This work was supported by the Australian National Health and Medical Research Council (NHMRC fellowship #454330 to JX, project grant #628761 to SM and APP1058647 to JX), Multiple Sclerosis Research Australia (MSRA #12070 to JX), the University of Melbourne Research Grant Support Scheme and Melbourne Research CI Fellowship to JX as well as Australia Postgraduate Scholarships to HP and AF.&#160;We would like to acknowledge the Operational Infrastructure Scheme of the Department of Innovation, Industry and Regional Development, Victoria Australia.

<ol>
	<li>Baumann, N., Pham-Dinh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+of+oligodendrocyte+and+myelin+in+the+mammalian+central+nervous+system.">Biology of oligodendrocyte and myelin in the mammalian central nervous system.</a> Physiol Rev. 81 (2), 871-927 (2001).</li><li>Watkins, T. A., Emery, B., Mulinyawe, S., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+stages+of+myelination+regulated+by+gamma-secretase+and+astrocytes+in+a+rapidly+myelinating+CNS+coculture+system.">Distinct stages of myelination regulated by gamma-secretase and astrocytes in a rapidly myelinating CNS coculture system.</a> Neuron. 60 (4), 555-569 (2008).</li><li>Lee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MDGAs+interact+selectively+with+neuroligin-2+but+not+other+neuroligins+to+regulate+inhibitory+synapse+development.">MDGAs interact selectively with neuroligin-2 but not other neuroligins to regulate inhibitory synapse development.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (1), 336-341 (2013).</li><li>Xiao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BDNF+exerts+contrasting+effects+on+peripheral+myelination+of+NGF-dependent+and+BDNF-dependent+DRG+neurons.">BDNF exerts contrasting effects on peripheral myelination of NGF-dependent and BDNF-dependent DRG neurons.</a> J Neurosci. 29 (13), 4016-4022 (2009).</li><li>Chan, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NGF+controls+axonal+receptivity+to+myelination+by+Schwann+cells+or+oligodendrocytes.">NGF controls axonal receptivity to myelination by Schwann cells or oligodendrocytes.</a> Neuron. 43 (2), 183-191 (2004).</li><li>Xiao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-Derived+Neurotrophic+Factor+Promotes+Central+Nervous+System+Myelination+via+a+Direct+Effect+upon+Oligodendrocytes.">Brain-Derived Neurotrophic Factor Promotes Central Nervous System Myelination via a Direct Effect upon Oligodendrocytes.</a> Neurosignals. 18 (3), 186-202 (2010).</li><li>Lundgaard, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuregulin+and+BDNF+induce+a+switch+to+NMDA+receptor-dependent+myelination+by+oligodendrocytes.">Neuregulin and BDNF induce a switch to NMDA receptor-dependent myelination by oligodendrocytes.</a> PLoS Biology. 11 (12), e1001743 (2013).</li><li>Kleitman, N., W, P. M., Bunge, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Tissue culture methodes for the study of myelination. , (1991).</li><li>Xiao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+signal-regulated+kinase+1/2+signaling+promotes+oligodendrocyte+myelination+in+vitro.">Extracellular signal-regulated kinase 1/2 signaling promotes oligodendrocyte myelination in vitro.</a> J Neurochem. 122 (6), 1167-1180 (2012).</li><li>Wong, A. W., Xiao, J., Kemper, D., Kilpatrick, T. J., Murray, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendroglial+expression+of+TrkB+independently+regulates+myelination+and+progenitor+cell+proliferation.">Oligodendroglial expression of TrkB independently regulates myelination and progenitor cell proliferation.</a> The Journal of Neuroscience. 33 (11), 4947-4957 (2013).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cloning,+Characterization+and+Expression+of+miR-15a-3p+and+miR-15b-3p+in+Dairy+Cattle.">Molecular cloning, Characterization and Expression of miR-15a-3p and miR-15b-3p in Dairy Cattle.</a> Molecular and Cellular Probes. , (2014).</li><li>Emery, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelin+gene+regulatory+factor+is+a+critical+transcriptional+regulator+required+for+CNS+myelination.">Myelin gene regulatory factor is a critical transcriptional regulator required for CNS myelination.</a> Cell. 138 (1), 172-185 (2009).</li><li>Murai, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+receptor+TLX+stimulates+hippocampal+neurogenesis+and+enhances+learning+and+memory+in+a+transgenic+mouse+model.">Nuclear receptor TLX stimulates hippocampal neurogenesis and enhances learning and memory in a transgenic mouse model.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (25), 9115-9120 (2014).</li></ol>

The authors declare that there is no conflict of interest regarding this research.

Aksonların myelinizasyonuna omurgalıların merkezi ve çevresel sinir sistemlerinde optimal fonksiyonu için önemli bir işlemdir. miyelinli akson nesil ve bakım ve hücre dışı matriks proteinleri (Schwann hücreleri veya oligodendrositler itibaren) moleküler nöronal arasındaki etkileşimleri, glial içeren bir karmaşık ve koordineli bir süreçtir. Bu protokolün önemi ve uygulanabilirliği karışık ko-kültür ayarları içinde belirli bir hücre tipinde proteinlerin manipülasyonu izin vermesidir. Birden fazla hücre tipleri, belirli proteinlerin aktivitesini engellemek için künt farmakolojik araçlarını kullanarak, in vivo ve in vitro miyelinasyon tayininde hem miyelinasyona katılan veya sinyal yolları proteinler ya nöronal gelen miyelinasyona üzerine uyguladığı etkisi hakkında özel bilgiler sağlayamaz gibi ya glial perspektif, protein, benzersiz bir hücre tipi ile ifade edilir edilmiştir. Bu nedenle, in vitro olarak miyelinasyonoligodendroglial proteinler miyelinasyona üzerine uyguladığı etkileri sorgulamak için bize izin verir özellikle OPC uyum sağlamak Lentivirüste kullanımı ile bağlantılı olarak söylüyorlar. Biz başarıyla oligodendroglial sinyaller MSS miyelinasyonu 9 üzerinde sarf etkisini incelemek amacıyla özellikle in vitro miyelinasyon deneyi için oligodendrositler özellikle proteinleri aşırı ifade etmek 2K7 lentivirüs kullandık. In vitro miyelinasyon tayininde transdüse OPC tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için, optimizasyon inceleme ve OPC tohumlama yoluyla klonlama gelen protokolün her adım için gereklidir. Bu DNA düzeyinde, ilgi yapısının etiketli gen içeren pENTR vektör sıklıklandırılır zorunludur ve ilgi etiketli gen ile 2K7 DNA etiket ifadesi ve söz konusu gen için western blot tarafından kontrol edilmesi, virüs üretmek için DNA kullanılarak, önce. Ya HEK293Tcells veya HEK293 seçmek için esastırFT hücreleri virüs üretmek ve mikoplazma ücretsiz ortamda büyümek. Lentivirüs üretilmesinden sonra, OPC kullanmak için uygun bir seyreltme belirlemek için virüsün her parti titre etmek için önemlidir. Bu HEK293T hücrelere veya OPC viral seyreltilerde bir dizi ilave edilerek yapılabilir. 2K7 yapısı, her iki gen-faiz ve GFP içerdiğinden, transdüksiyon etkinliği floresan mikroskobu ile GFP ekspresyonu ile ve etiket ifadesi ve Batı benek analizi ile ilgili geni tahlil ile değerlendirilebilir. Mümkün olduğu kadar çok sayıda viral partiküller tek bir hücre enfekte için parlak GFP + hücreler daha yüksek virüs konsantrasyonu ile görünür hale gelecektir. Floresan mikroskobu ile GFP ekspresyonunun doğrulanması GFP virüs ve ifade titresi yararlı bir göstergedir, ancak ilgilenilen proteinin ekspresyonunu kontrol etmek için bir vekil olarak kullanılamaz. Her iki HEK293T hücrelerde ilgi konusu proteinin ekspresyonu seviyesini kontrol etmek için kritiktirve western blot analizi ile OPC. İlgi dahilindeki protein eş kültürlerinde nöronlar tarafından endojen olarak ifade edilirse western blot ile ko-kültür lisat analiz edilirken, OPC / OLS tarafından aşın maskelenebilir; böylece ko-kültür takdirde ilgilenilen proteinin ekspresyonu kardeş OPC kontrol edilebilir, böylece tohum aşağıdaki ilgi veya kültür kardeş OPC proteini etiketlemek için ya da önemlidir. deneyler başarılı olursa DRG ve OPC kültür hem de kalitesini doğrudan belirler. Kokültürünün ayarlarında, sıçan DRG nöronlarında sıçan veya fare türetilen OPC ile kültive edilebilir. OPC nazik ve hızlı kullanım gerektirir. Bu çok az etkili bir şekilde nöronlar üzerine tohum çok az sayıda hücre vardır, böylece OPC için toksik olan ilgi ve çok fazla virüs proteininin ifadesinin düşük düzeylerine yol açan OPC nakletmek için başarısız olarak OPC virüs titresi optimize etmek için önemlidir. Bu optimal transdüksiyon Hem Resul olabilirmiyelinasyon veya miyelin proteini ifade unanalyzable veya önemsiz değişiklikler t. Onlar konfluant üzerinde olmak ve yerel koşullara optimize edilmesi, kültürlü OPC ve transdük ihtiyaçlar dolayısıyla sayıda farklılaşmış sonra seribaşı olamaz eğer OPC ayırt. Bu, birden fazla deney içinde koşulları arasında karşılaştırılan miyelinli aksonal parça sayısına doğrudan karşılaştırma izin her miyelinasyon deneyi için OPC aynı sayıda tohum arzu edilir. Bu tekniğin önemli bir dezavantaj miyelinasyon tahlilleri arasında başlangıç ​​miyelinasyon seviyelerinde değişkenliktir. Viral transdüksiyon sonra, miyelinasyon bazal seviyede viral yönden enfekte OPC saf (dışı virüs tarafından enfekte edilmiş) OPC gibi myelinate olmadığını düşündürmektedir azaltılır. Bu, her bir deneyde bazal miyelinasyon için miyelinasyon nisbetle ölçüde miktarının aşılabilir. Bu nedenle, sadece GFP ifade eden boş vektör bir iç Contr olarak kullanılmalıdırol elde edilir. Miyelinasyon ek olarak, ilgi konusu bir protein ekspresyonu, miyelinasyon üzerinde dolaylı bir etkiye yol açan, örneğin hayatta kalma, yayılma ve farklılaşma gibi OPC diğer yönlerini etkileyebilir. Bu nedenle, örneğin hücre canlılığı gibi OPC davranış analizi miyelinasyonun deneyleri paralel olarak yapılmalıdır. Burada anlatılan viral transdüksiyon yöntemleri oligodendrosit miyelinasyon çalışma ile sınırlı değildir; aslında yaygın ve en iyi duruma getirme, bireysel hücre tipi için gerekli olabilir, örneğin Schwann hücrelerinin, astrositlerin, nöronlar gibi diğer hücre tipleri, uygulanabilir. Bu protokol, bir karma hücre kültür sistemi kullanırken özel avantajlara sahip arzu edilen bir hücre tipi, ilgi (doğal tipte veya mutant) bir proteinin seçici bir aşırı ifadesi ile çoğalması ve farklılaşması gibi hücre davranışını incelemek için büyük bir esneklik sunar. transdüksiyonu için kullanılan hücreler, sıçan ya da ya da izole edilebilirFare (yabani türü veya transgenik), böylece bir in vivo transgenik fare modeli kullanılarak daha tüketen elde etmek genellikle zordur transgenik hayvanlarda sinyalizasyon ve tazminat mekanizmaları hedeflenen çalışmada, ve çok daha fazla zaman izin. Son zamanlarda bulunan kanıtlar, lentiviral tabanlı strateji başarılı bir şekilde in vivo olarak, lentiviral yaklaşımlar kullanılarak oligodendroglial hücrelerin transduse güçlü bir potansiyel düşündürmektedir hayvan modellerinde 13 hücre transdüksiyonu için kullanılmış olduğunu göstermektedir. Sonuç olarak, OPC ve Lentiviral enfeksiyonu ile in vitro miyelinasyon tahlil birleştirerek miyelinasyona yer alan moleküler mekanizmaların analizi için stratejik bir araç sağlar. miyelinasyon spesifik proteinlerin rolü sorgulanır ve OPC sıçan DRG ko-kültürlerinde kullanılmak için sıçanlar ve fareler izole edilebilir, lentiviral yaklaşım, Mech sorgulamak için çeşitli fare hatları nakavt teknolojisi ile kombinasyon halinde de kullanılabilirmiyelinasyonun süreçlerinde tazminat nizmasıdır.

Aksonların myelinizasyonuna hem merkezi hem periferik sinir sisteminde aksiyon potansiyeli hızlı ve etkin iletimi için çok önemlidir. İhtisas hücreler, Schwann hücreleri, merkezi sinir sisteminde periferik sinir sistemi ve oligodendrositler olarak, etrafında sarın ve miyelin de ensheathe aksonlar, etkin bir sinir yalıtım ve saltatory iletimini 1 kolaylaştırılması. miyelinasyon işlemi, retinal ganglion nöronlarının 2, mühendislik nanolifler 3 ya da Schwann hücrelerinin 4 veya oligodendrosit 5-7 ya da birlikte kültürlenmiş Dorsal kök ganglion nöronlarının kullanılarak in vitro incelenebilir. in vitro miyelinasyon tahlil sinir sistemi miyelinasyonun eğitim için kurulmuş bir modeldir ve in vivo 5-8 miyelinasyona sırasında meydana temel süreçlerin birçok çoğaltır. Tahlil C OPC ile dorsal kök ganglion (DRG) nöronların saflaştırılmış popülasyonlarının kokültürü, (içerirNS myelinasyon) veya Schwann hücreleri (PNS miyelinasyona için). Belirli koşullar altında bu myelinating hücrelerin in vivo mevcut miyelin spesifik proteinlerin aynı tamamlayıcısı ifade plazma zarı yalıtım sipariş ultra yapısal doğrulanmış, çok katmanlı levha DRG aksonlar ensheathe. in vitro olarak merkezi sinir sistemi miyelin okuyan en yaygın olarak kullanılan hücre modeli başarılı bir şekilde bu nörotrofinlerin gibi dış faktörler, in vitro 5,6 CNS miyelinasyon üzerinde uyguladığı etkilerini incelemek için kullanılmıştır DRG nöronlarının ve OPC, ko-kültürler bir. Bu gibi büyüme faktörlerinin veya küçük molekül farmakolojik inhibitörleri olarak, dış faktörlerin yaygın DRG&#39;ye OPC kokültürünün modeli 7,9 ile miyelinasyon yolaklarını rolünü incelemek için kullanılmıştır. Ancak, nöronlar ve oligodendrositlerin hem de içeren karma ko-kültür ortamlarında, resmen mümkün kaldığını büyüme faktörleri veya phar yamacological inhibitörleri DRG nöronlar ve oligodendrosit (OL) hem üzerine etkileri sarf olabilirdi. Bu, özellikle proteinler DRG&#39;lerin sadece ifade veya oligodendroglia bu ikili hücre sistemini kullanarak miyelinasyona üzerine uyguladığı bu rolleri incelemek için yeteneği sunuyor. Tümden oligodendroglial sinyalizasyon yolunun doğrudan, in vitro miyelinasyon deneyi için DRG nöronlarının üzerine konmadan önce, yanı sıra, yabani tip ve mutant proteinlerin her ikisini fazla sentezleyen bir zarif bir yolu olduğu kanıtlanmıştır miyelinasyon, OPC lentiviral transdüksiyon düzenleyen olduğunu doğrulamak için oligodendrositler tarafından kurucu olarak ifade proteinlerin demonte ifadesi olarak. Böylece bu yaklaşım, özellikle sorguya ve miyelinasyonun 9,10 çalışmak için oligodendrositler içinde sinyal yolları işlemek için bir cadde sunuyor. Bu yazıda, biz bir lentiviral aracılığıyla seçici oligodendrositlerin ilgi bir protein aşın geliştirdik yöntemleri raporin vitro miyelinasyonun incelemek için yaklaşım. teknikler ilgi alanı dahilindeki geni içeren sentezleme vektörlerinin üretimi ile başlar, daha sonra daha sonra pENTR vektörü (pENTR L1-L2 pENTR4IRES2GFP) klonlanır bir vahşi tipli, yapısal olarak aktif bir veya baskın negatif formunda olsun. (Ilgili geni içeren) Bu vektör, CMV yükselticisi verici (pENTR L4-R1, pENTR-pDNOR CMV) ve 2K7 Lentivector CMV promotörünü içeren bir 2K7 vektör yapılandırmak için söz konusu genin bir üretilmesi için bir enzim reaksiyonu birleştirilir ensefalomiyokarditis ve GFP (Şekil 1). PMD2.G virüs kılıfının ve pBR8.91 virüs paketi ile birlikte, bu ağ klonlanmış 2K7 yapısı daha sonra OPC nakletmek için kullanılabilir lentivirüs oluşturmak için HEK293T hücrelerine ko-transfekte edilirler. Lentivirüs ile enfekte sonra OPC ilgi protein yüksek düzeyde ifade. Bu OPC sonra DRG nöron kültürleri üzerine ekilmiş ve etkisi ifadesi olduğunu edilebiliristenen proteinin yüksek düzeyde sorguya olabilir miyelinasyona üzerinde uygular. ko-kültürler Western blot analizi ile miyelin protein ifadesi için değerlendirilir ve immünositokimya miyelinli aksonal segmentlerin oluşumu için görünür hale getirilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="843">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Item</td>
			<td style="width:148px;">Manufacturer</td>
			<td style="width:99px;">Catalog #</td>
			<td style="width:183px;">Notes</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">2K7 lentivector&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kind gift from Dr Suter9</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5-Fluoro-2&#8242;-deoxyuridine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0503-100mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>115545205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ampicillin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9518-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">B27 - NeuroCul SM1 Neuronal Supplement</td>
			<td>Stem Cell Technologies&#160;</td>
			<td>5711</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BDNF (Human)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>PT450021000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Biotin (d-Biotin)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B4639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bradford Reagent</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B6916-500ML&#160;&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BSA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A4161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chloramphenicol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0378-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CNTF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-13020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAKO fluoresence mounting media</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>S302380-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM, High Glucose, Pyruvate, no Glutamine</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10313039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5025-375KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DPBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DPBS, calcium, magnesium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14040182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EBSS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14155063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EcoRI-HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Entry vectors for promoter and gene of interest</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Generate as per protocols 1-2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>12003C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forskolin&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F6886-50MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glucose (D-glucose)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol</td>
			<td>Chem Supply</td>
			<td>GL010-500M</td>
			<td>See stock solutions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat Anti-Mouse IgG</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>115005003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat Anti-Mouse IgM&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>115005020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat Anti-Rat IgG</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>112005167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hoechst 33342</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Igepal</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I3021-100ML&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Insulin&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I6634&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kanamycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>60615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Laminin&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>23017015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LB Medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>See stock solutions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LB-Agar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>See stock solutions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-cysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C-7477</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Leibovitz&#39;s L-15 Medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11415064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Glutamine- 200mM (100X) liquid</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LR Clonase II Plus enzyme</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12538-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM, NEAA, no Glutamine</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10370088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse &#945; &#946;III Tubulin&#160;</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G7121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse &#945;MBP (monoclonal)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Na pyruvate&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NAC</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A8199</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NcoI-HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3193S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NEBuffer 4</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B7004S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Neurobasal medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NGF (mouse)</td>
			<td>Alomone Labs</td>
			<td>N-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NT-3</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>&#160;450-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">O1 antibody - Mouse anti-O1</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB344</td>
			<td>Alternative if O1 hybridoma cells are unavailable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">O1 hybridoma cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Conditioned medium containing anti-O1 antibody to be used for immunopanning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">O4 antibody - Mouse anti-O4</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB345</td>
			<td>Alternative if O4 hybridoma cells are unavailable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">O4 hybridoma cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Conditioned medium containing anti-O4 antibody to be used for immunopanning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;Competent Cells</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A10460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">One Shot Stbl competent cells</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>C7373-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Papain Suspension</td>
			<td>Worthington/Cooper</td>
			<td>LS003126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">pBR8.91</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kind gift from Dr Denham10</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PDGF-AA (Human)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>PT10013A500&#160;&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin- Streptomycin 100X solution</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pENTRY4IRES2GFP</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11818-010&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pMD2.G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Poly-D-lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6407-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polyethylenimine (PEI)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>408727-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Poly-L-ornithine&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich&#160;</td>
			<td>P3655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Progesterone&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P8783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protease inhibitor tablet (Complete mini)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836153001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Proteinase K</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Supplied with Clonase enzyme</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Putrescine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P-5780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rabbit &#945; neurofilament</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB1987&#160;&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rabbit &#945;MBP (polyclonal)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ran2 hybridoma cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>TIB-119</td>
			<td>Conditioned medium containing anti-Ran2 antibody to be used for immunopanning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rat anti CD140A/PDGFRa antibody</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>558774</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SacII</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SOC medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Supplied with competent bacteria</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium selenite&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S5261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Spe I</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0133S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T4 DNA Ligase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T4 DNA Ligase Buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TE buffer pH8</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>See stock solutions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TNE lysis buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trace Elements B</td>
			<td>Cellgro&#160;</td>
			<td>99-175-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Transferrin (apo-Transferrin human)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton&#160;X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9201-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin Inhibitor From Chicken Egg White</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10109878001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin-EDTA (1X), phenol red (0.05%)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Unconjugated Griffonia Simplicifolia Lectin BSL-1</td>
			<td>Vector laboratories&#160;</td>
			<td>L-1100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Uridine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U3003-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production and use of lentivirus to selectively transduce primary oligodendrocyte precursor cells for in vitro myelination assays

Miyelinasyon nöronlar ve glial hücreleri oluşturan miyelin iki içeren karmaşık bir süreçtir, periferal sinir sisteminin (PNS), merkezi sinir sisteminde (CNS) oligodendrositler ve Schwann hücreleri. Biz bir in vitro miyelinasyon deneyi, in vitro MSS miyelinasyonun eğitim için kurulmuş bir modeli kullanın. Bunu yapmak için, ön-madde oligodendrosit hücreleri (OPC) Myelinating ko-kültürler oluşturmak üzere saflaştırılmış primer, kemirgen Dorsal kök ganglion (DRG) nöronlarının ilave edilir. Oligodendrositler tarafından ifade belirli proteinler miyelinasyona üzerine uygulamayın spesifik rolleri sorgulamak için biz seçici DRG nöronlar üzerine numaralı seribaşı önce yabani türü, yapısal olarak aktif veya dominant negatif proteinlerini aşın lentivirüs kullanarak OPC transduce protokolleri geliştirmiştir. Bu bize özellikle miyelinasyonun düzenleyen bu oligodendroglial proteinlerin rollerini sorgulamak için izin verir. protokolleri de ot çalışmaya uygulanabilirher hücre tipi, böylece bu tip bir sinyal ve dengeleme mekanizmaları arasında hedef çalışma için oligodendrositler gibi arzu edilen bir hücre tipi ile ifade edilen proteinlerin, seçici manipülasyonuna olanak veren bir yaklaşım sağlar. Sonuç olarak, lentiviral enfekte OPC ile in vitro miyelinasyon tahlil birleştirerek miyelinasyona yer alan moleküler mekanizmaların analizi için stratejik bir araç sağlar.

FLAG-etiketli hücre dışı sinyal ile ilişkili kinaz 1 (Flag-ERK1) enzim 2K7 yapıları ve virüs üretimi için gerekli olan ambalaj ve aksesuar yapılar, her iki dahil olmak üzere kullanılan yapıların, bir restriksiyon dijest ile doğrulanır lentivirüs üretimi için kullanılan yapı (Şekil 3) . <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/52179/52179fig3highres.jpg" /> Şekil 3: DNA yapısı doğrulama. Lentivirüs üretimi için gerekli olan bütün DNA yapıları, Stbl3 bakteriden saflaştırılmıştır ve sınırlama enzimi sindirimi ile doğrulanmıştır. Aksesuar ve paketleme vektörleri belirtilmiştir, ve kesilmemiş bir plazma (A) &#39;ya göre, Ncol ve EcoRI ile sindirildi. 2K7-GFP Spel ve Sacll (A) ile sindirilmiştir. 2K7-Flag-ERK1 DNA, tek başına Spel veya Sacll ile ya sindirimi ile doğrulanmıştır, ya da çift sindirmek (B) oldu. Bantlama desenleri vardımaymun yazılımı kullanarak yapı dizilerinin sanal sindirim oluşturulan beklenen desenleri ile karşılaştırıldığında. OPC kullanmak için uygun bir seyreltme belirlemek için Erk 1 lentivirüs HEK293T hücreleri (Şekil 4) titre edilmiştir. Bu viral HEK293T hücrelere seyreltileri, bir dizi ekleyerek yapılır (Şekiller 4A, 4C ve 4D) ve OPC (Şekil 4B) kadar edildi. Zaman (Şekil 4D) ile gen-faiz artışı ifade seviyeleri. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52179/52179fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/52179/52179fig4highres.jpg" /> Şekil 4: HEK293T hücreleri ve OPC Flag-ERK1 virüsü Titrasyon. Flag-ERK1 virüs HEK293T hücrelerinde titre edilmiştir (A, C, D) veya OPC (B). HEK293T hücreleri (A) ya da OPC (B), Flag-ERK1 virüs ile enfeksiyondan sonra GFP tanımı, 48 saat boyunca görüntülenmiştir. HEK293T hücre lizatları ERK1 ya da enfeksiyon, toplam ERK1 / 2 48 saat sonra, (C) &#39;nin mevcudiyetine karşılık sonda edilmiştir. HEK293T hücre lizatları bir yükleme kontrolü 48 saat veya Bayrak-ERK1 virüsü (D) ile enfeksiyondan sonra 96 saat olarak ya Bayrak varlığı, ERK1 / 2 ve Aktin için problanmıştır. Bu lekeler, tüm lekelenen ve iki zaman noktalarında (D) ifade seviyeleri doğrudan karşılaştırılmasını kolaylaştırmak için birlikte görüntülendi. (A) için ölçek çubuğu 100 mikron =. (B) için ölçek çubuğu 50 mikron =. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52179/52179fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Uygun virüs seyreltme belirlendikten sonra, saflaştırılmış OPC transgen sentezleme suff ulaşmasına izin verecek biçimde 48 saat en az enfekte edilmiş ve kültüre edildiicient kat, daha sonra miyelinasyon potansiyeli (Şekil 5) değerlendirmek için DRG nöronlarının ekilmiştir. DRG nöronlar üzerine numaralı seribaşı sonra, OPC oligodentrositlere ayırt ve batı lekeleme (Şekil 5C) tarafından değerlendirilebilir miyelin proteinleri, ifade başlayacak. Bazı olgun oligodendrositler myelinate olacak, ve bu MBP boyama (Şekil 5D) üzerinden görüntülenebilir. Aksonlar da myelinasyon düzeylerinin analiz edilmesi sırasında akson yoğunluğu dikkate alınır sağlamak için böyle Nörofilaman veya βIII-tubulin (Şekil 5D) ve bir marker ile boyanmış olması gerekir. <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/52179/52179fig5highres.jpg" /> Şekil 5: OPC DRG nöronlarının üzerine tohumlama yapılmadan önce 48 saat süre ile Flag-ERK1 virüsü ile enfekte edildi. Kardeş OPC sabit ve Bayrak ve GFP (A) için boyandı ya parçalanır ve doğrulamak için Bayrak ve ERK1 için problanmıştır yaviral aşın protein (C) &#39;nin ifadesi. Eş-kültür kültürde, 2 hafta sonra sabit ve βIII-tubulin ve MBP DRG aksonlar görselleştirmek ve myelinating gibi olmayan myelinating oligodendrositler (B) için boyandı. Bir Myelinating oligodendrosit ok-baş (B) ile gösterilir ok ve olmayan Myelinating oligodendrosit ile gösterilir. Paralel ko-kültürler çözülmüş ve ko-kültür (D) &#39;de transgen ekspresyonunu doğrulamak için, miyelin protein MBP ve MAG, hem de işaretle ve ERK1 / 2 için problanmıştır. ERK1 seviyelerinde bir artış, Lizatlar Ölçek çubuğu = 20 um mevcut DRG türetilmiş ERK1 büyük miktarlarda ko-kültür görülmemiştir. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Isim </td><td> Malzemeler </td><td> Notlar </td></tr><tr><td> TE Tamponu, pH 8 </td><td> 10 mM Tris, pH 8 1 mM EDTA, pH 8 </td><td> Iyonu giderilmiş su içinde tamamlanır. </td></tr><tr><td> Polietilenimin (PEI) </td><td> 1 g / l </td><td> -20 ° C&#39;de iyonu giderilmiş suda, filtre-sterilize ve mağaza stokları tamamlanır. </td></tr><tr><td> LB ortamında </td><td> 20 gr Tripton 10 g Maya özütü 10 gr NaCl </td><td> Iyonu giderilmiş su ile, 2 L tamamlanır </td></tr><tr><td> % 50 Gliserol stok </td><td> Gliserin </td><td> Iyonu giderilmiş su ve otoklav bir eşit hacmi ile tamamlanır </td></tr><tr><td> HEK 293, T hücre ortamı </td><td> DMEM % 10 Fetal Sığır Serumu % 1 Penisilin / streptomisin % 1 L-glutamin </td><td></td></tr><tr><td> TNE liziz tamponu </td><td> 10 mM Tris, pH 8 150 mM NaCI 1 mM EDTA, pH 8 % 1 NP-40 </td><td> Bu, su ile temas halinde kristalize olur ilk deiyonize su daha küçük bir hacimde NP40 içinde çözülür. Iyonu giderilmiş su içinde nihai hacme tamamlanır </td></tr><tr><td> M1 </td><td> MEM % 10 Fetal Sığır Serumu % 0.4, D-glukoz 2 nM L-glutamat % 1 Penisilin / streptomisin </td><td> Sıçan DRG nöronlar ile kullanım için </td></tr><tr><td> MM1 </td><td> Neuro temelli vasat 2% B27 (SM1) ek % 0.4, D-glukoz 2 nM L-glutamat % 1 Penisilin / streptomisin </td><td> Fare DRG nöronlar ile kullanım için </td></tr><tr><td> M2 </td><td> DMEM 10 mg / ml transferin 5 mg / L İnsülin 20 nM progesteron 100 uM Putresin 10 uM FDU 10 uM Üridin </td><td> 1-2 ay içinde kullanılmak üzere bir büyük hacimli FDU olmadan DMEM ve üridinin M2 Makyaj. 2 hafta içinde bitmiş olabilir küçük birimlere FDU ve üridin ekle </td></tr><tr><td> MM2 </td><td> MM1 10 uM FDU 10 uM Üridin </td><td> 2 hafta içinde bitmiş olabilir ortamın küçük hacimleri FDU ve üridin ekleyin. </td></tr><tr><td> 10x MT-PBS, pH 7.4 </td><td> 28,48 g / L (160 mM) 2 Na HPO 4 · 2H 2 O 5.52 g / L (40 mM) NaH 2 PO 4 · H 2 O 87,66 g / L (1.5 M), NaCI </td><td> Iyonu giderilmiş su ilave edin ve 10 N NaOH ile 7.4&#39;e pH ayarlamak </td></tr><tr><td> 1x MT-PBS </td><td> 10x MT-PBS Deiyonize su </td><td> 1x MT-PBS için deiyonize su içinde 10 kat MT-PBS 1:10 seyreltin </td></tr><tr><td> 10x Borat tamponu (1.5 M) </td><td> 18.55 gr Borik asit 1x MT-PBS </td><td> 150 mi 1x MT-PBS içinde, borik asit içinde çözülür. 10 N NaOH ile pH 8.56 ayarlayın ve 1x MT-PBS ile 200 ml son hacim. Otoklav </td></tr><tr><td> 1x Borat tamponu (0.15 M) </td><td> 10x Borat tamponu 1x MT-PBS </td><td> PLN çözülmesi için, bu tampon 100 ml hazırlayın. 10 mi 10x borat tampon (pH 8.56) ve 1x MT-PBS, 90 ml ekle </td></tr><tr><td> 0.5 mg / ml poli-L-ornitin (PLN) </td><td> 50mg Poli-L-ornitin hidrobromid 0.15 M Borat tamponu (pH 8.56) </td><td> 1x borat tamponu, 100 ml poli-L-ornitin hidrobromid 50 mg eritin. En fazla bir ay için 4 ° C&#39;de filtre sterilize edin (0.22 um filtre) ve mağaza </td></tr><tr><td> 100x Poly-D-lisin (PDL) </td><td> 5 mg Poli-D-lizin Steril deiyonize su </td><td> 100x PDL stokları tek kullanımlık parçalar halinde -20 ° C de dondurulabilir. Kullanım sırasında, steril, de-iyonize su içinde 1x seyreltilmiş </td></tr><tr><td> Papain tampon </td><td> Tablo 2 görün </td><td></td></tr><tr><td> Dnaz </td><td> 12,500 U DNase I 1 mi EBSS </td><td> Buz üzerinde, soğutulmuş EBSS&#39;ye 1 ml Dnaz I çözülür. Kısım (örneğin, 300 ul / tüp) ve -20 ° C&#39;de gece boyunca dondurma. -20 ° C&#39;de saklayın. </td></tr><tr><td> % 4 BSA </td><td> 8 g BSA 200 mi DPBS </td><td> 37 ° C&#39;de 150 mi, DPBS içinde BSA içinde çözülür. ~ Ile 7.4&#39;e pH ayarlama1 N NaOH ile 1 mi. 200 ml hacim kazandırın. Sterilize etmek için 0.22 um filtre içinden filtre. -20 ° C&#39;de 1 ml&#39;lik numuneler hazırlayın ve mağaza olun. </td></tr><tr><td> 10x Lo ovomukoid </td><td> 3 g BSA 200 mi DPBS 3 g tripsin inhibitörü </td><td> 150 ml DPBS için BSA ekleyin ve iyice karıştırın. Tripsin önleyici ilave edin ve eritmek için karıştırın. PH&#39;ı 7.4&#39;e ayarlamak için 1 N NaOH ~ 1 ml ilave edilir. DPBS ile 200 ml hacim getirin. 0.22 um&#39;lik bir filtreden filtre-sterilize edin. -20 ° C&#39;de 1 ml&#39;lik numuneler hazırlayın ve mağaza olun. </td></tr><tr><td> 6x Merhaba ovomukoid </td><td> 6 g BSA 200 mi DPBS 6 g tripsin önleyicisi </td><td> 150 ml DPBS için BSA ekleyin ve iyice karıştırın. Tripsin önleyici ilave edin ve eritmek için karıştırın. PH&#39;ı 7.4&#39;e ayarlamak için 1 N NaOH ~ 1 ml ilave edilir. DPBS ile 200 ml hacim getirin. 0.22 um&#39;lik bir filtreden filtre-sterilize edin. -20 ° C&#39;de 1 m alikotları ve mağaza olun. </td></tr><tr><td> SATO baz </td><td> Tablo 3 görün </td><td&gt; </td></tr><tr><td> SATO medya (sıçan) </td><td> 1% SATO baz % 1 Penisilin / streptomisin 1%, 0.5 mg / mL arasında insülin % 1 L-Glutamin % 0.1 NAC % 0.1 Biyotin DMEM ve filtre sterilize ile yapın. </td><td></td></tr><tr><td> SATO medya (fare) </td><td> 1% SATO baz 1%, 0.5 mg / ml insülin % 1 Penisilin / streptomisin % 1 L-Glutamin % 0.1 NAC % 0.1 Biyotin % 0.1 İz Elementler B % 2 B27 DMEM ve filtre sterilize ile yapın. </td><td></td></tr><tr><td> Ensülin </td><td> 10 mg insülin 20 mi steril deionzed su </td><td> Iyonu giderilmiş su insülin ekleyin ve insülin çözünmesi için 1 N HCI, 100 ul ilave edin. İyice karıştırın. 4-6 hafta süre ile, 4 ° C&#39;de bir 0.22 mikron filtre ve mağaza Filtre </td></tr><tr><td> NAC (N-asetil-L-sistein) </td><td> 5 mg / ml NAC DMEM </td><td> 5 mg için DMEM&#39;de NAC çözülür/ Ml -20 ° C&#39;de çözelti, belirtilen miktar ve saklayın. </td></tr><tr><td> Cı-Biyotin </td><td> / Ml biyotin 50 ug Steril deiyonize su </td><td> -20 ° C&#39;de 50 ug / ml solüsyon, bir kısım ve mağaza yapmak için su içinde biotin eritin. </td></tr><tr><td> CNTF (siliyer nörotrofik faktör) </td><td> 10 ug / ml CNTF DPBS içinde% 0.2 BSA </td><td> DPBS steril% 0.2 BSA ile 10 ug / ml çözelti yapmak için CNTF seyreltin. Kısım, -80 ° C&#39;de, sıvı azotun ve deposunda flaş dondurma. </td></tr><tr><td> PDGF (platelet türevli büyüme faktörü) </td><td> 10 ug / ml, PDGF DPBS içinde% 0.2 BSA </td><td> DPBS steril% 0.2 BSA ile 10 ug / ml (üreticinin talimatlarına göre hazırlanmıştır), PDGF, ana stokunu. Kısım, -80 ° C&#39;de, sıvı azotun ve deposunda flaş dondurma. </td></tr><tr><td> NT3 (nörotrofin-3) </td><td> 1 ug / ml, NT-3 DPBS içinde% 0.2 BSA </td><td> NT3 ana stoc seyreltink, DPBS steril% 0.2 BSA ile 1 ug / ml olacak şekilde (üreticinin talimatlarına göre hazırlanmıştır). Kısım, -80 ° C&#39;de, sıvı azotun ve deposunda flaş dondurma. </td></tr><tr><td> Forskolin </td><td> 50 mg Forskolin Steril DMSO </td><td> Forskolin 50 mg şişesine 1 ml steril DMSO ilave edin ve tamamen tekrar süspansiyon iyice karıştırın. 15 ml&#39;lik bir tüpe aktarın ve 4.2 mg / ml&#39;lik bir konsantrasyona ulaşmak için 11 ml steril DMSO ilave edin. -20 ° C&#39;de kısım ve mağaza. </td></tr></tbody></table> Tablo 3. Stok çözümleri.

Watch this Scientific Journal Video about Production and Use of Lentivirus to Selectively Transduce Primary Oligodendrocyte Precursor Cells for In Vitro Myelination Assays at JoVE.com

Production and Use of Lentivirus to Selectively Transduce Primary Oligodendrocyte Precursor Cells for In Vitro Myelination Assays

Here we present protocols that offer a flexible and strategic foundation for virally manipulating oligodendrocyte precursor cells to overexpress proteins of interest in order to specifically interrogate their role in oligodendrocytes via the in vitro model of central nervous system myelination.

Üretim ve seçici transduce İlköğretim Oligodendrosit Öncü Hücreler için Lentivirüste kullanımı için<em&gt; İn Vitro</em&gt; Myelinasyon Tahliller

Myelination is a complex process that involves both neurons and the myelin forming glial cells, oligodendrocytes in the central nervous system (CNS) and ...

production-use-lentivirus-to-selectively-transduce-primary

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Production and Use of Lentivirus to Selectively Transduce Primary Oligodendrocyte Precursor Cells for In Vitro Myelination Assays

14.4K Görüntüleme.  The University of Melbourne. Here we present protocols that offer a flexible and strategic foundation for virally manipulating oligodendrocyte precursor cells to overexpress proteins of interest in order to specifically interrogate their role in oligodendrocytes via the in vitro model of central nervous system myelination.

Video: Production and Use of Lentivirus to Selectively Transduce Primary Oligodendrocyte Precursor Cells for In Vitro Myelination Assays

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T cell replacement in lymphopenic patients. We studied thymic settling progenitors from murine embryonic day 13 and 18 thymi by two complementary in vitro and in vivo techniques, both based on the &#8220;hanging drop&#8221; method. This method allowed colonizing irradiated fetal thymic lobes with E13 and/or E18 thymic progenitors distinguished by CD45 allotypic markers and thus following their progeny. Colonization with mixed populations allows analyzing cell autonomous differences in biologic properties of the progenitors while colonization with either population removes possible competitive selective pressures. The colonized thymic lobes can also be grafted in immunodeficient male recipient mice allowing the analysis of the mature T cell progeny in vivo, such as population dynamics of the peripheral immune system and colonization of different tissues and organs. Fetal thymic organ cultures revealed that E13 progenitors developed rapidly into all mature CD3+ cells and gave rise to the canonical &#947;&#948; T cell subset, known as dendritic epithelial T cells. In comparison, E18 progenitors have a delayed differentiation and were unable to generate dendritic epithelial T cells. The monitoring of peripheral blood of thymus-grafted CD3-/- mice further showed that E18 thymic settling progenitors generate, with time, larger numbers of mature T cells than their E13 counterparts, a feature that could not be appreciated in the short term fetal thymic organ cultures.

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

This article describes in vivo and in vitro methodology to characterize the thymic settling progenitors by the analysis of the kinetics of generation, phenotype and numbers of their T cell progeny.

Timus Karakterizasyonu kullanma Fare Embriyo atalarıdır Settling<em&gt; In Vivo</em&gt; Ve<em&gt; In Vitro</em&gt; Tahliller

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T ...

Gelişim Biyolojisi

In Vitro Colony Assays for Characterizing Tri-potent Progenitor Cells Isolated from the Adult Murine Pancreas

Stem and progenitor cells from the adult pancreas could be a potential source of therapeutic beta-like cells for treating patients with type 1 diabetes. However, it is still unknown whether stem and progenitor cells exist in the adult pancreas. Research strategies using cre-lox lineage-tracing in adult mice have yielded results that either support or refute the idea that beta cells can be generated from the ducts, the presumed location where adult pancreatic progenitors may reside. These in vivo cre-lox lineage-tracing methods, however, cannot answer the questions of self-renewal and multi-lineage differentiation-two criteria necessary to define a stem cell. To begin addressing this technical gap, we devised 3-dimensional colony assays for pancreatic progenitors. Soon after our initial publication, other laboratories independently developed a similar, but not identical, method called the organoid assay. Compared to the organoid assay, our method employs methylcellulose, which forms viscous solutions that allow the inclusion of extracellular matrix proteins at low concentrations. The methylcellulose-containing assays permit easier detection and analyses of progenitor cells at the single-cell level, which are critical when progenitors constitute a small sub-population, as is the case for many adult organ stem cells. Together, results from several laboratories demonstrate in vitro self-renewal and multi-lineage differentiation of pancreatic progenitor-like cells from mice. The current protocols describe two methylcellulose-based colony assays to characterize mouse pancreatic progenitors; one contains a commercial preparation of murine extracellular matrix proteins and the other an artificial extracellular matrix protein known as a laminin hydrogel. The techniques shown here are 1) dissociation of the pancreas and sorting of CD133+Sox9/EGFP+ ductal cells from adult mice, 2) single cell manipulation of the sorted cells, 3) single colony analyses using microfluidic qRT-PCR and whole-mount immunostaining, and 4) dissociation of primary colonies into single-cell suspensions and re-plating into secondary colony assays to assess self-renewal or differentiation.

In Vitro Colony Assays for Characterizing Tri-potent Progenitor Cells Isolated from the Adult Murine Pancreas

In vitro colony assays to detect self-renewal and differentiation of progenitor cells isolated from adult murine pancreas are devised. In these assays, pancreatic progenitors give rise to cell colonies in 3-dimensional space in methylcellulose-containing semi-solid medium. Protocols for handling single cells and characterization of individual colonies are described.

In Vitro Colony Tahliller Tri-güçlü Progenitör Hücreleri karakterize Yetişkin Fare Pankreas İzole

Stem and progenitor cells from the adult pancreas could be a potential source of therapeutic beta-like cells for treating patients with type 1 diabetes. ...

Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting occurs. Loss of muscle mass and function is associated with muscle fiber type atrophy, fiber type switching, defective muscle regeneration associated with dysfunction of satellite cells, muscle stem cells, and other pathophysiological processes. These changes are associated with changes in intracellular as well as local and systemic niches. In addition to most commonly used rodent models of muscle ageing, there is a need to study muscle homeostasis and wasting using human models, which due to ethical implications, consist predominantly of in vitro cultures. Despite the wide use of human Myogenic Progenitor Cells (MPCs) and primary myoblasts in myogenesis, there is limited data on using human primary myoblast and myotube cultures to study molecular mechanisms regulating different aspects of age-associated muscle wasting, aiding in the validation of mechanisms of ageing proposed in rodent muscle. The use of human MPCs, primary myoblasts and myotubes isolated from adult and aged people, provides a physiologically relevant model of molecular mechanisms of processes associated with muscle growth, atrophy and regeneration. Here we describe in detail a robust, inexpensive, reproducible and efficient protocol for the isolation and maintenance of human MPCs&#160;and their progeny&#160;&#8212; myoblasts and myotubes from human muscle samples using enzymatic digestion. Furthermore, we have determined the passage number at which primary myoblasts from adult and aged people undergo senescence in an in vitro culture. Finally, we show the ability to transfect these myoblasts and the ability to characterize their proliferative and differentiation capacity and propose their suitability for performing functional studies of molecular mechanisms of myogenesis and muscle wasting in vitro.

This protocol describes a robust, reproducible and simple method of isolation and culture of myoblast progenitor cells from the skeletal muscle of adult and aged people. The muscles used here include foot and leg muscles. This approach enables the isolation of an enriched population of primary myoblasts for functional studies.

Yetişkin ve Yaşlı İnsanların İskelet Kası miyojenik Öncü Hücreler / İlköğretim miyoblastların hazırlanması ve Kültür

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting ...

Reprogramming Primary Amniotic Fluid and Membrane Cells to Pluripotency in Xeno-free Conditions

Autologous cell-based therapies got a step closer to reality with the introduction of induced pluripotent stem cells. Fetal stem cells, such as amniotic fluid and membrane mesenchymal stem cells, represent a unique type of undifferentiated cells with promise in tissue engineering and for reprogramming into iPSC for future pediatric interventions and stem cell banking. The protocol presented here describes an optimized procedure for extracting and culturing primary amniotic fluid and membrane mesenchymal stem cells and generating episomal induced pluripotent stem cells from these cells in fully chemically defined culture conditions utilizing human recombinant vitronectin and the E8 medium. Characterization of the new lines by applying stringent methods &#8211; flow cytometry, confocal imaging, teratoma formation and transcriptional profiling &#8211; is also described. The newly generated lines express markers of embryonic stem cells &#8211; Oct3/4A, Nanog, Sox2, TRA-1-60, TRA-1-81, SSEA-4 &#8211; while being negative for the SSEA-1 marker. The stem cell lines form teratomas in scid-beige mice in 6-8 weeks and the teratomas contain tissues representative of all three germ layers. Transcriptional profiling of the lines by submitting global expression microarray data to a bioinformatic pluripotency assessment algorithm deemed all lines pluripotent and therefore, this approach is an attractive alternative to animal testing. The new iPSC lines can readily be used in downstream experiments involving the optimization of differentiation and tissue engineering.

This protocol describes the reprogramming of primary amniotic fluid and membrane mesenchymal stem cells into induced pluripotent stem cells using a non-integrating episomal approach in fully chemically defined conditions. Procedures of extraction, culture, reprogramming, and characterization of the resulting induced pluripotent stem cells by stringent methods are detailed.

Birincil amniyotik sıvı ve membran hücreler Pluripotent Xeno-Alerjik koşullarında için yeniden programlama

Autologous cell-based therapies got a step closer to reality with the introduction of induced pluripotent stem cells. Fetal stem cells, such as amniotic ...

Rapid Detection of Neurodevelopmental Phenotypes in Human Neural Precursor Cells (NPCs)

Human brain development proceeds through a series of precisely orchestrated processes, with earlier stages distinguished by proliferation, migration, and neurite outgrowth; and later stages characterized by axon/dendrite outgrowth and synapse formation. In neurodevelopmental disorders, often one or more of these processes are disrupted, leading to abnormalities in brain formation and function. With the advent of human induced pluripotent stem cell (hiPSC) technology, researchers now have an abundant supply of human cells that can be differentiated into virtually any cell type, including neurons. These cells can be used to study both normal brain development and disease pathogenesis. A number of protocols using hiPSCs to model neuropsychiatric disease use terminally differentiated neurons or use 3D culture systems termed organoids. While these methods have proven invaluable in studying human disease pathogenesis, there are some drawbacks. Differentiation of hiPSCs into neurons and generation of organoids are lengthy and costly processes that can impact the number of experiments and variables that can be assessed. In addition, while post-mitotic neurons and organoids allow the study of disease-related processes, including dendrite outgrowth and synaptogenesis, they preclude the study of earlier processes like proliferation and migration. In neurodevelopmental disorders, such as autism, abundant genetic and post-mortem evidence indicates defects in early developmental processes. Neural precursor cells (NPCs), a highly proliferative cell population, may be a suitable model in which to ask questions about ontogenetic processes and disease initiation. We now extend methodologies learned from studying development in mouse and rat cortical cultures to human NPCs. The use of NPCs allows us to investigate disease-related phenotypes and define how different variables (e.g., growth factors, drugs) impact developmental processes including proliferation, migration, and differentiation in only a few days. Ultimately, this toolset can be used in a reproducible and high-throughput manner to identify disease-specific mechanisms and phenotypes in neurodevelopmental disorders.

Rapid Detection of Neurodevelopmental Phenotypes in Human Neural Precursor Cells NPCs

Neurodevelopmental processes such as proliferation, migration, and neurite outgrowth are often perturbed in neuropsychiatric diseases. Thus, we present protocols to rapidly and reproducibly assess these neurodevelopmental processes in human iPSC-derived NPCs. These protocols also allow the assessment of the effects of relevant growth factors and therapeutics on NPC development.

Hızlı algılama nörogelişimsel fenotipleri insan sinir habercisi hücrelerdeki (NPCs)

Human brain development proceeds through a series of precisely orchestrated processes, with earlier stages distinguished by proliferation, migration, and ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain and protect cellular identities. The conversion of germ cells into specific neurons in the nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a powerful tool for performing genetic screens in order to dissect regulatory pathways that safeguard established cell identities. Reprogramming of germ cells to a specific type of neurons termed ASE requires transgenic animals that allow broad over-expression of the Zn-finger transcription factor (TF) CHE-1. Endogenous CHE-1 is expressed exclusively in two head neurons and is required to specify the glutamatergic ASE neurons fate, which can easily be visualized by the gcy-5prom::gfp reporter. A trans gene containing the heat-shock promoter-driven che-1 gene expression construct allows broad mis-expression of CHE-1 in the entire animal upon heat-shock treatment. The combination of RNAi against the chromatin-regulating factor LIN-53 and heat-shock-induced che-1 over-expression leads to reprogramming of germ cell into ASE neuron-like cells. We describe here the specific RNAi procedure and appropriate conditions for heat-shock treatment of transgenic animals in order to successfully induce germ cell to neuron conversion.

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

This protocol describes how to study cellular processes during cell fate conversion in Caenorhabditis elegans in vivo. Using transgenic animals, allowing heat-shock promoter-driven overexpression of the neuron fate-inducing transcription factor CHE-1 and RNAi-mediated depletion of the chromatin-regulating factor LIN-53 germ cell to neuron reprogramming can be observed in vivo.

Uygulama için yeniden programlamak Germ hücreleri için C. elegans nöronlarda RNAi ve transkripsiyon faktörü ifade ısı şok bağlı

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause disease when disrupted. Scientists have developed clever techniques to investigate characteristics and natural dynamics of these cells within intact tissue by expressing fluorescent proteins in subsets of cells. However, at times, experiments require more selected visualization of cells within the tissue, sometimes at the single-cell or population-of-cells manner. To achieve this and visualize single cells within a population of cells, scientists have utilized single-cell photoconversion of fluorescent proteins. To demonstrate this technique, we show here how to direct UV light to an Eos-expressing cell of interest in an intact, living zebrafish. We then image those photoconverted Eos+ cells 24 h later to determine how they changed in the tissue. We describe two techniques: single cell photoconversion and photoconversions of populations of cell. These techniques can be used to visualize cell-cell interactions, cell-fate and differentiation, and cell migrations, making it a technique that is applicable in numerous biological questions.

Here, we present a protocol to show how cell photoconversion is achieved through UV exposure to specific areas expressing the fluorescent protein, Eos, in living animals.

Yaşam sağlam Zebra balığı tek hücreli Photoconversion

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Isolation of Human Endometrial Stromal Cells for In Vitro Decidualization

The differentiation of human endometrial stromal cells (HESC) from fibroblast-like appearance into secretory decidua is a transformation required for embryo implantation into the uterine lining of the maternal womb. Improper decidualization has been established as a root cause for implantation failure and subsequent early embryo miscarriage. Therefore, understanding the molecular mechanisms underlying decidualization is advantageous to improving the rate of successful births. In vivo based studies of artificial decidualization are often limiting due to ethical dilemmas associated with human research, as well as translational complications within animal models. As a result, in vitro assays through primary cell culture are often utilized to explore the modulation of decidualization via hormones. This study provides a detailed protocol for the isolation of HESC and subsequent artificial decidualization via the supplementation of hormones to the culturing medium. Further, this study provides a well-designed method to knockdown any gene of interest by utilizing lipid-based siRNA transfections. This protocol permits the optimization of culture purity as well as product yield, thereby maximizing the ability to utilize this model as a reliable method to understand the molecular mechanisms underlying decidualization, and the subsequent quantification of secreted agents by decidualized endometrial stromal cells.

Isolation of Human Endometrial Stromal Cells for In Vitro Decidualization

This study presents a validated and optimized procedure for the isolation and culture of human endometrial stromal cells to conduct in vitro decidualization assay. Further, this study provides a detailed method to efficiently knockdown a specific gene using siRNAs in human endometrial stromal cells.

Vitro Decidualization için insan endometrium Stromal hücre izolasyon

The differentiation of human endometrial stromal cells (HESC) from fibroblast-like appearance into secretory decidua is a transformation required for ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and chromosome dynamics. While the germline is an excellent model, the analysis is often two dimensional due to the time and labor required for three-dimensional analysis. Major readouts in such studies are the number/position of nuclei and protein distribution within the germline. Here, we present a method to perform automated analysis of the germline using confocal microscopy and computational approaches to determine the number and position of nuclei in each region of the germline. Our method also analyzes germline protein distribution that enables the three-dimensional examination of protein expression in different genetic backgrounds. Further, our study shows variations in cytoskeletal architecture in distinct regions of the germline that may accommodate specific spatial developmental requirements. Finally, our method enables automated counting of the sperm in the spermatheca of each germline. Taken together, our method enables rapid and reproducible phenotypic analysis of the C. elegans germline.

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

We present an automated method for three-dimensional reconstruction of the Caenorhabditis elegans germline. Our method determines the number and position of each nucleus within the germline and analyses germline protein distribution and cytoskeletal structure.

Çekirdeklerin dağıtım, proteinler ve sitoiskeleti çalışmaya Caenorhabditis elegans Germline sayısal analizi

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Induction and Validation of Cellular Senescence in Primary Human Cells

Cellular senescence is a state of permanent cell cycle arrest activated in response to different damaging stimuli. Activation of cellular senescence is a hallmark of various pathophysiological conditions including tumor suppression, tissue remodeling and aging. The inducers of cellular senescence in vivo are still poorly characterized. However, a number of stimuli can be used to promote cellular senescence ex vivo. Among them, most common senescence-inducers are replicative exhaustion, ionizing and non-ionizing radiation, genotoxic drugs, oxidative stress, and demethylating and acetylating agents. Here, we will provide detailed instructions on how to use these stimuli to induce fibroblasts into senescence. This protocol can easily be adapted for different types of primary cells and cell lines, including cancer cells. We also describe different methods for the validation of senescence induction. In particular, we focus on measuring the activity of the lysosomal enzyme Senescence-Associated &#946;-galactosidase (SA-&#946;-gal), the rate of DNA synthesis using 5-ethynyl-2&#39;-deoxyuridine (EdU) incorporation assay, the levels of expression of the cell cycle inhibitors p16 and p21, and the expression and secretion of members of the Senescence-Associated Secretory Phenotype (SASP). Finally, we provide example results and discuss further applications of these protocols.

Here, we discuss a series of protocols for induction and validation of cellular senescence in cultured cells. We focus on different senescence-inducing stimuli and describe the quantification of common senescence-associated markers. We provide technical details using fibroblasts as a model, but the protocols can be adapted to various cellular models.

İndüksiyon ve birincil insan hücrelerinde hücresel yaşlanma doğrulama

Cellular senescence is a state of permanent cell cycle arrest activated in response to different damaging stimuli. Activation of cellular senescence is a ...