Bu çalışma Sağlık hibe Ulusal Enstitüsü # 1R01CA120825-01A1, Massachusetts Amherst Üniversitesi İşbirlikçi Biyomedikal Araştırma (CBR) Programı ve Bhushan J. Toley için Isenberg Bursu ile desteklenmiştir. Biz minnetle James Schafer, kameramanların, anlatıcı ve bu video editörü değerli katkısını kabul.

1. Cihaz İmalatı Elastomerik malzemeler içinde mikroakış özellikleri çoğaltma Duffy ve diğerleri tarafından tarif edilen metoda dayanır. 1 <ol><li> Karışım elastomer (polidimetilsiloksan, PDMS) ile 9:1 ağırlık oranında silikon elastomer Kit (Dow Corning, Midland, MI) sertleştirme maddesi ve 4 mm kalınlığında bir katman oluşturmak için ana üzerine dökün. Degas, 5 saat boyunca 60 ° C &#39;de hava kabarcıklarını çıkarmak ve karışım tedavi etmek. Peel Elastomer üzerindeki akış özellikleri bir damga elde etmek için kalıp PDMS tedavi. </li><li> 1.5 mm biyopsi yumruk (Miltex, York, PA) kullanılarak giriş ve çıkışları için Punch delik bir matkap basın üzerine monte. Herhangi bir enkaz dışarı çekin. </li><li> Damga özellikleri yan ve bir oksijen plazma yakıcısı 8 dakika oksijen plazma temiz bir cam slayt koşuluyla. Bunların arasında bir bağ oluşturmak üzere hemen temas içinde muameleye tabi olan yüzeylerde getirin. En az 5 saat süreyle sıcak bir slayt üzerine 60 ° C&#39;de montaj koruyuns bağı güçlendirmek için. </li><li> Dikenli dişi luer lock konnektör (Qosina, Edgewood, NY) bağlı erkek luer kilit bir arabirim konnektörleri kullanarak giriş ve çıkışları için 0.032 &quot;ID PTFE (Cole Parmer, Vernon Hills, IL) bağlayın. </li><li> Vafleri ve bir Y-konnektör (; Şekil 1 Upchurch Bilimsel, Oak Harbor, WA) kullanarak akış montaj ayarlayın. Mikroskop cihazı monte edin. 20G 1.5 &quot;iğne (Bioscience BD, Rockville, MD) kullanılarak tüp için şırınga takın. </li></ol> 2. Üniforma sferoidlerin Oluşumu Sferoidler asılı damla yöntemi 2,3 oluşturulmuştur. <ol><li> Steril bir hücre kültürü kaputu altında hücreleri Trypsinize. </li><li> 5 dakika boyunca 2000 rpm&#39;de santrifüje hücreler tripsinize ve 6 ml taze ortam içinde tekrar süspansiyon haline getirin. Istenen bir nihai konsantrasyon (Tablo 1) stok çözeltisi ile seyreltilir. </li><li> 48 kuyu plaka kapağını çıkarın ve ste baş aşağı yerleştirinkaput rilized. Her iyi karşılık Genelgesi bölgelerde kapağında görülür. Nemi korumak için sterilize 1 mL su ile plakanın her doldurun. Bir mikropipet kullanılarak her bir dairesel bölge içinde seyreltilmiş hücre solüsyonu 20 ul damlacık koyun. Dikkatli bir şekilde kapağı ters çevirin ve damla kuyuların kenarlarına dokunmayın sağlanması, plaka üzerine yerleştirin. </li><li> Belirli bir gün sayısı (Tablo 1) için 37 ° C&#39;da plaka inkübe edin. Bir sfero Her asılı damla oluşturacaktır. </li></ol> 3. Cihaz içine sferoidlerin Giriş Bu bölüm için 1 ve Tablo 2 Şekil bakın. <ol><li> Akış giriş aracılığıyla uygulamaya% 70 etanol ile yıkama yoluyla sterilize cihaz. PBS hücre besiyerinin tamponlu HEPES izledi sahip sonra, yıkayın. Tüp bağlı orta şırınga S F bırakın. </li><li> Şırınga S P içine 2-3 sferoidler çizin, hava kabarcıklarını çıkarmak için şırınga dokunun veCihazın ambalaj giriş bağlanırlar. </li><li> Açık giriş vanası V Pin ve yakın V Fin. Aç çıkış valfi V Pout ve yakın V Fçıkış. Aşağı doğru iğne ile dikey paketleme şırıngayı tutun; sferoidlerin iğne luer lock konnektör içine şırınga altına yerleşmek gibi izleyebilirsiniz. Ambalaj şırınga ve izlemek sferoidler üzerindeki pimi itin cihazın içine boru ve akış girin. Ancak ambalaj çıkış valfı açık olduğundan, bir küremsi cihazın odasına girer ve arka (Şekil 2) ileti korunabilir. </li><li> Kapat giriş vanası V Pin ve çıkış vanası V Pout. Bir şırınga pompası üzerinde şırınga S F monte edin. Açık vana V Fin ve vana V Fçıkış. 3 ul / dk akış cihaz içine ortamı. </li></ol> 4. Apoptoz algılama Agent Giriş (CaspGLOW) Sferoidler sahip odaları ambalaj sonra, u için dengeleme izintespit apoptozis veya terapötik ajanlar tanıtmadan önce, besin gradyanlar ve mikroçevrelerde kurmak için 24 saat s. Odasındaki doku üst ve alt delinmez duvarları ile temas halinde oldukları için, doku kalınlığı boyunca hiçbir besin eğimleri (0,15) bulunmaktadır. 24 saatlik inkübasyon sonrasında doku kalınlığı boyunca hücre tabakaları bu nedenle eşdeğerdir ve sadece heterojen uzağa akış kanalından bir yönde. <ol><li> V Fin kapatın, şırınga pompası durdurmak, pompa şırınga S F kaldırmak ve 0.25 ul / CaspGLOW Kırmızı Aktif Kaspaz-3 işaretleyici (Kırmızı-DEVD-FMK ml içeren orta olan bir şırınga ile değiştirin; Biovision, Mountain View, CA). </li><li> El ile büyük orta yerinden sağlamak için aygıt ile bu çözeltinin 0.7 ml yıkayın. , Pompa üzerinde şırınga monte akışını yeniden başlatın ve açık V Fin. 5-8 saatlik bir süre içinde, apoptoz t içine ajan diffüze tespitO doku ve apoptotik bölgelerinde parlak fluoresces. Bu konsantrasyonda Apoptoz tespit ajan cihaza sonraki tüm akış çözümleri korunur. </li></ol> Not: <ol class="lroman"><li> Doku heterojenlik Bölüm 6&#39;da tarif edildiği gibi flöresan doğrusal yoğunluk profilleri elde ile teyit edilebilir. Profiller doku hücre canlılığı açısından heterojen olduğunu doğrulayarak, apoptoz mekansal degradeleri göstermelidir. </li><li> CaspGLOW Green Aktif Kaspaz-3 işaretleyici (fluorescein-DEVD-FMK; Biovision) aynı zamanda apoptoz tespit etmek için de kullanılabilir. Bu işaretleyici yerine kırmızı fluorofor rodamin arasında yeşil fluorofor floresein içerir. </li></ol> 5. Terapötik Ajan Tanıtımı <ol><li> Ajan tespit apoptoz içeren; 10 uM doksorubisin hidroklorür (Sigma-Aldrich, St Louis, MO Dox) tanıtmak için adımlar 4,1-4,2 bulunan yordamı izleyin. </li><li> Therape akışı devamzaman sabit bir süre için utic ajan çözeltisi. Vana V Fin kapatın ve şırınga pompası kapatın. Ajan tespit apoptoz içeren taze orta şırınga ile tedavi şırınga değiştirin. Sürekli mikroskop altında doku izlerken 24 -36 saat süreyle taze orta akışı sağlayın. </li></ol> 6. İlaç Diffüzivite Katsayıları Time-lapse Mikroskopi ve Kestirim Temiz floresans verileri elde etmek için, dokuların alt katmanları üzerinde mikroskop odaklanarak tüm görüntüleri elde. Dikey yönde hiçbir besin eğimleri (bakınız Bölüm 4) olduğundan, hücrelerin alt tabakaları üzerindeki tüm diğer tabakaların iyi temsilcileridir. <ol><li> Tüm satın alma süreci IPLab bir özelleştirilmiş komut (Bioscience BD, Rockville, MD) kullanılarak otomasyona geçilmiştir. 10x büyütmede dolu spheroid her 30 dakikada bir (Şekil 3A) iletilen ışık ve floresans görüntüler elde edin. Acquirönceki Dox tanıtılması için arka plan floresan e bir görüntü. Odanın büyüklüğü (1000 mikron x 300 mikron) için yerleştirmek için, iki komşu görüntüleri ve birlikte çini onları 4 kazanır. </li><li> Ilacın difüzyon katsayılarının matematiksel tahmini için, ilk adım ImageJ kullanarak Dox floresans ortalama lineer yoğunluğu profilleri üretmektir. Odasında doku kapsayan ilgi dikdörtgen bir bölge (ROI) seçin. Akış kanalından mesafenin bir fonksiyonu olarak ortalama yoğunlukları bir profil oluşturmak için Plot profili komutunu kullanın. 3 adede kadar farklı zaman noktaları için tekrarlayın. </li><li> Dokudan otofloresans ölçmek için Dox tanıtmadan önce bir arka plan floresan görüntüsü elde edin. Elde edilen yoğunluğu profillerden ortalama arka plan floresan yoğunluğu çıkarma ve elde etmek için gelen maksimum yoğunluğu her profili normale <img src="/files/ftp_upload/2425/2425eq0.jpg" alt="c" /> (X, t) (Şekil 3B). </li><li> Bir sonraki adım, tümör dokusu içinde Dox etkili bir difüzyon katsayısı D değerlendirmektir. Dox difüzyon aşağıdaki denklem 5 ile temsil edilebilir <img src="/files/ftp_upload/2425/2425eq1.jpg" alt="Denklem 1"/> TÜMHATAİŞLEV tamamlayıcı hata fonksiyonu olduğu, x kanaldan doku içine mesafe ve t Dox tanıtılması (Şekil. 3&#39;e bakın) sonra zaman. Ele alındığında her zaman noktasında aşağıdaki yinelemeli şeması kullanın: <ul><li> D için bir ne olacağını tahmin </li><li> Her yerde, x eşitliğin sağ tarafına hesaplayın </li><li> İki taraf arasındaki karesi hataların toplamı (rezidü) hesaplayın </li><li> Kalıntı en aza indirmek için D değiştirme </li></ul></li><li> Ortalama dokuda Dox arasında ortalama etkin difüzyon katsayısı tahmin etmek her zaman noktasında alınan D optimum değerleri. </li></ol> 7. Temsilcisi Sonuçlar: &lt;p class = &quot;jove_content&quot;&gt; mikroakışkan cihazlar 1mm verilmedi x 0.3mm x 0.15mm optik üç boyutlu tümör dokusunun büyümesi için erişilebilir kültürü odaları. Çok hücreli tümör sferoidler bu odaların içine uçakla edildi ve arka iki filtre mesajlarını tarafından muhafaza edildi. Asılı damla yönteminde, tutarlı bir boyut ve çeşitli hücre hatlarından şekilli parçacıkları arasında hızlı oluşumunu sağlamıştır. 3 güne kadar sferoidler için başarılı bir aygıt üzerinde yetiştirilmiştir. Odacıklarda Büyüme sferoidlerin içinde mikroçevrelerde bir tekrarlanabilir modifikasyonu ile ilişkili bulunmuştur. Apoptosis, akış kanalı ve doku içine daha yüksek bir derin bir yakınlık içinde hücrelerinde daha az olmuştur. Cihaz, tümör dokusunda doksorubisin difüzyon katsayısı tahmin etmek için kullanıldı. 8.75 x 10 -7 cm 2 s -1 elde edilen değerin 9.1 değeri ile aynı fikirde x 10 -7 cm 2 s -1 insan meme kanseri daha önce 6. Min. <table border="1"><tbody><tr><td> Hücre Hattı </td><td> Gerekli Hücre Konsantrasyon </td><td> İnkübasyon Süresi </td></tr><tr><td> LS174T </td><td> 300 hücre / ml &#39; </td><td> 2-3 gün </td></tr><tr><td> T47D </td><td> 750 hücre / ml &#39; </td><td> 3-4 gün </td></tr><tr><td> MDA-MB-231 </td><td> 150 hücre / mcL </td><td> 5-6 gün </td></tr></tbody></table> Asılı Damla sferoidler için Tablo 1. Parametreler <table border="1"><tbody><tr><td> Kısım </td><td> Tanım </td></tr><tr><td> S F </td><td> Akış Şırınga </td></tr><tr><td> S P </td><td> Şırınga Ambalaj </td></tr><tr><td> V Fin </td><td> Akış Giriş Valfi </td></tr><tr><td> V Pin </td><td> Giriş Valfi Ambalaj </td></tr><tr><td> V Fçıkış </td><td> Akış Outlet Vana </td></tr><tr><td> V Pout </td><td> Outlet Vana Paketleme </td></tr></tbody></table> Akışı Kurulumu Tablo 2. Enjektörler ve Vanalar <img src="/files/ftp_upload/2425/2425fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1 akışını kurulum V Fin ve V Fçıkış şematik:. Akış giriş ve çıkış valfleri, V Pin ve V Pout: Ambalaj giriş ve çıkış valfleri, S F ve S P: Akış ve ambalaj şırınga. Bir sfero odasına uçakla olduğunda ambalaj şırınga ve giriş ve çıkış vanalarının ambalaj kullanılmaktadır. Akış şırınga ve akım giriş ve çıkış valfleri daha sonra orta akış için kullanılır. <img src="/files/ftp_upload/2425/2425fig2.jpg" alt="Şekil 2," /> Şekil 2. Cihaz üzerinde bir çember içinde sıkışıp kalmış bir spheroid şematik. A spheroid cihazda odasına akar ve iki filtre pos tarafından engellendiOdanın arka ts. <img src="/files/ftp_upload/2425/2425fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3,. Cihaz üzerinde tümör dokusunda Doksorubisin difüzyon. A. doksorubisin yerini ve konsantrasyon (kırmızı) gösteren, doku iletilen ışık ve kırmızı floresan görüntü birleştirilmiştir. Ölçek çubuğu 250 mikron temsil eder. Doksorubisin floresansı B. Normalize lineer yoğunluk profili.

<ol>
	<li>Duffy, D. C., McDonald, J. C., Schueller, O. J., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Prototyping+of+Microfluidic+Systems+in+Poly(dimethylsiloxane).">Rapid Prototyping of Microfluidic Systems in Poly(dimethylsiloxane).</a> Anal. Chem. 70, 4974-4984 (1998).</li><li>Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+generation+of+homogeneous+multicellular+tumor+spheroids+applicable+to+a+wide+variety+of+cell+types.">Method for generation of homogeneous multicellular tumor spheroids applicable to a wide variety of cell types.</a> Biotechnol. Bioeng. 83, 173-180 (2003).</li><li>Timmins, N. E., Nielsen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+multicellular+tumor+spheroids+by+the+hanging-drop+method.">Generation of multicellular tumor spheroids by the hanging-drop method.</a> Methods. Mol. Med. 140, 141-151 (2007).</li><li>Kasinskas, R. W., Forbes, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+typhimurium+specifically+chemotax+and+proliferate+in+heterogeneous+tumor+tissue+in+vitro.">Salmonella typhimurium specifically chemotax and proliferate in heterogeneous tumor tissue in vitro.</a> Biotechnol. Bioeng. 94, 710-721 (2006).</li><li>Walsh, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multipurpose+microfluidic+device+designed+to+mimic+microenvironment+gradients+and+develop+targeted+cancer+therapeutics.">A multipurpose microfluidic device designed to mimic microenvironment gradients and develop targeted cancer therapeutics.</a> Lab. Chip. 9, 545-554 (2009).</li><li>Lankelma, J., Fernandez Luque, R., Dekker, H., Schinkel, W., Pinedo, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mathematical+model+of+drug+transport+in+human+breast+cancer.">A mathematical model of drug transport in human breast cancer.</a> Microvasc. Res. 59, 149-161 (2000).</li><li>Less, J. R., Skalak, T. C., Sevick, E. M., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvascular+architecture+in+a+mammary+carcinoma:+branching+patterns+and+vessel+dimensions.">Microvascular architecture in a mammary carcinoma: branching patterns and vessel dimensions.</a> Cancer. Res. 51, 265-273 (1991).</li><li>Brown, J. M., Giaccia, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unique+physiology+of+solid+tumors:+opportunities+(and+problems)+for+cancer+therapy.">The unique physiology of solid tumors: opportunities (and problems) for cancer therapy.</a> Cancer. Res. 58, 1408-1416 (1998).</li><li>Thomlinson, R. H., Gray, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+histological+structure+of+some+human+lung+cancers+and+the+possible+implications+for+radiotherapy.">The histological structure of some human lung cancers and the possible implications for radiotherapy.</a> Br. J. Cancer. 9, 539-549 (1955).</li><li>Minchinton, A. I., Tannock, I. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+penetration+in+solid+tumours.">Drug penetration in solid tumours.</a> Nat. Rev. Cancer. 6, 583-592 (2006).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Tümörlerde damar seyrek ve kötü 7,8 geliştirdi. Damar 9 olsa sağlanan besinler ve ilaçlar için ulaşılmaz olan kan damarlarından (&gt; 100 mikron) uzakta bulunan bölgeler vardır. Sonuçtaki heterojen mikroçevrede birçok kemoterapötik 10 sınırlı etkinliğe katkıda bulunmaktadır. Burada geliştirilen mikroakışkan cihaz in vitro, sakin ve apoptotik ya da nekrotik hücre genişlemesi ile karakterize heterojen bir tümör mikro yaratır. Kanalın yakınlık hücreler, uygun olan, fakat difüzyon sınırlama çok kanaldan beslenme açısından eksik apoptotik bölgeler meydana getirirler. Akış kanalı, bir kan damarı temsil eder ve küremsi bir kan damarı bitişik bir tümör içinde küçük bir bölgede temsil eder. Cihazın içine sferoidler tanıtırken herhangi bir engel doku akmasına, çünkü yumruk giriş deliğine temiz ve pisliklerden arınmış olmasını sağlamakbölme, ve kırık küremsi doldurmak başarısızlığa neden olacaktır. Ambalaj şırınga sferoidlerin tanıtılması sürecinde manuel olarak çalıştırılır. Akış hızı odanın arka mesaj ile küremsi itme önlemek için mümkün olduğu kadar düşük tutulmalıdır. Tüm mikroakışkan cihazları gibi, bazı önlemler şırıngalar anahtarlama, özellikle sistem kabarcıkları önlemek için alınmalıdır. Bir şırınga her açıldığında kabarcıkları önlemeye yardımcı olacaktır tüp küçük bir parça kesme. Tek bir deneyde birden odaları ve çoklu tedavilerin kullanımına izin vermek için cihaza Değişiklikler devam etmektedir. Biz bu cihazlar solid tümörler, mevcut kanser tedavi davranışını anlamak için kullanılabilir inanıyoruz. Aynı zamanda, yeni kanser tedavilerinin geliştirilmesi için ilaç tarama platform oluşturmak için kolay bir şekilde kullanılabilir.

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktif Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th><th> Yorumlar </th></tr><tr><td> Silikon elastomer kiti </td><td> Ellsworth Yapıştırıcılar </td><td> 184 Sil Elast Takımı </td><td></td></tr><tr><td> Miltex biyopsi yumruk </td><td> MedexSupply </td><td> MTX-33-31AA </td><td> 1.5 mm </td></tr><tr><td> PTFE tüp </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-06417-31 </td><td> 0.032 &quot;ID </td></tr><tr><td> Erkek luer lock konnektör </td><td> Qosina </td><td> 65111 </td><td></td></tr><tr><td> Dikenli dişi luer lock konnektör </td><td> Qosina </td><td> 11556 </td><td></td></tr><tr><td> Kapatma vanası </td><td> IDEX Sağlık ve Bilim </td><td> P-721 </td><td></td></tr><tr><td> Y-konnektörü </td><td> IDEX Sağlık ve Bilim </td><td> P-513 </td><td></td></tr><tr><td> 20G 1.5 &quot;iğneleri </td><td> BD BiosciencE </td><td> 305176 </td><td></td></tr><tr><td> Tripsin-EDTA </td><td> Invitrogen </td><td> 25300-054 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma </td><td> H-4034 </td><td></td></tr><tr><td> CaspGLOW Flöresein </td><td> Biovision </td><td> K183-25 </td><td></td></tr><tr><td> CaspGLOW Kırmızı </td><td> Biovision </td><td> K193-25 </td><td></td></tr><tr><td> Doksorubisin hidroklorür </td><td> Sigma </td><td> 44583 </td><td></td></tr><tr><td> LS174T </td><td> ATCC </td><td> CCL-188 </td><td> İnsan Kolon Karsinomu hücre hattı </td></tr><tr><td> T47D </td><td> ATCC </td><td> HTB-133 </td><td> İnsan Duktal Karsinoma hücre hattı </td></tr><tr><td> MDA-MB-231 </td><td> ATCC </td><td> HTB-26 </td><td> İnsan Meme Adenokarsinom hücre hattı </td></tr></tbody></table>

microfluidic device for recreating a tumor microenvironment in vitro

Biz in vitro heterojen üç boyutlu tümör dokulara teslimat ve ilaçların sistemik klirensi taklit eden bir mikroakışkan cihaz geliştirdik. Damar tarafından teslim Besinler canlı, sakin ve nekrotik hücre tipleri oluşan heterojen mikroçevrelerde sebebiyet veren tümörler tüm bölümlerine ulaşmak için başarısız. Birçok kanser ilaçlarının etkili hücreleri nedeniyle bu heterojenlik her türlü nüfuz ve tedavisinde başarısız. Kanser hücrelerinin tek katmanlarını zor in vitro model bir uygun olan kanser ilaçlarının test etmek için yapma, bu heterojen taklit ederler. Bizim mikroakışkan cihazları yumuşak litografi kullanarak PDMS üzerinden hazırlandı. Asılı damla yöntemi ile oluşturulan Multisellüler tümör sferoidler, eklenen ve kısıtlı cihaz üzerinde dikdörtgen odasına ve bir tarafta sürekli orta perfüzyon ile muhafaza edildi. Cihazda odaları dikdörtgen doku içinde doğrusal basamaklara yarattı. Floresan lekeleri inci ölçmek için kullanılmıştırdokusu içinde apoptozis e değişkenliği. Cihazda Tümörler floresan kemoterapötik ilaç doksorubisin, time-lapse mikroskopi doku içine onun difüzyon izlemek için kullanılan ve etkin difüzyon katsayısı tahmin edilmiştir ile tedavi edildi. Asılı damla yöntemi çeşitli kanser hücre hatları düzgün sferoidlerin hızlı oluşumunu sağladı. Cihaz en fazla 3 gün için sferoidlerin büyüme sağladı. Orta akan yakınlığı Hücreleri minimal apoptotik vardı ve bu çok kanaldan böylece doğru kan damarları komşu tümörlerde bölgelerde taklit, daha apoptotik vardı. Doksorubisin difüzyon katsayısının tahmini değeri insan meme kanseri daha önceden bildirilen değeri ile anlaştılar. Solid tümörler ilaç penetrasyonu ve kalıcılık onların etkinliğini etkilediği için, bu cihazın uyuşturucu davranışını anlamak ve yeni kanser tedavi geliştirilmesinde önemli bir araç olduğuna inanıyoruz.

Watch this Scientific Journal Video about Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro at JoVE.com

Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro

Biz heterojen tümör mikroçevrelerde yeniden bir mikroakışkan cihazın imalat ve operasyon için prosedür sunmak<em&gt; In vitro</em&gt;. Tümör dokusu içinde apoptosis değişkenliği değerlendirildi floresan lekeleri ve tümör dokusu içine kemoterapötik ilaç doksorubisin etkin difüzyon katsayısı kullanılarak ölçüldü.

Bir Tümör Mikroçevre yeniden oluşturmak için mikroakışkan Cihazı<em&gt; In vitro</em

We have developed a microfluidic device that mimics the delivery and systemic clearance of drugs to heterogeneous three-dimensional tumor tissues in ...

microfluidic-device-for-recreating-a-tumor-microenvironment-in-vitro

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro

11.5K Görüntüleme.  University Of Massachusetts Amherst. Biz heterojen tümör mikroçevrelerde yeniden bir mikroakışkan cihazın imalat ve operasyon için prosedür sunmak In vitro. Tümör dokusu içinde apoptosis değişkenliği değerlendirildi floresan lekeleri ve tümör dokusu içine kemoterapötik ilaç doksorubisin etkin difüzyon katsayısı kullanılarak ölçüldü.

Video: Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro

A Microfluidic Device for Studying Multiple Distinct Strains

The study of cell responses to environmental changes poses many experimental challenges: cells need to be imaged under changing conditions, often in a comparative manner. Multiwell plates are routinely used to compare many different strains or cell lines, but allow limited control over the environment dynamics. Microfluidic devices, on the other hand, allow exquisite dynamic control over the surrounding conditions, but it is challenging to image and distinguish more than a few strains in them. Here we describe a method to easily and rapidly manufacture a microfluidic device capable of applying dynamically changing conditions to multiple distinct yeast strains in one channel. The device is designed and manufactured by simple means without the need for soft lithography. It is composed of a Y-shaped flow channel attached to a second layer harboring microwells. The strains are placed in separate microwells, and imaged under the exact same dynamic conditions. We demonstrate the use of the device for measuring protein localization responses to pulses of nutrient changes in different yeast strains.

We present a simple method to produce microfluidic devices capable of applying similar dynamic conditions to multiple distinct strains, without the need for a clean room or soft lithography.

Birden Farklı Suşlarının incelenmesi için bir mikroakışkan Cihazı

The study of cell responses to environmental changes poses many experimental challenges: cells need to be imaged under changing conditions, often in a ...

Biyomühendislik

Systematic Analysis of In Vitro Cell Rolling Using a Multi-well Plate Microfluidic System

A major challenge for cell-based therapy is the inability to systemically target a large quantity of viable cells with high efficiency to tissues of interest following intravenous or intraarterial infusion. Consequently, increasing cell homing is currently studied as a strategy to improve cell therapy. Cell rolling on the vascular endothelium is an important step in the process of cell homing and can be probed in-vitro using a parallel plate flow chamber (PPFC). However, this is an extremely tedious, low throughput assay, with poorly controlled flow conditions. Instead, we used a multi-well plate microfluidic system that enables study of cellular rolling properties in a higher throughput under precisely controlled, physiologically relevant shear flow1,2. In this paper, we show how the rolling properties of HL-60 (human promyelocytic leukemia) cells on P- and E-selectin-coated surfaces as well as on cell monolayer-coated surfaces can be readily examined. To better simulate inflammatory conditions, the microfluidic channel surface was coated with endothelial cells (ECs), which were then activated with tumor necrosis factor-&#945; (TNF-&#945;), significantly increasing interactions with HL-60 cells under dynamic conditions. The enhanced throughput and integrated multi-parameter software analysis platform, that permits rapid analysis of parameters such as rolling velocities and rolling path, are important advantages for assessing cell rolling properties in-vitro. Allowing rapid and accurate analysis of engineering approaches designed to impact cell rolling and homing, this platform may help advance exogenous cell-based therapy.

Systematic Analysis of In Vitro Cell Rolling Using a Multi-well Plate Microfluidic System

This study used a multi-well plate microfluidic system, significantly increasing throughput of cell rolling studies under physiologically relevant shear flow. Given the importance of cell rolling in the multi-step cell homing cascade and the importance of cell homing following systemic delivery of exogenous populations of cells in patients, this system offers potential as a screening platform to improve cell-based therapy.

Sistematik Analizi<em&gt; In Vitro</emÇok-çukurlu plaka mikroakışkan Sistemi ile&gt; Hücre Rolling

A major challenge for cell-based therapy is the inability to systemically target a large quantity of viable cells with high efficiency to tissues of ...

Tissue Engineering of Tumor Stromal Microenvironment with Application to Cancer Cell Invasion

3D organotypic cultures of epithelial cells on a matrix embedded with mesenchymal cells are widely used to study epithelial cell differentiation and invasion. Rat tail type I collagen and/or matrix derived from Engelbreth-Holm-Swarm mouse sarcoma cells have been traditionally employed as the substrates to model the matrix or stromal microenvironment into which mesenchymal cells (usually fibroblasts) are populated. Although experiments using such matrices are very informative, it can be argued that due to an overriding presence of a single protein (such as in type I Collagen) or a high content of basement membrane components and growth factors (such as in matrix derived from mouse sarcoma cells), these substrates do not best reflect the contribution to matrix composition made by the stromal cells themselves. To study native matrices produced by primary dermal fibroblasts isolated from patients with a tumor prone, genetic blistering disorder (recessive dystrophic epidermolysis bullosa), we have adapted an existing native matrix protocol to study tumor cell invasion. Fibroblasts are induced to produce their own matrix over a prolonged period in culture. This native matrix is then detached from the culture dish and epithelial cells are seeded onto it before the entire coculture is raised to the air-liquid interface. Cellular differentiation and/or invasion can then be assessed over time. This technique provides the ability to assess epithelial-mesenchymal cell interactions in a 3D setting without the need for a synthetic or foreign matrix with the only disadvantage being the prolonged period of time required to produce the native matrix. Here we describe the application of this technique to assess the ability of a single molecule expressed by fibroblasts, type VII collagen, to inhibit tumor cell invasion.

Tissue engineered fibroblast-derived native matrix is an emerging tool to generate a stromal substrate which supports epithelial cell proliferation and differentiation. Here a protocol applying this methodology to assess the impact of different stromal cell types on tumor cell biology is presented.

Kanser Hücre Invasion Uygulama ile Tümör Stromal mikroçevresinin Doku Mühendisliği

3D organotypic cultures of epithelial cells on a matrix embedded with mesenchymal cells are widely used to study epithelial cell differentiation and ...

Protocol for Biofilm Streamer Formation in a Microfluidic Device with Micro-pillars

Several bacterial species possess the ability to attach to surfaces and colonize them in the form of thin films called biofilms. Biofilms that grow in porous media are relevant to several industrial and environmental processes such as wastewater treatment and CO2 sequestration. We used Pseudomonas fluorescens, a Gram-negative aerobic bacterium, to investigate biofilm formation in a microfluidic device that mimics porous media. The microfluidic device consists of an array of micro-posts, which were fabricated using soft-lithography. Subsequently, biofilm formation in these devices with flow was investigated and we demonstrate the formation of filamentous biofilms known as streamers in our device. The detailed protocols for fabrication and assembly of microfluidic device are provided here along with the bacterial culture protocols. Detailed procedures for experimentation with the microfluidic device are also presented along with representative results.

Protocols for the study of biofilm formation in a microfluidic device that mimics porous media are discussed. The microfluidic device consists of an array of micro-pillars and biofilm formation by Pseudomonas fluorescens in this device is investigated.

Mikro-ayağı ile bir mikroakışkan Aygıt Biyofilm Çıtası Formasyonu Protokolü

Several bacterial species possess the ability to attach to surfaces and colonize them in the form of thin films called biofilms. Biofilms that grow in ...

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

There are few high-throughput in vitro systems which facilitate the development of multi-species biofilms that contain numerous species commonly detected within in vivo oral biofilms. Furthermore, a system that uses natural human saliva as the nutrient source, instead of artificial media, is particularly desirable in order to support the expression of cellular and biofilm-specific properties that mimic the in vivo communities. We describe a method for the development of multi-species oral biofilms that are comparable, with respect to species composition, to supragingival dental plaque, under conditions similar to the human oral cavity. Specifically, this methods article will describe how a commercially available microfluidic system can be adapted to facilitate the development of multi-species oral biofilms derived from and grown within pooled saliva. Furthermore, a description of how the system can be used in conjunction with a confocal laser scanning microscope to generate 3-D biofilm reconstructions for architectural and viability analyses will be presented. Given the broad diversity of microorganisms that grow within biofilms in the microfluidic system (including Streptococcus, Neisseria, Veillonella, Gemella, and Porphyromonas), a protocol will also be presented describing how to harvest the biofilm cells for further subculture&#160;or DNA extraction and analysis. The limits of both the microfluidic biofilm system and the current state-of-the-art data analyses will be addressed. Ultimately, it is envisioned that this article will provide a baseline technique that will improve the study of oral biofilms and aid in the development of additional technologies that can be integrated with the microfluidic platform.

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

The goal of this methods paper is to describe the use of a microfluidic system for the development of multi-species biofilms that contain species typically identified in human supragingival dental plaque.&#160;Methods to describe biofilm architecture, biofilm viability, and an approach to harvest biofilm for culture-dependent or culture-independent analyses are highlighted.

Yüksek verimli bir kullanımı<em&gt; İn Vitro</em&gt; Mikroakışkan Sistemi Ağız Çok türler biyofilm Geliştirmek İçin

There are few high-throughput in vitro systems which facilitate the development of multi-species biofilms that contain numerous species commonly detected ...

Analyzing Mixing Inhomogeneity in a Microfluidic Device by Microscale Schlieren Technique

In this paper, we introduce the use of microscale schlieren technique to measure mixing inhomogeneity in a microfluidic device. The microscale schlieren system is constructed from a Hoffman modulation contrast microscope, which provides easy access to the rear focal plane of the objective lens, by removing the slit plate and replacing the modulator with a knife-edge. The working principle of microscale schlieren technique relies on detecting light deflection caused by variation of refractive index1-3. The deflected light either escapes or is obstructed by the knife-edge to produce a bright or a dark band, respectively. If the refractive index of the mixture varies linearly with its composition, the local change in light intensity in the image plane is proportional to the concentration gradient normal to the optical axis. The micro-schlieren image gives a two-dimensional projection of the disturbed light produced by three-dimensional inhomogeneity.
To accomplish quantitative analysis, we describe a calibration procedure that mixes two fluids in a T-microchannel. We carry out a numerical simulation to obtain the concentration gradient in the T-microchannel that correlates closely with the corresponding micro-schlieren image. By comparison, a relationship between the grayscale readouts of the micro-schlieren image and the concentration gradients presented in a microfluidic device is established. Using this relationship, we are able to analyze the mixing inhomogeneity from associate micro-schlieren image and demonstrate the capability of microscale schlieren technique with measurements in a microfluidic oscillator4. For optically transparent fluids, microscale schlieren technique is an attractive diagnostic tool to provide instantaneous full-field information that retains the three-dimensional features of the mixing process.

Herein, we describe a procedure that employs microscale schlieren technique to measure mixing inhomogeneity in a microfluidic device. Through calibration, distribution of concentration gradient can be derived from the micro-schlieren image.

Mikro Schlieren Tekniği ile bir mikroakışkan Aygıt karıştırma homojen Analizi

In this paper, we introduce the use of microscale schlieren technique to measure mixing inhomogeneity in a microfluidic device. The microscale schlieren ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and accurate assessment of ocular toxicity in man are needed. To address this need, we have developed an eye irritation test (EIT) which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model that is based on normal human cells. The EIT is able to separate ocular&#160;irritants and corrosives (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category). The test utilizes two separate protocols, one designed for liquid chemicals and a second, similar protocol for solid test articles. The EIT prediction model uses a single exposure period (30 min for liquids, 6 hr for solids) and a single tissue viability cut-off (60.0% as determined by the MTT assay). Based on the results for 83 chemicals (44 liquids and 39 solids) EIT achieved 95.5/68.2/ and 81.8% sensitivity/specificity and accuracy (SS&#38;A) for liquids, 100.0/68.4/ and 84.6% SS&#38;A for solids, and 97.6/68.3/ and 83.1% for overall SS&#38;A. The EIT will contribute significantly to classifying the ocular irritation potential of a wide range of liquid and solid chemicals without the use of animals to meet regulatory testing requirements. The EpiOcular EIT method was implemented in 2015 into the OECD Test Guidelines as TG 492.

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

We have developed an eye irritation test which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model. The test is able to discriminate between ocular irritant and corrosive materials (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category).

Yeniden İnşa İnsan Kornea gibi Epitelyal (RHCE) Doku Modeli kullanılarak Göz tahriş Kimyasalların Tehlike Tanımlaması Göz tahrişi Testi (EIT)

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Fully Automated Centrifugal Microfluidic Device for Ultrasensitive Protein Detection from Whole Blood

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is a promising method to detect small amount of proteins in biological samples. The devices providing a platform for reduced sample volume and assay time as well as full automation are required for potential use in point-of-care-diagnostics. Recently, we have demonstrated ultrasensitive detection of serum proteins, C-reactive protein (CRP) and cardiac troponin I (cTnI), utilizing a lab-on-a-disc composed of TiO2 nanofibrous (NF) mats. It showed a large dynamic range with femto molar (fM) detection sensitivity, from a small volume of whole blood in 30 min. The device consists of several components for blood separation, metering, mixing, and washing that are automated for improved sensitivity from low sample volumes. Here, in the video demonstration, we show the experimental protocols and know-how for the fabrication of NFs as well as the disc, their integration and the operation in the following order: processes for preparing TiO2 NF mat; transfer-printing of TiO2 NF mat onto the disc; surface modification for immune-reactions, disc assembly and operation; on-disc detection and representative results for immunoassay. Use of this device enables multiplexed analysis with minimal consumption of samples and reagents. Given the advantages, the device should find use in a wide variety of applications, and prove beneficial in facilitating the analysis of low abundant proteins.

This protocol demonstrates how to achieve femto molar detection sensitivity of proteins in 10 &#181;L of whole blood within 30 min. This can be achieved by using electrospun nanofibrous mats integrated in a lab-on-a-disc, which offers high surface area as well as effective mixing and washing for enhanced signal-to-noise ratio.

Tüm Blood adlı ultrasensitive Protein Algılama için Tam Otomatik Santrifüj mikroakışkan Cihazı

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is a promising method to detect small amount of proteins in biological samples. The devices providing a platform ...

Co-culture of Living Microbiome with Microengineered Human Intestinal Villi in a Gut-on-a-Chip Microfluidic Device

Here, we describe a protocol to perform long-term co-culture of multi-species human gut microbiome with microengineered intestinal villi in a human gut-on-a-chip microphysiological device. We recapitulate the intestinal lumen-capillary tissue interface in a microfluidic device, where physiological mechanical deformations and fluid shear flow are constantly applied to mimic peristalsis. In the lumen microchannel, human intestinal epithelial Caco-2 cells are cultured to form a &#39;germ-free&#39; villus epithelium and regenerate small intestinal villi. Pre-cultured microbial cells are inoculated into the lumen side to establish a host-microbe ecosystem. After microbial cells adhere to the apical surface of the villi, fluid flow and mechanical deformations are resumed to produce a steady-state microenvironment in which fresh culture medium is constantly supplied and unbound bacteria (as well as bacterial wastes) are continuously removed. After extended co-culture from days to weeks, multiple microcolonies are found to be randomly located between the villi, and both microbial and epithelial cells remain viable and functional for at least one week in culture. Our co-culture protocol can be adapted to provide a versatile platform for other host-microbiome ecosystems that can be found in various human organs, which may facilitate in vitro study of the role of human microbiome in orchestrating health and disease.

We describe an in vitro protocol to co-culture gut microbiome and intestinal villi for an extended period using a human gut-on-a-chip microphysiological system.

içinde Microengineered İnsan Bağırsak Villi Oturma mikrobiyomu Co-kültür, bir Gut-on-a-Chip mikroakışkan Aygıt

Here, we describe a protocol to perform long-term co-culture of multi-species human gut microbiome with microengineered intestinal villi in a human ...

Perfusable Vascular Network with a Tissue Model in a Microfluidic Device

A spheroid (a multicellular aggregate) is regarded as a good model of living tissues in the human body. Despite the significant advancement in the spheroid cultures, a perfusable vascular network in the spheroids remains a critical challenge for long-term culture required to maintain and develop their functions, such as protein expressions and morphogenesis. The protocol presents a novel method to integrate a perfusable vascular network within the spheroid in a microfluidic device. To induce a perfusable vascular network in the spheroid, angiogenic sprouts connected to microchannels were guided to the spheroid by utilizing angiogenic factors from human lung fibroblasts cultured in the spheroid. The angiogenic sprouts reached the spheroid, merged with the endothelial cells co-cultured in the spheroid, and formed a continuous vascular network. The vascular network could perfuse the interior of the spheroid without any leakage. The constructed vascular network may be further used as a route for supply of nutrients and removal of waste products, mimicking blood circulation in vivo. The method provides a new platform in spheroid culture toward better recapitulation of living tissues.

The protocol describes how to engineer a perfusable vascular network in a spheroid. The spheroid's surrounding microenvironment is devised to induce angiogenesis and connect the spheroid to the microchannels in a microfluidic device. The method allows the perfusion of the spheroid, which is a long-awaited technique in three-dimensional cultures.