Name: chemical amputation and regeneration of the pharynx in the planarian schmidtea mediterranea
Uploaded: 2018-03-26T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 14 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Chemical Amputation and Regeneration of the Pharynx in the Planarian Schmidtea mediterranea at JoVE.com

Alejandro Sánchez Alvarado, ilk iyileştirme ve geliştirme bu tekniğin desteklenen teşekkür etmek istiyorum. Carolyn Adler'in laboratuvar çalışmalarında Cornell Üniversitesi başlangıç fonlar tarafından desteklenir.

1. hazırlık
<ol><li>
Planarialar su hazırlanması 17<ol>
<li>Planarians 1 X Montjuïc tuz solüsyonu içinde korumak. Planarian su hazırlamak için bireysel hisse senedi 1 M CaCl2, 1 M MgSO4, 1 M MgCl2, 1 M KCl ve çözümleri ultrasaf su içinde 5 M NaCl olun. Filtre-0.2 µm şişe-üst filterfor uzun süreli depolama ile sterilize. Not: Montjuïc tuzları hazırlamak için sadece ultrasaf deiyonize su (bir direnci 18,2 MΩ 25 ° c) kullanın.</li>
		<li>5 X tuz solüsyonu 1 L stokunun hazırlamak için 1 M CaCl2, 1 M MgSO4, MgCl2, 0.5 mL KCl ve 5 M NaCl çözümleri 900 mL ultrasaf su 1.6 mL 0.5 mL 5 mL 5 mL birleştirir. Bu çözüm için NaHCO3 0,504 g ekleyin ve karışımı ilave edin. PH hidroklorik asit ile 7.0 için ayarlayın.</li>
		<li>Bu 5 X 1 X çalışma konsantrasyonu ultrasaf su geniş kapasite damacana gibi steril bir kap içinde hisse senedi çözüm seyreltik ( Tablo reçetesigörmek). Bu 1 X çözüm eşeysiz planarians korumak için kullanın. Not: Montjuïc tuz solüsyonu alternatif, yerel olarak satın alınan kaynak suyu veya ultrasaf su piyasada akvaryum tuz içeren kullanın (bkz. Tablo malzeme) bir konsantrasyon of0.5 g/L18karıştırın.</li>
		<li>Statik kültür19bakteriyel enfeksiyonu önlemek için bir antibiyotik içeren suda planarians korumak. 50 mg/mL stok çözüm gentamisin sülfat ultrasaf su hazırlamak ve filtre sterilize. Nerede hayvanlar korunur kaplarına gentamisin sülfat 50 µg/mL (1: 1000 seyreltme) son bir konsantrasyon için ekleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Karaciğer Yapıştır hazırlanması
	<ol>
<li>Planarians organik bir diyete gelişmek gibi çim beslenen sığır eti karaciğer, satın alma taze karaciğer ve işlemi 24 h içinde kaldırmak yavaşça soyulmuştu tarafından karaciğer Kapsüllenen zar kapsül. Karaciğer ~ 1 cm küpler halinde kesilmiş ve kapalı kazımak ve tüm hepatik damarları ve arterler atmak için bir bıçak kullanın.</li>
		<li>Karaciğer adet gıda fabrikası veya mutfak robotu kullanarak macerate ve sonra bir tel kafes gıda süzgeç aracılığıyla geçer. Hamur işi çanta birleştirmek ve şırınga veya 35 mm Petri yemekler dağıtmak. Besleme önce yavaşça hava kabarcıkları kaldırmak için santrifüj kapasitesi.</li>
		<li>Aliquots karaciğer için-80 ° c en çok bir yıl ve kullanmadan önce tezcan saklayın. Çözdürme sonra artık herhangi bir karaciğer bir kez yeniden dondurma veya en fazla 24 saat için 4 ° C'de depolayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Hayvan bakım
	<ol>
<li>Planarians büyüyecek ve çeşitli boyutlarda bağlı olarak besleme frekans daraltmak. Planarians her hafta (14 günde bir kez) besleme. Uzun vadeli toplu kültürler, irili ufaklı ( Tablo malzemelerigörmek) plastik kaplar kullanın.</li>
		<li>Hayvanları beslemek için bir metal spatula veya plastik transfer damlalıklı bir kutu içinde bir bezelye büyüklüğünde damla karaciğer eklemenizi sağlar. Hayvanlar kutusunu temizlemeden önce 1-2 h. Kaldır kalan yemek yemek izin.</li>
		<li>Beslenen değilse temiz worms (besleme hemen sonra bir kez ve bir kez iki gün sonra) beslenen Eğer haftada iki kez veya haftada bir kez. Temizlemek için bir plastik kabı dikkatle planarians kutusunda koruyarak suyu dökerek su tahliye. Kutusunu yüzey kağıt havlu ile silin, sonra kutunun temiz olana her tarafta tekrarlayın.</li>
		<li>Su (yaklaşık ¾ kutusu birimi için) eski yerine koymak ve gentamisin 50 µg/mL nihai bir konsantrasyon için ekleyin. Hayvanlar karanlık bir dolap ya da 20 ° C kuluçka saklayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Solucanlar yelpazesi
	<ol>
<li>5-7 gün önceden beslenen edildi solucanlar seçin. Not: Bu pharynges son zamanlarda (1-2 gün kala amputasyon) beslenen solucanlar dan kesmek önemli ölçüde daha zordur. Beslenen hayvanlar da sodyum azid için daha duyarlıdır.</li>
		<li>Aşağı yukarı 6 mm uzunluğunda olan solucanlar seçin. Solucan boyutunu tahmin etmek için bir plastik transfer pipet kullanarak bir Petri kabına aktarın. Düz 6 - inç cetvel veya 5 x 5 mm grafik kağıdı altında Petri kabına yerleştirin ve o tarar iken solucan uzunluğu ölçmek. Not: Solucanlar uzunluğu 6 mm daha küçük kesmek daha zordur.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Sodyum azid hazırlanması
	<ol>
<li>Sodyum azid toz planarialar suda çözülerek 100 mM çözüm hazırlamak. Uyarı: Sodyum azid toksik ve dikkatle ele alınmalıdır. Sodyum azid boşa atmayın. Aşağıdaki kullanmak, bunları ayrı ayrı olarak tehlikeli atık bertarafı için toplar.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. yutak amputasyon
<ol><li>Yer bir 35-mm çap Petri kabına solucanlar. Dikkatle tüm planarian su yemek plastik transfer damlalıklı kullanarak kaldırın. Not: En fazla 20 6 mm solucanlar konforlu bu büyüklükte bir tabak içinde yerleştirilebilir.</li>
	<li>Mikroskop altında tabak yerleştirin ve birden fazla kurt-ebilmek var olmak görüş aynı anda büyütme ayarlayın (örneğin 10 X büyütme). Planarian su 100 mM sodyum azid çözüm ile değiştirin. Not: Bir 35-mm Petri için yaklaşık 5 mL sodyum azid de yeterlidir. Çözüm tamamen planarians daldırın. Çözüm cilt daha büyük yemekler için gerektiği gibi ayarlayın.</li>
	<li>Mikroskop ve yemek için ilk 3-4 dk taşıma kaçının altında hayvanlar izlemek.</li>
	<li>Yutak ekstrüzyon ile mikroskop gözlemlemek; yutak faringeal kese çıkıntı ve tam olarak uzatmak (yaklaşık 1 mm uzunluğunda) şekil 1Badımında gösterildiği gibi. Not: Yutak tamamen devam etmeden önce uzanan işlemini tamamlayana kadar bekleyin önemlidir. Bir kez yutak hayvandan ortaya çıkıyor, tam çekiş kabaca 1 dk alır.</li>
	<li>Bir plastik transfer damlalıklı hayvanlar çanak çevresinde bücür için kullanın. Hayvanlar damlalıklı emmek ve birkaç kez amacına zorla bırakın. Yutak tamamen uzun, bu güçlü pipetting ayırmak için neden olur.</li>
	<li>Alternatif olarak, yutak, uzunluğu boyunca dikey veya yatay olarak iyi forseps ( Tablo malzemelerigörmek) bir çift kullanarak onun çevresi boyunca şekil 1 ciçinde gösterildiği gibi kavramak. Forseps sıkışmak yutak ile hayvan Menisküs yukarı doğru kaldırın. Hayvan ortaya çıkar, yüzey gerilimi hayvandan ayırmak yutak sebep olacaktır. Not: Bu yöntem, nerede güçlü dönen yeterli değil daha küçük hayvanlar (1-3 mm uzunluğunda) pharynges kaldırmak için kullanılabilir. Alay ya da başka türlü hayvan bedeni yaralanmasına kaçının.</li>
	<li>Bir aktarım damlalıklı kullanarak, uzvunu hayvanlar taze planarialar su içeren yeni bir tabak için taşıyın.</li>
	<li>Bir kez transfer, durulama iyice planarialar su tamamen üç kere su alışverişi, hayvanlarda kesilmiş. Planarialar su 50µg/mL gentamisin ile içeren yeni bir tabak aktarın. Not: Tam arabellek değişimi bu üç yıkama sırasında sodyum azid kaldırılmasını sağlamak için önemlidir.</li>
	<li>Ertesi gün, çanak suda gentamisin 50 µg/mL içeren taze planarialar su ile değiştirin. Bundan sonra her gün tekrarlayın.</li>
</ol>3. yutak kaldırıldıktan sonra amputasyon değerlendirilmesi
<ol><li>Şekil 2Agösterildiği gibi karanlık bir nokta yutak, başarılı kaldırıldıktan sonra ortaya çıkmıştır olup olmadığını belirlemek için hayvanlar (10-20 X büyütme ile) mikroskop altında incelemek.</li>
	<li>Alternatif olarak, tamir ve hayvanlar Pearson ve ark. tarafından açıklanan protokolüne göre çamaşır suyu 20. emmek hayvan gecede 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) veya fluorescently Birleşik streptavidin (1 mg/mL sulandırılmış 1:500 1 X %0,3 içeren fosfat Buffered Saline Triton-X). Hayvanlar % 80 glycerol/20% 1 X fosfat Buffered serum ve floresan stereomicroscope (şekil 2B) altında görüntü içindeki slaytları bağlama. Not: Tüm görüntüleri bu el yazması bir floresan stereomicroscope 1.0 X amacı ile ele geçirildi.</li>
</ol>4. yutak rejenerasyon davranış besleme ölçme tarafından değerlendirilmesi
<ol><li>
Karaciğer hazırlanması
	<ol>
<li>Karaciğer hamur gerekli miktar bir microcentrifuge veya konik tüp aktarın. Kısaca hava kabarcıkları kaldırmak için spin. Karaciğer hacmi tahmin ve sonra 1/5 hacminin ve kırmızı gıda boyası toplam hacminin % 2 planarialar su ekleyin. Örneğin, 1000 µL karaciğer yapıştırın, 200 µL planarialar su ve gıda renklendirme 24 µL ekleyin.</li>
		<li>Gıda renklendirme eşit olarak karaciğer Yapıştır dağıtılır kadar iyice karıştırın bir plastik havaneli, pipet ucu veya metal spatula kullanarak. Tekrar kısaca spin. Karaciğer Yapıştır 24 h için 4 ° C'de depolanan veya uzun süreli depolama için-80 ° C'de aliquots donup kalan ev.</li>
		<li>En çok 25 hayvanlar sınama olumlu sonuçlanırsa, 25 µL çanak (yaklaşık 1 µL hayvan başına karaciğer hamur) başı karaciğer hamur hazırlayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Hayvan besleme
	<ol>
<li>Yedi gün sonra kimyasal amputasyon, hayvanlar için yeni Petri kabına aktarın. 10-15 hayvan sınama olumlu sonuçlanırsa, bir 35 mm tabak kullanın; 15'den fazla hayvan-meli var olmak sınav 60 mm kabında. Hayvanlar, besleme önce yaklaşık 1 h için bozulmamış anlatmamanı.</li>
		<li>Makas kullanarak, kabaca ½ cm uzakta-in dar ucuna çıkararak P200 pipet ucu genişliğini artırın. Damlalıklı 25 µL çanak içine kırmızı karaciğer yapıştırın. Not: Son kırpma viskoz karaciğer Yapıştır daha kolay pipetting sağlar. Karaciğer yüzeyinde yüzen önlemek için dağıtımı sırasında ucuna çanak dibine kadar dokunma.</li>
		<li>Hayvanlar için 30 dk beslemek izin.</li>
		<li>Hayvanlar beyaz bir arka plan üzerine yerleştirerek veya onları 10-20 X büyütme ile mikroskop altında incelenmesi tarafından yemiş hayvan sayısı puanı.</li>
		<li>Besleme sonra karaciğer yemek çıkarın ve temizleyin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Tanaka, E. M., Reddien, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cellular+basis+for+animal+regeneration.">The cellular basis for animal regeneration.</a> Dev. Cell. 21, 172-185 (2011).</li><li>Tanaka, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Molecular+and+Cellular+Choreography+of+Appendage+Regeneration.">The Molecular and Cellular Choreography of Appendage Regeneration.</a> Cell. 165, 1598-1608 (2016).</li><li>Curado, S., Stainier, D. Y. R., Anderson, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitroreductase-mediated+cell/tissue+ablation+in+zebrafish:+a+spatially+and+temporally+controlled+ablation+method+with+applications+in+developmental+and+regeneration+studies.">Nitroreductase-mediated cell/tissue ablation in zebrafish: a spatially and temporally controlled ablation method with applications in developmental and regeneration studies.</a> Nat. Protoc. 3, 948-954 (2008).</li><li>White, D. T., Mumm, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nitroreductase+system+of+inducible+targeted+ablation+facilitates+cell-specific+regenerative+studies+in+zebrafish.">The nitroreductase system of inducible targeted ablation facilitates cell-specific regenerative studies in zebrafish.</a> Methods. 62, 232-240 (2013).</li><li>Smith-Bolton, R. K., Worley, M. I., Kanda, H., Hariharan, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerative+growth+in+Drosophila+imaginal+discs+is+regulated+by+Wingless+and+Myc.">Regenerative growth in Drosophila imaginal discs is regulated by Wingless and Myc.</a> Dev. Cell. 16, 797-809 (2009).</li><li>Smith-Bolton, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Imaginal+Discs+as+a+Model+of+Epithelial+Wound+Repair+and+Regeneration.">Drosophila Imaginal Discs as a Model of Epithelial Wound Repair and Regeneration.</a> Adv. Wound Care. 5, 251-261 (2016).</li><li>Newmark, P. A., S&#225;nchez Alvarado, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Not+your+father's+planarian:+a+classic+model+enters+the+era+of+functional+genomics.">Not your father's planarian: a classic model enters the era of functional genomics.</a> Nat. Rev. Genet. 3, 210-219 (2002).</li><li>Reddien, P. W., S&#225;nchez Alvarado, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamentals+of+planarian+regeneration.">Fundamentals of planarian regeneration.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 20, 725-757 (2004).</li><li>Wagner, D. E., Wang, I. E., Reddien, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonogenic+neoblasts+are+pluripotent+adult+stem+cells+that+underlie+planarian+regeneration.">Clonogenic neoblasts are pluripotent adult stem cells that underlie planarian regeneration.</a> Science. 332, 811-816 (2011).</li><li>Scimone, M. L., Kravarik, K. M., Lapan, S. W., Reddien, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neoblast+specialization+in+regeneration+of+the+planarian+Schmidtea+mediterranea.">Neoblast specialization in regeneration of the planarian Schmidtea mediterranea.</a> Stem Cell Reports. 3, 339-352 (2014).</li><li>van Wolfswinkel, J. C., Wagner, D. E., Reddien, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+analysis+reveals+functionally+distinct+classes+within+the+planarian+stem+cell+compartment.">Single-cell analysis reveals functionally distinct classes within the planarian stem cell compartment.</a> Cell Stem Cell. 15, 326-339 (2014).</li><li>Adler, C. E., Seidel, C. W., McKinney, S. A., S&#225;nchez Alvarado, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+amputation+of+the+pharynx+identifies+a+FoxA-dependent+regeneration+program+in+planaria.">Selective amputation of the pharynx identifies a FoxA-dependent regeneration program in planaria.</a> Elife. 3, e02238 (2014).</li><li>Adler, C. E., S&#225;nchez Alvarado, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PHRED-1+is+a+divergent+neurexin-1+homolog+that+organizes+muscle+fibers+and+patterns+organs+during+regeneration.">PHRED-1 is a divergent neurexin-1 homolog that organizes muscle fibers and patterns organs during regeneration.</a> Dev. Biol. 427, 165-175 (2017).</li><li>Wong, M. C., Martynovsky, M., Schwarzbauer, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+cell+migration+using+Caenorhabditis+elegans+as+a+model+system.">Analysis of cell migration using Caenorhabditis elegans as a model system.</a> Methods Mol. Biol. 769, 233-247 (2011).</li><li>Margie, O., Palmer, C., Chin-Sang, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C+elegans+chemotaxis+assay.">C elegans chemotaxis assay.</a> J. Vis. Exp. , e50069 (2013).</li><li>Fang-Yen, C., Gabel, C. V., Samuel, A. D. T., Bargmann, C. I., Avery, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+microsurgery+in+Caenorhabditis+elegans.">Laser microsurgery in Caenorhabditis elegans.</a> Methods Cell Biol. 107, 177 (2012).</li><li>Tasaki, J., Uchiyama-Tasaki, C., Rouhana, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Stem+Cell+Motility+In+Vivo+Based+on+Immunodetection+of+Planarian+Neoblasts+and+Tracing+of+BrdU-Labeled+Cells+After+Partial+Irradiation.">Analysis of Stem Cell Motility In Vivo Based on Immunodetection of Planarian Neoblasts and Tracing of BrdU-Labeled Cells After Partial Irradiation.</a> Methods Mol. Biol. 1365, 323-338 (2016).</li><li>Roberts-Galbraith, R. H., Brubacher, J. L., Newmark, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+genomics+screen+in+planarians+reveals+regulators+of+whole-brain+regeneration.">A functional genomics screen in planarians reveals regulators of whole-brain regeneration.</a> Elife. 5, (2016).</li><li>Arnold, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenic+shifts+in+endogenous+microbiota+impede+tissue+regeneration+via+distinct+activation+of+TAK1/MKK/p38.">Pathogenic shifts in endogenous microbiota impede tissue regeneration via distinct activation of TAK1/MKK/p38.</a> Elife. 5, (2016).</li><li>Pearson, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formaldehyde-based+whole-mount+in+situ+hybridization+method+for+planarians.">Formaldehyde-based whole-mount in situ hybridization method for planarians.</a> Dev. Dyn. 238, 443-450 (2009).</li><li>LoCascio, S. A., Lapan, S. W., Reddien, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eye+Absence+Does+Not+Regulate+Planarian+Stem+Cells+during+Eye+Regeneration.">Eye Absence Does Not Regulate Planarian Stem Cells during Eye Regeneration.</a> Dev. Cell. 40, 381-391 (2017).</li><li>Nishimura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+dopaminergic+neurons+after+6-hydroxydopamine-induced+lesion+in+planarian+brain.">Regeneration of dopaminergic neurons after 6-hydroxydopamine-induced lesion in planarian brain.</a> J. Neurochem. 119, 1217-1231 (2011).</li><li>Wilson, D. F., Chance, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Azide+inhibition+of+mitochondrial+electron+transport.+I.+The+aerobic+steady+state+of+succinate+oxidation.">Azide inhibition of mitochondrial electron transport. I. The aerobic steady state of succinate oxidation.</a> Biochim. Biophys. Acta. 131, 421-430 (1967).</li><li>Duncan, H. M., Mackler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+Transport+Systems+of+Yeast:+III.+Preparation+and+properties+of+cytochrome+oxidase.">Electron Transport Systems of Yeast: III. Preparation and properties of cytochrome oxidase.</a> J. Biol. Chem. 241, 1694-1697 (1966).</li><li>Buchan, J. R., Yoon, J. H., Parker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress-specific+composition,+assembly+and+kinetics+of+stress+granules+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Stress-specific composition, assembly and kinetics of stress granules in Saccharomyces cerevisiae.</a> J. Cell Sci. 124, 228-239 (2011).</li><li>Cebri&#224;, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+the+nervous+system+in+the+model+planarian+Schmidtea+mediterranea:+An+immunocytochemical+study.">Organization of the nervous system in the model planarian Schmidtea mediterranea: An immunocytochemical study.</a> Neurosci. Res. 61, 375-384 (2008).</li><li>Shimoyama, S., Inoue, T., Kashima, M., Agata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+Neuropeptide-Coding+Genes+Involved+in+Planarian+Pharynx+Extension.">Multiple Neuropeptide-Coding Genes Involved in Planarian Pharynx Extension.</a> Zoolog. Sci. 33, 311-319 (2016).</li><li>Ito, H., Saito, Y., Watanabe, K., Orii, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epimorphic+regeneration+of+the+distal+part+of+the+planarian+pharynx.">Epimorphic regeneration of the distal part of the planarian pharynx.</a> Dev. Genes Evol. 211, 2-9 (2001).</li><li>Bueno, D., Espinosa, L., Bagu&#241;&#224;, J., Romero, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Planarian+pharynx+regeneration+in++tail+fragments+monitored+with+cell-specific+monoclonal+antibodies.">Planarian pharynx regeneration in tail fragments monitored with cell-specific monoclonal antibodies.</a> Dev. Genes Evol. 206, 425-434 (1997).</li><li>Hyman, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The invertebrates: Platyhelminthes and Rhynchocoela, the acoelomate Bilateria. , (1951).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu iletişim kuralı sodyum azid kullanarak yutak seçici ablasyon yöntemi açıklar. Planarians diğer hedeflenen ablasyon çalışmaları değiştirilmiş ameliyat photoreceptors21 veya farmakolojik tedavi dopaminerjik nöron22ablate kaldırmak için kullandık. Bir önemli mevcut yöntemler üzerinde kimyasal amputasyon cerrahisi gerektirmez avantajdır. Planarian vücut diğerleri ile karşılaştırıldığında farklıdır yutak katı yapısını çok daha yumuşak gövdeli hayvan onun tümüyle kaldırılmasını kolaylaştırır. Ayrıca, yutak ve daha tekrarlanabilir bir yara birden daha büyük bir cerrahi alet tarafından indüklenen üreten bağırsak katıldığınız bir küçük Kavşağı (yemek borusu)30 hayvan yutak ayırır. Fiziksel özellikleri ve hayvan geri kalanı için küçük anatomik bağlantı göre yutak kaldırma bu nedenle diğer cerrahi amputasyon daha daha homojen yaralar oluşturur.
Sodyum azid maruz uzunluğunu da bu teknik başarısı için önemlidir. Ne kadar kısa maruz kalma sodyum azid planarians olumsuz etkilemez, uzun süre maruz toksik ve sonunda hayvanlar öldürür. Sodyum azid sitokrom oksidaz23,24inhibisyonu yoluyla enerji bağımlı işlemler inhibe olduğu bilinmektedir. Buna ek olarak, transkripsiyon ve translasyon, büyük olasılıkla bu tepkiler stres granül25anahtar bileşenleri birikimi tarafından bastırır. Planarians, sodyum azid pozlama mitoz 24 saat sonra hücrelerin proliferasyonu12devam için bastırır. Azid pozlama zaman sınırlandırılması, deneysel tasarım azid ayrıntılı durulama ve muhasebe geçici Mitotik bastırılması için kaldırma yardımcı olabilir gibi değişiklikler bu sınırlamalarının üstesinden gelir.
Yutak ve onun karakteristik Radyal simetri benzersiz anatomik konumunu önceden varolan kök hücrelerden yeni rejenere faringeal doku kolay düzeye çıkarılmasını sağlar. Yutak rejenerasyon, doku lekeleri streptavidin ve DAPI, immünhistokimya, gibi veya in situ hibridizasyon26tarafından kullanarak hücresel ve anatomik düzeyde izlenebilir. Açıklanan besleme tahlil burada yutak fonksiyonel rejenerasyon deneyleri. Yutak27,28 kemotaksisi doğru gıda gerektirir ve hayvanlar olmadan tamamen işlevsel bir yutak yemek yemek yapamam. Bu basit, kantitatif değerlendirmesi organ fonksiyon bu nedenle yapısal yeniden oluşturma işlemi tamamlar. Ayrıca, kimyasal amputasyon hayvanların nüfus üzerinde gerçekleştirilen ve aynı yaralanma ile çok sayıda hayvan oluşturabilir. Bu nedenle büyük ölçekli çalışmaları için uygun bir yöntemdir. Olgun bir yutak rejenerasyon, kök hücre gerektirir gerçeği ile birleştiğinde bu avantajları, yutak amputasyon organ yenilenme eğitim için ideal bir model yapar. Daha geniş kesimleri ile birlikte kullanıldığında, yutak kaldırma nasıl yara boyutu ve anatomik pozisyon anahtar meselesi rejenerasyon alanı21yaralanma kök hücre yanıtı etkisi hakkında hipotezler test etmek için kullanılabilir.

Rejenerasyon hayvanlar alemi tam vücut yenilenme içinde bazı omurgasızlar omurgalıların1daha sınırlı yetenekleri için arasında değişen rejeneratif kapasiteleri ile ortaya çıkan bir olgudur. Yedek fonksiyonel dokuların karmaşık bir süreçtir ve genellikle birden çok hücre tiplerinin eşzamanlı restorasyon üzerine kuruludur. Örneğin, semender uzuv, dokusunu, kondrosit, nöronlar, kas ve epitel hücreleri gerek yeniden oluşturmak için2yerini aldı. Bu yeni oluşturulan hücre tipleri de düzgün yeni bacak işlevini kolaylaştırmak için organize olmak gerekir. Bu karmaşık süreçleri anlamak belirli hücre tipleri ve organları kendi entegrasyon rejenerasyon odaklanmak teknikler gerektirir.
Rejeneratif yanıt-e doğru çalışma kolaylaştırmak için istihdam stratejileri ya belirli hücre tiplerinin hedeflenen ablasyon veya dokuların daha büyük Koleksiyonlar biridir. Örneğin, Zebra balığı, Metronidazol3,4uygulamadan sonra imha edilmesini ifade belirli hücre tipleri içinde nitroreductase yol açar. Drosophila larva pro-apoptotik genler doku özel Organizatör altında ifade seçerek özel bölgeler Imaginal disk5,6ablate. Bu stratejileri her ikisi de hızlı ama kontrollü zarar ve moleküler ve hücresel yenilenme için sorumlu mekanizmaları incelemek için kullanılır.
Bu makale, seçmeli olarak tüm organ yutak planarian Schmidtea mediterraneaadlı ablate için bir yöntemi açıklanmaktadır. Planarians nerede bile dakika parçaları bütün hayvanlar 7,8regrow rejenerasyon, üretken rejeneratif yeteneklerini bilinen klasik bir model vardır. Kök hücreler pluripotent hücreler ve soy tarafından kısıtlanmış ataları9,10,11oluşan büyük, türdeş olmayan nüfusu var. Bu hücreler çoğalırlar ve yutak, gergin, sindirim ve boşaltım sistemleri ve kas ve epitel hücreleri9,10,12de dahil olmak üzere tüm eksik dokular yerine ayırt etmek. Bu kök hücre yenilenme başlatmak biliyoruz iken, biz tam olarak onları tüm bu farklı hücre türleri yerine götürmek moleküler mekanizmaları kavramak değil. Kesin kök hücre yanıt-e doğru çıkarmak tanımlanan yaralama yöntemleri bu karmaşık süreci belirginleştiren yardımcı olabilir.
Yutak beslenmesi için gerekli bir büyük, silindirik tüp ve nöronlar, kas, epitelyal ve salgı hücreleri13,29içerir. Normalde hayvan ventral tarafta bir kese içinde gizli, hayvanın tek vücut yiyecek varlığı algılama üzerine açılış ile uzanır. Seçmeli olarak yutak kesmek için bir kimyasal denilen sodyum azid, yaygın olarak kullanılan bir anestezi C. elegans14,15,16planarians emmek. Planarians kullanımı ilk Adler ve arktarafından bildirildi., 201412. Sodyum azid maruz dakikada planarians onların pharynges bükün ve nazik ajitasyon ile yutak hayvandan ayırır. Biz bu yutak tam ve seçici kaybına yol "kimyasal amputasyon" bakın. Bir hafta sonra amputasyon, tamamen işlevsel bir yutak geri yüklenen12olur. Yutak beslenmesi için gerekli olduğundan, fonksiyonel rejenerasyon beslenme davranışı izleyerek ölçülebilir. Aşağıda, protokolü için kimyasal amputasyon ve yutak yenileme ve restorasyon davranış beslenme değerlendirmek açıklar.

<table><tbody><tr><td>Calcium Chloride Dihydrate (CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Fisher Chemical</td><td>C79-3</td><td>Montju&amp;iuml;c salt solution</td></tr><tr><td>Magnesium Sulfate Anhydrous (MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Fisher Chemical</td><td>M65-3</td><td>Montju&amp;iuml;c salt solution</td></tr><tr><td>Magnesium Chloride Hexahydrate (MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Acros/VWR</td><td>41341-5000</td><td>Montju&amp;iuml;c salt solution</td></tr><tr><td>Potassium Chloride (KCl)</td><td>Acros Organics/VWR</td><td>196770010</td><td>Montju&amp;iuml;c salt solution</td></tr><tr><td>Sodium Chloride (NaCl)</td><td>Acros Organics/VWR</td><td>207790050</td><td>Montju&amp;iuml;c salt solution</td></tr><tr><td>Sodium Bicarbonate (NaHCO3)</td><td>Acros Organics/VWR</td><td>123360010</td><td>Montju&amp;iuml;c salt solution</td></tr><tr><td>Nalgene autoclavable polypropylene copolymer lowboy with spigot</td><td>ThermoFisher Scientific/VWR</td><td>2324-0015</td><td>Storing planaria water</td></tr><tr><td>Instant Ocean Sea Salt</td><td>Spectrum Brands</td><td>Amazon</td><td>Planaria water</td></tr><tr><td>Gentamicin Sulfate</td><td>Gemini Bio-products</td><td>400-100P</td><td>Planaria water</td></tr><tr><td>Razor blades</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>71970</td><td>Mincing liver&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Disposable pastry bags-16&amp;rdquo;, 12 pack</td><td>Wilton</td><td>Amazon</td><td>Liver aliquots</td></tr><tr><td>5 mL syringes</td><td>BD/VWR</td><td>309647</td><td>Liver aliquots</td></tr><tr><td>Petri dishes-35mm/60mm</td><td>Greiner Bio-One/VWR</td><td>82050-536/82050-544</td><td></td></tr><tr><td>Plastic containers (various sizes)</td><td>Ziploc</td><td>Amazon</td><td>Housing planarians in static culture</td></tr><tr><td>Sodium Azide</td><td>Sigma</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Transfer pipette</td><td>Globe Scientific</td><td>138030</td><td></td></tr><tr><td>Forceps - Dumont Tweezer, Style 5</td><td>Electron Microscopy Sciences&amp;nbsp;</td><td>72700-D (0203-5-PO)</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>DAPI&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>62247</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate</td><td>ThermoFisher</td><td>S11223</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP229-1</td><td></td></tr></tbody></table>

chemical amputation and regeneration of the pharynx in the planarian schmidtea mediterranea

Planarians yeniden oluşturma işlemi son derece verimli solucanlar vardır. Bu yeteneği hızla herhangi bir yaralanma türüne yanıt verebilir kök hücreler çok sayıda borçlular. Bu hayvanların ortak yaralanma modellerinde birden çok organları zarar doku büyük miktarda kaldırın. Bu geniş doku hasarı üstesinden gelmek için burada seçerek tek bir organ, yutak, planarian Schmidtea mediterraneakaldırmak için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu sitokrom oksidaz inhibitörü sodyum azid içeren bir çözümde iliklerine hayvanlar tarafından elde etmek. Sodyum azid kısa maruz kalma "kimyasal amputasyon." dediğimiz hayvan yutak ekstrüzyon neden olur Kimyasal amputasyon tüm yutak kaldırır ve nerede yutak bağırsak için verdiği küçük bir yara oluşturur. Geniş durulama sonra tüm uzvunu hayvanların yaklaşık bir hafta içinde tamamen işlevsel bir yutak yeniden. Vücudun geri kalanıyla kök hücre yenilenme yeni yutak sürücü. Burada, bir ayrıntılı sağlamak protokol için kimyasal amputasyon ve başarılı amputasyon ve rejenerasyon değerlendirmek için histolojik ve davranış yöntemleri açıklanmaktadır.

Sodyum azid maruz planarians, esneme ve kıvranmak hayvanlar neden normal hareketliliğini bozar. Bu hareketler yutak hayvan ventral taraftan çıkmaya zorlamak ve sodyum azid çözümünde yaklaşık 6 dakika sonra-ebilmek var olmak seen yutak beyaz ucu (şekil 1B-sol kapı aynası). Birkaç dakika sonra hayvanlar aktif olarak sözleşme ve tamamen yutak zorla vücut dışına iterek genişletir. (Şekil 1B-orta Masası). Yaklaşık 11 dk azid maruz kaldıktan sonra hayvanlar ve yutak rahatlayın. Bu aşamada, yutak karakteristik çan şeklinde açıkça görülmeye başlıyor (şekil 1B-doğru kapı aynası). Kolay amputasyon için yutak dinlenmek beklemek önemlidir.
Yutak bir büyük olduğundan, uzvunu hayvanlar (şekil 2A)sırt tarafında karanlık bir hale kaldırmadan dokusunun unpigmented yığın sonuçlanır. Bu karanlık bölge Canlı hayvanlarda başarılı amputasyon görsel bir göstergesidir. Spot hemen amputasyon sonra görülebilir ve ertesi gün daha belirgin hale gelir. Yutak yeniden oluşturur gibi bu bölge aydınlatır. Yutak rejenerasyon daha doğrusu izlemek için hayvanlar DAPI veya fluorescently Birleşik streptavidin Boyanabilen (şekil 2B)bir gecede. Kantitatif yutak rejenerasyon ölçüde değerlendirmek için kendi alan ImageJ yazılımı kullanılarak ölçülebilir.
Yutak chemosensation ve yemek yenmesi için önemli bir organdır. Bu işlevler yeniden oluşturma işlemi sırasında geri yüklenir olduğunda belirlemek için biz besleme deneyleri hayvan davranışları izlemek için kullanılır. Karaciğer salça ile boyama gıda birleştirerek, biz yiyen hayvanlar değil (şekil 3A)yapan insanlardan ayırt etmek başardık. Biz o zaman işlevsel bir yutak hayvanlarla yüzdesi değerlendirmek için kırmızı hayvan sayısı sayılabilir. Şekil 3B' gösterilen sonuçlara dayanarak, 7 gün sonra amputasyon, bir hafta sonra yutak kaldırma, işlevsel bir yutak hayvanlar yeniden gösteren başarılı beslenme davranışı geri yüklendi. Sodyum azid pozlama beslenme davranışı etkilenen olup olmadığını sınamak için hayvanlar sodyum azid batırılmış ama hemen yutak fırlatma önce onu yıkadım. Gıda-arama davranışı sodyum azid pozlama ile besleme tahlil tarafından değiştirilmiş olup olmadığını bir gün sonra biz değerlendirildi. Sodyum azid pozlama yedikten sonra sağlam bir yutak istinat tüm hayvanların bir yutak eksik kimyasal olarak kesilmiş hayvanların aksine (n = 30 hayvanlar her koşul için) gıda. Yutak sağlam olduğu sürece bu sonuç sodyum azid pozlama beslenme davranışı, etkilemez gösterir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57168/57168fig1.jpg"> Resim 1 . Yutak fırlatma ve amputasyonu. (A) şeması planarian anatomi. (B) görüntülerini canlı hayvan yutak fırlatma 100 mM sodyum azid iliklerine üzerine gösterilen. Kırmızı oklar yutak vurgulayın. Ölçek çubukları 750 µm. (C) = görüntü canlı hayvan (solda) ve forseps kullanarak amputasyon şeması (sağda). Panelleri yutak sürükleyici iki farklı seçeneklerini göster. Hayvan ventral tarafı yukarı dönük. Ölçek çubukları 500 µm. = <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57168/57168fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57168/57168fig2.jpg"> Resim 2 . Yutak amputasyon ve rejenerasyon değerlendirilmesi. (A) temsilcisi canlı hayvan görüntülerini belirtilen kez önce ve sonra kesilmiş. Orta paneli karanlık nokta kesik çizgili beyaz kutu tarafından vurgulanan amputasyon sonra faringeal bölgede gösterir. Sırt tarafı yukarı dönük. Ölçek çubukları = 500 µm. (B) temsilcisi görüntüleri ile Alexa488-streptavidin lekeli hayvanlar belirtilen kez önce ve sonra kesilmiş. Orta paneli yutak yokluğu amputasyon sonra gösterir. Faringeal bölge tarafından beyaz kutu vurgulanır. Ventral tarafı yukarı dönük. Ölçek çubuğu 500 µm. = <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57168/57168fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57168/57168fig3.jpg"> Şekil 3. Yutak rejenerasyon değerlendirilmesi. (A) görüntüleri ve şematik 60 mm Petri kabına merkezinde 25 µl karaciğer yerleştirerek yapılan tahlil, beslenme. Şematik (sol üst) ve resim (orta) show davranış hayvanlarda olduğu gibi pharynges ile besleme. Yemiş hayvan üst hakkı, görüntü. Şematik (sol alt) ve davranış 1 gün sonra amputasyon hayvanlarda beslenme görüntü (orta). Alt sağ, hayvan değil yemiş. Ölçek çubuğu 750 = µm. tahlil sonuçlarını besleme (B) . (Kırmızı rengi tarafından sayısal) gıda amputasyon sonra belirli zamanlarda yutulur hayvanlar yüzdesi. N her zaman noktası için 10 hayvan, nüsha tekrarlanan =. Hata çubuğu SD = <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57168/57168fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Chemical Amputation and Regeneration of the Pharynx in the Planarian Schmidtea mediterranea at JoVE.com

Chemical Amputation and Regeneration of the Pharynx in the Planarian Schmidtea mediterranea

Kimyasal amputasyon ve yeniden oluşturulmasını Planarian Schmidtea mediterranea yutak

Planarian Schmidtea mediterranea kök hücre ve doku rejenerasyonu çalışmak için mükemmel bir modeldir. Bu yayın seçerek bir organ, yutak, kimyasal sodyum azid hayvanlara açarak kaldırın yöntemi açıklanır. Bu iletişim kuralı Ayrıca yutak rejenerasyon izlemek için yöntem açıklar.

Planarians are flatworms that are extremely efficient at regeneration. They owe this ability to a large number of stem cells that can rapidly respond to ...

chemical-amputation-regeneration-pharynx-planarian-schmidtea

Nanyang Technological University

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Developmental Biology

Chemical Amputation and Regeneration of the Pharynx in the Planarian Schmidtea mediterranea

Unit 1

Regeneration and Repair

SCIENTISTS IN ACTION

10.7K Görüntüleme.  Cornell University. Planarian Schmidtea mediterranea kök hücre ve doku rejenerasyonu çalışmak için mükemmel bir modeldir. Bu yayın seçerek bir organ, yutak, kimyasal sodyum azid hayvanlara açarak kaldırın yöntemi açıklanır. Bu iletişim kuralı Ayrıca yutak rejenerasyon izlemek için yöntem açıklar.

Video: Chemical Amputation and Regeneration of the Pharynx in the Planarian Schmidtea mediterranea

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila melanogaster, inductive microenvironments known as larval Hematopoietic Pockets (HPs) have been identified as anatomical sites for the development and regulation of blood cells (hemocytes), in particular of the self-renewing macrophage lineage.&#160;HPs are segmentally repeated pockets between the epidermis and muscle layers of the larva, which also comprise sensory neurons of the peripheral nervous system. In the larva, resident (sessile) hemocytes are exposed to anti-apoptotic, adhesive and proliferative cues from these sensory neurons and potentially other components of the HPs, such as the lining muscle and epithelial layers. During normal development, gradual release of resident hemocytes from the HPs fuels the population of circulating hemocytes, which culminates in the release of most of the resident hemocytes at the beginning of metamorphosis. Immune assaults, physical injury or mechanical disturbance trigger the premature release of resident hemocytes into circulation. The switch of larval hemocytes between resident locations and circulation raises the need for a common standard/procedure to selectively isolate and quantify these two populations of blood cells from single Drosophila larvae. Accordingly, this protocol describes an automated method to release and quantify the resident and circulating hemocytes from single larvae. The method facilitates ex vivo approaches, and may be adapted to serve a variety of developmental stages of Drosophila and other invertebrate organisms.

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

Drosophila blood cells, or hemocytes, cycle between resident sites and circulation. In the larva, resident (sessile) hemocytes localize to inductive microenvironments, the Hematopoietic Pockets, while circulating hemocytes move freely in the hemolymph. The goal of this protocol is the standardized isolation and quantification of these two, behaviorally distinct but interchanging, hemocyte populations.

Ve tahlil Kan Hücresi popülasyonlar<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Larva

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila ...

Gelişim Biyolojisi

Inducing Complete Polyp Regeneration from the Aboral Physa of the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis

Cnidarians, and specifically Hydra, were the first animals shown to regenerate damaged or severed structures, and indeed such studies arguably launched modern biological inquiry through the work of Trembley more than 250 years ago. Presently the study of regeneration has seen a resurgence using both &#34;classic&#34; regenerative organisms, such as the Hydra, planaria and Urodeles, as well as a widening spectrum of species spanning the range of metazoa, from sponges through mammals. Besides its intrinsic interest as a biological phenomenon, understanding how regeneration works in a variety of species will inform us about whether regenerative processes share common features and/or species or context-specific cellular and molecular mechanisms. The starlet sea anemone, Nematostella vectensis, is an emerging model organism for regeneration. Like Hydra, Nematostella is a member of the ancient phylum, cnidaria, but within the class anthozoa, a sister clade to the hydrozoa that is evolutionarily more basal. Thus aspects of regeneration in Nematostella will be interesting to compare and contrast with those of Hydra and other cnidarians. In this article, we present a method to bisect, observe and classify regeneration of the aboral end of the Nematostella adult, which is called the physa. The physa naturally undergoes fission as a means of asexual reproduction, and either natural fission or manual amputation of the physa triggers re-growth and reformation of complex morphologies. Here we have codified these simple morphological changes in a Nematostella Regeneration Staging System (the NRSS). We use the NRSS to test the effects of chloroquine, an inhibitor of lysosomal function that blocks autophagy. The results show that the regeneration of polyp structures, particularly the mesenteries, is abnormal when autophagy is inhibited.

Inducing Complete Polyp Regeneration from the Aboral Physa of the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis

Here we demonstrate how to induce and monitor regeneration in the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis, a model cnidarian anthozoan. We demonstrate how to amputate and categorize regeneration using a morphological staging system, and we use this system to reveal a requirement for autophagy in regenerating polyp structures.

Starlet Deniz Anemone Aboral physa Tam Polip Regeneration uyaran<em&gt; Nematostella vectensis</em

Cnidarians, and specifically Hydra, were the first animals shown to regenerate damaged or severed structures, and indeed such studies arguably launched ...

Surgical Ablation Assay for Studying Eye Regeneration in Planarians

In the study of adult stem cells and regenerative mechanisms, planarian flatworms are a staple in vivo model system. This is due in large part to their abundant pluripotent stem cell population and ability to regenerate all cell and tissue types after injuries that would be catastrophic for most animals. Recently, planarians have gained popularity as a model for eye regeneration. Their ability to regenerate the entire eye (comprised of two tissue types: pigment cells and photoreceptors) allows for the dissection of the mechanisms regulating visual system regeneration. Eye ablation has several advantages over other techniques (such as decapitation or hole punch) for examining eye-specific pathways and mechanisms, the most important of which is that regeneration is largely restricted to eye tissues alone. The purpose of this video article is to demonstrate how to reliably remove the planarian optic cup without disturbing the brain or surrounding tissues. The handling of worms and maintenance of an established colony is also described. This technique uses a 31 G, 5/16-inch insulin needle to surgically scoop out the optic cup of planarians immobilized on a cold plate. This method encompasses both single and double eye ablation, with eyes regenerating within 1-2 weeks, allowing for a wide range of applications. In particular, this ablation technique can be easily combined with pharmacological and genetic (RNA interference) screens for a better understanding of regenerative mechanisms and their evolution, eye stem cells and their maintenance, and phototaxic behavioral responses and their neurological basis.

This protocol shows how to consistently excise planarian eyes (optic cups) without disturbing surrounding tissues. Using an insulin needle and syringe, either one or both eyes can be ablated to facilitate investigations into the mechanisms regulating eye regeneration, the evolution of visual regeneration, and the neural basis of light-induced behavior.

Cerrahi Ablasyon Tahlili Planaryalar Göz Rejenerasyon incelenmesi için

In the study of adult stem cells and regenerative mechanisms, planarian flatworms are a staple in vivo model system. This is due in large part to their ...

A Planarian Motility Assay to Gauge the Biomodulating Properties of Natural Products

A straightforward, controllable means of using the non-parasitic planarian, Dugesia tigrina, a free-living aquatic flatworm, to study the stimulant and withdrawal properties of natural products is described. Experimental assays benefitting from unique aspects of planarian physiology have been applied to studies on wound healing, regeneration, and tumorigenesis. In addition, because planarians exhibit sensitivity to a variety of environmental stimuli and are capable of learning and developing conditioned responses, they can be used in behavioral studies examining learning and memory. Planarians possess a basic bilateral symmetry and a central nervous system that uses neurotransmitter systems amenable to studies examining the effects of neuromuscular biomodulators. Consequently, experimental systems monitoring planarian movement and motility have been developed to examine substance addiction and withdrawal. Because planarian motility offers the potential for a sensitive, easily standardized motility assay system to monitor the effect of stimuli, the planarian locomotor velocity (pLmV) test was adapted to monitor both stimulation and withdrawal behaviors by planarians through the determination of the number of grid lines crossed by the animals with time. Here, the technique and its application are demonstrated and explained.

Planarian motility is used to gauge the stimulant and withdrawal properties of natural products when compared to the movement of the animals in spring water alone.

Doğal Ürünlerin Biyomodülasyon Özelliklerini Ölçmek için Bir Planarian Motilite Tsay

A straightforward, controllable means of using the non-parasitic planarian, Dugesia tigrina, a free-living aquatic flatworm, to study the stimulant and ...

Biyokimya

Adult Mouse Digit Amputation and Regeneration: A Simple Model to Investigate Mammalian Blastema Formation and Intramembranous Ossification

Here, we present a protocol of adult mouse distal terminal phalanx (P3) amputation, a procedurally simple and reproducible mammalian model of epimorphic regeneration, which involves blastema formation and intramembranous ossification analyzed by fluorescence immunohistochemistry and sequential in-vivo microcomputed tomography (&#956;CT). Mammalian regeneration is restricted to amputations transecting the distal region of the terminal phalanx (P3); digits amputated at more proximal levels fail to regenerate and undergo fibrotic healing and scar formation. The regeneration response is mediated by the formation of a proliferative blastema, followed by bone regeneration via intramembranous ossification to restore the amputated skeletal length. P3 amputation is a preclinical model to investigate epimorphic regeneration in mammals, and is a powerful tool for the design of therapeutic strategies to replace fibrotic healing with a successful regenerative response. Our protocol uses fluorescence immunohistochemistry to 1) identify early-and-late blastema cell populations, 2) study revascularization in the context of regeneration, and 3) investigate intramembranous ossification without the need for complex bone stabilization devices. We also demonstrate the use of sequential in vivo &#956;CT to create high resolution images to examine morphological changes after amputation, as well as quantify volume and length changes in the same digit over the course of regeneration. We believe this protocol offers tremendous utility to investigate both epimorphic and tissue regenerative responses in mammals.

Here, we present a protocol of adult mouse terminal phalanx amputation to investigate mammalian blastema formation and intramembranous ossification, analyzed by fluorescent immunohistochemistry and sequential in-vivo microcomputed tomography.

Yetişkin fare basamak amputasyon ve rejenerasyonu: Mammalin Blastema oluşumu ve Intramembranous ossifikasyon araştırmak için basit bir model

Here, we present a protocol of adult mouse distal terminal phalanx (P3) amputation, a procedurally simple and reproducible mammalian model of epimorphic ...

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

Free-living planarian flatworms have a long history of experimental usage owing to their remarkable regenerative abilities1. Small fragments excised from these animals reform the original body plan following regeneration of missing body structures. For example if a 'trunk' fragment is cut from an intact worm, a new 'head' will regenerate anteriorly and a 'tail' will regenerate posteriorly restoring the original 'head-to-tail' polarity of body structures prior to amputation (Figure 1A).
Regeneration is driven by planarian stem cells, known as 'neoblasts' which differentiate into ~30 different cell types during normal body homeostasis and enforced tissue regeneration. This regenerative process is robust and easy to demonstrate. Owing to the dedication of several pioneering labs, many tools and functional genetic methods have now been optimized for this model system. Consequently, considerable recent progress has been made in understanding and manipulating the molecular events underpinning planarian developmental plasticity2-9.
The planarian model system will be of interest to a broad range of scientists. For neuroscientists, the model affords the opportunity to study the regeneration of an entire nervous system, rather than simply the regrowth/repair of single nerve cell process that typically are the focus of study in many established models. Planarians express a plethora of neurotransmitters10, represent an important system for studying evolution of the central nervous system11, 12 and have behavioral screening potential13, 14. 
Regenerative outcomes are amenable to manipulation by pharmacological and genetic apparoaches. For example, drugs can be screened for effects on regeneration simply by placing body fragments in drug-containing solutions at different time points after amputation. The role of individual genes can be studied using knockdown methods (in vivo RNAi), which can be achieved either through cycles of microinjection or by feeding bacterially-expressed dsRNA constructs8, 9, 15. Both approaches can produce visually striking phenotypes at high penetrance- for example, regeneration of bipolar animals16-21. To facilitate adoption of this model and implementation of such methods, we showcase in this video article protocols for pharmacological and genetic assays (in vivo RNAi by feeding) using the planarian Dugesia japonica.

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

An attractive model for studying stem cell differentiation within a live animal is the planarian flatworm. Regeneration is studied by simple amputation experiments that are easily performed in a basic laboratory and are amenable to pharmacological and genetic (in vivo RNAi) manipulation as detailed by protocols in this article.

Farmakolojik ve Fonksiyonel Genetik Tahliller Planarian Rejenerasyon işleyin<emJaponica> Dugesia</em

Free-living planarian flatworms have a long history of experimental usage owing to their remarkable regenerative abilities1. Small fragments excised from ...

Biyoloji

Planarian Immobilization, Partial Irradiation, and Tissue Transplantation

The planarian, a freshwater flatworm, has proven to be a powerful system for dissecting metazoan regeneration and stem cell biology1,2. Planarian regeneration of any missing or damaged tissues is made possible by adult stem cells termed neoblasts3. Although these stem cells have been definitively shown to be pluripotent and singularly capable of reconstituting an entire animal4, the heterogeneity within the stem cell population and the dynamics of their cellular behaviors remain largely unresolved. Due to the large number and wide distribution of stem cells throughout the planarian body plan, advanced methods for manipulating subpopulations of stem cells for molecular and functional study in vivo are needed.
Tissue transplantation and partial irradiation are two methods by which a subpopulation of planarian stem cells can be isolated for further study. Each technique has distinct advantages. Tissue transplantation allows for the introduction of stem cells, into a na&iuml;ve host, that are either inherently genetically distinct or have been previously treated pharmacologically. Alternatively, partial irradiation allows for the isolation of stem cells within a host, juxtaposed to tissue devoid of stem cells, without the introduction of a wound or any breech in tissue integrity. Using these two methods, one can investigate the cell autonomous and non-autonomous factors that control stem cell functions, such as proliferation, differentiation, and migration.
Both tissue transplantation5,6 and partial irradiation7 have been used historically in defining many of the questions about planarian regeneration that remain under study today. However, these techniques have remained underused due to the laborious and inconsistent nature of previous methods. The protocols presented here represent a large step forward in decreasing the time and effort necessary to reproducibly generate large numbers of grafted or partially irradiated animals with efficacies approaching 100 percent. We cover the culture of large animals, immobilization, preparation for partial irradiation, tissue transplantation, and the optimization of animal recovery. Furthermore, the work described here demonstrates the first application of the partial irradiation method for use with the most widely studied planarian, Schmidtea mediterranea. Additionally, efficient tissue grafting in planaria opens the door for the functional testing of subpopulations of na&iuml;ve or treated stem cells in repopulation assays, which has long been the gold-standard method of assaying adult stem cell potential in mammals8. Broad adoption of these techniques will no doubt lead to a better understanding of the cellular behaviors of adult stem cells during tissue homeostasis and regeneration.

An effective method for grafting tissue of defined and consistent size between planaria is described. Also included is a description of how the immobilization technique used for transplantation can be adapted, in conjunction with lead shields, for the partial irradiation of live animals.

Planarian İmmobilizasyon, Kısmi Işınlama, ve Doku Nakli

The planarian, a freshwater flatworm, has proven to be a powerful system for dissecting metazoan regeneration and stem cell biology1,2. Planarian ...

Planarian Scrunching as a Quantitative Behavioral Readout for Noxious Stimuli Sensing

Freshwater planarians normally glide smoothly through ciliary propulsion on their ventral side. Certain environmental conditions, however, can induce musculature-driven forms of locomotion: peristalsis or scrunching. While peristalsis results from a ciliary defect, scrunching is independent of cilia function and is a specific response to certain stimuli, including amputation, noxious temperature, extreme pH, and ethanol. Thus, these two musculature-driven gaits are mechanistically distinct. However, they can be difficult to distinguish qualitatively. Here, we provide a protocol for inducing scrunching using various physical and chemical stimuli. We detail the quantitative characterization of scrunching, which can be used to distinguish it from peristalsis and gliding, using freely available software. Since scrunching is a universal planarian gait, albeit with characteristic species-specific differences, this protocol can be broadly applied to all species of planarians, when using appropriate considerations. To demonstrate this, we compare the response of the two most popular planarian species used in behavioral research, Dugesia japonica and Schmidtea mediterranea, to the same set of physical and chemical stimuli. Furthermore, the specificity of scrunching allows this protocol to be used in conjunction with RNA interference and/or pharmacological exposure to dissect the molecular targets and neuronal circuits involved, potentially providing mechanistic insight into important aspects of nociception and neuromuscular communication.

Freshwater planarians exhibit three gaits (gliding, peristalsis, and scrunching) that are distinguishable by quantitative behavioral analysis. We describe a method to induce scrunching using various noxious stimuli, quantification thereof, and distinction from peristalsis and gliding. Using gene knockdown, we demonstrate the specificity of scrunching as a quantitative phenotypic readout.

Zararlı Uyaranlar Algılama için Nicel Davranışsal Okuma olarak Planarian Scrunching

Freshwater planarians normally glide smoothly through ciliary propulsion on their ventral side. Certain environmental conditions, however, can induce ...

Planarian Ovary Dissection for Ultrastructural Analysis and Antibody Staining

Accessibility to germ cells allows the study of germ cell development, meiosis, and recombination. The sexual biotype of the freshwater planarian, Schmidtea mediterranea, is a powerful invertebrate model to study the epigenetic specification of germ cells. Unlike the large number of testis and male germ cells, planarian oocytes are relatively difficult to locate and examine, as there are only two ovaries, each with 5-20 oocytes. Deeper localization within the planarian body and lack of protective epithelial tissues also make it challenging to dissect planarian ovaries directly. 
This protocol uses a brief fixation step to facilitate the localization and dissection of planarian ovaries for downstream analysis to overcome these difficulties. The dissected ovary is compatible for ultrastructural examination by transmission electron microscopy (TEM) and antibody immunostaining. The dissection technique outlined in this protocol also allows for gene perturbation experiments, in which the ovaries are examined under different RNA interference (RNAi) conditions. Direct access to the intact germ cells in the ovary achieved by this protocol will greatly improve the imaging depth and quality and allow cellular and subcellular interrogation of oocyte biology.

<meta charset="utf8"></head><body>Ultrastrüktürel Analiz ve Antikor Boyama için Planaryan Over Diseksiyonu

This protocol presents steps taken to dissect ovaries in the freshwater planarians, Schmidtea mediterranea. The dissected ovaries are compatible for antibody immunostaining and ultrastructural analysis with transmission electron microscopy to study the cell biology of the oocytes and somatic cells, providing an imaging depth and quality that were previously inaccessible.

Kimyasal amputasyon ve yeniden oluşturulmasını Planarian Schmidtea mediterranea yutak

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Ve tahlil Kan Hücresi popülasyonlar

Starlet Deniz Anemone Aboral physa Tam Polip Regeneration uyaran