-10F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy Punch (2.0mm)&#160;</td>
			<td>Kai Industries</td>
			<td>BP-20F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma System</td>
			<td>Femto Science</td>
			<td>COVANCE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass</td>
			<td>MATSUNAMI GLASS</td>
			<td>C024241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture Dishes</td>
			<td>Iwaki</td>
			<td>1000-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RFP Expressing Human Umbilical Vein Endothelial Cell</td>
			<td>Angio Proteomie</td>
			<td>cAP-0001RFP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Human Lung Fibroblasts</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-2512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Growth Medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast Growth Media Kits</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>26140079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution</td>
			<td>Wako</td>
			<td>168-23191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.05w/v% Trypsin-0.53mmol/l EDTA&#8226; 4Na Solution with Phenol Red</td>
			<td>Wako</td>
			<td>204-16935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (Phosphate Buffered Salts)</td>
			<td>Takara bio</td>
			<td>T900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Sumitomo bakelite</td>
			<td>631-21031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000ul Chip</td>
			<td>NIPPON Genetics</td>
			<td>FG-402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200ul&#160; Chip</td>
			<td>NIPPON Genetics</td>
			<td>FG-301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10ul Chip</td>
			<td>NIPPON Genetics</td>
			<td>37650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Model 370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP Expressing Human Umbilical Vein Endothelial Cell</td>
			<td>Angio Proteomie</td>
			<td>cAP-0001GFP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibrinogen from bovine plasma</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F8630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aprotinin from bovine lung</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin from bovine plasma</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H21492</td>
			<td>Fluorescent dye to stain nuclei in protocol 5.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde Solution</td>
			<td>Wako</td>
			<td>163-25983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Fluorescence Microscope</td>
			<td>OLYMPUS</td>
			<td>IX71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Degital CCD Camera</td>
			<td>OLYMPUS</td>
			<td>ORCA-R2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Laser Scanning Biological Microscope</td>
			<td>OLYMPUS</td>
			<td>FV1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Fluorescence Microscope</td>
			<td>OLYMPUS</td>
			<td>IX-83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein isothiocyanate-dextran</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>FD70S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

perfusable vascular network with a tissue model in a microfluidic device

Bir küresel (çok hücreli agrega) insan vücudunun içinde yaşayan doku iyi bir model olarak kabul edilir. Küresel kültürler içinde önemli ilerleme rağmen pulcuklarının perfusable vasküler ağlarda korumak ve protein ifadeler ve morfogenetik gibi işlevlerini geliştirmek için gerekli uzun vadeli kültür için kritik bir meydan okuma kalır. Protokol perfusable bir damar ağı içinde küresel bir mikrosıvısal cihazın entegre etmek için yeni bir yöntem sunuyor. Küresel perfusable vasküler ağlarda ikna etmek için mikro için bağlı anjiogenik lahanası için küresel anjiogenik faktörler küresel kültürlü insan akciğer fibroblastlar üzerinden kullanarak destekli. Anjiogenik lahanası küresel işbirliği kültürlü endotel hücreleri ile birleştirilmiş küresel ulaştı ve sürekli bir damar ağı kurdu. Vasküler ağ olmadan herhangi bir küresel iç sıvı. İnşa vasküler ağ daha fazla besin temini ve atık ürünlerin, kan dolaşımını içinde vivotaklit kaldırılması için bir yol olarak kullanılabilir. Yöntemi küresel kültür yaşam dokuların daha iyi Rekapitülasyon doğru yeni bir platform sağlar.

Şekil 1 bir tasarım ve fotoğraf mikrosıvısal cihazın gösterir. Hangi kanalda 2 küresel de içeren üç paralel kanal içerir. Kanal 1 ve 3 HUVEC kültürü için kullanılan ve 2 için küresel kanalıdır. Her kanal trapez microposts desen PDMS tasarlanmış ayrılır. Microposts Kanal 2 hidrojel yüzey gerilimi tarafından kanallarına 1 ve 3 sızıntı önlemek ve mikro28arasında küresel ve HUVECs maddelerin değişimi sağlar.
Şekil 7a bir mikrosıvısal Aygıt Merkezi hücre tohum sonra gösterir. Parlak alan ve floresan görüntüleri gün 0 alınan fibrin jel sadece 2 olmadan herhangi bir kanalı kanal 1 ve 3 dolu ve HUVECs başarıyla fibrin jel yanak için bağlı olduğunu göstermektedir. Her iki dolu küresel odak parlak alan görüntü olduğunu ve küresel düzgün cihazın alt kısmında yerleşmiş gösteren microposts. Anjiogenik filizi 1 gün ve saat (şekil 7b) ile lahanası artar uzunluğu gözlenir. Günde 3, en uzun Filiz küresel ulaştı ve 7 günde anjiogenik lahanası çoğunu küresel (ortalama mesafe Kanal 1 ve 3 küresel < 500 µm) ulaştı. En iyi durumda, aygıt kültür, 4 gün sonra vasküler Lümen ile akışı görülebilir. Damar açı vasküler ipucu yönleri ve vasküler kökünden küresel merkezi olarak tanımlanmıştır. Şekil 7 7 gün içinde aygıt kültür sırasında quantified damar açı görüntülenir. Vasküler açıları anjiogenik lahanası küresel doğru göç gösteren bir saat-bağımlı şekilde azaldı.
Şekil 8 nerede RFP-HUVECs ve GFP-HUVECs birleştirilmiş vasküler ağ bölümünü gösterir. Coordinately RFP-HUVECs ve GFP-HUVECs tek bir vasküler Lümen açıkça anjiogenik lahanası kanallardan 1 ve 3 küresel RFP-HUVECs için anastomosed gösterir ve sürekli bir damar ağı kurdu ok uçları ile gösterildiği gibi kurdu. Perfusability damar ağının onaylamak için FITC dextran Kanal 1 enjekte ettiler. FITC-dextran Kanal 1 inşa vasküler ağ ve küresel iç akıyordu ve sonunda Kanal 3 (Şekil 9) ulaştı. FITC dextran çözüm perfüzyon sırasında extravascular uzaya damar ağından hiçbir sızıntı vardır. Bu daha önce küçük moleküller vasküler Lümen enjekte damar duvarından geçmek ve extravascular bölgelerinde hücrelerle tepki gösterilmiştir. Buna ek olarak, permeabilite katsayısı damar ağının bu vivo içinde27yakın olduğu gösterilmiştir. Bu sonuçlar tümleşik vasküler ağ küresel için besin kaynağı ve atık ürün kaldırmak anlamına.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57242/57242fig1.jpg"> Resim 1 : Tasarım ve mikrosıvısal aygıt fotoğrafı. (a) mikrosıvısal cihazın tasarımına genel bakış. Gri alan üç mikrosıvısal kanal trapez microposts tarafından ayrılmış gösterir. Kanal 2 küresel kültür için iyi vardır. Doğru rakam soldaki kırmızı dikdörtgende büyütülmüş görünümü görüntüler. (b) olan kanalları kırmızı mürekkeple doldurulur mikrosıvısal aygıt fotoğrafı. <a href="/files/ftp_upload/57242/57242fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57242/57242fig2.jpg"> Resim 2 : Deneysel saat. <a href="/files/ftp_upload/57242/57242fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57242/57242fig3v2.jpg"> Şekil 3 : Bir küresel mikrosıvısal cihazın içine yüklemek için yöntem. (a) MS ve medya ile bir küresel bir damla iki ayrı yemekleri yapma. Ardından küresel Trombin ile MS aktarın. (b) şematik kesit görünümü küresel enjeksiyon sırasında cihazın. Jel aşırı miktarda dışarı delik 2A ve 2B'yi akar. Ancak, küresel fiziksel doğumdan nedeniyle cihazın altındaki kalır. (c) şeması cihazların bir kuluçka makinesine olduklarında. 35-mm tabağı ile cihazın üzerinde Kimwipe konuldu ve ıslak Kimwipe 100-mm tabak içinde yerleştirildi. <a href="/files/ftp_upload/57242/57242fig3v2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57242/57242fig4.jpg"> Şekil 4 : Pipet ipuçları fotoğraf kesmek aygıta tohum hücrenin. Sol beyaz ucu delik 1A, 1B, 3A ve 3 C ve fibrin jel (Adım 4.1.9, 4.1.13, 4.2.4 ve 4.2.6) bir damla için transfer küresel içindir. Orta sarı ucu küresel kuyudan 96-(Adım 4.1.7) topluluğu içindir. Şu beyaz ucu küresel kuyu (adımı 4.1.11) olduğunu. İpuçları kesim önce de fotoğrafta gösterilir. <a href="/files/ftp_upload/57242/57242fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57242/57242fig5.jpg"> Şekil 5 : Perfusable damarlara. Anjiogenik lahanası mikro üzerinden microposts arasında açılması için bağlamak vermedi ve Lümen ve mikro (siyah oklar) arasındaki bağlantıyı kaybettim. Kanal 1 ve 3 numaralı seribaşı yetersiz HUVECs neden olur. Kırmızı: RFP-HUVECs küresel içinde yeşil: GFP-HUVECs mikro üzerinden. Hücreleri cihazda 14 gün boyunca kültürlü. <a href="/files/ftp_upload/57242/57242fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57242/57242fig6v2.jpg"> Şekil 6 : Vasküler kök, ipucu ve küresel Merkezi tanımını. (a) vasküler kök ve Filiz uzunluğu ölçmek için ipucu konumunu belirlemek için yöntem. Hızlandırılmış floresan görüntüleri hizalama sonra birkaç gün sonra aygıtı kültür alınan floresan görüntü gün 0 görüntü tarafından çıkarılır. ImageJ yazılım tarafından çıkarma sonra filizi uzunluğu ölçülür. (b) küresel Merkezi tanımı. RFP HUVECs floresan görüntülerini binarized ve kendi centroid ImageJ yazılım tarafından ölçülür. Biz centroid küresel merkezi olarak tanımlar. <a href="/files/ftp_upload/57242/57242fig6v2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57242/57242fig7.jpg"> Şekil 7 : Mikrosıvısal cihazın vasküler bir ağ oluşumu. (a) hücre tohum sonra bir mikrosıvısal cihazın bir merkezinin zaman hata görüntüler. Kırmızı: Küresel, yeşil RFP HUVECs kültürlü: GFP-HUVECs Kanal 1 ve 3 hasat. Filiz uzunluğu (b) ve vasküler açı (c) kantitatif analiz (n = 42 filizi 3 aygıtlar'da, hata çubukları standart hatalar (S.E.) gösterir). Filiz uzunluğu gün 0 (b, üst) vasküler ucu HUVECs konumunu mesafe olarak tanımlanmıştır. Açısı (∠TRS) vasküler kök (R), uç (T) ve (S) (c, üst) küresel Merkezi tarafından tanımlanmıştır. Şekil 6 vasküler kök, ipucu ve küresel Merkezi açıklaması için bkz. Bu veri ImageJ yazılımını kullanarak elde edilmiştir. Filiz uzunluğu ve damar açı tanımını açıklayan şemaları Nashimoto, Y. ve ark. değiştirilir 27. <a href="/files/ftp_upload/57242/57242fig7large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57242/57242fig8v2.jpg"> Şekil 8 : Mikro ve küresel HUVECs tarafından vasküler Lümen oluşumu. (a) örnek aygıt kültür 14 gün sonra bakış floresan görüntü. Sarı dikdörtgen (b) gösterilen optik bölüm x-y konumunu gösterir. (b) x-y, y-z ve x-z optik bölümünü inşa vasküler ağ. Beyaz okları vasküler Lümen gösterir. Kırmızı: Küresel, yeşil RFP HUVECs kültürlü: GFP-HUVECs mikro, mavi kültürlü: hücresel çekirdeği. (a) (a) görüntü fiksasyonun önce olduğu için hiçbir mavi Floresans gösterir. <a href="/files/ftp_upload/57242/57242fig8v2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57242/57242fig9.jpg"> Şekil 9 : İnşa bir damar ağı kullanarak bir küresel perfüzyon. Parlak alan (a) ve floresan görüntüleri (b) küresel aygıt kültür 7 gün sonra. (c) floresan FITC dextran sonra aynı küresel imajını (70 kDa) yükleme. Kırmızı: RFP-HUVECs küresel ve Kanal 1 ve 3, yeşil: FITC-dextran, mavi: hücresel çekirdeği. <a href="/files/ftp_upload/57242/57242fig9large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
Ek dosya 1: mikrosıvısal aygıt tasarımını. Dxf biçiminde dosyasıdır. <a href="/files/ftp_upload/57242/Supplementary_File_1.dxf" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Perfusable Vascular Network with a Tissue Model in a Microfluidic Device at JoVE.com

Perfusable Vascular Network with a Tissue Model in a Microfluidic Device

Perfusable vasküler ağ özellikli bir doku içinde bir mikrosıvısal aygıt

Protokol bir küresel perfusable vasküler ağlarda mühendisi açıklar. Küresel'ın çevresindeki microenvironment angiogenez teşvik ve küresel bir mikrosıvısal cihazın mikro bağlanmak için planlanmaktadır. Yöntemi uzun zamandır beklenen tekniktir üç boyutlu kültürlerde küresel perfüzyon sağlar.

A spheroid (a multicellular aggregate) is regarded as a good model of living tissues in the human body. Despite the significant advancement in the ...

perfusable-vascular-network-with-tissue-model-microfluidic

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

13.8K Görüntüleme.  Kyoto University. Protokol bir küresel perfusable vasküler ağlarda mühendisi açıklar. Küresel'ın çevresindeki microenvironment angiogenez teşvik ve küresel bir mikrosıvısal cihazın mikro bağlanmak için planlanmaktadır. Yöntemi uzun zamandır beklenen tekniktir üç boyutlu kültürlerde küresel perfüzyon sağlar.

Video: Perfusable Vascular Network with a Tissue Model in a Microfluidic Device

Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro

We have developed a microfluidic device that mimics the delivery and systemic clearance of drugs to heterogeneous three-dimensional tumor tissues in vitro. Nutrients delivered by vasculature fail to reach all parts of tumors, giving rise to heterogeneous microenvironments consisting of viable, quiescent and necrotic cell types. Many cancer drugs fail to effectively penetrate and treat all types of cells because of this heterogeneity. Monolayers of cancer cells do not mimic this heterogeneity, making it difficult to test cancer drugs with a suitable in vitro model. Our microfluidic devices were fabricated out of PDMS using soft lithography. Multicellular tumor spheroids, formed by the hanging drop method, were inserted and constrained into rectangular chambers on the device and maintained with continuous medium perfusion on one side. The rectangular shape of chambers on the device created linear gradients within tissue. Fluorescent stains were used to quantify the variability in apoptosis within tissue. Tumors on the device were treated with the fluorescent chemotherapeutic drug doxorubicin, time-lapse microscopy was used to monitor its diffusion into tissue, and the effective diffusion coefficient was estimated. The hanging drop method allowed quick formation of uniform spheroids from several cancer cell lines. The device enabled growth of spheroids for up to 3 days. Cells in proximity of flowing medium were minimally apoptotic and those far from the channel were more apoptotic, thereby accurately mimicking regions in tumors adjacent to blood vessels. The estimated value of the doxorubicin diffusion coefficient agreed with a previously reported value in human breast cancer. Because the penetration and retention of drugs in solid tumors affects their efficacy, we believe that this device is an important tool in understanding the behavior of drugs, and developing new cancer therapeutics.

Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro

We present the procedure for fabrication and operation of a microfluidic device that recreates heterogeneous tumor microenvironments in vitro. The variability in apoptosis within tumor tissue was quantified using fluorescent stains and the effective diffusion coefficient of the chemotherapeutic drug doxorubicin into tumor tissue was evaluated.

Bir Tümör Mikroçevre yeniden oluşturmak için mikroakışkan Cihazı<em&gt; In vitro</em

We have developed a microfluidic device that mimics the delivery and systemic clearance of drugs to heterogeneous three-dimensional tumor tissues in ...

Biyomühendislik

A Microfluidic Device for Studying Multiple Distinct Strains

The study of cell responses to environmental changes poses many experimental challenges: cells need to be imaged under changing conditions, often in a comparative manner. Multiwell plates are routinely used to compare many different strains or cell lines, but allow limited control over the environment dynamics. Microfluidic devices, on the other hand, allow exquisite dynamic control over the surrounding conditions, but it is challenging to image and distinguish more than a few strains in them. Here we describe a method to easily and rapidly manufacture a microfluidic device capable of applying dynamically changing conditions to multiple distinct yeast strains in one channel. The device is designed and manufactured by simple means without the need for soft lithography. It is composed of a Y-shaped flow channel attached to a second layer harboring microwells. The strains are placed in separate microwells, and imaged under the exact same dynamic conditions. We demonstrate the use of the device for measuring protein localization responses to pulses of nutrient changes in different yeast strains.

We present a simple method to produce microfluidic devices capable of applying similar dynamic conditions to multiple distinct strains, without the need for a clean room or soft lithography.

Birden Farklı Suşlarının incelenmesi için bir mikroakışkan Cihazı

The study of cell responses to environmental changes poses many experimental challenges: cells need to be imaged under changing conditions, often in a ...

Microfluidic Fabrication of Polymeric and Biohybrid Fibers with Predesigned Size and Shape

A &#8220;sheath&#8221; fluid passing through a microfluidic channel at low Reynolds number can be directed around another &#8220;core&#8221; stream and used to dictate the shape as well as the diameter of a core stream.&#160;Grooves in the top and bottom of a microfluidic channel were designed to direct the sheath fluid and shape the core fluid.&#160;By matching the viscosity and hydrophilicity of the sheath and core fluids, the interfacial effects are minimized and complex fluid shapes can be formed.&#160;Controlling the relative flow rates of the sheath and core fluids determines the cross-sectional area of the core fluid.&#160;Fibers have been produced with sizes ranging from 300 nm to ~1 mm, and fiber cross-sections can be round, flat, square, or complex as in the case with double anchor fibers. Polymerization of the core fluid downstream from the shaping region solidifies the fibers.&#160;Photoinitiated click chemistries are well suited for rapid polymerization of the core fluid by irradiation with ultraviolet light.&#160;Fibers with a wide variety of shapes have been produced from a list of polymers including liquid crystals, poly(methylmethacrylate), thiol-ene and thiol-yne resins, polyethylene glycol, and hydrogel derivatives. Minimal shear during the shaping process and mild polymerization conditions also makes the fabrication process well suited for encapsulation of cells and other biological components.

Two adjacent fluids passing through a grooved microfluidic channel can be directed to form a sheath around a prepolymer core; thereby&#160;determining both shape and cross-section. Photoinitiated polymerization, such as thiol click chemistry, is well suited for rapidly solidifying the core fluid into a microfiber with predetermined size and shape.

Önceden Tasarlanmış Boyut ve Şekle Sahip Polimerik ve Biyohidred Elyafların Mikroakışkan İmalatı

A &#8220;sheath&#8221; fluid passing through a microfluidic channel at low Reynolds number can be directed around another &#8220;core&#8221; stream and ...

Protocol for Biofilm Streamer Formation in a Microfluidic Device with Micro-pillars

Several bacterial species possess the ability to attach to surfaces and colonize them in the form of thin films called biofilms. Biofilms that grow in porous media are relevant to several industrial and environmental processes such as wastewater treatment and CO2 sequestration. We used Pseudomonas fluorescens, a Gram-negative aerobic bacterium, to investigate biofilm formation in a microfluidic device that mimics porous media. The microfluidic device consists of an array of micro-posts, which were fabricated using soft-lithography. Subsequently, biofilm formation in these devices with flow was investigated and we demonstrate the formation of filamentous biofilms known as streamers in our device. The detailed protocols for fabrication and assembly of microfluidic device are provided here along with the bacterial culture protocols. Detailed procedures for experimentation with the microfluidic device are also presented along with representative results.

Protocols for the study of biofilm formation in a microfluidic device that mimics porous media are discussed. The microfluidic device consists of an array of micro-pillars and biofilm formation by Pseudomonas fluorescens in this device is investigated.

Mikro-ayağı ile bir mikroakışkan Aygıt Biyofilm Çıtası Formasyonu Protokolü

Several bacterial species possess the ability to attach to surfaces and colonize them in the form of thin films called biofilms. Biofilms that grow in ...

Analyzing Mixing Inhomogeneity in a Microfluidic Device by Microscale Schlieren Technique

In this paper, we introduce the use of microscale schlieren technique to measure mixing inhomogeneity in a microfluidic device. The microscale schlieren system is constructed from a Hoffman modulation contrast microscope, which provides easy access to the rear focal plane of the objective lens, by removing the slit plate and replacing the modulator with a knife-edge. The working principle of microscale schlieren technique relies on detecting light deflection caused by variation of refractive index1-3. The deflected light either escapes or is obstructed by the knife-edge to produce a bright or a dark band, respectively. If the refractive index of the mixture varies linearly with its composition, the local change in light intensity in the image plane is proportional to the concentration gradient normal to the optical axis. The micro-schlieren image gives a two-dimensional projection of the disturbed light produced by three-dimensional inhomogeneity.
To accomplish quantitative analysis, we describe a calibration procedure that mixes two fluids in a T-microchannel. We carry out a numerical simulation to obtain the concentration gradient in the T-microchannel that correlates closely with the corresponding micro-schlieren image. By comparison, a relationship between the grayscale readouts of the micro-schlieren image and the concentration gradients presented in a microfluidic device is established. Using this relationship, we are able to analyze the mixing inhomogeneity from associate micro-schlieren image and demonstrate the capability of microscale schlieren technique with measurements in a microfluidic oscillator4. For optically transparent fluids, microscale schlieren technique is an attractive diagnostic tool to provide instantaneous full-field information that retains the three-dimensional features of the mixing process.

Herein, we describe a procedure that employs microscale schlieren technique to measure mixing inhomogeneity in a microfluidic device. Through calibration, distribution of concentration gradient can be derived from the micro-schlieren image.

Mikro Schlieren Tekniği ile bir mikroakışkan Aygıt karıştırma homojen Analizi

In this paper, we introduce the use of microscale schlieren technique to measure mixing inhomogeneity in a microfluidic device. The microscale schlieren ...

Microfluidic Genipin Deposition Technique for Extended Culture of Micropatterned Vascular Muscular Thin Films

The chronic nature of vascular disease progression requires the development of experimental techniques that simulate physiologic and pathologic vascular behaviors on disease-relevant time scales. Previously, microcontact printing has been used to fabricate two-dimensional functional arterial mimics through patterning of extracellular matrix protein as guidance cues for tissue organization. Vascular muscular thin films utilized these mimics to assess functional contractility. However, the microcontact printing fabrication technique used typically incorporates hydrophobic PDMS substrates. As the tissue turns over the underlying extracellular matrix, new proteins must undergo a conformational change or denaturing in order to expose hydrophobic amino acid residues to the hydrophobic PDMS surfaces for attachment, resulting in altered matrix protein bioactivity, delamination, and death of the tissues.
Here, we present a microfluidic deposition technique for patterning of the crosslinker compound genipin. Genipin serves as an intermediary between patterned tissues and PDMS substrates, allowing cells to deposit newly-synthesized extracellular matrix protein onto a more hydrophilic surface and remain attached to the PDMS substrates. We also show that extracellular matrix proteins can be patterned directly onto deposited genipin, allowing dictation of engineered tissue structure. Tissues fabricated with this technique show high fidelity in both structural alignment and contractile function of vascular smooth muscle tissue in a vascular muscular thin film model. This technique can be extended using other cell types and provides the framework for future study of chronic tissue- and organ-level functionality.

We present a method for microfluidic deposition of patterned genipin and fibronectin on PDMS substrates, allowing extended viability of vascular smooth muscle cell-dense tissues. This tissue fabrication method is combined with previous vascular muscular thin film technology to measure vascular contractility over disease-relevant time courses.

Micropatterned Vasküler Musküler İnce Filmlerin Genişletilmiş Kültür mikroakışkan Genipin Biriktirme Tekniği

The chronic nature of vascular disease progression requires the development of experimental techniques that simulate physiologic and pathologic vascular ...

Custom-designed Laser-based Heating Apparatus for Triggered Release of Cisplatin from Thermosensitive Liposomes with Magnetic Resonance Image Guidance

Liposomes have been employed as drug delivery systems to target solid tumors through exploitation of the enhanced permeability and retention (EPR) effect resulting in significant reductions in systemic toxicity. Nonetheless, insufficient release of encapsulated drug from liposomes has limited their clinical efficacy. Temperature-sensitive liposomes have been engineered to provide site-specific release of drug in order to overcome the problem of limited tumor drug bioavailability. Our lab has designed and developed a heat-activated thermosensitive liposome formulation of cisplatin (CDDP), known as HTLC, to provide triggered release of CDDP at solid tumors. Heat-activated delivery in vivo was achieved in murine models using a custom-built laser-based heating apparatus that provides a conformal heating pattern at the tumor site as confirmed by MR thermometry (MRT). A fiber optic temperature monitoring device was used to measure the temperature in real-time during the entire heating period with online adjustment of heat delivery by alternating the laser power. Drug delivery was optimized under magnetic resonance (MR) image guidance by co-encapsulation of an MR contrast agent (i.e.,&#160;gadoteridol) along with CDDP into the thermosensitive liposomes as a means to validate the heating protocol and to assess tumor accumulation. The heating protocol consisted of a preheating period of 5 min prior to administration of HTLC and 20 min heating post-injection. This heating protocol resulted in effective release of the encapsulated agents with the highest MR signal change observed in the heated tumor in comparison to the unheated tumor and muscle. This study demonstrated the successful application of the laser-based heating apparatus for preclinical thermosensitive liposome development and the importance of MR-guided validation of the heating protocol for optimization of drug delivery.

AN MRI-compatible&#160;custom-designed laser-based heating apparatus has been developed to provide local heating of subcutaneous tumors in order to activate release of agents from thermosensitive liposomes specifically at the tumor region.

Manyetik Rezonans Görüntü Rehberlik ile Termosensitif Lipozomlu gelen Sisplatinin Tetikleme Release için özel tasarlanmış Lazer-bazlı ısıtma Aparatı

Liposomes have been employed as drug delivery systems to target solid tumors through exploitation of the enhanced permeability and retention (EPR) effect ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet high-throughput, method to perform single-cell culture experiments. Here, we report a microfluidic chip-based strategy for high-efficiency single-cell isolation (~77%) and demonstrate its capability of performing long-term single-cell culture (up to 7 d) and cellular heterogeneity analysis using clonogenic assay. These applications were demonstrated with KT98 mouse neural stem cells, and A549 and MDA-MB-435 human cancer cells. High single-cell isolation efficiency and long-term culture capability are achieved by using different sizes of microwells on the top and bottom of the microfluidic channel. The small microwell array is designed for precisely isolating single-cells, and the large microwell array is used for single-cell clonal culture in the microfluidic chip. This microfluidic platform constitutes an attractive approach for single-cell culture applications, due to its flexibility of adjustable cell culture spaces for different culture strategies, without decreasing isolation efficiency.

Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture.

Yüksek verim Tek hücreli İzolasyonu ve Kültür mikroakışkan Platformu

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

Co-culture of Living Microbiome with Microengineered Human Intestinal Villi in a Gut-on-a-Chip Microfluidic Device

Here, we describe a protocol to perform long-term co-culture of multi-species human gut microbiome with microengineered intestinal villi in a human gut-on-a-chip microphysiological device. We recapitulate the intestinal lumen-capillary tissue interface in a microfluidic device, where physiological mechanical deformations and fluid shear flow are constantly applied to mimic peristalsis. In the lumen microchannel, human intestinal epithelial Caco-2 cells are cultured to form a &#39;germ-free&#39; villus epithelium and regenerate small intestinal villi. Pre-cultured microbial cells are inoculated into the lumen side to establish a host-microbe ecosystem. After microbial cells adhere to the apical surface of the villi, fluid flow and mechanical deformations are resumed to produce a steady-state microenvironment in which fresh culture medium is constantly supplied and unbound bacteria (as well as bacterial wastes) are continuously removed. After extended co-culture from days to weeks, multiple microcolonies are found to be randomly located between the villi, and both microbial and epithelial cells remain viable and functional for at least one week in culture. Our co-culture protocol can be adapted to provide a versatile platform for other host-microbiome ecosystems that can be found in various human organs, which may facilitate in vitro study of the role of human microbiome in orchestrating health and disease.

We describe an in vitro protocol to co-culture gut microbiome and intestinal villi for an extended period using a human gut-on-a-chip microphysiological system.

içinde Microengineered İnsan Bağırsak Villi Oturma mikrobiyomu Co-kültür, bir Gut-on-a-Chip mikroakışkan Aygıt

Here, we describe a protocol to perform long-term co-culture of multi-species human gut microbiome with microengineered intestinal villi in a human ...

Image-guided, Laser-based Fabrication of Vascular-derived Microfluidic Networks

This detailed protocol outlines the implementation of image-guided, laser-based hydrogel degradation for the fabrication of vascular-derived microfluidic networks embedded in PEGDA hydrogels. Here, we describe the creation of virtual masks that allow for image-guided laser control; the photopolymerization of a micromolded PEGDA hydrogel, suitable for microfluidic network fabrication and pressure head-driven flow; the setup and use of a commercially available laser scanning confocal microscope paired with a femtosecond pulsed Ti:S laser to induce hydrogel degradation; and the imaging of fabricated microfluidic networks using fluorescent species and confocal microscopy. Much of the protocol is focused on the proper setup and implementation of the microscope software and microscope macro, as these are crucial steps in using a commercial microscope for microfluidic fabrication purposes that contain a number of intricacies. The image-guided component of this technique allows for the implementation of 3D image stacks or user-generated 3D models, thereby allowing for creative microfluidic design and for the fabrication of complex microfluidic systems of virtually any configuration. With an expected impact in tissue engineering, the methods outlined in this protocol could aid in the fabrication of advanced biomimetic microtissue constructs for organ- and human-on-a-chip devices. By mimicking the complex architecture, tortuosity, size, and density of in vivo vasculature, essential biological transport processes can be replicated in these constructs, leading to more accurate in vitro modeling of drug pharmacokinetics and disease.

This protocol outlines the implementation of image-guided, laser-based hydrogel degradation to fabricate vascular-derived, biomimetic microfluidic networks embedded in poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) hydrogels. These biomimetic microfluidic systems may be useful for tissue engineering applications, generation of in vitro disease models, and fabrication of advanced "on-a-chip" devices.

Vasküler kaynaklı mikroakışkan Ağların görüntü kılavuzluğunda, Lazer tabanlı Fabrikasyon

This detailed protocol outlines the implementation of image-guided, laser-based hydrogel degradation for the fabrication of vascular-derived microfluidic ...