Yazarlar Tammo Reisewitz el yazması ve hem Mako Hayashi ve Sayuri Hagiwara dikkatli ekimi için eleştirel okuma ve Siyanobakteriler, görüntü işleme için Yoshitaka Kimori, Chihong şarkı, Naoyuki Miyazaki ve Miyoko gözlem için teşekkür ederiz Nagayoşi yapıları bölümleme ile yardım ettiğin için. Bu eser için Fizyolojik Bilimler (NIPS) Y.K. için ulusal Enstitü ortak çalışma programı tarafından desteklenen

1. zaman uyumlu Siyanobakteriler kültürünün
<ol><li>S. elongatus PCC 7942 %1,5 (w/v) agar ve %0,3 (w/v) sodyum thiosulfate8içeren steril BG 11 plaka (içinde 9 cm steril plastik petri kabına) üzerinde kültür.</li>
	<li>Tabakları bir büyüme Odası 23 ° c ile 50 µE/m2/s ve 12 h ışık/12 s karanlık döngüleri tabi bir ışık şiddeti yerleştirin.</li>
	<li>Hücreleri üzerine taze BG11 ağar kaplamalar haftada bir kez transfer. Not: Kültürler agar üzerinde yeşil şeritler halinde görünür bu kültür koşul altında bir hafta sonra aktif Proliferasyona hücreleri.</li>
	<li>Yeşil kümeleri bir alev sterilize tel döngü ve çizgi içeren hücrelerin hücre bir taze BG11 agar plaka üzerine al. Temiz bir bankta bunu.</li>
</ol>2. izleme tarafından floresans mikroskobu
<ol><li>6 gün agar tabakta kültürlü hücreleri DNA sıkıştırma gözlemlemek için kullanın. Hücreleri plaka ışık dönemin sonunda hücrenin üzerine dökülen 1 mL tarafından 0.2 M Sükroz çözeltisi toplamak. Böylece hücrelerin çoğu toplanan çözüm hücreleri dökülen yineleyin. Askıya-hücre çözümü DNA boyama için mikro bir tüp içine aktarın.</li>
	<li>DNA 500 µL askıya alınan hücre çözüm 1 µg/ml nihai bir konsantrasyon için mikro bir tüp boya (Örneğin Höchst 33342) çözüm boyama ekleyin. Daha sonra tüp 10 min için karanlıkta tutmak.</li>
	<li>2.000 x g tortu için de 1 dk. için hücreleri santrifüj kapasitesi. Süpernatant atmak ve bir yoğun hücre süspansiyon elde etmek için 0.2 M Sükroz çözüm 10 µL ekleyin.</li>
	<li>Bir slayt cam için lekeli hücreleri içeren çözüm 1 µL transfer için bir kapak kayma koymak ve 100 X ve daldırma yağ bir büyütme ile bir objektif lens kullanarak UV filtre ile donatılmış bir floresan mikroskop ile gözlemlemek.</li>
	<li>DNA sıkıştırma en hücreleri bu noktasında görülmektedir onaylayın, sonra örnek dondurucu adım için hazır olun.</li>
</ol>3. örnek Cryo-HVET için dondurma
<ol><li>Dalma-donma aygıtı ayarlama. Sıvı azot ile tank doldurmak ve cryo-odası soğutma tankı ve odası ile bir Teflon tüp bağlandıktan sonra başlar.</li>
	<li>Sıvı azot sıcaklık odasına aşağı soğutma sonra odanın içinde bir küçük bakır pota sıvı etan doldurun. Sıvı etan patlayıcı olduğu için işlem sırasında gözlük.</li>
	<li>Kızdırma boşaltma delikli bir karbon kaplı icin karbon tarafında kılavuz (delikli ızgara) 30 s 50 plazma iyon bombarder kullanarak anne.</li>
	<li>1 µL BSA altın izleme uygulamak (15 nm) delikli ızgarasına indirgeme bir işaretleyici olarak.</li>
	<li>2.5 µL aliquot hücrelerinin DNA düzenleme aşamasında delikli ızgarasına uygulanır. Bir filtre kağıdı fazlalık çözümüyle kapalı leke. Kılavuz kullanarak bir dalgıç dalma dondurucu cihaz hemen sıvı etan Dalma.</li>
	<li>Onlar incelenir kadar donmuş ızgaralar sıvı azot depoda saklamak.</li>
</ol>4. Cryo-HVET
<ol><li>1 yüksek gerilim, HVEM kurmak MV.</li>
	<li>Cryo-numune tutucu-150 ° c cryo-iş istasyonu içinde sıvı azot ile precooled HVEM için dondurulmuş kılavuzunda mount ve HVEM yükleyin. Buz tarafından kirlenmesini önlemek için dikkatli olun.</li>
	<li>1, daha düşük büyütmede görüntüleme alanı seçme 000 X. Eucentric z ekseni yüksekliğini ayarla.</li>
	<li>Örneği Sahne Alanı'na-60 ° eğim ve tepki devirme dönme kaldırın.</li>
	<li>Bir büyütme 10, hedef konumda yakın odak ayarlamak 000 X. Ayarla bir 6-10 µm odaklı görüntü sapma tarafından odak noktası altında. Görüntüleme için doz 2 e-/Å-2 için ayarla veya önceden numune üzerinde daha az.</li>
	<li>HVEM görüntü ekranda akım yoğunluğu tarafından elektron doz ölçmek. Fotoðraf bir elektron film veya dijital kamera odaklama işleminin olduğu gibi aynı büyütmede tarafından.</li>
	<li>Tilt görüntüleri el ile (4.5) olduğu gibi aynı yordam tarafından-60 ° ila + 60 ° 2 ° ila 4 ° tilt açı artışı, toplamak. Not: içinde birçok modern elektron mikroskoplar, tilt serisi edinimi bir dijital fotoğraf makinesi kombinasyonu tarafından otomatikleştirilmiştir. Bu durumda, kullanım kılavuzu izleyin. Negatif ince tabaka için için bir su tankında tam güçte geliştirici kullanarak Geliştirici 20 ° C'de 12 dk filmler geliştirmek ve düzeltmek bir fixer 10 dk. dijital ortama için 4000 dpi (0.635 nm/piksel görüntü üzerinde) bir çözünürlükte filmler düz yataklı tarayıcı kullanarak. Bir dijital fotoğraf makinesi söz konusu olduğunda toplanan görüntüleri doğrudan sonraki görüntü işleme adımının için tabi. Gerekirse, iki ila dört binning (boyutu azaltma faktörü) ve ilgili yazılım (Örneğin ImageJ) kullanarak bir Medyan filtresi tarafından görüntü boyutunu azaltmak.</li>
</ol>5. tomografik imar
<ol><li>Komut "tif2mrc" veya "newstack" but yazılım9' kullanarak görüntüleri eğimli bir yığın görüntü dosyasından tek tek yapmak.</li>
	<li>BUT içinde eTomo GUI yazılım başlatın ve görüntü parametreleri ayarlayın: piksel boyutunu, indirgeme çapı, görüntü döndürme, vb. Daha sonra komut dosyaları oluşturun.</li>
	<li>Malzemeler, tablolarda listelenen yazılımlar göre bireysel programları çalıştırmak nerede tilt serisi (bir ortalama artık hata ile 0.5 daha az) indirgeme işaretçileri kullanarak hizalanır. Son olarak, but içinde SIRT algoritmasıyla bir 3D tomogram yeniden.</li>
	<li>Faiz (ROI) bölgesinin tomogram ayıklamak ve denoise filtre kullanarak denoise: bir anizotropik difüzyon but, EMAN10ikili bir filtre veya matematiksel bir morfoloji filtre11, vb, uygun parametrelerle birlikte karşıtlığı artırmak için.</li>
</ol>6. ayrılmasını faiz özelliği
Not: aşağıda açıklanan yordamı yazılım kullanılan (bkz: Malzemeler tablo) özgüdür ancak diğer yazılım paketleri yerine kullanılabilir. Onların Kullanıcı kılavuzuna başvurun.
<ol><li>3B görüntüleyici penceresinde Amira yazılım tomogram dosyasını açın ve bir OrthoSlice oluşturmak.</li>
	<li>Segmentasyon Düzenleyicisi penceresinde, yeni bir "etiket alan" seçerek bir bölümleme dosyası oluşturun.</li>
	<li>El ile ilgi (FOI) özelliğinin kenarlığı izleyin. Bütün tomogram dilimleri ile FOI izleyin. İkinci FOI için yeni bir "malzeme" oluşturmak ve aynı işlemi yineleyin.</li>
	<li>"SurfaceGen" menüsünden seçerek bir yüzey işleme oluşturmak. Kesimli birimin görselleştirmek için "SurfaceView" menü. Taşımak, döndürmek ve 3B cilt yakınlaştırmak için 3D Görüntüleyici penceresinde araçları kullanın.</li>
	<li>Otomatik bölümleme için Sihirli Değnek aracını kullanın. Bir nesne üzerinde tıklatın ve görüntü ve maskeleme böylece tam özellikleri tarafından seçilen değer aralığını kapsayacak şekilde kaydırıcıları ayarlayın.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Smith, R. M., Williams, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+rhythms+in+gene+transcription+imparted+by+chromosome+compaction+in+the+cyanobacterium+Synechococcus+elongatus.">Circadian rhythms in gene transcription imparted by chromosome compaction in the cyanobacterium Synechococcus elongatus.</a> Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 103 (22), 8564-8569 (2006).</li><li>Kondo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cyanobacterial+circadian+clock+based+on+the+kai+oscillator.">A cyanobacterial circadian clock based on the kai oscillator.</a> CSHS Quant. Biol. 72, 47-55 (2007).</li><li>Seki, Y., Nitta, K., Kaneko, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observation+of+polyphosphate+bodies+and+DNA+during+the+cell+division+cycle+of+Synechococcus+elongatus+PCC+7942.">Observation of polyphosphate bodies and DNA during the cell division cycle of Synechococcus elongatus PCC 7942.</a> Plant biol. 16 (1), 258-263 (2014).</li><li>Murata, K., Hagiwara, S., Kimori, Y., Kaneko, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructure+of+compacted+DNA+in+cyanobacteria+by+high-voltage+cryo-electron+tomography.">Ultrastructure of compacted DNA in cyanobacteria by high-voltage cryo-electron tomography.</a> Sci. Rep. 6, 34934 (2016).</li><li>Koster, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perspectives+of+molecular+and+cellular+electron+tomography.">Perspectives of molecular and cellular electron tomography.</a> J. struct. boil. 120 (3), 276-308 (1997).</li><li>Lu&#269;i&#263;, V., Rigort, A., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+tomography:+The+challenge+of+doing+structural+biology+in+situ.">Cryo-electron tomography: The challenge of doing structural biology in situ.</a> J. Cell Biol. 202 (3), 407-419 (2013).</li><li>Murata, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+Adsorption+of+Cyanophage+P-SSP7+onto+Marine+Prochlorococcus.">Visualizing Adsorption of Cyanophage P-SSP7 onto Marine Prochlorococcus.</a> Sci. Rep. 7, 44176 (2017).</li><li>Rippka, R., Deruelles, J., Waterbury, J. B., Herdman, M., Stanier, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generic+assignments,+strain+histories+and+properties+of+pure+cultures+of+Cyanobacteria.">Generic assignments, strain histories and properties of pure cultures of Cyanobacteria.</a> J. Gen. Microbiol. 111, 1-61 (1979).</li><li>Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD.">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> J. struct. boil. 116, 71-76 (1996).</li><li>Jiang, W., Baker, M. L., Wu, Q., Bajaj, C., Chiu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+a+bilateral+denoising+filter+in+biological+electron+microscopy.">Applications of a bilateral denoising filter in biological electron microscopy.</a> J. Struct. Biol. 144, 114-122 (2003).</li><li>Kimori, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+image+processing+for+quantitative+shape+analysis+of+biomedical+structures:+effective+contrast+enhancement.">Morphological image processing for quantitative shape analysis of biomedical structures: effective contrast enhancement.</a> J. Sync. Rad. 20, 848-853 (2013).</li><li>Jun, S., Zhao, G., Ning, J., Ga Gibson, ., Watkins, S. C., Zhang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+microscopy+for+3D+structural+analysis+of+dynamic+interactions.">Correlative microscopy for 3D structural analysis of dynamic interactions.</a> J. Visual. Exper. 76, e50386 (2013).</li><li>Murata, K., Esaki, M., Ogura, T., Arai, S., Yamamoto, Y., Tanaka, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-cell+imaging+of+the+budding+yeast+Saccharomyces+cerevisiae+by+high-voltage+scanning+transmission+electron+tomography.">Whole-cell imaging of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae by high-voltage scanning transmission electron tomography.</a> Ultramicros. 146, 39-45 (2014).</li><li>Kortje, K. H., Paulus, U., Ibsch, M., Rahmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+thick+sections+of+nervous+tissue+with+energy-filtering+transmission+electron+microscopy.">Imaging of thick sections of nervous tissue with energy-filtering transmission electron microscopy.</a> J. Microsc. 183, 89-101 (1996).</li><li>Bouwer, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+most-probable+loss+tomography+of+thick+selectively+stained+biological+specimens+with+quantitative+measurement+of+resolution+improvement.">Automated most-probable loss tomography of thick selectively stained biological specimens with quantitative measurement of resolution improvement.</a> J. Struct. Biol. 148 (3), 297-306 (2004).</li><li>Egerton, R. F., Li, P., Malac, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation+damage+in+the+TEM+and+SEM.">Radiation damage in the TEM and SEM.</a> Micron. 35 (6), 399-409 (2004).</li><li>Danev, R., Buijsse, B., Khoshouei, M., Plitzko, J. M., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volta+potential+phase+plate+for+in-focus+phase+contrast+transmission+electron+microscopy.">Volta potential phase plate for in-focus phase contrast transmission electron microscopy.</a> Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 111 (44), 15635-15640 (2014).</li><li>Murata, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zernike+phase+contrast+cryo-electron+microscopy+and+tomography+for+structure+determination+at+nanometer+and+subnanometer+resolutions.">Zernike phase contrast cryo-electron microscopy and tomography for structure determination at nanometer and subnanometer resolutions.</a> Structure. 18 (8), 903-912 (2010).</li><li>Wolf, S. G., Houben, L., Elbaum, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-scanning+transmission+electron+tomography+of+biological+cells.">Cryo-scanning transmission electron tomography of biological cells.</a> Nat. Methods. 11 (4), 423-428 (2014).</li><li>Ophus, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+linear+phase+contrast+in+scanning+transmission+electron+microscopy+with+matched+illumination+and+detector+interferometry.">Efficient linear phase contrast in scanning transmission electron microscopy with matched illumination and detector interferometry.</a> Nat. Comm. 7, 1-7 (2016).</li><li>Schertel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo+FIB-SEM:+Volume+imaging+of+cellular+ultrastructure+in+native+frozen+specimens.">Cryo FIB-SEM: Volume imaging of cellular ultrastructure in native frozen specimens.</a> J. Struct. Biol. 184 (2), 355-360 (2013).</li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının bildirin.

Biz bir sıra geçici DNA sıkıştırma Siyanobakteriler içinde görüntülenmesi için iletişim kurallarının sundu. Temel kavram bağdaşık ışık ve elektron mikroskobu (CLEM)12benzemektedir. Buna ek olarak, bu yöntemde, canlı Siyanobakteriler floresans mikroskobu tarafından izlenen, hızla EM ızgaralar donmuş ve doğrudan yüksek gerilim cryo-elektron tomografi ile görüntülenir. İlk uygulama, DNA'ın ayrıntılı yapısı bakteri hücreleri sıkıştırılmış gibi başarılı bir şekilde 3D görselleştirildiği. Şu anda, bu konuya özel bir işlemdir ama daha kapsamlı, bazı durumlarda değiştirilmiş metodolojisi ile uygulanacaktır. Burada, avantajları, sınırlamaları ve bu yöntemi gelecekteki olanakları ele alınmıştır.
Bu yöntemin avantajları, biri bütün hücre 3D görselleştirme. 1 MV HVEM başarıyla görüntülenir Dinamik DNA hücre altı organelleri yapısını sıkıştırılmış hücreleri. Ancak, normal hücrelere ince yapısı nedeniyle düşük görüntü kontrastı ayırt edilebilir değil. Esnek olmayan artan ve kalın numuneler birden çok saçılma bulanıklaştırır görüntü13. Sıfır-kaybı ve en olası kaybı görüntü bir enerji filtresi yoluyla filtre elastik saçılma14,15azaltarak görüntü kontrastı artırabilir ama numuneler iMFP kalın için çalışmaz. Sıfır-kaybı ve en olası kaybı doruklarına numune kalınlığı ile büyük ölçüde azaltır. Elektron hassas buz gömülü numuneler için yeterli bir sinyal-gürültü oranı elde etmek özellikle zordur. Murata vd göstermiştir bu 1MV tarama iletim plastik parlak alan görüntüde daha yüksek görüntü kontrastı Maya hücreleri 5 µm kalınlık ile gömülü mikroskobu (kök) verir nerede görüntü kontrastı öncelikle genlik kontrast13 tarafından verilir . Ancak, daha yüksek hızlandırılmış elektron Knock hasar etkisi zarar duyarlı cryo-numune16için ışınlama doz için başka bir sınırlama oluşturur bekleniyor. Faz plaka17,18 Volta ve Frits kullanma HVEM için toplam doz gelecekte azaltarak Knock zarar azaltmak mümkün olabilir. HVEM için kalın örnekler kullanarak başka bir sınırlama HVEM sağlamak Kullanıcı Özellikleri dünya çapında kıt olduğu gerçeği gelir.
Kalın numuneler, cryo-kök tomografi vasıl 300 gözlemlemek için alternatif bir yöntem kullanarak kV yüksek kontrastlı görüntüler dondurulmuş-sulu numuneler üzerinde birkaç yüz nanometre19aşan kalınlı¤ında göstermiştir. Cryo-kök faz kontrast almak için elektron pthychographic mikroskobu Ayrıca, faz plaka kondansatör objektif bir faz modülasyonlu kırınım pixelated 2D dedektörü20transposes girmiştir. Görüntüleri birden çok diffractions hesaplamadan tarafından alınır. Doğrudan ve hızlı 3D cryo-görüntüleme büyük yerli cryo-yalan-SEM örnekleri, donmuş Ayrıca kullanılan21, seri nerede ile odaklı iyon kiriş kesit ve yüz görüntüleme engellemek için görüntüleme tamamen donmuş numuneler sulu için uygulanır. Bu teknolojiler Biyolojik örneklerin görüş yelpazesini genişletmek, bakteri, hedef konumunu bulmak zor olsa da Örneğin etiketli bakteri, çünkü hedef tamamen buz altında ve kırpma önce tanımlanamıyor.
DNA sıkıştırma Siyanobakteriler farklı bir yapıda üretir. DNA sıkıştırılmış hücreleri bile normal hücrelerde mevcut değil bir büyük yoğunluk önyargı hücrelerindeki nedeniyle lekeli olmadan kolayca ayırt edilirler. Ancak, hücre içinde daha fazla yerel etkinlikler görselleştirmek için fluorescently etiketli ROI elektron mikroskobu aktarmak gereklidir. Bağdaşık ışık ve elektron mikroskobu (CLEM) için ışık mikroskobu görüntüler ve elektron mikroskobu görüntüleri genellikle EM Bulucu ızgaralar12tarihinde floresan lateks boncuk veya kuantum nokta kullanarak correlated. Etiketleme parçacıklar yüksek elektron yoğunluğu floresans yanı sıra olması gerekir. Doğru ve güvenilir bir şekilde iki görüntü arasında pozisyonlar ilişkilendirmek. Ayrıca, etiketli alanı cryo-ışık mikroskobu ile teyit ederek, Roi tam örtüşme arasında iki mikroskoplar elde edilebilir. Bu parçacıklar ve cryo-ışık mikroskobu DNA sıkıştırma daha ayrıntılı yapısal olaylar karakterize, daha sağlam ve doğru bir ilişki içinde belgili tanımlık gelecek için vazgeçilmez bir araç olacaktır.
Bu makalede, siyanobakteriler DNA sıkıştırma geçici yapısını zaman uyumlu kültür, floresans mikroskobu ve yüksek gerilim cryo-elektron tomografi birleşimiyle karakterize gösterilmiştir. Bu iletişim kuralı sıkıştırılmış DNA gözlem üzerinde duruluyor. Bu yöntem yukarıda bahsedilen diğer yeni teknolojilerle birleştirildiğinde, bu DNA sıkıştırma daha ayrıntılı süreci araştırmak mümkün ve uygun değiştirilmiş yöntemleri yaygın olarak bakteri diğer dinamik yapısal olaylara tabidir.

DNA sıkıştırma bazı Siyanobakteriler olduğu belirlendi dramatik bir sitoplazmik olaydır. Ne zaman Synechococcus elongatus altında 12 h her ışık/karanlık döngüsü, görünümü diğer zaman açıkça farklı ışık süresi kısaltılmış göründü DNA kültürlü1puan. Bu işlem tarafından Kai proteinler2dayalı bir sirkadiyen saat denetlenir sürülmüştür. Seki ve ark. Höchst 33342 ile lekeli DNA ışık döneminin sonuna doğru S. elongatus hücrelerdeki sıkıştırılmış ve floresan mikroskop altında dalgalı bir çubuk şekli gösterdi bildirdin. Sıkıştırılmış DNA sonra çubuk ortasındaki ikiye bölünmüş ve nihayet her kızı hücre3normal tekdüze dağılım için döndürülen hücre olarak ayrılmış. Ancak, onun geçici doğası ve büyüklüğü elektron mikroskopi için yapısal analizi engellemiştir. Murata vd. kombine zaman uyumlu kültür, floresans mikroskobu, Hızlı dondurma ve yüksek de dahil olmak üzere çeşitli yöntemler gerilim elektron cryo-tomografi (cryo-HVET) ve geçici DNA sıkıştırma, yapısını belirlenmesinde başarılı oldu polifosfat organları (PPBs)4kinetik dahil olmak üzere. El yazması deneysel prosedürler birleştirerek görsel zor bir malzeme ayrıntılı açıklamasını sağlar.
S. elongatus kapsül bir şekli vardır, canlı hücreler çok kısa bir süre için sadece 2-5 µm, 0.5 µm hakkında bir genişliği ve mükemmel DNA sıkıştırma uzunluğu görünür. Bu nedenle, siyanobakteriyel DNA sıkıştırma içinde meydana gelen yapısal değişiklikler ayrıntılı olarak bilinmiyordu. Bu yapıların elektron mikroskobu tarafından araştırmak için iki ana teknik sorunların üstesinden gelmek gereklidir. Bir yerel koşullar yakınındaki bakteri bütün kalın bir örnek gözlem ve diğer dinamik bir yapısı hızlı fiksasyonu. İlk sorun gelince, esnek olmayan ortalama özgür keçiyolu (iMFP) elektron elektron mikroskobu5hızlanan voltajı bağlıdır. 300 transmisyon elektron mikroskobu (TEM) içinde kV, sanki daha az 350 nm. Örneğin, bir buz gömülü cyanobacterium zaman (numune kalınlığı ≈ 600 nm) 200kV TEM görülmektedir (iMFP ≈ 250 nm), hücre içindeki yapıları gözlemlemek zordur. Buna karşılık, 1 MV TEM (iMFP ≈ 500 nm) vermek ve görüntü hücre (Şekil 1) boyunca sitoplazmik yapısının. Bu iletişim kuralı ' belgili tanımlık eriyik, 1 hızlanan bir gerilim, bir yüksek gerilim elektron mikroskobu (HVEM) bir parçası olarak MV istihdam. Ancak, HVEM uygulamak İmkanlar dünya çapında sınırlıdır. Olası alternatif çözümler de tartışma bölümde ele alınmıştır. İkinci sorun cryo-elektron mikroskobu (cryo-EM) tarafından çözüldü. Bu dinamik yapılar yerel koşullar, nerede örnek sıvı etan hızlı dondurucu cihaz kullanarak hızla dondurulur ve donmuş an doğrudan değişiklikler6minimum görülmektedir yakınındaki görüntülenmesi için güçlü bir araçtır. Tomografi ile birleştirerek, üç boyutlu (3D) yapıları bir anlık görüntü tilt serisi7' den yeniden olabilir. Bu deneyde, DNA sıkıştırma zaman uyumlu kültür altında 12 h her açık/koyu döngüsü kullanarak elongatus S. yeniden oluşturulmalı ve numune dondurulması zamanlaması floresan mikroskop altında izleyerek tespit edildi.
Burada açıklanan yaklaşım yaygın olarak bakteri hücreleri, Örneğin hücre bölünmesi, kromozom segregasyon ve faj enfeksiyon dinamik yapıları incelenmesi için geçerlidir ve mikrobiyolojik araştırmada yeni yollar açmak için bir potansiyele sahiptir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="796">
	<tbody>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:235px;">Hoechst 33342 solution</td>
			<td style="width:143px;">Dojindo</td>
			<td style="width:155px;">346-07951</td>
			<td style="width:263px;">1mg/mL in H2O</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Agar Powder (for plant culture)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>016-11875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Boric acid</td>
			<td>Wako</td>
			<td>027-02192</td>
			<td>99.5%</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Manganese chloride tetrahydrate</td>
			<td>Wako</td>
			<td>139-00722</td>
			<td>99%</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Zinc sulfate heptahydrate</td>
			<td>Wako</td>
			<td>264-00405</td>
			<td>99.5%</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium molybdate</td>
			<td>Wako</td>
			<td>196-02472</td>
			<td>99%</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Copper sulfate pentahydrate</td>
			<td>Wako</td>
			<td>039-04412</td>
			<td>99.5%</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cobalt nitrate hexahydrate</td>
			<td>Wako</td>
			<td>031-03752</td>
			<td>99.5%</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium nitrate</td>
			<td>Wako</td>
			<td>191-02542</td>
			<td>99%</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>Wako</td>
			<td>131-00405</td>
			<td>99.5%</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Calcium chloride dehydrate</td>
			<td>Wako</td>
			<td>031-00435</td>
			<td>99.5%</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Citric acid</td>
			<td>Wako</td>
			<td>036-05522</td>
			<td>98%</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EDTA-2Na</td>
			<td>Dojindo</td>
			<td>343-01861</td>
			<td>99.5%</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium carbonate</td>
			<td>Wako</td>
			<td>197-01581</td>
			<td>99.8%</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Potassium phosphate dibasic</td>
			<td>Wako</td>
			<td>164-04295</td>
			<td>99%</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TES (Good&#8217;s buffer)</td>
			<td>Dojindo</td>
			<td>344-02653</td>
			<td>99%</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ferric ammonium citrate</td>
			<td>Wako</td>
			<td>092-00802</td>
			<td>1st Grade</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium thiosulfate pentahydrate</td>
			<td>Wako</td>
			<td>197-03585</td>
			<td>99%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BSA gold tracer 15nm</td>
			<td>Aurion</td>
			<td>215.133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Quantifoil EM grid</td>
			<td>Quantifoil MicroTools</td>
			<td>R3.5/1 Copper grid</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Electron films</td>
			<td>Kodak</td>
			<td>SO-163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Developer</td>
			<td>Kodak</td>
			<td>D19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fixer</td>
			<td>Kodak</td>
			<td>Rapid fixer</td>
			<td>Solution</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>Grade 1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Growth chamber</td>
			<td>NKsystem</td>
			<td>LH-100SP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fluorescent microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>ECLIPSE 50i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">High voltage TEM</td>
			<td>HItachi</td>
			<td>H1250M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cryo-specimen holder for HVEM</td>
			<td>Gatan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">plunge-freezing device</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EM CPC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Plasma Ion bombarder</td>
			<td>Vacuum device</td>
			<td>PIB-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Liquid nitrogen storage</td>
			<td>Taylor-Wharton</td>
			<td>25LDB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Developing tank</td>
			<td>Dosaka EM</td>
			<td>TB-3-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">flatbed scanner</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Coolscan 9000ED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Segmentation software</td>
			<td>FEI</td>
			<td>Amira</td>
			<td>https://www.fei.com/software/amira</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tomographic Reconstruction software</td>
			<td>eTOMO</td>
			<td></td>
			<td>http://bio3d.colorado.edu/imod</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of dna compaction in cyanobacteria by high-voltage cryo-electron tomography

Bu iletişim kuralı, siyanobakteriler geçici DNA sıkıştırma görselleştirmek açıklar. DNA sıkıştırma son zamanlarda bazı Siyanobakteriler hücre bölünmesi önce gerçekleşmesi için bulundu dramatik sitoplazmik olaydır. Ancak, büyük hücre boyutu ve geçici karakteri nedeniyle yapısı ayrıntılı araştırmak zordur. Zorlukları aşmak için ilk olarak, DNA sıkıştırma tekrarlanarak cyanobacterium Synechococcus elongatus PCC 7942 12 h her ışık/karanlık döngüsü kullanılarak zaman uyumlu kültür tarafından üretilmektedir. İkinci olarak, DNA sıkıştırma floresans mikroskobu tarafından izlenen ve hızlı donma tarafından ele geçirdi. Üçüncü olarak, hücre DNA'ın ayrıntılı yapısı sıkıştırılmış yüksek gerilim cryo-elektron tomografi tarafından üç boyutlu (3D) olarak görüntülenir. Bu yöntemler bakteri, Örneğin hücre bölünmesi, kromozom segregasyon, fajının enfeksiyon vbgeçici yapılarını araştırmak için yaygın olarak uygulanabilir ayarlanır., hangi floresans mikroskobu tarafından izlenen ve doğrudan tarafından görüntülenmiştir Cryo-elektron tomografi uygun zaman noktalarda.

Küçük 12 h her açık/koyu döngüsü bir kesin zaman uyumlu kültürde Höchst ile etiketli DNA karanlık durumda (Şekil 2a) normal tekdüze dağılım gösterir. Ancak, bu kademeli hücre içinde ışık döneminde düzenler ve ışık dönemin sonunda bir dalgalı çubuk benzeri yapı (Şekil 2b) olarak görünür. Son olarak, Merkezi ( Şekil 2c oklar) çubuk böler ve onun iki bölümden kızı hücreleri (Şekil 2B) dağıtılır. Hücre bölünmesi sonra sıkıştırılmış DNA hemen kaybolur ve DNA için normal bir üniforma dağılımı verir.
Ne zaman bir aliquot hücreleri DNA sıkıştırma son aşamasında içeren hücre hemen transfer delikli bir ızgara üzerine ve hızlı donmuş sıvı etan ve donmuş kılavuz 1 MV cryo-HVEM, siyanobakteriler dahil olmak üzere iç yapıları tarafından gözlenmiştir DNA, thylakoid membran katmanları, hücre duvarları ve PPBs, olduğu gibi bir anlık görüntü (Şekil 3a) dondurma anda ortaya çıktı. Birçok hücreler hücreleri ( Şekil 3a' beyaz ok) farklı DNA sıkıştırma gösterdi ve normal hücreleri ( Şekil 3biçinde beyaz ok uçları) kolayca ayırt edici olabilir. Bazı hücrelerin ortasındaki bir daralma önce hücre bölünmesi ( Şekil 3a' sarı ok) beklendiği gibi sergiledi.
3D tomograms içinde büyük organellerin hücre bölümlenmiş; hücre duvarı, thylakoid membran katmanları, DNA ve PPBs olabilir (Şekil 4) ayırt. Özellikle, sıkıştırılmış DNA nerede DNA düşük yoğunluklu malzeme ile çevrili ve thylakoid membran katmanlar düzenlenen DNA'ın çubuk dalgalı bozuk sitoplazma içinde ayrı bir boşluk ayrılmış. PPBs dinamik davranışı yeni gözlenen: DNA'sı hücreleri, sıkıştırılmış ise büyük birçok küçük PPBs DNA için uygun görüldü ve normal hücrelere daha az. Buna ek olarak, çoğu PPBs çiftleri olarak ortaya çıktı ve bazı DNA PPBs ayrılması bir süreçte olduğu ortaya çıktı. Bu PPBs kendilerini iki DNA ikilenmesi ve işlevi tarafından fosfat DNA sentezi için tedarikçileri olarak ayrılır olduğunu ileri sürdü.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57197/57197fig1.jpg"> Şekil 1. Cryo-EM görüntülerini normal Siyanobakteriler, S. elongatus PCC 7942 farklı hızlanan gerilimleri, buz gömülü. a) 200kV ve b) 1000kV. Ölçek çubuğu = 500 nm. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57197/57197fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57197/57197fig2.jpg"> Resim 2: Floresan mikroskopi cyanobacterium S. elongatus hücre. Her açık/koyu altında 12 saat döngüleri zaman uyumlu kültür sonra hücreleri Höchst 33342 ile lekeli. (a) hücreleri koyu devlet başlangıcı 2 h sonra tek tip DNA etiketleme gösterir. Birçok hücrelerdeki DNA yavaş yavaş ışık döneminde yoğunlaşmak. Sonuçta bir kalın dalgalı çubuk (b) DNA sıkıştırmak tipik kurdu. Bu aşamadan sonra hızlı bir şekilde kendi merkezlerinde (ok uçları) bölünmüş hücre bölünmesi (c) ve iki parça sırasında sıkıştırılmış DNA yapıları ayrılmış kızı hücreleri (d). Kızı hücreleri tek tip DNA karanlık dönemde tekrar etiketleme için döndürdü. Ölçek çubuğu 2 µm. = <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57197/57197fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57197/57197fig3.jpg"> Şekil 3: Siyanobakteriler görüntüsünü Cryo-HVEM gömülü amorf buz (a) bir raw resim 0 ° tilt olarak gösterir. Görüntüleri ışık dönemin sonunda alındı. Bazı hücreleri dalgalı çubuk şekilli DNA organları benzer ökaryotik yoğun kromozomlar (beyaz ok) gösterir. Normal hücrelerde, siyanobakteriler discernable DNA yapısı içinde sitoplazma (beyaz ok uçları) sergi. Bazı hücrelerin hücre bölünmesi (sarı ok) önce beklendiği gibi merkezi bir daralma sergi. (b) xy, xz, yz-3D tomogram dilim. Sarı noktalı çizgiler kavşak dilimleri göster. Ölçek çubuğu 2 µm. = <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57197/57197fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57197/57197fig4.jpg"> Şekil 4: Ultrastructure hücre içeren sıkıştırılmış DNA'sı. Ana bileşenleri parçalara: hücre duvarı (parlak sarı), thylakoid membranlar (kırmızı) ve DNA (mavi). (a) 3D tomogram dilim z gösterir. (b) tüm kesimleri. Hücre ayrılık gösteren daralma hücre (ok) ortasında görünür. PPBs sarı veya turuncu küreler modellenmiştir; turuncu her alanda en yakın sarı küre muadili temsil eder. Ölçek çubuğu = 500 nm. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57197/57197fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of DNA Compaction in Cyanobacteria by High-voltage Cryo-electron Tomography at JoVE.com

Visualization of DNA Compaction in Cyanobacteria by High-voltage Cryo-electron Tomography

Bu iletişim kuralı, siyanobakteriler geçici DNA sıkıştırma görselleştirmek açıklar. Zaman uyumlu ekimi, floresans mikroskobu, Hızlı dondurma ve yüksek tarafından izleme gerilim cryo-elektron tomografi kullanılır. Bu metodolojileri için bir protokol sundu ve gelecekteki uygulamalar ve gelişmeler ele alınmıştır.

Siyanobakteriler yüksek gerilim Cryo-elektron tomografi tarafından DNA sıkıştırma görselleştirme

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. DNA compaction is a dramatic cytoplasmic event recently found to ...

visualization-dna-compaction-cyanobacteria-high-voltage-cryo-electron

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

9.0K Görüntüleme.  National Institute for Physiological Sciences. Bu iletişim kuralı, siyanobakteriler geçici DNA sıkıştırma görselleştirmek açıklar. Zaman uyumlu ekimi, floresans mikroskobu, Hızlı dondurma ve yüksek tarafından izleme gerilim cryo-elektron tomografi kullanılır. Bu metodolojileri için bir protokol sundu ve gelecekteki uygulamalar ve gelişmeler ele alınmıştır.

Video: Visualization of DNA Compaction in Cyanobacteria by High-voltage Cryo-electron Tomography

Visualization of DNA Replication in the Vertebrate Model System DT40 using the DNA Fiber Technique

Maintenance of replication fork stability is of utmost importance for dividing cells to preserve viability and prevent disease. The processes involved not only ensure faithful genome duplication in the face of endogenous and exogenous DNA damage but also prevent genomic instability, a recognized causative factor in tumor development.
Here, we describe a simple and cost-effective fluorescence microscopy-based method to visualize DNA replication in the avian B-cell line DT40. This cell line provides a powerful tool to investigate protein function in vivo by reverse genetics in vertebrate cells1. DNA fiber fluorography in DT40 cells lacking a specific gene allows one to elucidate the function of this gene product in DNA replication and genome stability. Traditional methods to analyze replication fork dynamics in vertebrate cells rely on measuring the overall rate of DNA synthesis in a population of pulse-labeled cells. This is a quantitative approach and does not allow for qualitative analysis of parameters that influence DNA synthesis. In contrast, the rate of movement of active forks can be followed directly when using the DNA fiber technique2-4. In this approach, nascent DNA is labeled in vivo by incorporation of halogenated nucleotides (Fig 1A). Subsequently, individual fibers are stretched onto a microscope slide, and the labeled DNA replication tracts are stained with specific antibodies and visualized by fluorescence microscopy (Fig 1B). Initiation of replication as well as fork directionality is determined by the consecutive use of two differently modified analogues. Furthermore, the dual-labeling approach allows for quantitative analysis of parameters that influence DNA synthesis during the S-phase, i.e. replication structures such as ongoing and stalled forks, replication origin density as well as fork terminations. Finally, the experimental procedure can be accomplished within a day, and requires only general laboratory equipment and a fluorescence microscope.

DT40, a model vertebrate genetic system, provides a powerful tool to analyze protein function. Here we describe a simple method that allows qualitative analysis of parameters that influence DNA synthesis during the S-phase in DT40 cells at the single molecule level.

DNA replikasyonu Görselleştirme Omurgalı Model Sistemi DT40 DNA Fiber Tekniği

Maintenance of replication fork stability is of utmost importance for dividing cells to preserve viability and prevent disease. The processes involved not ...

Biyoloji

Visualization of ATP Synthase Dimers in Mitochondria by Electron Cryo-tomography

Electron cryo-tomography is a powerful tool in structural biology, capable of visualizing the three-dimensional structure of biological samples, such as cells, organelles, membrane vesicles, or viruses at molecular detail. To achieve this, the aqueous sample is rapidly vitrified in liquid ethane, which preserves it in a close-to-native, frozen-hydrated state. In the electron microscope, tilt series are recorded at liquid nitrogen temperature, from which 3D tomograms are reconstructed. The signal-to-noise ratio of the tomographic volume is inherently low. Recognizable, recurring features are enhanced by subtomogram averaging, by which individual subvolumes are cut out, aligned and averaged to reduce noise. In this way, 3D maps with a resolution of 2 nm or better can be obtained. A fit of available high-resolution structures to the 3D volume then produces atomic models of protein complexes in their native environment. Here we show how we use electron cryo-tomography to study the in situ organization of large membrane protein complexes in mitochondria. We find that ATP synthases are organized in rows of dimers along highly curved apices of the inner membrane cristae, whereas complex I is randomly distributed in the membrane regions on either side of the rows. By subtomogram averaging we obtained a structure of the mitochondrial ATP synthase dimer within the cristae membrane.

We present a protocol of how to collect and process electron cryo-tomograms of whole mitochondria. The technique provides detailed insights into the structure, function, and organization of large membrane protein complexes in native biological membranes.

Elektron Cryo-tomografi ile Mitokondri ATP Sintazı dimerlerini Görselleştirme

Electron cryo-tomography is a powerful tool in structural biology, capable of visualizing the three-dimensional structure of biological samples, such as ...

Cryo-electron Microscopy Specimen Preparation By Means Of a Focused Ion Beam

Here we present a protocol used to prepare cryo-TEM samples of Aspergillus niger spores, but which can easily be adapted for any number of microorganisms or solutions. We make use of a custom built cryo-transfer station and a modified cryo-SEM preparation chamber2. The spores are taken from a culture, plunge-frozen in a liquid nitrogen slush and observed in the cryo-SEM to select a region of interest. A thin lamella is then extracted using the FIB, attached to a TEM grid and subsequently thinned to electron transparency. The grid is transferred to a cryo-TEM holder and into a TEM for high resolution studies. Thanks to the introduction of a cooled nanomanipulator tip and a cryo-transfer station, this protocol is a straightforward adaptation to cryogenic temperature of the routinely used FIB preparation of TEM samples. As such it has the advantages of requiring a small amount of modifications to existing instruments, setups and procedures; it is easy to implement; it has a broad range of applications, in principle the same as for cryo-TEM sample preparation. One limitation is that it requires skillful handling of the specimens at critical steps to avoid or minimize contaminations.

Cryo Electron Microscopes, either Scanning (SEM) or Transmission (TEM), are widely used for characterization of biological samples or other materials with a high water content1. A SEM/Focused Ion Beam (FIB) is used to identify features of interest in samples and extract a thin, electron-transparent lamella for transfer to a cryo-TEM.

Odaklanmış iyon demeti Of Cryo-elektron Mikroskopi Numune Hazırlama By Means

Here we present a protocol used to prepare cryo-TEM samples of Aspergillus niger spores, but which can easily be adapted for any number of microorganisms ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the development of diverse techniques to visualize individual RNA transcripts in single living cells. One promising technique that has recently been described utilizes an oligonucleotide-based optical probe, ratiometric bimolecular beacon (RBMB), to detect RNA transcripts that were engineered to contain at least four tandem repeats of the RBMB target sequence in the 3&#8217;-untranslated region. RBMBs are specifically designed to emit a bright fluorescent signal upon hybridization to complementary RNA, but otherwise remain quenched. The use of a synthetic probe in this approach allows photostable, red-shifted, and highly emissive organic dyes to be used for imaging. Binding of multiple RBMBs to the engineered RNA transcripts results in discrete fluorescence spots when viewed under a wide-field fluorescent microscope. Consequently, the movement of individual RNA transcripts can be readily visualized in real-time by taking a time series of fluorescent images. Here we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery into cells by microporation and live-cell imaging of single RNA transcripts.

Ratiometric bimolecular beacons (RBMBs) can be used to image single engineered RNA transcripts in living cells. Here, we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery of RBMBs into cells by microporation and fluorescent imaging of single RNA transcripts in real-time.

Oranlı metrik Bimoleküler Fenerleri kullanma Yaşam Hücrelerde Tek Engineered RNA Transkriptlerinin Gerçek zamanlı Görüntüleme

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Visualization of miniSOG Tagged DNA Repair Proteins in Combination with Electron Spectroscopic Imaging (ESI)

The limits to optical resolution and the challenge of identifying specific protein populations in transmission electron microscopy have been obstacles in cell biology. Many phenomena cannot be explained by in vitro analysis in simplified systems and need additional structural information in situ, particularly in the range between 1 nm and 0.1 &#181;m, in order to be fully understood. Here, electron spectroscopic imaging, a transmission electron microscopy technique that allows simultaneous mapping of the distribution of proteins and nucleic acids, and an expression tag, miniSOG, are combined to study the structure and organization of DNA double-strand break repair foci.

Visualization of miniSOG Tagged DNA Repair Proteins in Combination with Electron Spectroscopic Imaging ESI

Electron spectroscopic imaging can image and distinguish nucleic acid from protein at nanometer resolution. It can be combined with the miniSOG system, which is able to specifically label tagged proteins in transmission electron microscopy samples. We illustrate the use of these technologies using double-strand break repair foci as an example.

Elektron Spektroskopik Görüntüleme Kombinasyonunun miniSOG Etiketli DNA Onarım Proteinler Görselleştirme (ESI)

The limits to optical resolution and the challenge of identifying specific protein populations in transmission electron microscopy have been obstacles in ...

Visualization of Surface-tethered Large DNA Molecules with a Fluorescent Protein DNA Binding Peptide

Large DNA molecules tethered on the functionalized glass surface have been utilized in polymer physics and biochemistry particularly for investigating interactions between DNA and its binding proteins. Here, we report a method that uses fluorescent microscopy for visualizing large DNA molecules tethered on the surface. First, glass coverslips are biotinylated and passivated by coating with biotinylated polyethylene glycol, which specifically binds biotinylated DNA via avidin protein linkers and significantly reduces undesirable binding from non-specific interactions of proteins or DNA molecules on the surface. Second, the DNA molecules are biotinylated by two different methods depending on their terminals. The blunt ended DNA is tagged with biotinylated dUTP at its 3' hydroxyl terminus, by terminal transferase, while the sticky ended DNA is hybridized with biotinylated complimentary oligonucleotides by DNA ligase. Finally, a microfluidic shear flow makes single DNA molecules stretch to their full contour lengths after being stained with fluorescent protein-DNA binding peptide (FP-DBP).

We present an approach for visualizing fluorescent protein DNA binding peptide (FP-DBP)-stained large DNA molecules tethered on the polyethylene glycol (PEG) and avidin-coated glass surface and stretched with microfluidic shear flows.

Peptit bağlanma floresan protein DNA ile yüzey-gergin büyük DNA moleküllerinin Görselleştirme

Large DNA molecules tethered on the functionalized glass surface have been utilized in polymer physics and biochemistry particularly for investigating ...

Genetic Modification of Cyanobacteria by Conjugation Using the CyanoGate Modular Cloning Toolkit

Cyanobacteria are a diverse group of prokaryotic photosynthetic organisms that can be genetically modified for the renewable production of useful industrial commodities. Recent advances in synthetic biology have led to development of several cloning toolkits such as CyanoGate, a standardized modular cloning system for building plasmid vectors for subsequent transformation or conjugal transfer into cyanobacteria. Here we outline a detailed method for assembling a self-replicating vector (e.g., carrying a fluorescent marker expression cassette) and conjugal transfer of the vector into the cyanobacterial strains Synechocystis sp. PCC 6803 or Synechococcus elongatus UTEX 2973. In addition, we outline how to characterize the performance of a genetic part (e.g., a promoter) using a plate reader or flow cytometry.

Here, we present a protocol describing how to i) assemble a self-replicating vector using the CyanoGate modular cloning toolkit, ii) introduce the vector into a cyanobacterial host by conjugation, and iii) characterize transgenic cyanobacteria strains using a plate reader or flow cytometry.

CyanoGate Modüler Klonlama Araç Kiti Kullanılarak Konjugasyon ile Siyanobakterilerin Genetik Modifikasyonu

Cyanobacteria are a diverse group of prokaryotic photosynthetic organisms that can be genetically modified for the renewable production of useful ...

Visualization of DNA Repair Proteins Interaction by Immunofluorescence

Mammalian cells are constantly exposed to chemicals, radiations, and naturally occurring metabolic by-products, which create specific types of DNA insults. Genotoxic agents can damage the DNA backbone, break it, or modify the chemical nature of individual bases. Following DNA insult, DNA damage response (DDR) pathways are activated and proteins involved in the repair are recruited. A plethora of factors are involved in sensing the type of damage and activating the appropriate repair response. Failure to correctly activate and recruit DDR factors can lead to genomic instability, which underlies many human pathologies including cancer. Studies of DDR proteins can provide insights into genotoxic drug response and cellular mechanisms of drug resistance.
There are two major ways of visualizing&#160;proteins in vivo: direct observation, by tagging the protein of interest with a fluorescent protein and following it by live imaging, or indirect immunofluorescence on fixed samples. While visualization of fluorescently tagged proteins allows precise monitoring over time, direct tagging in N- or C-terminus can interfere with the protein localization or function. Observation of proteins in their unmodified, endogenous version is preferred. When DNA repair proteins are recruited to the DNA insult, their concentration increases locally and they form groups, or &#8220;foci&#8221;, that can be visualized by indirect immunofluorescence using specific antibodies.
Although detection of protein foci does not provide a definitive proof of direct interaction, co-localization of proteins in cells indicates that they regroup to the site of damage and can inform of the sequence of events required for complex formation. Careful analysis of foci spatial overlap in cells expressing wild type or mutant versions of a protein can provide precious clues on functional domains important for DNA repair function. Last, co-localization of proteins indicates possible direct interactions that can be verified by co-immunoprecipitation in cells, or direct pulldown using purified proteins.

Following DNA damage, human cells activate essential repair pathways to restore the integrity of their genome. Here, we describe the method of indirect immunofluorescence as a means to detect DNA repair proteins, analyze their spatial and temporal recruitment, and help interrogate protein-protein interaction at the sites of DNA damage.

DNA Onarım Proteinlerinin İmmünfluoresan Etkileşiminin Görselleştirilmesi

Mammalian cells are constantly exposed to chemicals, radiations, and naturally occurring metabolic by-products, which create specific types of DNA ...

Cryo-Electron Microscopic Grid Preparation for Time-Resolved Studies using a Novel Robotic System, Spotiton

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental challenge of great interest to the field of cryo-electron microscopy (cryo-EM). A few methodological strategies have been developed that support these &#34;time-resolved&#34; studies, one of which, Spotiton-a novel robotic system-combines the dispensing of picoliter-sized sample droplets with precise temporal and spatial control. The time-resolved Spotiton workflow offers a uniquely efficient approach to interrogate early structural rearrangements from minimal sample volume. Fired from independently controlled piezoelectric dispensers, two samples land and rapidly mix on a nanowire EM grid as it plunges toward the cryogen. Potentially hundreds of grids can be prepared in rapid succession from only a few microliters of a sample. Here, a detailed step-by-step protocol of the operation of the Spotiton system is presented with a focus on troubleshooting specific problems that arise during grid preparation.

The protocol presented here describes the use of Spotiton, a novel robotic system, to deliver two samples of interest onto a self-wicking, nanowire grid that mix for a minimum of 90 ms prior to vitrification in liquid cryogen.

Yeni Bir Robotik Sistem Kullanarak Zaman Çözümlenen Çalışmalar için Kriyo-Elektron Mikroskobik Izgara Hazırlığı, Spotiton

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental ...

Sample Preparation by 3D-Correlative Focused Ion Beam Milling for High-Resolution Cryo-Electron Tomography

Cryo-electron tomography (cryo-ET) has become the method of choice for investigating cellular ultrastructure and molecular complexes in their native, frozen-hydrated state. However, cryo-ET requires that samples are thin enough to not scatter or block the incident electron beam. For thick cellular samples, this can be achieved by cryo-focused ion beam (FIB) milling. This protocol describes how to target specific cellular sites during FIB milling using a 3D-correlative approach, which combines three-dimensional fluorescence microscopy data with information from the FIB-scanning electron microscope. Using this technique, rare cellular events and structures can be targeted with high accuracy and visualized at molecular resolution using cryo-transmission electron microscopy (cryo-TEM).

Here, we present a pipeline for 3D-correlative focused ion beam milling on guiding the preparation of cellular samples for cryo-electron tomography. The 3D position of fluorescently tagged proteins of interest is first determined by cryo-fluorescence microscopy, and then targeted for milling. The protocol is suitable for mammalian, yeast, and bacterial cells.

Yüksek Çözünürlüklü Kriyo-Elektron Tomografisi için 3D Korbağıntılı Odaklanmış İyon Işını Frezeleme ile Numune Hazırlama

Cryo-electron tomography (cryo-ET) has become the method of choice for investigating cellular ultrastructure and molecular complexes in their native, ...