Bu eser Tıp bilimi, Yonsei Üniversitesi beyin Kore 21 artı proje tarafından desteklenmiştir. Buna ek olarak, bu eser Ulusal Araştırma Vakfı Kore (NMK-2017R1D1A1B03030315) bir hibe tarafından desteklenmiştir.

Tüm yordamları Yonsei Üniversitesi Tıp Fakültesi, uygun araştırma Etik Kurulu tarafından onaylanmıştır. Tüm deneysel hayvan laboratuvar hayvan bakımı Komitesi Yonsei Üniversitesi Tıp Fakültesi, kuralları uyarınca feda etti.
1. hazırlanması reaktifler
Dikkat: Paraformaldehyde (PFA), Akrilamid ve Sodyum Lauryl Sülfat (SDS) toksik tahriş edici vardır ve böylece bir duman başlıklı uygun kişisel koruyucu ekipman (PPE; önlük, eldiven, koruyucu gözlük) ile ele alınmalıdır.
<ol><li>%4 Akrilamid (AA) çözüm (A4P0): 20 mL % 40 Akrilamid çözüm için 180 mL 0.1 M fosfat tamponlu tuz (PBS) ekleyin.</li>
	<li>% 0.25 VA-044 çözüm: 2,2´-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane 0.5 g ekleyin] dihydrochloride (VA-044) toz 200 ml 0.1 M fosfat tamponlu tuz (PBS). VA-044 toz-ebilmek var olmak stok oda sıcaklığında iken, PBS solubilization üzerine 4 ° C'de depolanmalıdır. En iyi sonucu elde etmek için sadece deneme için gerekli çözüm miktarda hazırlamak.</li>
	<li>ANLAŞMA kokteyl çözüm: 10 g Akrilamid 225 mL % 4 paraformaldehyde (PFA) çözeltisi ekleyin ve 200 ml % 4 ile ses seviyesini PFA. Kullanılmadan önce VA-044 tozu 100 mg 40 mL 50 mL konik tüp içinde karışımı ekleyin.</li>
	<li>Çözüm arabelleği temizleyerek PAKTI: 40 g Sodyum Lauryl Sülfat (SDS) 350 mL 0.1 M PBS ekleyin ve 500 ml 0.1 M PBS ile ses seviyesini. Çözüm takas mPACT için % 0,5 α-thioglycerol çözüm arabelleği temizleyerek PAKTI ekleyin.</li>
	<li>Bu çalışmada kullanılan fareler 2-hafta-yaşlı BALB erkek fareler vardı; Bu çalışmada kullanılan fareler 2 hafta eski erkek SD-sıçan vardı.</li>
</ol>2. anestezi ve perfüzyon cerrahi
Dikkat: PFA ve Akrilamid toksik tahriş edici ve böylece bir duman başlıklı uygun KKE ile ele alınmalıdır.
<ol><li>30 mg/kg 1 mL şırınga ile 26'lik iğne kullanarak zoletil patojen-Alerjik bir odada hayvan anestezi. İzlemek hayvan için 5-10 dak.</li>
	<li>Hayvan cerrahi anestezi uçağa ulaştı sonra anestezi derinliği belirlemek için ayak-çimdik yanıt yöntemini kullanın. Yanıt vermeyi durdurma sorununu onaylayın. Not: bir önceki çalışmada11' kullanılan benzer bir iletişim kuralı fare ve sıçan cerrahi içeren aşağıdaki adımları izleyin.</li>
	<li>Göğüs kafesi, deri ve karın duvarı altında 5-6 cm kesi yapmak.</li>
	<li>Eğri, künt makas bir kesik kesik önceden siteyi bulmak için göğüs alan palpating diyafram içinde olun</li>
	<li>Kesik göğüs kafesi plevral boşluğu ortaya çıkarmak için tüm uzunluğu boyunca uzanır.</li>
	<li>Dikkatli bir şekilde akciğerlere yerinden. Köprücük kemiği kadar göğüs kafesi ile kesme yapmak. Iris makas kullanarak, küçük bir insizyon attım sol ventrikül arka bitene kadar dayanabilir. Bir 18'lik perfüzyon künt veya zeytin uçlu iğne kesilmiş ventrikül geçen artan aort içine yerleştirin.</li>
	<li>İğne güvenli ve kalp bir hemostat ile sıkma tarafından kaçağı önlemek. Alternatif olarak, değiştirilmiş bir hemostat aorta iğne ucu etrafında kelepçe için kullanın.</li>
	<li>Azalan aortaya en az hasar sağlamak için dikkat çekici sağ atriyumu büyük bir kesi yapmak. Fare şimdi perfüzyon için hazırdır.</li>
</ol>3. bütün perfüzyon ve sıçan diseksiyon
Dikkat: PFA ve Akrilamid toksik tahriş edici ve böylece bir duman başlıklı uygun KKE ile ele alınmalıdır.
Not: Aşağıdaki tüm perfüzyon adımları bir önceki çalışmada Woo ve arktarafından kullanılan bir iletişim kuralı benzer. (2016) 10 , 11.
<ol><li>Kalbin sağ atrium herhangi bir hava kabarcıkları tanıtmak değil dikkat çekici bir 18'lik iğne için ekleyin.</li>
	<li>50 mL şırınga kullanarak, hızlı bir şekilde ve eşit olarak 50 mL heparin (10 adet/mL) içeren soğuk 0.1 M PBS çözeltisi pompa.</li>
	<li>18'lik iğne Peristaltik pompa tüp takın.</li>
	<li>200 mL heparin (10 adet/mL) içeren soğuk 0.1 M PBS çözeltisi ile 10 mL/dak bir dolaşım hızda yıkayın.</li>
	<li>250 mL kan dolaşımı hızla 10 mL/dk soğuk % 4 İngiltere'de yılın çözeltisi ile düzeltmek. Fare bu aşamada sert olmalıdır.</li>
	<li>Toplar ve kalan PFA çözüm bertarafı için saklarız.</li>
	<li>ANLAŞMA için bir soğutulmuş PAKTI kokteyl çözüm %4 PFA, % 4 Akrilamid ve % 0.25 VA-044 toz kurcalayarak bir 18'lik iğne ile sıvı ve baş ve omurga kaldır. Kafatası bir ensizyon boyun burun yaparak ortaya çıkarmak. Bu ek perfüzyon adım psPACT ve mPACT yöntemleri için gerekli değildir; fiksasyon sonra hemen baş ve omurga yalıtmak ve kafatası bulaşmasına neden.</li>
	<li>Kafatasının herhangi bir kalıntı boyun ve omurga kas kaldırarak maruz.</li>
	<li>Peel away kafatası için rongeurs ve makas kullanın. Beyin ve omurilik kaldırın.</li>
	<li>Dokuya %4 oranında depolamak PFA 4 ° c; doku 1 hafta kadar saklanabilir.</li>
</ol>4. hidrojel Monomer infüzyon ve fare ve fare MSS polimerizasyonu
Dikkat: Akrilamid, SDS, α-thioglycerol ve İngiltere'de yılın tahriş edici ve böylece bir duman Hood ve uygun çiş ile ele alınmalıdır.
<ol><li>
PAKTI (pasif Temizleme tekniği)
	<ol>
<li>İzole etmek ve tüm MSS (beyin ve omurilik) sabit fareler ve sıçanlar %4 PFA, % 4 Akrilamid ve % 0.25 VA-044 toz ve mağaza 24 h doku tamamen s içinde dalmış sağlamak için 4 ° C'de soğutulmuş PAKTI kokteyl solüsyon içeren bir 50 mL tüp için kültür olution.</li>
		<li>10 dk mendil kullanarak bir azot tanka bağlı hibridizasyon sistem jel için örnek azot gazı içinde katıştırma: sistem 37 ° C'ye ayarla Dokuların taze soğuk (4 ° C) PAKTI içeren bir 50 mL tüp transferi kokteyl çözüm ve tüp kap ile bağlayın ve vakum üzerine açın.</li>
		<li>Hidrojel polimerize için örnek bir sallayarak kuluçka (150 d/d, 37 ° C) içeren tüp 3 h için veya polimerizasyon tamamlanana kadar koyun.</li>
		<li>Bloting kağıt kullanarak (bakınız Tablo malzemeler), Kaldır dokuları çevreleyen kalan polimerli hidrojel.</li>
		<li>Doku takas solüsyon (0.1 M PBS, pH %8.0 8 SDS) içeren bir 50 mL tüp aktarın.</li>
		<li>Örnek doku temizlenmiş oldu kadar 37 ° C ve 150 rpm için ayarla titreyen bir kuluçka makinesine koyun. Ortalama olarak, bu tam açıklığı elde etmek için yaklaşık 20 gün boyunca fareyi CNS alır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
psPACT (işlem ayrı pasif Temizleme tekniği)
	<ol>
<li>Bütün MSS (beyin ve omurilik) kemik kesici ve makas PFA-sabit fare ve sıçanlar temiz bir banka üzerinden ayırma.</li>
		<li>Doku transferi doku tamamen sabitleştirici dalmış PFA ve mağaza 24 h için 4 ° C'de % 4 içeren bir 50 mL tüp sağlamak.</li>
		<li>1s için sabit doku 0.1 M PBS yıkama ve A4P0 çözüm (0.1 M PBS %4 Akrilamid) aktarın. Mağaza 24 h 37 ° C'de.</li>
		<li>5 min için doku 0.1 M PBS içinde yıkayın.</li>
		<li>% 0.25 dokusunda bırakın VA-044 0.1 M PBS içinde. 6-24 h 37 ° C'de depolayın ve sonra taze % 0.25 VA-044/PBS çözüm için transfer.</li>
		<li>10 dk mendil kullanarak hibridizasyon jel için örnek azot gazı embed sistemi ( Tablo malzemelerigörmek) bağlı bir azot tankı: Transfer dokuların taze soğuk (4 ° C) içeren bir 50 mL tüp % 0.25 VA-044/PBS çözüm ve tüp kap ile bağlamak. Vakum üzerine açın.</li>
		<li>Doku çözüm (0.1 M PBS, pH %8.0 8 SDS) temizlemek için transfer.</li>
		<li>Titreyen bir kuluçka doku temizlenmiş oldu kadar 37 ° C ve 150 rpm için ayarla örnek kuluçkaya. Ortalama olarak, yaklaşık 17 gün boyunca fare CNS tam açıklığı elde etmek için alır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
mPACT (değiştirilmiş pasif Temizleme tekniği)
	<ol>
<li>Bütün MSS (beyin ve omurilik) kemik kesici ve makas PFA-sabit fare ve sıçanlar temiz bir banka üzerinden ayırma.</li>
		<li>4.2.2 - psPACT Protokolü'nün 4.2.8 adımları.</li>
		<li>Doku çözüm temizlenmesi için transfer. ANLAŞMA ve psPACT protokollerinden farklı olarak, mPACT % 0.5 α-thioglycerol ek olarak % 8 SDS 0.1 M PBS, pH 8.0 içinde oluşan bir takas çözüm gerektirdiğini unutmayın. Α-thioglycerol doku daha hızlı ve etkili bir şekilde temizlemek yardımcı olur un esmerleşme bir ajandır. Doku tam çözümde dalmış emin olun.</li>
		<li>Örnek doku temizlenmiş oldu kadar 37 ° C ve 150 rpm için ayarla titreyen bir kuluçka makinesine koyun. Ortalama olarak, fare CNS tam açıklığı elde etmek için yaklaşık 2 hafta sürer.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Kırılma indisi eşleme ve temizlenen MSS Immunostaining
Not: njantlar (Kırılma indisi eşleşen çözüm Nycodenz tabanlı) 0.8 g/mL Nycodenz toz içinde 30 mL temel tampon (% 0,01 sodyum azid ve ara-20 0.1 M PBS, pH 8.0) çözünmüş oluşur. Bu çözüm toz uygun solvasyon için izin vermek için kuluçka sallayarak 37 ° C yerleştirilir önerilir.
<ol><li>Kuluçkaya dokularda % 0.1 0.1 M PBS için 2 h, Triton X-100 sonra blok 0.1 M PBS 6 h için de %2 sığır serum albümin (BSA) ile.</li>
	<li>Bölümlerde üç kez PBST yıkamak (% 0.1 0.1 M PBS ara-20) için 2 h. bölümleri (Bu durumda, kan damarlarının lekeleri bir anti-tavşan PECAM-CD31 antikor) birincil antikorlar ile 2 gün boyunca leke.</li>
	<li>Bölümleri de %2 BSA (Bu durumda, bir keçi Anti-tavşan IgG Cy3 floresan eşlenik) ikincil antikor ile 2 gün boyunca leke.</li>
	<li>Yıkama üç kez içinde PBST 2 h için doku ve mağaza 15 mL 2-10 gün boyunca njantlar etiketli.</li>
	<li>Görüntüleme önce etiketli dokular njantlar küçük bir miktar için 35 veya 60 mm doku kültürü yemekleri üzerinde hareket ettirin. Silikon çevresinde çanak alt kenarı ile düzeltmek.</li>
	<li>1.5-2 mL taze njantlar ekleyin.</li>
</ol>6. görüntü işleme
<ol><li>Kiremit bir confocal lazer tarama microscopewith 10 x büyütme kullanarak tarama ile temizlenmiş dokuların görüntüleri elde etmek ( Tablo malzemelerigörmek). Cy3 etiketli dokusunun 550-600 nm dalga boyu kullanın.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Zhu, X., Xia, Y., Wang, X., Si, K., Gong, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+brain+imaging:+A+powerful+tool+for+neuroscience.">Optical brain imaging: A powerful tool for neuroscience.</a> Neurosci Bull. 33 (1), 95-102 (2017).</li><li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems.">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).</li><li>Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+CLARITY+for+rapid+and+high-resolution+imaging+of+intact+tissues.">Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues.</a> Nat Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).</li><li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLARITY+reveals+dynamics+of+ovarian+follicular+architecture+and+vasculature+in+three-dimensions.">CLARITY reveals dynamics of ovarian follicular architecture and vasculature in three-dimensions.</a> Sci Rep. 7, 44810 (2017).</li><li>Lee, H., Park, J. H., Seo, I., Park, S. H., Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+application+of+the+electrophoretic+tissue+clearing+technology,+CLARITY,+to+intact+solid+organs+including+brain,+pancreas,+liver,+kidney,+lung,+and+intestine.">Improved application of the electrophoretic tissue clearing technology, CLARITY, to intact solid organs including brain, pancreas, liver, kidney, lung, and intestine.</a> BMC Dev Biol. 14, 48 (2014).</li><li>Jensen, K. H. R., Berg, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+and+perspectives+in+tissue+clearing+using+CLARITY.">Advances and perspectives in tissue clearing using CLARITY.</a> J Chem Neuroanat. 86, 19-34 (2017).</li><li>Treweek, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-body+tissue+stabilization+and+selective+extractions+via+tissue-hydrogel+hybrids+for+high-resolution+intact+circuit+mapping+and+phenotyping.">Whole-body tissue stabilization and selective extractions via tissue-hydrogel hybrids for high-resolution intact circuit mapping and phenotyping.</a> Nat Protoc. 10 (11), 1860-1896 (2015).</li><li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+phenotyping+within+transparent+intact+tissue+through+whole-body+clearing.">Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing.</a> Cell. 158 (4), 945-958 (2014).</li><li>Neckel, P. H., Mattheus, U., Hirt, B., Just, L., Mack, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+tissue+clearing+(PACT):+Technical+evaluation+and+new+perspectives+in+immunofluorescence,+histology,+and+ultrastructure.">Large-scale tissue clearing (PACT): Technical evaluation and new perspectives in immunofluorescence, histology, and ultrastructure.</a> Sci Rep. 6, 34331 (2016).</li><li>Woo, J., Lee, M., Seo, J. M., Park, H. S., Cho, Y. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+the+optical+transparency+of+rodent+tissues+by+modified+PACT-based+passive+clearing.">Optimization of the optical transparency of rodent tissues by modified PACT-based passive clearing.</a> Exp Mol Med. 48 (12), 274 (2016).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> J Vis Exp. (65), (2012).</li><li>Roberts, D. G., Johnsonbaugh, H. B., Spence, R. D., MacKenzie-Graham, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+clearing+of+the+mouse+central+nervous+system+using+passive+CLARITY.">Optical clearing of the mouse central nervous system using passive CLARITY.</a> J Vis Exp. (112), (2016).</li><li>Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SeeDB:+A+simple+and+morphology-preserving+optical+clearing+agent+for+neuronal+circuit+reconstruction.">SeeDB: A simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction.</a> Nat Neurosci. 16 (8), 1154-1161 (2013).</li><li>Choi, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+expression+of+the+receptor+for+advanced+glycation+end+products+in+neurons+and+astrocytes+in+a+triple+transgenic+mouse+model+of+Alzheimer's+disease.">Increased expression of the receptor for advanced glycation end products in neurons and astrocytes in a triple transgenic mouse model of Alzheimer's disease.</a> Exp Mol Med. 46, 75 (2014).</li><li>Chang, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contralaterally+transplanted+human+embryonic+stem+cell-derived+neural+precursor+cells+(ENStem-A)+migrate+and+improve+brain+functions+in+stroke-damaged+rats.">Contralaterally transplanted human embryonic stem cell-derived neural precursor cells (ENStem-A) migrate and improve brain functions in stroke-damaged rats.</a> Exp Mol Med. 45, 53 (2013).</li><li>Kim, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+differential+plaque+depositions+in+the+brains+of+Tg2576+and+Tg-APPswe/PS1dE9+transgenic+mouse+models+of+Alzheimer+disease.">Analysis of differential plaque depositions in the brains of Tg2576 and Tg-APPswe/PS1dE9 transgenic mouse models of Alzheimer disease.</a> Exp Mol Med. 44 (8), 492-502 (2012).</li><li>Kinameri, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prdm+proto-oncogene+transcription+factor+family+expression+and+interaction+with+the+Notch-Hes+pathway+in+mouse+neurogenesis.">Prdm proto-oncogene transcription factor family expression and interaction with the Notch-Hes pathway in mouse neurogenesis.</a> PLoS One. 3 (12), e3859 (2008).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Pasif, elektroforetik sigara ekstraksiyon yöntemleri istihdam ederken PAKTI önceki doku NETLİK2,3,4,7 gibi yöntemleri temizlenmesi ile elde tutarlılık önemli ölçüde geliştirilmiş , 8, teknik hala birkaç eksiklikler, maksimal doku netlik12ulaşmak için gereken süreyi en önemli biri olduğunu taşımaktadır. Mevcut çalışmada, biz önemli ölçüde doku hala doku bütünlüğü ve yapısı6,10koruyarak temizlemek için gereken süreyi azaltmak değiştirilmiş PAKTI protokolleri mevcut. Ayrıca, ilk kez, biz uygulama protokolleri bütün CNS doku ve bir üst düzey kemirgen model, sıçan10takas doku göstermek.
Özellikle, psPACT örnek işleme %4 Akrilamid ve % 0.25 içerir VA-044 hidrojel oluşumu sırasında iki ayrı adımda mPACT daha da psPACT inşa ve çözüm % 0.5 α-thioglycerol10ile takas % 8 SDS ilave süre. Akrilamid ve sonraki VA-044 adım ayıran son doku bütünlüğü şeffaflık PAKTI ile elde sonra olumsuz etkileyebilir doku çevreleyen unpolymerized hidrojel monomerleri kalan kaldırmak için engeller; Ayrıca, bu Maksimum optik temizleme üretmek için gereken süreyi önemli ölçüde azaltır. α-thioglycerol daha da mPACT yöntemindeki ilavesi açıklığa hızlandırır işlemek13, α-thioglycerol orijinal anlaşma yönteminde sadece reaktifler kullanarak daha az erişilebilir doku bölgelerinde temizlemek yardımcı olur un esmerleşme bir ajan olduğu gibi 7 , 8 , 9.
ANLAŞMA, psPACT ve mPACT kemirgen doku üzerinde karşılaştırma psPACT orijinal anlaşma protokolü göre optik saydamlığı artırır iken, mPACT en iyi şekilde Temizleme ve her iki bütünün sonraki yüksek çözünürlükte görüntüleme için izin verdiğini gösterdi memeli organ ve kesitli dilimler olarak Şekil 2, şekil 3, şekil 4' te gösterilmiştir. Şeffaflık, verimlilik ve doku istikrar diğer iki Temizleme yöntemleri ile karşılaştırıldığında farklılıkları mPACT ispat yöntemi anahtarı işlenmiş organlarda α-thioglycerol tabanlı lipid fiyasko. Bu işlenmiş organlar, kan damarlara Morfoloji, ayirt ve confocal mikroskobu (şekil 5 dE) ile ilgili olarak özellikle hızlı 3D analiz için izin verdi.
α-thioglycerol takas SDS tabanlı çözüm için ek optik şeffaflık hızlandırılması için kritik olmakla birlikte, bu da biraz doku kırılganlık artar ve daha sonrası işleme hasar bölgelerine duyarlı yapar. MPACT verimlilik açısından açık üstünlüğü bu sınırlama daha ağır basar; Yine de, iş şu anda maksimal takas ile elde edilebilir emin olmak için yapılıyor hiçbir masraftan doku bütünlüğü için en az.
Böylece, bizim sonuçlar bir 3D analiz dahil ancak bunlarla sınırlı nöronal ağlara, kan damarlara ve doku matris mimari memeli organlarının fonksiyonel ve anatomik özellikleri sağlamak için güçlü bir araştırmacı araç olarak mPACT kurmak. İleride, biz mPACT gibi doku yaralanması, gelişimsel malformasyonlar, kanser ve nörodejeneratif hastalığın patofizyolojisi katkıda üst düzey biyolojik mekanizmaları soruşturma özellikle yararlı olabileceğine inanıyor hastalık14,15,16,17. İnce hücresel mekanizmaları hastalık içinde yer alan bir çalışma ile birlikte, mPACT daha kapsamlı bir çoklu ölçek ne kadar çeşitli farklı hastalığın ortaya çıkmasına neden gözlenen fenotip için mekanizmaları etkileşim anlama sağlamak potansiyeline sahiptir.

Klinik ve bilimsel açıdan soruşturma temel amacı organ yapısı ve fonksiyonu tam bir anlayış ulaşmak içerir; Ancak, memeli organları son derece karmaşık doğası kez tamamen bu amaç1ulaşmak için bir engel olarak hizmet vermektedir. Sağlam dokulara gelen bir hidrojel Akrilamid tabanlı melez inşa içerir, berraklık (açık Lipid değiş tokuş Akrilamid melezleşmiştir katı görüntüleme uyumlu Tisssue-hidrojel)2,3,4, elde organ, beyin, karaciğer ve dalak, onların yapısal bütünlük5koruyarak dahil olmak üzere çeşitli optik geçiş izni. NETLİK böylece sadece görselleştirme ince karmaşık hücresel ağlar ve doku türleri Morfoloji kesit gerek kalmadan incelemek için bir fırsat aynı zamanda sağlamıştır.
Doku izni elde etmek için NETLİK örnek el altında lipit içeriğini kaldırmak için elektroforetik yöntemleri kullanır. NETLİK fiziksel olarak istikrarlı doku-hidrojel melez üretmek için kaydetti iken, elektroforetik doku takas (vb) yöntemleri kullanımı, esmerleşme epitope hasar, dahil olmak üzere, doku kalitesi açısından değişken sonuçlar verir çalışmalar göstermiştir ve protein kaybı5,6. Bu sorunları gidermek için vb tedavi yerini alan bir pasif, deterjan iyonik bağlı delipidation tekniği ile anlaşma (pasif netlik tekniği), gibi değiştirilmiş protokolleri gelişmiş7,8,9olmuştur. Sonuçlarında büyük bir tutarlılık ulaşmak rağmen ancak, PAKTI maksimal izni elde etmek için daha fazla zaman gerektirir. Ayrıca, bu teknikleri hiçbiri henüz tüm CNS formu veya fareler ve eskiden şiling şimdi pigs gibi daha büyük kemirgen modellerinde uygulandı.
Bu da çalışmanın roman metodolojileri, psPACT (işlem-ayrı PAKTI) ve mPACT (değiştirilmiş PAKTI), Bütün CNS ve iç organlar fare ve sıçan modelleri10hızlı Gümrükleme kolaylaştırmak için teklif tarafından bu sınırlamaları gidermek çalışmaktadır. Özellikle, psPACT % 4 Akrilamid ve % 0.25 dokulara işleyen VA-044 hidrojel oluşumu sırasında; iki ayrı adımda mPACT esasen aynı adımları içerir, ancak % 0.5 α-thioglycerol anahtar reaktifi olarak SDS tabanlı takas Çözümle takviyeleri. Her iki teknikleri endojen sistemik ve cerebrospinal dolaşım optik temizleme üretmek için gereken süreyi önemli ölçüde azaltmak için sistemleri koşum. İlke kanıtı olarak biz confocal mikroskopi kan damarı desenleri temizlenen doku10analiz kullanımını göstermektedir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
			<td>Affymetrix, Inc.</td>
			<td>75819</td>
			<td>Clearing solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nycodenz</td>
			<td>Axia-Shield</td>
			<td>1002424</td>
			<td>nRIMS solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Acrylamide Solution</td>
			<td>Bio Rad Laboratories, Inc.</td>
			<td>161-0140</td>
			<td>Polymerization (A4P0)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,2&#180;-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane] Dihydrochloride</td>
			<td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td>
			<td>017-19362</td>
			<td>Polymerization (VA-044)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Thioglycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1753-100ML</td>
			<td>Clearing solution (mPACT)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Georgiachem</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td>nRIMS solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787-50ML</td>
			<td>Immuno Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Bovogen</td>
			<td>BSA100</td>
			<td>Immuno Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>375095</td>
			<td>Perfusion (PBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002-25G</td>
			<td>nRIMS solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PECAM-CD31 antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology Inc.</td>
			<td>sc-28188</td>
			<td>Immuno Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit-IgG Cy3 fluorescent conjugate</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Inc.</td>
			<td>111-165-003</td>
			<td>Immuno Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde</td>
			<td>Tech &#38; Innovation</td>
			<td>BPP-9004</td>
			<td>Perfusion, Polymerization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20X Phosphate Buffered Saline (pH 7.4)</td>
			<td>Tech &#38; Innovation</td>
			<td>BPB-9121</td>
			<td>Perfusion, Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL stripette</td>
			<td>Coatar</td>
			<td>4488</td>
			<td>Solution transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td>Clearing tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Cell culture dish</td>
			<td>SPL</td>
			<td>20035</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal dish</td>
			<td>SPL</td>
			<td>211350</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>Korea vaccine Co., Ltd</td>
			<td>26G 1/2</td>
			<td>Anesthetize&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL syringe</td>
			<td>Korea vaccine Co., Ltd</td>
			<td>21G1 1/4</td>
			<td>Perfusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3553</td>
			<td>Polymerization (A4P0)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman 3MM paper</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z270849</td>
			<td>Blotting paper for gel removal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM780</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN lite Software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>ZEN 2012</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump</td>
			<td>Longerpump</td>
			<td>BT100-1F</td>
			<td>Perfusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasyGel</td>
			<td>Lifecanvas Technologies</td>
			<td>EasyGel</td>
			<td>Tissue gel hybridization system</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

novel passive clearing methods for the rapid production of optical transparency in whole cns tissue

NETLİK geliştirme beri teknik temizleyerek bir bioelectrochemical bu üç boyutlu fenotip eşleme için şeffaf dokularda, roman Temizleme yöntemleri kübik (açık, engelsiz beyin görüntüleme dahil olmak üzere çok sayıda sağlar kokteyller ve sayısal analiz), anahtarı (etkileşim zaman sistemde kontrol) ve kimyasal kinetik, harita (Proteom büyütülmüş analizi) ve PAKTI (pasif netlik tekniği), kurulmuştur için varolan araç daha fazla genişletmek için biyolojik dokuların mikroskopik analiz. Üzerine iyileştirmek ve özgün PAKTI yordamı tüm merkezi sinir sistemi (MSS), böbrek, dalak ve tüm fare embriyo gibi sağlam kemirgen dokuların bir dizi için en iyi duruma getirme mevcut çalışma amaçlamaktadır. PsPACT (işlem-ayrı PAKTI) ve mPACT (değiştirilmiş PAKTI) olarak adlandırdığı, roman bu teknikler hücre devresi haritalama ve olduğu gibi normal ve patolojik dokularda hücre altı yapıları görselleştirme son derece etkili yol sağlar. Aşağıdaki iletişim kuralında, biz onların yapısal bütünlük psPACT ve mPACT üzerinden en az işgali ile maksimal doku izni elde etmek nasıl ayrıntılı, adım adım anahat sağlar.

En iyi duruma getirilmiş pasif Temizleme teknikleri kullanarak tüm CNS şeffaf bir model nesil
Fare ve sıçan bütün CNS dokuların optik geçiş izni hızla çeşitli pasif Temizleme Teknikleri (şekil 1) kullanılarak sağlanır. Zaman içinde takas dokusunun bir şematik şekil 2Agösterilir. Özgün PAKTI yönteminden farklı olarak, % 4 Akrilamid (A4P0) ve % 0.25 VA-044 başlatıcı çözüm örnekleri hidrojel Melez oluşturmak üzere iki ayrı adımda tedavi psPACT (işlem-ayrı PAKTI) içerir. mPACT (değiştirilmiş PAKTI) çözüm % 0.5 α-thioglycerol ile takas % 8 SDS ilave psPACT daha da artırır. ANLAŞMA, psPACT ve mPACT gün 14 üzerinden işleme örnekleri karşılaştırılır ve şekil 2Bsundu.
Bir önceki çalışmada, bu süre orijinal anlaşma Protokolü 23 gün, psPACT optik geçiş izni elde ve mPACT tüm fare CNS sadece 20 ve 14 gün, sırasıyla10temizlenmiş bildirdi. Bu da çalışmanın, fare beyin örnekleri mPACT protokolü aracılığıyla tedavi ederken onlar 14 gün (2B rakam) sonra optik şeffaflık elde bulduk. Sıçan bütün CNS örnekleri psPACT yolu ile işlenen ve dokularda sırasıyla 30 ve 20 gün içinde silinmesinden gibi aynı zamanda bu mPACT maksimal izni en yüksek etkinlik ile elde gösterdi mPACT (şekil 3A, B). Yetişkin sıçan beyin tüm MSS aksine, tek başına bir sadece 5 gün içinde (4A rakam) mPACT ile temizlendi. Temizlenen sıçan beyin damar kalıpları ile ayirt psPACT ve mPACT işleme yardımcı programı (şekil 4B, mPACT veri beynin anatomik ve fonksiyonel analiz için bu takas yordamlardan göstermek için sonra analiz edildi Woo ve ark. 2016 gösterilen)10.
Pasif doku protokolleri temizleyerek bu kullanarak en iyi duruma getirilmiş, takas kez üç protokoller arasında farklılık olsa da biz bütün MSS, sağlam, şeffaf modellerinin görselleştirmek başardık. En iyi duruma getirilmiş pasif yöntemler temizlemek daha kısa bir süre içinde organ netlik elde. Birlikte ele alındığında, bu sonuçlar yöntemi takas mPACT açık CNS yöntemleri temizleyerek daha stabil ve hızlı önceki pasif oluşturabilirsiniz öneririz. Bu nedenle, mPACT memeli organların gelecekte yapısal ve anatomik analizleri kullanmak için büyük bir potansiyele sahiptir ve varolan yöntemleri etkinliği ve güvenliği açısından önemli bir avantaj sağlar.
Nesil optik temizlenen iç organlar ve embriyo mPACT kullanarak
Bütün CNS dokular yanı sıra, Yetişkin fare dalak ve böbrek mPACT ile 19 ve 23 gün içinde sırasıyla silinmesinden (şekil 5AB). Fare embriyo E10.5 ve E13.5 da mPACT iletişim kuralı üzerinden işlenmesi 3 gün sonra temizlendi. Şekil 5C -E fare embriyo, sıçan Kauda at ve sıçan dalak kuyruk bölgesi microvasculature yanı sıra tüm embriyo kan damarı desen canlandırmayı gösterilir. Bu sonuçlar bu mPACT çok çeşitli doku ve organların 3D anatomik analiz için şeffaf modelleri oluşturmak için kullanılan öneririz.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57123/57123fig1.jpg"> Şekil 1: en iyi duruma getirilmiş pasif Temizleme Teknikleri (anlaşma) şematik gösterim. Her üç anlaşma protokolü olarak bireysel adımlar bir taslağını her adım için gerekli reaktifler yanında sağlanır. Özgün PAKTI doku polimerizasyon hidrojel oluşumu %4 PFA, % 4 Akrilamid (AA) çözüm ve % 0.25 VA-044 başlatıcı çözüm soğuk karışımı ile gelen protokolüdür. Sonra doku azot gazı kullanarak polimerli, pasif çözüm Temizleme % 8 SDS ile temizlenir. PsPACT (işlem-ayrı PAKTI) % 4 AA çözüm ve % 0.25 VA-044 başlatıcı çözüm ayrı tedavi süreçleri doku hidrojel oluşumu için kullanır; Bu koşullar bu orijinal anlaşma protokolü farklı. MPACT (değiştirilmiş PAKTI) ek % 0.5 α-thioglycerol çözüm psPACT Protokolü'nün temizlenmesi % 8 SDS ekler. Üç tüm iletişim kuralları için sağlam doku, inkübe > = 37 ° C titreyen bir kuluçka elde maksimal izni ISS kadar. <a href="/files/ftp_upload/57123/57123fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57123/57123fig2.jpg"> Şekil 2: optik fare tüm merkezi sinir sistemi (MSS) pasif doku takas tarafından saydamlığını. (A) PAKTI tabanlı yöntemleri ile zaman içinde temizleyerek tüm CNS doku Schematization. (B) karşılaştırma üç pasif Temizleme iletişim kuralları (orijinal PAKTI, psPACT, mPACT) 14 gün sonra işleme, fare tüm CNS. (C) optik geçiş izni mPACT 14 gün içinde işleme için tabi fare beyin. Bu rakam Woo vd. 201610değiştirildi. 3 mm boyunda 2 c harflerdir. <a href="/files/ftp_upload/57123/57123fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57123/57123fig3.jpg"> Şekil 3: optik şeffaflık sıçan bütün CNS doku post-psPACT ve mPACT. (A) yetişkin fare tüm CNS doku elde psPACT ile maksimal optik Gümrükleme 30 gün sonra. (B) yetişkin fare tüm CNS doku 20 gün sonra mPACT ile maksimal optik izni elde. Önce ve sonra diyagramları bütün CNS boyutunu işlemden, önce ve sonra göz tarafından ölçülen gösterir. <a href="/files/ftp_upload/57123/57123fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57123/57123fig4.jpg"> Şekil 4: kesitli yetişkin sıçan beyin mPACT işleme ve microvasculature görselleştirme. (A) 4-mm kalın yetişkin sıçan beyin karşılaştırılması bölümleri 3 ve 5 gün işleme mPACT sonra. (B) 3D projeksiyon ile anti-CD31 antikor psPACT işlendikten sonra görüntülenir yetişkin sıçan beyin damar kalıplarının. Ölçek çubukları, 1.500 µm ve 100 µm. Bu rakam Woo vd. 201610değiştirildi. <a href="/files/ftp_upload/57123/57123fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57123/57123fig5.jpg"> Şekil 5: mPACT işleme kemirgen organlar ve tüm fare embriyolar. mPACT, sırasıyla 19 ve 23 gün içinde yetişkin fare (A) dalak ve (B) böbrek optik şeffaflık elde etti. (C) mPACT şeffaf E10.5 ve E13.5 fare embriyo 3 gün sonra üretilen. Sonra mPACT ile takas microvasculature anti-CD31 fare embriyo kuyruk bölgesinde ile görselleştirme (D) . (E) 3D projeksiyon damarlara sıçan Kauda at ve (F) fare dalak ile anti-CD31, sonrasında işleme yolu ile mPACT. Bu rakam Woo vd. 201610değiştirildi. <a href="/files/ftp_upload/57123/57123fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Novel Passive Clearing Methods for the Rapid Production of Optical Transparency in Whole CNS Tissue at JoVE.com

Novel Passive Clearing Methods for the Rapid Production of Optical Transparency in Whole CNS Tissue

Roman pasif optik şeffaflık bütün sinir dokusunda hızlı üretim için yöntemleri Temizleme

Burada, iki roman metodolojisi, psPACT ve mPACT maksimal optik şeffaflık ve doku damarlara sağlam kemirgen sonraki mikroskobik analizi elde etmek için mevcut tüm CNS.

Since the development of CLARITY, a bioelectrochemical clearing technique that allows for three-dimensional phenotype mapping within transparent tissues, ...

novel-passive-clearing-methods-for-rapid-production-optical

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.7K Görüntüleme.  Yonsei University College of Medicine. Burada, iki roman metodolojisi, psPACT ve mPACT maksimal optik şeffaflık ve doku damarlara sağlam kemirgen sonraki mikroskobik analizi elde etmek için mevcut tüm CNS.

Video: Novel Passive Clearing Methods for the Rapid Production of Optical Transparency in Whole CNS Tissue

Methods for Experimental Manipulations after Optic Nerve Transection in the Mammalian CNS

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. The optic nerve can be accessed within the orbit of the eye and completely transected (axotomized), cutting the axons of the entire RGC population. Optic nerve transection is a reproducible model of apoptotic neuronal cell death in the adult CNS 1-4. This model is particularly attractive because the vitreous chamber of the eye acts as a capsule for drug delivery to the retina, permitting experimental manipulations via intraocular injections. The diffusion of chemicals through the vitreous fluid ensures that they act upon the entire RGC population. Viral vectors, plasmids or short interfering RNAs (siRNAs) can also be delivered to the vitreous chamber in order to infect or transfect retinal cells 5-12. The high tropism of Adeno-Associated Virus (AAV) vectors is beneficial to target RGCs, with an infection rate approaching 90% of cells near the injection site 6, 7, 13-15. Moreover, RGCs can be selectively transfected by applying siRNAs, plasmids, or viral vectors to the cut end of the optic nerve 16-19 or injecting vectors into their target the superior colliculus 10. This allows researchers to study apoptotic mechanisms in the injured neuronal population without confounding effects on other bystander neurons or surrounding glia. RGC apoptosis has a characteristic time-course whereby cell death is delayed 3-4 days postaxotomy, after which the cells rapidly degenerate. This provides a window for experimental manipulations directed against pathways involved in apoptosis. Manipulations that directly target RGCs from the transected optic nerve stump are performed at the time of axotomy, immediately after cutting the nerve. In contrast, when substances are delivered via an intraocular route, they can be injected prior to surgery or within the first 3 days after surgery, preceding the initiation of apoptosis in axotomized RGCs. In the present article, we demonstrate several methods for experimental manipulations after optic nerve transection.

Optic Nerve transection is a widely used model of adult CNS injury. This model is ideal for performing a number of experimental manipulations that target the retina globally or directly target the injured neuronal population of retinal ganglion cells.

Memeli MSS Optik Sinir transeksiyonu sonra Deneysel İşlemler Yöntemleri

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. The optic nerve can be ...

Nörobilim

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

Glutamat ve GABA hızlı Micro-iyontoforez: Synaptic Entegrasyon Araştırma yararlı bir araç

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

In Koku Reseptör Nöronlar Tüm Dağı ile immün<em&gt; Drosophila</em&gt; Anten

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Assessment of Vascular Regeneration in the CNS Using the Mouse Retina

The rodent retina is perhaps the most accessible mammalian system in which to investigate neurovascular interplay within the central nervous system (CNS). It is increasingly being recognized that several neurodegenerative diseases such as Alzheimer&#8217;s, multiple sclerosis, and amyotrophic lateral sclerosis present elements of vascular compromise. In addition, the most prominent causes of blindness in pediatric and working age populations (retinopathy of prematurity and diabetic retinopathy, respectively) are characterized by vascular degeneration and failure of physiological vascular regrowth. The aim of this technical paper is to provide a detailed protocol to study CNS vascular regeneration in the retina. The method can be employed to elucidate molecular mechanisms that lead to failure of vascular growth after ischemic injury. In addition, potential therapeutic modalities to accelerate and restore healthy vascular plexuses can be explored. Findings obtained using the described approach may provide therapeutic avenues for ischemic retinopathies such as that of diabetes or prematurity and possibly benefit other vascular disorders of the CNS.

The rodent retina has long been recognized as an accessible window to the brain. In this technical paper we provide a protocol that employs the mouse model of oxygen-induced retinopathy to study the mechanisms that lead to failure of vascular regeneration within the central nervous system after ischemic injury. The described system can also be harnessed to explore strategies to promote regrowth of functional blood vessels within the retina and CNS.

Fare Retina kullanma CNS&#39;deki Vasküler Rejenerasyon Değerlendirilmesi

The rodent retina is perhaps the most accessible mammalian system in which to investigate neurovascular interplay within the central nervous system (CNS). ...

Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique non-linear deformations, dramatically hampering one's ability to evaluate cellular morphology, distribution and connectivity in the central nervous system (CNS). However, optical clearing techniques are changing the way tissues are visualized. These approaches permit one to probe deeply into intact organ preparations, providing tremendous insight into the structural organization of tissues in health and disease. Techniques such as Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) achieve this goal by providing a matrix that binds important biomolecules while permitting light-scattering lipids to freely diffuse out. Lipid removal, followed by refractive index matching, renders the tissue transparent and readily imaged in 3 dimensions (3D). Nevertheless, the electrophoretic tissue clearing (ETC) used in the original CLARITY protocol can be challenging to implement successfully and the use of a proprietary refraction index matching solution makes it expensive to use the technique routinely. This report demonstrates the implementation of a simple and inexpensive optical clearing protocol that combines passive CLARITY for improved tissue integrity and 2,2&#8242;-thiodiethanol (TDE), a previously described refractive index matching solution.

Optical clearing techniques are revolutionizing the way tissues are visualized. In this report we describe modifications of the original Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) protocol that yields more consistent and less expensive results.

Pasif kullanımı Netlik Fare Merkezi Sinir Sistemi Optik Takas

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the molecular and cellular basis of higher brain functions. A whole-mount preparation of adult brains with well-preserved morphology is critical for such whole brain-based studies, but can be technically challenging and time-consuming. This protocol describes an easy-to-learn, one-step dissection approach of an adult fly head in less than 10 s, while keeping the intact brain attached to the rest of the body to facilitate subsequent processing steps. The procedure helps remove most of the eye and tracheal tissues normally associated with the brain that can interfere with the later imaging step, and also places less demand on the quality of the dissecting forceps. Additionally, we describe a simple method that allows convenient flipping of the mounted brain samples on a coverslip, which is important for imaging both sides of the brains with similar signal intensity and quality. As an example of the protocol, we present an analysis of dopaminergic (DA) neurons in adult brains of WT (w1118) flies. The high efficacy of the dissection method makes it particularly useful for large-scale adult brain-based studies in Drosophila.

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

The adult Drosophila brain is a valuable system for studying neuronal circuitry, higher brain functions, and complex disorders. An efficient method to dissect whole brain tissue from the small fly head will facilitate brain-based studies. Here we describe a simple, one-step dissection protocol of adult brains with well-preserved morphology.

Basit Bir adım Yetişkin Tüm montaj Hazırlama Diseksiyon Protokolü<em&gt; Drosophila</em&gt; Brain

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Methods for the Discovery of Novel Compounds Modulating a Gamma-Aminobutyric Acid Receptor Type A Neurotransmission

This manuscript presents a step-by-step protocol for screening compounds at gamma-aminobutyric acid type A (GABAA) receptors and its use towards the identification of novel molecules active in preclinical assays from an in vitro recombinant receptor to their pharmacological effects at native receptors in rodent brain slices. For compounds binding at the benzodiazepine site of the receptor, the first step is to set up a primary screen that consists of developing radioligand binding assays on cell membranes expressing the major GABAA subtypes. Then, taking advantage of the heterologous expression of rodent and human GABAA receptors in Xenopus oocytes or HEK 293 cells, it is possible to explore, in electrophysiological assays, the physiological properties of the different receptor subtypes and the pharmacological properties of the identified compounds. The Xenopus oocyte system will be presented here, starting with the isolation of the oocytes and their microinjection with different mRNAs, up to the pharmacological characterization using two-electrode voltage clamps. Finally, recordings conducted in rodent brain slices will be described that are used as a secondary physiological test to assess the activity of molecules at their native receptors in a well-defined neuronal circuit. Extracellular recordings using population responses of multiple neurons are demonstrated together with the drug application.

Here, we present protocols to discover compounds active at GABAA receptors, from the binding to the physiology and pharmacology.

Bir Neurotransmission roman bileşikleri bir gama - aminobütirikasit reseptör oransal keşfi için yöntemleri yazın

This manuscript presents a step-by-step protocol for screening compounds at gamma-aminobutyric acid type A (GABAA) receptors and its use towards the ...

Chronic Implantation of Whole-cortical Electrocorticographic Array in the Common Marmoset

Electrocorticography (ECoG) allows the monitoring of electrical field potentials from the cerebral cortex with high spatiotemporal resolution. Recent development of thin, flexible ECoG electrodes has enabled conduction of stable recordings of large-scale cortical activity. We have developed a whole-cortical ECoG array for the common marmoset. The array continuously covers almost the entire lateral surface of cortical hemisphere, from the occipital pole to the temporal and frontal poles, and it captures whole-cortical neural activity in one shot. This protocol describes a chronic implantation procedure of the array in the epidural space of the marmoset brain. Marmosets have two advantages regarding ECoG recordings, one being the homologous organization of anatomical structures in humans and macaques, including frontal, parietal, and temporal complexes. The other advantage is that the marmoset brain is lissencephalic and contains a large number of complexes, which are more difficult to access in macaques with ECoG, that are exposed to the brain surface.These features allow direct access to most cortical areas beneath the surface of the brain. This system provides an opportunity to investigate global cortical information processing with high resolutions at a sub-millisecond order in time and millimeter order in space.

We have developed a whole-cortical electrocorticographic array for the common marmoset that continuously covers almost the entire lateral surface of cortex, from the occipital pole to the temporal and frontal poles. This protocol describes a chronic implantation procedure of the array in the epidural space of the marmoset brain.

Kronik yaygın Marmoset bütün kortikal Electrocorticographic dizide implantasyonu

Electrocorticography (ECoG) allows the monitoring of electrical field potentials from the cerebral cortex with high spatiotemporal resolution. Recent ...

A Hydrophobic Tissue Clearing Method for Rat Brain Tissue

Hydrophobic tissue clearing methods are easily adjustable, fast, and low-cost procedures that allows for the study of a molecule of interest in unaltered tissue samples. Traditional immunolabeling procedures require cutting the sample into thin sections, which restricts the ability to label and examine intact structures. However, if brain tissue can remain intact during processing, structures and circuits can remain intact for the analysis. Previously established clearing methods take significant time to completely clear the tissue, and the harsh chemicals can often damage sensitive antibodies. The iDISCO method quickly and completely clears tissue, is compatible with many antibodies, and requires no special lab equipment. This technique was initially validated for the use in mice tissue, but the current protocol adapts this method to image hemispheres of control and transgenic rat brains. In addition to this, the present protocol also makes several adjustments to preexisting protocol to provide clearer images with less background staining. Antibodies for Iba-1 and tyrosine hydroxylase were validated in the HIV-1 transgenic rat and in F344/N control rats using the present hydrophobic tissue clearing method. The brain is an interwoven network, where structures work together more often than separately of one another. Analyzing the brain as a whole system as opposed to a combination of individual pieces is the greatest benefit of this whole brain clearing method.

Here we present a hydrophobic tissue clearing method that allows for the viewing of target molecules as part of intact brain structures. This technique has now been validated for F344/N control and HIV-1 transgenic rats of both sexes.

Sıçan Beyin Dokusu için Hidrofobik Doku Temizleme Yöntemi

Hydrophobic tissue clearing methods are easily adjustable, fast, and low-cost procedures that allows for the study of a molecule of interest in unaltered ...

Immunostaining of Whole-Mount Retinas with the CLARITY Tissue Clearing Method

The tissue hydrogel delipidation method (CLARITY), originally developed by the Deisseroth laboratory, has been modified and widely used for immunostaining and imaging of thick brain samples. However, this advanced technology has not yet been used for whole-mount retinas. Although the retina is partially transparent, its thickness of approximately 200 &#181;m (in mice) still limits the penetration of antibodies into the deep tissue as well as reducing light penetration for high-resolution imaging. Here, we adapted the CLARITY method for whole-mount mouse retinas by polymerizing them with an acrylamide monomer to form a nanoporous hydrogel and then clearing them in sodium dodecyl sulfate to minimize protein loss and avoid tissue damage. CLARITY-processed retinas were immunostained with antibodies for retinal neurons, glial cells, and synaptic proteins, mounted in a refractive index matching solution, and imaged. Our data demonstrate that CLARITY&#160;can improve the quality of standard immunohistochemical staining and imaging for retinal neurons and glial cells in whole-mount preparation. For instance, 3D resolution of fine axon-like and dendritic structures of dopaminergic amacrine cells were much improved by CLARITY. Compared to non-processed whole-mount retinas, CLARITY can reveal immunostaining for synaptic proteins such as postsynaptic density protein 95. Our results show that CLARITY renders the retina more optically transparent after the removal of lipids and preserves fine structures of retinal neurons and their proteins, which can be routinely used for obtaining high-resolution imaging of retinal neurons and their subcellular structures in whole-mount preparation.

Here we present a protocol to adapt the CLARITY method of the brain tissues for whole-mount retinas to improve the quality of standard immunohistochemical staining and high-resolution imaging of retinal neurons and their subcellular structures.

CLARITY Doku Temizleme Yöntemi ile Tüm Mount Retinaların İmmünasyonunun İmmünasyon

The tissue hydrogel delipidation method (CLARITY), originally developed by the Deisseroth laboratory, has been modified and widely used for immunostaining ...