Bu araştırma Ulusal Sağlık Enstitüleri hibe (R01-DE025985) ve bir Amerikan Kanser Derneği araştırma bilim adamı Ödülü (RSG-13-383-MPC) tarafından desteklenmiştir. Bu eser, Davis de ABD Tarım Bakanlığı (2015-67015-23268 ve 2014-67015-21787) ve University of California, yeni araştırma girişimi bursu gelen hibe tarafından desteklenmiştir.

Dikkat: Bu yordamda kullanılan hücre hatları bulaşıcı virüs içerebilir, dikkatli olun ve yalnızca düzey 2 BSL tesis veya daha yüksek devam edin.
1. hücre hazırlık ve bakım
<ol><li>Kültür TREx-K-RTA BCBL-1 hücreleri (veya başka bir KSHV enfekte PEL hücre hatları) RPMI1640 orta % 15 fetal sığır serum (FBS) ve % 1 penisilin streptomisin glutamin çözüm ile desteklenmiştir.</li>
	<li>Sürekli olarak büyümeye ve 2 – 4 günde 1:4 oranında tarafından hücreleri bölmek için emin hücreleri ile %5 karbondioksit (CO2), 37 ° C'de büyümek.</li>
	<li>Hücre kültürleri iyi hücre büyümesini ve hücre kültürü yeniden başlatmak veya hücre kültür koşullar buna göre ayarlamak için tavsiye edilir Morfoloji, aksi takdirde onaylamak için her gün bir ışık mikroskobu ile izleyin.</li>
</ol>2. timidin eşitleme ve litik indüksiyon
<ol><li>Bir 10 cm Petri dish, plaka TREx-K-Rta BCBL-1 hücrelerde taze hazırlanan medya (1 x 106 hücreler/2 mL medya)</li>
	<li>200 mM timidin ekleyin (son konsantrasyonu: 2 mM) çanak, mix ve 18 h için kuluçkaya.</li>
	<li>500 x g., 5 min için hücreleri steril 1 fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) x hücrelerle yıkama, tekrar santrifüj kapasitesi ve taze hazırlanmış medya hücrelerde resuspend santrifüj. Toplam 3 yıkama için işlemi yineleyin. Taze hazırlanmış medyada resuspend.</li>
	<li>Hücreler için 8 h S-faz çıkmak izin verir.</li>
	<li>Timidin ekleyin (son konsantrasyonu: 2 mM), mix ve 16 h için kuluçkaya.</li>
	<li>500 x g., 5 min için hücreleri steril 1 fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) x hücrelerle yıkama, tekrar santrifüj kapasitesi ve taze hazırlanmış medya hücrelerde resuspend santrifüj. Toplam 3 yıkama için işlemi yineleyin. Taze hazırlanmış medyada resuspend.</li>
	<li>Viral reaktivasyonu ikna etmek için 12-O-tetradecanoyl-phrobol-13-acetate (TPA, son konsantrasyonu 20 ng/mL) ve Doksisiklin (DOX, nihai toplama 100 ng/mL) hücre kültürü ekleyin, karıştırın ve 4 h için kuluçkaya. K-Rta indüklenebilir kaset olmadan hücre hatlarında TPA (son konsantrasyonu 20 ng/mL ve sodyum bütrat (1 mM)) kullanarak yeniden etkinleştirme teşvik.</li>
	<li>500 x g., 5 min için hücreleri steril 1 fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) x hücrelerle yıkama, tekrar santrifüj kapasitesi ve komple kültür medya hücrelerde resuspend santrifüj. Toplam 3 yıkama için işlemi yineleyin. Tam kültür medyada resuspend.</li>
	<li>Hücreler için 24 h büyümeye izin.</li>
</ol>3. fiksasyon ve Permeabilization
Not: devam etmeden önce sabitleme çözüm (% 3.7 formaldehit DEPC tedavi PBS), Dietil pyrocarbonate tedavi fosfat tamponlu tuz çözeltisi (DEPC-PBS), glisin DEPC PBS olun (glycine son konsantrasyonu: 100 mM) ve permeabilizating çözüm (% 50 aseton, % 50 metanol) hazırlanır. Genellikle, her slayt en az 0,5 milyon hücre gerektirir, gerekirse çarp ve özellikle hücreleri sağlıklı olmayan ilave hücreler için arka kadar içerir.
<ol><li>Hücreleri bir 1.5 mL microcentrifuge tüpüne toplamak.</li>
	<li>Hücreler için 200 x g. yıkama, 2 dk santrifüj kapasitesi 3 kez ile 1 mL steril DEPC PBS hücreleri. 1.2 mL DEPC PBS resuspend.</li>
	<li>(Deneysel Kur tarafından belirlenen) coverslips uygun sayıda 6-şey plaka dipleri yerleştirin.</li>
	<li>Her coverslip DEPC PBS karışımı hücrenin 200 µL pipet, en az 0,5 milyon hücre her slayt üzerinde olduğundan emin olun. Hücreler 2 min için yerleşmek izin ve aşırı DEPC hücreleri sadece ince bir tabaka bırakarak PBS Aspire edin. Bu süreçte kaldırılacak hücreleri normaldir. Dikkat: PFA toksik, uygun koruma giymek.</li>
	<li>Dikkatli bir şekilde çözüm (DEPC PBS % 3.7 formaldehit) her kapak kayma sabitleme 1 mL ekleyin. 10 dakikadır düzeltmek hücreleri izin.</li>
	<li>Coverslips 3 kez DEPC PBS ile yıkayın.</li>
	<li>Dikkatle glisin DEPC PBS 1 mL ekleyin (glycine son konsantrasyonu: 100 mM) her kapak kayma. 5 min için gidermek için hücreleri izin.</li>
	<li>Bir shaker 5 min için üzerinde DEPC PBS ve iki yerde 1,5 mL ekleyin veya sıkıca ama hafifçe el 1 dk. aspiratı aşırı DEPC PBS sallamayın. Hücreleri bozmaya değil dikkatli olun. Toplam 3 yıkama için bu adımı yineleyin.</li>
	<li>Dikkatle her kapak notu için çözüm (% 50 aseton, metanol % 50) permeabilizing 1 mL ekleyin. 15 dakikadır permeabilize hücrelere izin. Not: Bu noktada, coverslips-20 ° C-dondurucu için artık bir hafta daha saklanabilir. Donma önlemek veya görüntü kalitesi hızla düşebilir gibi dondurucuya harcanan zamanı en aza indirmek. Hücreleri kalır dondurucu ne zaman ıslak ve kapalı metanol/aseton ve onlar düzgün DEPC PBS ile dondurucu kaldırılması sonra suyla temasa olduğunu emin olmak için emin olun.</li>
	<li>Bir shaker 5 min için üzerinde DEPC PBS ve iki yerde 1,5 mL ekleyin veya sıkıca sallamak ama hafifçe el 1 dk. için aşırı DEPC PBS Aspire, hücreleri bozmaya değil dikkatli olun. Toplam 3 yıkama için bu adımı yineleyin.</li>
</ol>4. IFA ve RNA-balık
Not: RNA balık sonda etiketleme ve hazırlık ile ilgili olarak: için K-959 baz çifti, 31 farklı probları intron olduğunu Rta oluşturulan bu 20 baz bir GC içeren çifti her, yaklaşık % 50 içerik. Çalışma ve hisse senedi çözümleri sondalar, sırasıyla 100 µM ve 2.5 µM konsantrasyonları, bölünmemeli idi.
<ol><li>Mikroskop slaytlar ile gerekli deneysel bilgi ya da bir çeşit ayırt etiket etiket.</li>
	<li>Nemli kağıt havlu ile yapışmalı plastik konteyner alt çizgi.</li>
	<li>
Birincil antikor çözüm hazırlamak (1,5 µL LANA antikor, RNA Pol II antikor 0,75 µL, baker'ın 3 µL Maya tRNA, DEPC PBS 30 µL kadar) ve her coverslip mevcut tarifini çarpın. Birincil antikor çözüm her yer 30 µL mikroskop slayt etiketli.
	<ol>
<li>İlk faiz birincil antikor titre ve en uygun miktarda kullanın. Serum (asit sıvı) RNase büyük miktarda içerebilir olarak saflaştırılmış IgG, kullandığınızdan emin olun.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coverslip (çözüm dış yüzey hücreleri) etiketli mikroskop slaytlar yerleştirin ve nemli kağıt havlu ile konteyner içine slaytlar hareket. Kabarcıklar tanıtmak değil dikkatli olun. Kapsayıcı plastik wrap ile dış kapak. Konteyner 37 ° C için 1 h için bir kuluçka içine taşıyın.</li>
	<li>Bir balık yıkama arabellek (2 x serum sodyum sitrat tampon (SSC) (son), % 10 formamide, % 90 DEPC dH2O) hazırlayın.</li>
	<li>2 x hibridizasyon arabellek hazırlamak (4 x SSC, % 20 dextran sülfat).</li>
	<li>İkincil antikor ve balık intron sonda arabellek hazırlamak (2 hibridizasyon arabellek (son 1 x Hyb arabellek) x 20 µL, fırıncı mayası 4 µL tRNA (son %10), formamide (son %10), intron K-Rta sonda 4 µL (son 125 nM), 0.8 ikincil antikor, DEPC dH2 µg O kadar 40 µL). Gerekli her slayt için reçete çarpın.</li>
	<li>Kuluçka sonra hücreleri 3 kez DEPC PBS 5 min için 6 iyi plaka ile yıkayın.</li>
	<li>Balık yıkama arabellek 5 min için 3 kez yıkayın. Coverslip balık-yıkama arabellekte karışımı ikincisi antikor ve intron sonda (Adım 4.7) hazırlama bitiş kadar tutun.</li>
	<li>Temiz cam slaytlar için birincil antikor kuluçka hibridizasyon için kullanılan.</li>
	<li>40 µL ikincil antikor ve her bir cam slayt üzerine solüsyon içeren balık intron sondası yerleştirin.</li>
	<li>Slayda hücrelerle coverslips kabarcıklar tanıtmak için dikkatli olmanız hücre yüzü aşağı bakacak şekilde arabellek üstüne yerleştirin.</li>
	<li>Nemli kağıt havlu ile plastik bir kap içine slaytlar altına yerleştirin. İlk plastik wrap ve sonra alüminyum folyo plastik kapta sarın.</li>
	<li>Kapsayıcı için 16-24 h 37 ° C'de slaytlar ile kuluçkaya.</li>
	<li>Kuluçka sonra dikkatlice coverslip cam slayt kenarından slayt ve geri yukarı dönük olacak şekilde 6 iyi tabak içine koymak ve balık-yıkama arabellekte 3 kere 6 iyi plaka 5 min için hücrelerle yıkayın.</li>
	<li>2 kere 2 içeren hücreleri yıkama x SSC.</li>
	<li>DAPI (1:1, 000) 2 ekleyin x SSC ve oda sıcaklığında 5 min için oturmak için izin verir.</li>
	<li>2 kere 2 içeren hücreleri yıkama x SSC.</li>
	<li>Hibridizasyon için kullanılan cam slaytlar temiz ve çözüm cam slaytlar üzerine montaj 10 µL ekleyin.</li>
	<li>Coverslips yüzü aşağı montaj çözümü üzerine yerleştirin. Kabarcıklar tanıtmak değil dikkatli olun.</li>
	<li>Laboratuvar doku ile yavaşça hücreleri ezmeye değil dikkatli olmak aşırı montaj çözüm çıkarın.</li>
	<li>Tırnak cilası kullanarak, coverslips kenarında geniş bir tabaka uygulayın ve kurumasını sağlar.</li>
	<li>Floresans mikroskobu gerçekleştirmek için devam edin.</li>
</ol>5. 3D Floresans mikroskobu
Not: protokoller floresan mikroskop sistem kullanılan türü ile değişir iken, aşağıdaki adımları en uygun görüntü verilerini nicel analiz edinimi sağlamak için yardımcı olacaktır.
<ol><li>Sabit örnekleri pretreat ve anti-fade medya floresan photobleaching görüntüleme sırasında geciktirmek için mount.</li>
	<li>Tüm cep telefonu (veya hücre çekirdeği)-ebilmek esir alma yüksek kalite hedefi (örneğin bir 60 X 1,42 N.A petrol-daldırma lens), alan bakış açısı içinde kullanın.</li>
	<li>Pozlama parametreleri (örneğin, uyarma güç, pozlama süresi) pozitif ve negatif kontrol örnekleri kullanarak her Floresans renk kanalı için ayarlayın. Floresans görüntüleri elde etmek. Not: yalnızca bir floresan etiketi pozitif kontrol örnekleri de renk kanalları arasında "çapraz karışma" düzeyini belirlemek için kullanılmalıdır. Görüntüleme sabit hücre numuneler için Floresans uyarma güç (biraz daha uzun pozlama süreleri ile) photobleaching en aza indirmek için azaltılabilir.</li>
	<li>Görüntüleme protokolü kurulduktan sonra aynı pozlama parametreleri bir çalışmada tüm örnekleri için tutarlı korumak — böylece görüntü verilerini doğru bir şekilde analiz ve karşılaştırıldığında.</li>
	<li>Sonrası edinme görüntü işleme ve 3D yeniden gerçekleştirin. K-Rta transkript RNA-balık sinyal (kırmızı), LANA molekülleri ayirt (yeşil) ve nükleer Kromatin DAPI (mavi) ile lekeli (uygun olduğunda) tanımlayın. Not: K-Rta ve LANA co kümelenmiş olan hücre çekirdeği bölgelerinde böylece viral transkripsiyon fabrika ve çoğaltma karmaşık ile ilişkili olduğu düşünülmektedir.</li>
</ol>

<ol>
	<li>de Laat, W., Grosveld, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Grosveld+Spatial+organization+of+gene+expression:+the+active+chromatin+hub.">Grosveld Spatial organization of gene expression: the active chromatin hub.</a> Chromosome Res. 11 (5), 447-459 (2003).</li><li>Misteli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+dynamics:+implications+for+nuclear+architecture+and+gene+expression.">Protein dynamics: implications for nuclear architecture and gene expression.</a> Science. 291 (5505), 843-847 (2001).</li><li>Bernardi, R., Pandolfi, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure,+dynamics+and+functions+of+promyelocytic+leukaemia+nuclear+bodies.">Structure, dynamics and functions of promyelocytic leukaemia nuclear bodies.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (12), 1006-1016 (2007).</li><li>Cioce, M., Lamond, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cajal+bodies:+a+long+history+of+discovery.">Cajal bodies: a long history of discovery.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 21, 105-131 (2005).</li><li>Boisvert, F. M., van Koningsbruggen, S., Navascues, J., Lamond, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multifunctional+nucleolus.">The multifunctional nucleolus.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (7), 574-585 (2007).</li><li>Sutherland, H., Bickmore, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factories:+gene+expression+in+unions.">Transcription factories: gene expression in unions.</a> Nat Rev Genet. 10 (7), 457-466 (2009).</li><li>Schmid, M., Speiseder, T., Dobner, T., Gonzalez, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+virus+replication+compartments.">DNA virus replication compartments.</a> J Virol. 88 (3), 1404-1420 (2014).</li><li>Chen, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kaposi's+Sarcoma-Associated+Herpesvirus+Hijacks+RNA+Polymerase+II+To+Create+a+Viral+Transcriptional+Factory.">Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus Hijacks RNA Polymerase II To Create a Viral Transcriptional Factory.</a> J Virol. 91 (11), (2017).</li><li>Ganem, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KSHV+and+the+pathogenesis+of+Kaposi+sarcoma:+listening+to+human+biology+and+medicine.">KSHV and the pathogenesis of Kaposi sarcoma: listening to human biology and medicine.</a> J Clin Invest. 120 (4), 939-949 (2010).</li><li>Mesri, E. A., Cesarman, E., Boshoff, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kaposi's+sarcoma+and+its+associated+herpesvirus.">Kaposi's sarcoma and its associated herpesvirus.</a> Nat Rev Cancer. 10 (10), 707-719 (2010).</li><li>Campbell, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+arginine+methyltransferase+1-directed+methylation+of+Kaposi+sarcoma-associated+herpesvirus+latency-associated+nuclear+antigen.">Protein arginine methyltransferase 1-directed methylation of Kaposi sarcoma-associated herpesvirus latency-associated nuclear antigen.</a> J Biol Chem. 287 (8), 5806-5818 (2012).</li><li>Guito, J., Lukac, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KSHV+Rta+Promoter+Specification+and+Viral+Reactivation.">KSHV Rta Promoter Specification and Viral Reactivation.</a> Front Microbiol. 3, 30 (2012).</li><li>Darst, R. P., Haecker, I., Pardo, C. E., Renne, R., Kladde, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+diversity+of+Kaposi's+sarcoma-associated+herpesvirus.">Epigenetic diversity of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus.</a> Nucleic Acids Res. 41 (5), 2993-3009 (2013).</li><li>Osborne, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myc+dynamically+and+preferentially+relocates+to+a+transcription+factory+occupied+by+Igh.">Myc dynamically and preferentially relocates to a transcription factory occupied by Igh.</a> PLoS Biol. 5 (8), 192 (2007).</li><li>Fanucchi, S., Shibayama, Y., Burd, S., Weinberg, M. S., Mhlanga, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+contact+permits+transcription+between+coregulated+genes.">Chromosomal contact permits transcription between coregulated genes.</a> Cell. 155 (3), 606-620 (2013).</li><li>Borah, S., Darricarrere, N., Darnell, A., Myoung, J., Steitz, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+viral+nuclear+noncoding+RNA+binds+re-localized+poly(A)+binding+protein+and+is+required+for+late+KSHV+gene+expression.">A viral nuclear noncoding RNA binds re-localized poly(A) binding protein and is required for late KSHV gene expression.</a> PLoS Pathog. 7 (10), 1002300 (2011).</li><li>Chang, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+demethylase+JMJD2A+regulates+Kaposi's+sarcoma-associated+herpesvirus+replication+and+is+targeted+by+a+viral+transcriptional+factor.">Histone demethylase JMJD2A regulates Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus replication and is targeted by a viral transcriptional factor.</a> J Virol. 85 (7), 3283-3293 (2011).</li><li>McAllister, S. C., Hansen, S. G., Messaoudi, I., Nikolich-Zugich, J., Moses, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+efficiency+of+phorbol+ester-induced+lytic+reactivation+of+Kaposi's+sarcoma-associated+herpesvirus+during+S+phase.">Increased efficiency of phorbol ester-induced lytic reactivation of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus during S phase.</a> J Virol. 79 (4), 2626-2630 (2005).</li><li>Miller, G., El-Guindy, A., Countryman, J., Ye, J., Gradoville, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lytic+cycle+switches+of+oncogenic+human+gammaherpesviruses.">Lytic cycle switches of oncogenic human gammaherpesviruses.</a> Adv Cancer Res. 97, 81-109 (2007).</li><li>Guito, J., Lukac, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KSHV+Rta+Promoter+Specification+and+Viral+Reactivation.">KSHV Rta Promoter Specification and Viral Reactivation.</a> Front Microbiol. 3, 30 (2012).</li></ol>

Yazarlar bu yazının hiçbir mali bağları ya da rakip çakışmaları çıkarları var.

Sıra dışı durumlar karşılamak için değiştirilebilir Protokolü bazı yönleri vardır. Fiksasyon ve permeabilization arabellekleri seçiminde de değiştirilebilir. Fiksasyon arabellekleri için paraformaldehyde da etkilidir ve etanol permeabilization için kullanılabilir.
Şoklama formaldehit ile glisin PBS formaldehit sığır serum albumin (BSA) yokluğunda antikorlar devre dışı bırakmasını engeller, ancak coverslips iyice yeterli yıkanır,-ebilmek var olmak Kaptan glisin PBS adım olarak önerilir. İletişim kuralında, sığır serum albümin engelleyen bir çözüm olarak kullanmaktan kaçının. RNA bozulması nedeniyle muhtemelen daha zayıf RNA-balık sinyalleri gösterdi Izumiya laboratuarında pilot çalışmalar yapılmıştır. Birincil antikor için engelleme gerekirse RNase free BSA kullanılması önerilir. Üzerinden geçmiş deneyim, bu antikor belirli ise, BSA eklenmesi tepki gerekli olmadığını fark ettim. Ancak, her zaman tüm kuluçka tRNA adımlar için maya aşırı miktarda dahil etmek için tavsiye edilir RNA yıkımı önlemek. Bu Ajan engelleme olarak tRNA kullanarak belirli RNA-balık sinyalleri arttı fark edilmiştir.
Hücre döngüsü eşitleme bir daha verimli ve zaman uyumlu KSHV etkinleştirme üretmek için uygulamaya konmuştur. Hücre döngüsü eşitleme için hidroksiüreye veya serum açlık alternatif yaklaşımlar olabilir. Hidroksiüreye yalnız ile kuluçka KSHV zayıf yeniden etkinleştirir o hidroksiüreye timidin blok kullanarak olarak etkili olsa da doğrulanmıştır.
Nasıl bu tekniği diğer çalışmalar için uygulanabilir mi? Izumiya lab's en son yayında, bu aktif KSHV episomes ve RNA pol II, RNA transkripsiyonu için temel bir enzim transkripsiyonu Bu colocalization gösterilmiştir. Ancak, bu ortak harekete geçirmek, eş repressors ve hücresel transkripsiyon faktörleri birkaç KSHV gen yönetmelikte yer vardır bilinen. Kantitatif RT-PCR viral transkript miktarının ve viral gen ekspresyonu üzerindeki etkilerini değerlendirirken üzerinde bir nüfus kültürlü hücrelerinin (yeniden etkinleştirme ve gizli karışımı) tarihsel olarak kullanılmıştır. Yukarıda açıklanan yaklaşım kullanarak, analizleri viral transkripsiyon incelemek için tek episomal seviyeye daraltılabilir. Böylece, diğer hücresel ve viral enzimlerin kronolojik zamanmekansal yönetmelik onların dernek KSHV reaktivasyonu ile anlayış kazanmak için incelenebilir. Bu da ancak intron değil bozulmuş Eğer RNA intron bölgenin geçici doğa RNA balık probları melezlemek ve genellikle yerelleştirmek onların yıkımı bağımlı olduğu için nerede etkin transkripsiyon, gerçekleşiyor olduğunu belirtmeyi dikkat çekicidir Hemen, Balık probları her zaman etkin transkripsiyon bulunan sinyalleri sunabilirim.
Şu anda, hücresel transkripsiyon fabrikalar oluşumu ve sonraki gen ekspresyonu genomik boyutlarını ve yapılandırma hücresel rehberleri karmaşıklığı nedeniyle arasındaki ilişkiyi araştırmayı zordur. Bu bağlamda, KSHV episomes sonucu olarak nispeten küçük genom büyüklükleri, tanımlanmış reaktivasyonu mekanizmaları açık RNA Pol II toplama oluşumları ile ideal bir araç olabilir. KSHV'ın manipulable viral Mini kromozom kullanarak, herpesvirology hücresel epigenetik araştırma alanı için benzersiz bir açıdan katkıda bulunabilir.

Çekirdek kronolojik zamanmekansal organizasyonu hassas bir şekilde ayarlanmış gen ekspresyonu ökaryotlarda oransal olarak önemli bir rol oynar giderek netlik kazanmıştır. Çoğu doku belirli genler üzerinde birçok kromozomlar dağıtılır ve koordine bir şekilde1belirli uyaranlara yanıt için zaman uyumlu olarak düzenlenmiş olması gerekir. Hücreleri aktif Kromatin hub'lar (ACH) genleri ve CIS düzenleyici bileşenleri belirli nükleer alanı1buluşturan bir yolu olarak oluşturun.
Bu da tarafından çeşitli çalışmalar çekirdeği çok yoğun ve yapışkan görünse de, biyolojik olarak aktif molekülleri çekirdeği oldukça hızlı bir şekilde Difüzyon2erişebilen olduğunu kanıtlanmıştır. Sonucu olarak kısa ömürlü bu özellik, çoğu DNA bağlayıcı proteinler 'için son derece uyumlu ve çok yönlü çekirdek2sağlayan nükleer alanda etrafında kendi yollarını duygu site Bağlayıcısı için site bağlayıcısı üzerinden atlama'.
Biomolecules çekirdeği içinde bu dinamik davranış rağmen nükleer membran gibi organları (ama bunlarla sınırlı olmamak üzere) çekirdekçik, Cajal organları ve promyelötik lösemi nükleer organları (PML-NB) hala mevcut. Bu yapıları birlikte3,4,5 tutun proteinler (PML-NB) çeşitli mekanizmalar tandem DNA yineler (çekirdekçik), rRNA (çekirdekçik) ve Cajal aytac (organları) veya PML gibi yapısal proteinler gibi geçer . Bu yapılar ve diğer cemaat transkripsiyon fabrikalar gibi sadece gerekli bileşenleri yerel konsantrasyonu artırmak, ancak aynı zamanda proteinler ve nükleik asitler sonuçta oluşturmak için bunları içinde kompozisyon düzenleyen iskele olarak hizmet bir verimli hücresel işlevler6için merkezi bir sitedeki.
Nerede ve ne zaman nükleer yapılar formu epigenetik eğitim araştırmacılar için bilgi hazinesi sağlar görselleştirme. Viroloji açısından bakıldığında, KSHV gibi gizlice enfekte virüsler reaktivasyonu önemli ölçüde çekirdeği Peyzaj ve dağıtım nükleer enzimlerin transkripsiyon öncelikle hücresel genlerin viral genler için sonuçta kaydırmaya değiştirir için tamamen işlevsel viral döl7,8üretmek. KSHV viral gen ifadesi kolaylaştırmak için hücresel gen ifade makine nasıl işlemek? Bu bilgileri ayrıca zamansal hücresel gen düzenleyici mekanizmaları ışık.
Diğer herpesviruses gibi KSHV litik çoğaltma ve gecikme süresi olarak adlandırılan iki ömürleri vardır. Gecikme süresi ilişkili genlerin9,10dışında KSHV öncelikle içinde hangi en-in onun viral gen ifade susturulması, gecikme süresi aşamasında yer alır. KSHV üretir gecikme süresi sırasında gecikme süresi yapısal viral genom bağlar ve insan kromozom11viral Kromatin tethers nükleer antijen (LANA), ilişkili. Viral genom ile LANA'ın samimi ilişki nedeniyle IFA ve DAPI leke ve viral episomes ile ilgili olarak ana bilgisayar Kromatin nerede olduğunu bulmak için kullanmak mümkündür.
KSHV reaktivasyonu tek episome düzeyinde ve derneğin diğer viral episomes virüslü bir hücre ile çalışmaya, aktif viral Kromatin situ transkripsiyonu bulmak için bir strateji kurulmuştur. Buna göre LANA ve RNAPII IFA intron RNA-balık ile bu KSHV K-Rta-anahtar viral protein intron bölge (tam sonda dizileri-ebilmek bulunmak Izumiya laboratuar en son yayın8') bağlamak RNA-balık probları oluşturarak kombine edilmiştir gerekli ve yeterli KSHV yeniden etkinleştirme-BT tanımlamak mümkün için transkripsiyon aslında alıyordu nerede8,11,12,13,14,15 yere . Bu intron RNA-balık tekniği araştırmacılar spliced ve sitoplazma16,17' ye ihraç hemen önce nerede mRNA sentezlenir görselleştirmenizi sağlar.
KSHV tarafından phorbol esterleri gibi 12-O-Tetradeconoyl-phorbol-13acetate (TPA) dahil olmak üzere çeşitli kimyasal uyaranlara yeniden etkinleştirilebilir ve Histon deacetylase inhibitörleri gibi sodyum bütrat, ayrıca KSHV overexpression tarafından yeniden etkinleştirmek için indüklenen viral transkripsiyon faktörü, K-Rta19. Araştırmacılar başarıyla yeniden etkinleştirme18inducing önce hücre döngüsü eşitleyerek KSHV reaktivasyonu verimliliği artmıştır. Böylece, bu belirli çalışmalar için hücreleri bir çift timidin blok (aşağıda açıklanan iletişim kuralı) kullanarak ve TPA ve Doksisiklin (Dox) ile kısa bir süre için inkübe senkronize. Bu deneylerde kullanılan hücre kültürünü cDNA klonlanmış ve K-Rta intron bölgenin içermez Doksisiklin indüklenebilir bir K-Rta kaset olduğundan Doxycyline kullanıldı. Yeniden etkinleştirmek mümkündür ancak KSHV kullanarak sadece K-Rta ifade indüklenen, çeşitli farklı biyokimyasal faktörler nedeniyle K-Rta ifade yalnız bir zayıf reaktivasyonu uyaranlara20olmaktadır araştırmacılar tarafından kanıtlanmıştır. Bunların hepsi birleştirerek ve uyuşturucu incubations kısa bir süre için sınırlayarak, bir güçlü ama aşırı yapay KSHV etkinleştirme görüntüleme için sağlanır.
LANA, RNAPII, etiketleme sonra K-Rta intron ve DNA olarak bu yazıda açıklanan, 3D Floresans görüntüleme widefield deconvolution mikroskop kullanılarak gerçekleştirildi. Disk görüntüsü oluşturma yazılımı ile işlendikten sonra aktif viral episomes kayma dağılımını düzgün değerlendirilebilir. Bu tekniği kullanarak, etkin Kromatin hub'ları ve diğer nükleer yapıların oluşumu temel doğa ile ilgili sorular Merkezi okudu olabilir. Aynı viral episomes aynı düzenleyici elemanlarının işleyen tek bir hücreye sahip kronolojik zamanmekansal gen düzenleyici mekanizmaları anlayışı derinleştirmek için benzersiz araştırma aracı temsil edebilir.
Farklı zaman noktalarda sabit birden çok hücre örnekleri doğal olarak dinamik bir moleküler süreci karakterize görüntüleme bir floresan dağıtım ince ya da küçük ölçekli değişiklikleri tespit edilmemiş veya önemsiz kabul kısıtlamadır. Nadir örneğini her hücresinde gözlenen aynı ince değişiklik görüntüler sürece bu doğrudur. Böylece, aktif viral transkripsiyon ve diğer nükleer yapıların tam kronolojik zamanmekansal ilişki eleştirel sabit Imaging'i kullanma değerlendirilemez. Bu teknik sorunları ele almak üzere, viral episomes işaretlenmiş resim canlı hücreleri ve zaman içinde anahtar hücresel enzimler konumunu takip için en iyi yaklaşım olduğunu.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:572px;" width="573">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:216px;">RPMI medium 1650 GlutaMAX</td>
			<td style="width:71px;">Gibco by Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">61870-036</td>
			<td style="width:167px;">Needs to be warmed to 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:71px;">Omega Scientific Inc.</td>
			<td style="width:119px;">FB-11</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:216px;">Pen Strep Glutamine (100x)</td>
			<td style="width:71px;">Gibco by Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">10378-016</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Thymidine&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T9250</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:216px;">Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Solution</td>
			<td style="width:71px;">Gibco by Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">14190-144</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">TPA</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P1585</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Sodium Butyrate&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">B5887</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Formaldehyde Solution&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">252549</td>
			<td style="width:167px;">Corrosive, toxic, health hazard</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Diethyl Pyrocarbonate</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D-5758</td>
			<td style="width:167px;">Acute toxicity&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Glycine</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">410225</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Acetone</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">179124</td>
			<td style="width:167px;">Flammable, toxic</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Methanol</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Chemical&#160;</td>
			<td style="width:119px;">67-56-1</td>
			<td style="width:167px;">Flammable, toxic, health hazard</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Rat monoclonal antibody to KSHV/HHV-8 ORF73</td>
			<td style="width:71px;">Advanced Biotechnologies</td>
			<td style="width:119px;">13-210-100</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Anti-RNA Polymerase II Antibody clone CTD4H8</td>
			<td style="width:71px;">EMD Milipore</td>
			<td style="width:119px;">05-623</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Ribonucleic acid, transfer from baker&#8217;s yeast (S. cerevisiae)&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">9014-25-9</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Saline sodium citrate buffer 20x (SSC)</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td align="right" style="width:119px;">15557044</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Formamide&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">295876</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Omnipur Dextran Sulfate, 50% solution</td>
			<td style="width:71px;">EMD Milipore</td>
			<td style="width:119px;">1916C093</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">DAPI (4&#8217;,6-diamindino-2-phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:119px;">D1306</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">slowFade Gold antifade reagent</td>
			<td style="width:71px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">S36936</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Micro cover glass 22x22</td>
			<td style="width:71px;">Matsunami</td>
			<td style="width:119px;">C022221</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;">VoloCITY</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;">3D imaging software</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">DeltaVision microscope</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Superfrost/Plus microscope slides</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-550-15</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

functional imaging of viral transcription factories using 3d fluorescence microscopy

İyi genler kayma ve temporal düzenlenmesi uygun gen ekspresyonu yöneten ayrılmaz bir parçası olduğu bilinmektedir. Sonuç olarak, nerede ve ne zaman transkripsiyon nükleer alanı içinde yer alıyor anlamak ve aynı hücre çekirdeği içinde enfekte episomes arasındaki ilişkiyi görselleştirmek için çok değerli olduğunu. Burada, ayirt (IFA) ve RNA-balık olmuştur combinedto belirlemek aktif Kaposi sarkomu ilişkili herpesvirus (KSHV) episomes transkripsiyonu. KSHV gecikme süresi ilişkili nükleer antijen (LANA) Boyama tarafından viral episomes çekirdeği içinde bulunduğu bulmak mümkündür. Buna ek olarak, sadece verimli enfeksiyon sırasında ifade edilir, viral bir gen intron bölgesinin hedef için RNA-balık probları tasarlayarak doğmakta olan RNA transkript bulunabilir. Bu moleküler probları birleşimini kullanarak, büyük viral transkripsiyon fabrikalar Meclisi görselleştirmek ve mekansal düzenleme viral gen ekspresyonu KSHV yeniden etkinleştirme sırasında analiz etmek mümkündür. Anti-RNA polimeraz II antikor boyama dahil olarak, bir de RNA polimeraz II (RNAPII) toplama ve KSHV transkripsiyon yeniden etkinleştirme sırasında arasındaki ilişkiyi görselleştirebilirsiniz.

Biraz kısaltılmış bir protokol nerede BCBL-1 hücreler kullanıldı ve sadece LANA ve K-Rta RNA (şekil 1) lekeli gerçekleştirildi. Bu deney nerede viral episomes aktif transkripsiyonu ve hücre bir popülasyondaki KSHV reaktivasyonu bizi canlı tutan heterojen incelemek için bize izin verir. Şekil 1' deki bir ok ile belirtilen hücre içinde farklı K-Rta Floresans viral episomes (LANA ile işaretlenmiş) dağılımı uygun bölgelerde etkin transkripsiyon KSHV genleri yakın yer alan için kanıttır. Aynı örnekte hücreleri ok ucu şekil 1 ' deki miktarlara biri gibi hangi değil önemli ölçüde örtüşen çok zayıf ve diffüz K-Rta Floresans LANA ile sergi görülebilir. Bu genel bulma hücreleri bir nüfus içinde yeniden etkinleştirme bizi canlı tutan ölçüde önemli farklılıklar olduğunu göstermektedir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56832/56832fig1.jpg" style="font-size: 14px;"> Şekil 1: , Viral episomes etkin transkripsiyon görselleştirme. IFA ve RNA-balık BCBL-1 hücreleri üzerinde gerçekleştirilen almıştır. BCBL-1 hücreleri değil senkronize ama 4 h kullanarak LANA immunostaining için TPA ve sodyum bütrat ile tedavi, RNA-balık K-Rta intron kırmızı bulunduğu etkin transkripsiyon için hedefleme gerçekleştirildi iken viral genom yeşil renkle görüntülenir. Hücresel Kromatin yazı fiksasyon ve permeabilization DAPI ile lekeli. K-Rta intron ve LANA lekeleri birlikte birleştirildi. Tam ok tam olarak yeniden ve VTFs oluşturan bir hücre işaret eder. Ok ucu yeniden etkinleştirmek için daha yeni başlıyor bir hücre doğru işaret ediyor iken K-Rta sinyali zayıf tarafından önerilen. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56832/56832fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
Sonraki timidin eşitleme etkinliğini ifade viral protein K-Rta (Şekil 2) görselleştirme tarafından incelenmiştir. Bir çift timidin blok G1/S faz geçiş TREX BCBL-1 hücreleri eşitlemek için gerçekleştirilen sonra daha önce açıklanan protokol gerçekleştirildi (LANA ve RNAPII boyama). K-Rta boyama inceleyerek, eşitlenmiş hücreleri daha eşitlenmemiş nüfusundan reaktivasyonu uyaranlara yanıt açıkça belirgindir. Izumiya laboratuvar (veri gösterilmez) yürütülen önceki çalışmalardan RNAPII da daha sık K-Rta ile hücre döngüsü senkronizasyondan sonra colocalizes da doğrulandı.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56832/56832fig2.jpg" style="font-size: 14px;"> Resim 2: Timidin etkinliğini. RNA-balık TREX K-Rta BCBL-1 hücreleri üzerinde gerçekleştirildi. Hücreleri (belirttiği "2 x Thy" başlık) bir çift timidin blok ile senkronize. 4 h K-Rta intron RNA balık probları melezleşmiştir için her iki eşitlenmemiş ve senkronize hücre popülasyonlarının TPA ve DOX ile tedavi edildi. Aynı şekilde parlak kırmızı olan hücreler K-Rta overexpressing değil, bunun yerine (değil gösterilir) Boyama DAPI ile doğrulanmış, öldüler. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56832/56832fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
Genel bir not olarak, bu iletişim kuralını yerine getirirken DAPI hücrelerle leke çok önemlidir. Apototic hücreleri kolayca nükleer parçalanma ve blebbing tarafından kabul edilebilir. Ağır indüksiyon uyaranlara ve genel hücre kültür uygulamaları göz önüne alındığında, bazı ölü hücreleri görülen yaygın bir durumdur. Her zaman canlı ve ölü hücreleri arasında ayırt birincil yöntem olarak DAPI ile leke önemlidir. Bazen antikorlar veya RNA probları apoptotik hücrelerde yakalanmayın ve sinyalleri üretmek, sonuç olarak bu hücreleri analizleri dışlamak önemlidir. DAPI boyama birkaç ek işlevler, hizmet edebilir örneğin şekil 3' te, bu okla gösterilen nesne aslında üç ayrı hücre bir yerine olduğu açıktır.
Resim 3 Resim 4 görüldüğü görüntüler böylece daha punctate örüntüyü yaratmak deconvolved unutmamak gerekir. RNAPII leke inceleyerek, hücreler arasındaki fark okla gösterilen ve çevredeki diğer hücreleri görülebilir. Bu RNAPII sinyal deconvolution nedeniyle normalden çok daha okunuyor söz dikkat çekicidir.
3D mikroskobu ile birlikte bu tekniği kullanarak RNAPII, LANA ve K-Rta uzaysal ilişkisi sorgulamak için bize izin verir. Örneğin, şekil 4' te, yüzük benzeri RNAPII yapıları çevre üzerinde noktalı KSHV genleri ile görülebilir. Genel olarak, LANA genellikle RNAPII hücrelerde transkripsiyon fabrikalar geliştirme ile colocalizes. Ancak, tüm LANA nokta çalışmaları 4 RNAPII ile colocalizeth Boyut (zaman) bu fenotip netleştirmek gerekli olurdu. K-Rta sinyalleri ile colocalize değil birkaç LANA noktalar (şekil 4) tek bir hücre içinde bile yeniden etkinleştirme uyaranlara yanıt episomal heterojenlik temsil eklemek önemlidir.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56832/56832fig3.jpg"> Şekil 3: Kombine IFA ve intron RNA-balık. IFA ve RNA-balık TREX K-Rta BCBL-1 hücreleri üzerinde gerçekleştirilen almıştır. Viral genom ile immunostaining Lana (yeşil), transkripsiyonu RNA-BALIKLA K-Rta mRNA (sarı) intron bölgenin görselleştirildiği, RNAPII (kırmızı) cemaat IFA ile etiketli ve hücreleri sonunda DAPI görüntüye kullanarak lekeli active bulunduğunu DNA (mavi). Sonra hücreleri yeniden TPA ve DOX kuluçka için 4 h ile etkinleştirildi TREx K-RTA BCBL-1 hücreleri bir çift timidin blok kullanarak senkronize ve 24 saat sonra hücreleri tespit edildi, permeabilized ve daha ileri görüntüleme için hazır. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56832/56832fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56832/56832fig4.jpg"> Şekil 4: 3 boyutlu görselleştirme Viral transkripsiyon fabrikaların. İntron RNA-balık K-Rta intron problar (açık mavi), RNAPII (kırmızı) ve LANA (yeşil) ve DAPI (koyu mavi) Boyama DNA immunostaining kullanarak. 3D render bir Z yığının mikroskobunun alınan, işlenen ve ticari görüntüleme yazılımı üzerinde inşa deconvolved (malzemelerin tabloya bakın). Sonra yeniden etkinleştirme uyarılmış Çift Kişilik timidin senkronize ve TPA ve 4 h hücreler için DOX ile tedavi TREx K-Rta BCBL-1 hücreleri 28 h işlendi. Bu videoyu izlemek için <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56832/Figure.mov" target="_blank">lütfen buraya tıklayın. (İndirmek için sağ tıklatın.)</a>

Watch this Scientific Journal Video about Functional Imaging of Viral Transcription Factories Using 3D Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Functional Imaging of Viral Transcription Factories Using 3D Fluorescence Microscopy

Viral transkripsiyon fabrikalar hücresel RNA polimeraz II viral gen transkripsiyonu yeniden etkinleştirme sırasında artırmak için ile zenginleştirilmiş ayrık yapılardır. Burada, sitelerinden Aktif 3D nükleer alanda viral Kromatin ayirt boyama ve in situ RNA hibridizasyon kombinasyonu tarafından transkripsiyonu birini bulmak için bir yöntem açıklanmıştır.

3D Floresans mikroskobu kullanılarak Viral transkripsiyon fabrikaların fonksiyonel görüntüleme

It is well known that spatial and temporal regulation of genes is an integral part of governing proper gene expression. Consequently, it is invaluable to ...

functional-imaging-viral-transcription-factories-using-3d

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

7.0K Görüntüleme.  University of California, Davis. Viral transkripsiyon fabrikalar hücresel RNA polimeraz II viral gen transkripsiyonu yeniden etkinleştirme sırasında artırmak için ile zenginleştirilmiş ayrık yapılardır. Burada, sitelerinden Aktif 3D nükleer alanda viral Kromatin ayirt boyama ve in situ RNA hibridizasyon kombinasyonu tarafından transkripsiyonu birini bulmak için bir yöntem açıklanmıştır.

Video: Functional Imaging of Viral Transcription Factories Using 3D Fluorescence Microscopy

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

Zaman atlamalı Görüntüleme siRNA Transfeksiyon sonra Mitoz

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Biyoloji

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to replenish depleted endoplasmic reticulum (ER) or sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ stores1,2. Since Ca2+ is a ubiquitous second messenger, it is not surprising to see that SOCE plays important roles in a variety of cellular processes, including proliferation, apoptosis, gene transcription and motility. Due to its wide occurrence in nearly all cell types, including epithelial cells and skeletal muscles, this pathway has received great interest3,4. However, the heterogeneity of SOCE characteristics in different cell types and the physiological function are still not clear5-7.
The functional channel properties of SOCE can be revealed by patch-clamp studies, whereas a large body of knowledge about this pathway has been gained by fluorescence-based intracellular Ca2+ measurements because of its convenience and feasibility for high-throughput screening. The objective of this report is to summarize a few fluorescence-based methods to measure the activation of SOCE in monolayer cells, suspended cells and muscle fibers5,8-10. The most commonly used of these fluorescence methods is to directly monitor the dynamics of intracellular Ca2+ using the ratio of F340nm and F380nm (510 nm for emission wavelength) of the ratiometric Ca2+ indicator Fura-2. To isolate the activity of unidirectional SOCE from intracellular Ca2+ release and Ca2+ extrusion, a Mn2+ quenching assay is frequently used. Mn2+ is known to be able to permeate into cells via SOCE while it is impervious to the surface membrane extrusion processes or to ER uptake by Ca2+ pumps due to its very high affinity with Fura-2. As a result, the quenching of Fura-2 fluorescence induced by the entry of extracellular Mn2+ into the cells represents a measurement of activity of SOCE9. Ratiometric measurement and the Mn+2 quenching assays can be performed on a cuvette-based spectrofluorometer in a cell population mode or in a microscope-based system to visualize single cells. The advantage of single cell measurements is that individual cells subjected to gene manipulations can be selected using GFP or RFP reporters, allowing studies in genetically modified or mutated cells. The spatiotemporal characteristics of SOCE in structurally specialized skeletal muscle can be achieved in skinned muscle fibers by simultaneously monitoring the fluorescence of two low affinity Ca2+ indicators targeted to specific compartments of the muscle fiber, such as Fluo-5N in the SR and Rhod-5N in the transverse tubules9,11,12.

The extent of store-operated Ca2+ entry (SOCE) can be monitored using fluorescent Ca2+ indicators. Mn2+ quenching of such indicators assays SOCE in cultured cells and skeletal muscle fibers. A technique allowing spatial and temporal resolution of SOCE by confocal imaging of mechanically skinned muscle fibers is also described.

Canlı hücreler Mağaza çalışan Kalsiyum Giriş Floresans tabanlı Ölçümü: Kültür Kanseri Hücre gelen İskelet Kası Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Viruses that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve to divert energy and resources for viral replication. Many aspects of host cell function are commandeered by viruses, usually by the expression of viral gene products that recruit host cell proteins and machineries. Moreover, viruses engineer specific membrane organelles or tag on to mobile vesicles and motor proteins to target regions of the cell (during de novo infection, viruses co-opt molecular motor proteins to target the nucleus; later, during virus assembly, they will hijack cellular machineries that will help in the assembly of viruses). Less is understood on how viruses, in particular those with RNA genomes, coordinate the intracellular trafficking of both protein and RNA components and how they achieve assembly of infectious particles at specific loci in the cell. The study of RNA localization began in earlier work. Developing lower eukaryotic embryos and neuronal cells provided important biological information, and also underscored the importance of RNA localization in the programming of gene expression cascades. The study in other organisms and cell systems has yielded similar important information. Viruses are obligate parasites and must utilise their host cells to replicate. Thus, it is critical to understand how RNA viruses direct their RNA genomes from the nucleus, through the nuclear pore, through the cytoplasm and on to one of its final destinations, into progeny virus particles 1.
FISH serves as a useful tool to identify changes in steady-state localization of viral RNA. When combined with immunofluorescence (IF) analysis 22, FISH/IF co-analyses will provide information on the co-localization of proteins with the viral RNA3. This analysis therefore provides a good starting point to test for RNA-protein interactions by other biochemical or biophysical tests 4,5, since co-localization by itself is not enough evidence to be certain of an interaction. In studying viral RNA localization using a method like this, abundant information has been gained on both viral and cellular RNA trafficking events 6. For instance, HIV-1 produces RNA in the nucleus of infected cells but the RNA is only translated in the cytoplasm. When one key viral protein is missing (Rev) 7, FISH of the viral RNA has revealed that the block to viral replication is due to the retention of the HIV-1 genomic RNA in the nucleus 8. 
Here, we present the method for visual analysis of viral genomic RNA in situ. The method makes use of a labelled RNA probe. This probe is designed to be complementary to the viral genomic RNA. During the in vitro synthesis of the antisense RNA probe, the ribonucleotide that is modified with digoxigenin (DIG) is included in an in vitro transcription reaction. Once the probe has hybridized to the target mRNA in cells, subsequent antibody labelling steps (Figure 1) will reveal the localization of the mRNA as well as proteins of interest when performing FISH/IF.

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

A fluorescence in situ hybridization (FISH) method was developed to visually detect viral genomic RNA using fluorescence microscopy. A probe is made with specificity to the viral RNA that can then be identified using a combination of hybridization and immunofluorescence techniques. This technique offers the advantage of identifying the localization of the viral RNA or DNA at steady-state, providing information on the control of intracellular virus trafficking events.

Floresans tarafından viral RNA tespit edilmesi<em&gt; In situ</em&gt; Hibridizasyon (FISH)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, traditional chemotherapeutic approaches have been largely unsuccessful. Hormone therapy is effective at early stage, but often fails with the eventual development of hormone-refractory tumors. We have been interested in developing therapeutics targeting specific metabolic deficiency of tumor cells. We recently showed that prostate tumor cells specifically lack an enzyme (argininosuccinate synthase, or ASS) involved in the synthesis of the amino acid arginine1. This condition causes the tumor cells to become dependent on exogenous arginine, and they undergo metabolic stress when free arginine is depleted by arginine deiminase (ADI)1,10. Indeed, we have shown that human prostate cancer cells CWR22Rv1 are effectively killed by ADI with caspase-independent apoptosis and aggressive autophagy (or macroautophagy)1,2,3. Autophagy is an evolutionarily-conserved process that allows cells to metabolize unwanted proteins by lysosomal breakdown during nutritional starvation4,5. Although the essential components of this pathway are well-characterized6,7,8,9, many aspects of the molecular mechanism are still unclear - in particular, what is the role of autophagy in the death-response of prostate cancer cells after ADI treatment? In order to address this question, we required an experimental method to measure the level and extent of autophagic response in cells - and since there are no known molecular markers that can accurately track this process, we chose to develop an imaging-based approach, using quantitative 3D fluorescence microscopy11,12.
Using CWR22Rv1 cells specifically-labeled with fluorescent probes for autophagosomes and lysosomes, we show that 3D image stacks acquired with either widefield deconvolution microscopy (and later, with super-resolution, structured-illumination microscopy) can clearly capture the early stages of autophagy induction. With commercially available digital image analysis applications, we can readily obtain statistical information about autophagosome and lysosome number, size, distribution, and degree of colocalization from any imaged cell. This information allows us to precisely track the progress of autophagy in living cells and enables our continued investigation into the role of autophagy in cancer chemotherapy.

Autophagy is a ubiquitous process that enables cells to degrade and recycle proteins and organelles. We apply advanced fluorescence microscopy to visualize and quantify the small, but essential, physical changes associated with the induction of autophagy, including the formation and distribution of autophagosomes and lysosomes, and their fusion into autolysosomes.

Gelişmiş 3D Floresan Mikroskobu kullanılarak Otofaji Kantitatif Analiz

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, ...

Simultaneous Multicolor Imaging of Biological Structures with Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled single molecules within a sample with a spatial resolution of tens of nanometers. Using either photoactivatable (PAFP) or&#160;photoswitchable (PSFP) fluorescent proteins fused to proteins of interest, or organic dyes conjugated to antibodies or other molecules of interest, fluorescence photoactivation localization microscopy (FPALM) can simultaneously image multiple species of molecules within single cells. By using the following approach, populations of large numbers (thousands to hundreds of thousands) of individual molecules are imaged in single cells and localized with a precision of ~10-30 nm. Data obtained can be applied to understanding the nanoscale spatial distributions of multiple protein types within a cell. One primary advantage of this technique is the dramatic increase in spatial resolution: while diffraction limits resolution to ~200-250 nm in conventional light microscopy, FPALM can image length scales more than an order of magnitude smaller. As many biological hypotheses concern the spatial relationships among different biomolecules, the improved resolution of FPALM can provide insight into questions of cellular organization which have previously been inaccessible to conventional fluorescence microscopy. In addition to detailing the methods for sample preparation and data acquisition, we here describe the optical setup for FPALM. One additional consideration for researchers wishing to do super-resolution microscopy is cost: in-house setups are significantly cheaper than most commercially available imaging machines. Limitations of this technique include the need for optimizing the labeling of molecules of interest within cell samples, and the need for post-processing software to visualize results. We here describe the use of PAFP and PSFP expression to image two protein species in fixed cells. Extension of the technique to living cells is also described.

We demonstrate the use of fluorescence photo activation localization microscopy (FPALM) to simultaneously image multiple types of fluorescently labeled molecules&#160;within cells. The techniques described yield the localization of thousands to hundreds of thousands of individual fluorescent labeled proteins, with a precision of tens of nanometers&#160;within single cells.

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized image analysis tools are available, most traditional image-analysis-based workflows have steep learning curves (for fine tuning of analysis parameters) and result in long turnaround times between imaging and analysis. In particular, cell segmentation, the process of identifying individual cells in an image, is a major bottleneck in this regard.
Here we present an alternate, cell-segmentation-free workflow based on PhenoRipper, an open-source software platform designed for the rapid analysis and exploration of microscopy images. The pipeline presented here is optimized for immunofluorescence microscopy images of cell cultures and requires minimal user intervention. Within half an hour, PhenoRipper can analyze data from a typical 96-well experiment and generate image profiles. Users can then visually explore their data, perform quality control on their experiment, ensure response to perturbations and check reproducibility of replicates. This facilitates a rapid feedback cycle between analysis and experiment, which is crucial during assay optimization. This protocol is useful not just as a first pass analysis for quality control, but also may be used as an end-to-end solution, especially for screening. The workflow described here scales to large data sets such as those generated by high-throughput screens, and has been shown to group experimental conditions by phenotype accurately over a wide range of biological systems. The PhenoBrowser interface provides an intuitive framework to explore the phenotypic space and relate image properties to biological annotations. Taken together, the protocol described here will lower the barriers to adopting quantitative analysis of image based screens.

Here we describe a workflow for rapidly analyzing and exploring collections of fluorescence microscopy images using PhenoRipper, a recently developed image-analysis platform.

Hızlı Analiz ve Floresans Mikroskopi Görüntüler Exploration

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy (f3D-SIM)

Imaging of biological samples using fluorescence microscopy has advanced substantially with new technologies to overcome the resolution barrier of the diffraction of light allowing super-resolution of live samples. There are currently three main types of super-resolution techniques &#8211; stimulated emission depletion (STED), single-molecule localization microscopy (including techniques such as PALM, STORM, and GDSIM), and structured illumination microscopy (SIM). While STED and single-molecule localization techniques show the largest increases in resolution, they have been slower to offer increased speeds of image acquisition. Three-dimensional SIM (3D-SIM) is a wide-field fluorescence microscopy technique that offers a number of advantages over both single-molecule localization and STED. Resolution is improved, with typical lateral and axial resolutions of 110 and 280 nm, respectively and depth of sampling of up to 30 &#181;m from the coverslip, allowing for imaging of whole cells. Recent advancements (fast 3D-SIM) in the technology increasing the capture rate of raw images allows for fast capture of biological processes occurring in seconds, while significantly reducing photo-toxicity and photobleaching. Here we describe the use of one such method to image bacterial cells harboring the fluorescently-labelled cytokinetic FtsZ protein to show how cells are analyzed and the type of unique information that this technique can provide.

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy f3D-SIM

Spatiotemporal information about dynamic proteins inside live cells is crucial for understanding biology. A type of super-resolution microscopy called fast 3D-structured illumination microscopy (f3D-SIM) reveals unique information about the cytokinetic Z ring in bacteria: both its bead-like appearance and the rapid dynamics of FtsZ within the ring.

Hızlı 3D-Yapılandırılmış Aydınlatma mikroskopi ile Canlı Bakteri Cytokinetic Z Yüzük Süper çözünürlük Görüntüleme (F3D-SIM)

Imaging of biological samples using fluorescence microscopy has advanced substantially with new technologies to overcome the resolution barrier of the ...

Implementing Patch Clamp and Live Fluorescence Microscopy to Monitor Functional Properties of Freshly Isolated PKD Epithelium

Cyst initiation and expansion during polycystic kidney disease is a complex process characterized by abnormalities in tubular cell proliferation, luminal fluid accumulation and extracellular matrix formation. Activity of ion channels and intracellular calcium signaling are key physiologic parameters which determine functions of tubular epithelium. We developed a method suitable for real-time observation of ion channels activity with patch-clamp technique and registration of intracellular Ca2+ level in epithelial monolayers freshly isolated from renal cysts. PCK rats, a genetic model of autosomal recessive polycystic kidney disease (ARPKD), were used here for ex vivo analysis of ion channels and calcium flux. Described here is a detailed step-by-step procedure designed to isolate cystic monolayers and non-dilated tubules from PCK or normal Sprague Dawley (SD) rats, and monitor single channel activity and intracellular Ca2+ dynamics. This method does not require enzymatic processing and allows analysis in a native setting of freshly isolated epithelial monolayer. Moreover, this technique is very sensitive to intracellular calcium changes and generates high resolution images for precise measurements. Finally, isolated cystic epithelium can be further used for staining with antibodies or dyes, preparation of primary cultures and purification for various biochemical assays.

Ion channels expressed in renal tubular epithelium play a significant role in the pathology of polycystic kidney disease. Here we describe experimental protocols used to perform patch-clamp analysis and intracellular calcium level measurements in cystic epithelium freshly isolated from rodent kidneys.

Patch Kelepçe ve Canlı Floresan Mikroskobu uygulanması Taze İzole PKD Epitelinin Fonksiyonel Properties Monitör

Cyst initiation and expansion during polycystic kidney disease is a complex process characterized by abnormalities in tubular cell proliferation, luminal ...

Identification of Kinesin-1 Cargos Using Fluorescence Microscopy

Fluorescence microscopy is employed to identify Kinesin-1 cargos. Recently, the heavy chain of Kinesin-1 (KIF5B) was shown to transport the nuclear transcription factor c-MYC for proteosomal degradation in the cytoplasm. The method described here involves the study of a motorless KIF5B mutant for fluorescence microscopy. The wild-type and motorless KIF5B proteins are tagged with the fluorescent protein tdTomato. The wild-type tdTomato-KIF5B appears homogenously in the cytoplasm, while the motorless tdTomato-KIF5B mutant forms aggregates in the cytoplasm. Aggregation of the motorless KIF5B mutant induces aggregation of its cargo c-MYC in the cytoplasm. Hence, this method provides a visual means to identify the cargos of Kinesin-1. A similar strategy can be utilized to identify cargos of other motor proteins.

Here, a protocol is presented to identify Kinesin-1 cargos. A motorless mutant of the Kinesin-1 heavy chain (KIF5B) aggregates in the cytoplasm and induces aggregation of its cargos. Both aggregates are detected under fluorescence microscopy. A similar strategy can be employed to identify cargos of other motor proteins.

Floresan mikroskobu kullanarak kinesin-1 Cargos Tanımlanması

Fluorescence microscopy is employed to identify Kinesin-1 cargos. Recently, the heavy chain of Kinesin-1 (KIF5B) was shown to transport the nuclear ...

Open Source High Content Analysis Utilizing Automated Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) based readouts of fixed or live cells in multiwell plates. This provides a means to screen for cell signaling processes read out using intramolecular FRET biosensors or intermolecular FRET of protein interactions such as oligomerization or heterodimerization, which can be used to identify binding partners. We describe here the functionality of this automated multiwell plate FLIM instrumentation and present exemplar data from our studies of HIV Gag protein oligomerization and a time course of a FRET biosensor in live cells. A detailed description of the practical implementation is then provided with reference to a list of hardware components and a description of the open source data acquisition software written in &#181;Manager. The application of FLIMfit, an open source MATLAB-based client for the OMERO platform, to analyze arrays of multiwell plate FLIM data is also presented. The protocols for imaging fixed and live cells are outlined and a demonstration of an automated multiwell plate FLIM experiment using cells expressing fluorescent protein-based FRET constructs is presented. This is complemented by a walk-through of the data analysis for this specific FLIM FRET data set.

We present an open source high content analysis (HCA) instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) based readouts. Data acquisition for this openFLIM-HCA instrument is controlled by software written in &#181;Manager and data analysis is undertaken in FLIMfit.

Otomatik Flüoresans Ömrü Görüntüleme Mikroskopi kullanmak Open Source Yüksek İçerik Analizi

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions ...