テクニカル サポートのため博士明分チャン ・ チェンさんは屋新を感謝致します。この作品は、台湾の科学技術省によって支えられた (ほとんど-103-2325-B-006-009、ほとんど-104-2325-B-006-001、ほとんど-105-2325-B-006-001、および MOST-106-2320-B-006-068-MY3) 厚生省と福祉 (MOHW106-TDU-B-211-144004)。また、国立成功大学、医学のコア研究室から多光子顕微鏡のサポートを感謝しております。

すべてのマウスの実験は、当研究所 (ケア、NCKU 医科大学実験動物の使用のためのガイド) のガイドラインに従って行われました。
1. 楽器、文化、メディア、料理の準備
<ol><li>実験的プロトコルを開始する前に取得 (尾静脈注射) を 26 G/0.5 cm の針を用いて 1 mL 注射器滅菌手術用縫合糸、3 mL シリンジ (肺灌流) の 24 G/3 cm 針ダルベッコ変更イーグル メディア (DMEM)、トリプシン EDTA 溶液 (5グラム/L のトリプシンと 0.53 mM)、ウシ胎児血清 (FBS)、1 x PBS (137 mM NaCl、KCl 2.7 mM、10 mM Na2フォー4と 1.8 mM KH2PO4)、6 cm 文化料理。</li>
</ol>2. 準備中と懸濁液中に腫瘍細胞の回復
<ol><li>滅菌ダルベッコ変更イーグル メディア (DMEM) 10% または 20% を含む準備 FBS たて 0.05%、1 x PBS 2 mM L グルタミンを追加およびトリプシン-EDTA。</li>
	<li>10 %dmem で細胞の培養 37 ° C で FBS、培養皿で 70-80% の合流があるまでそれらを育てます。</li>
	<li>2 mL の滅菌 1x PBS で 2 回洗濯に続いて、料理から文化メディア (DMEM) を削除します。</li>
	<li>0.05 %1 mL を加えてトリプシン-EDTA 料理に徹底的にすべてのセルをカバーするため。すぐに 800 μ L のソリューションを削除し、料理にのみ 200 μ L を残します。30 の 37 ° C で料理を孵化させなさい (携帯型) によって 1 分と細胞の大半がサスペンド状態になるまで待機します。</li>
	<li>新鮮な DMEM の 1 mL を追加 10% を含むと精力的にトリプシンの酵素活性を停止するお皿に直接 FB ピペットの細胞懸濁液を上下 1000 μ L ピペット単一細胞懸濁液を準備するとします。</li>
	<li>1.5 mL 遠心チューブにお皿からセルを転送、室温で 3 分間 162 x g 細胞をスピンします。</li>
	<li>上清を吸引し、37 ° C 2 時間の懸濁液で細胞を回転 1.5 mL 20 %fbs、エンド オーバー エンドを含む DMEM で腫瘍細胞を再懸濁します。 注: 媒体は回復中に黄色に変わったら場合、は、20% を含む新鮮な培地で古い培地を交換政府短期証券。</li>
</ol>3. 蛍光染色と Carboxyfluorescein サクシニミジルエステル (CFSE) と懸濁液中に腫瘍細胞の解析
<ol><li>懸濁液中の細胞回復後、用量を染色する蛍光を滴定の室を数えるノイバウアーのトリパン ブルーと適切な生菌数をカウントし、尾静脈注射。</li>
	<li>3 分の 1 mL にペレット細胞滅菌 1x PBS、162 x g 3 分で室温の遠心分離によって続いて再懸濁します常温 162 x g で細胞をスピンします。</li>
	<li>500 μ L の 10 を含む 1x PBS でペレットの細胞を再懸濁します %fbs と 0、5、10、20、または用量調節の 40 μ M CFSE 37 oC 暗闇の中で 10 分間の細胞懸濁液を孵化させなさいと。</li>
	<li>スピン ・ ダウン 3 分間室温で 162 x g でセルと 4 ml の 1% を含む DMEM の小球形にされた細胞を再懸濁します FBS。この洗浄工程を 3 回繰り返します。DMEM 最終的な洗浄のためだけの 4 ml 小球形にされた細胞を再懸濁します。</li>
	<li>尾静脈注射や CFSE 分類された細胞を蛍光活性化細胞のソーティング (FACS) による単一細胞の蛍光強度を定量化するために対象します。 注: は、FACS 解析や尾静脈注射を実行する前に氷の上細胞を保ちます。</li>
</ol>4. 肺植民地化アッセイ
<ol><li>20 μ m CFSE 分類されるセルを準備 (ステップ 3.1 3.4 を参照)。 注: 腫瘍細胞、FACS 解析から滴定結果に基づいてラベル付けのため CFSE の作業量を決定する (ステップ 3.3 を参照)。</li>
	<li>4-6 週のツインテールを暖かい-古い男性 c57bl/6 マウス (6 マウス) マウス尾静脈を拡張するためのマウスでごとに 5-10 分のハロゲン ランプを使用。</li>
	<li>徹底的にミックスし、(5 × 106セル/mL の最終的な細胞密度) の細胞懸濁液で任意の気泡を回避 (26Gx1/2) 1 mL 注射器 CFSE 分類された腫瘍細胞を吸引します。</li>
	<li>慎重に 1 を注入 x106 CFSE 分類された腫瘍細胞マウス落で提出する必要がありますマウスの尾静脈に DMEM を 200 μ l 添加します。 注: 注入中尾静脈の内腔に針を直接配置した場合腫瘍細胞必要があります簡単に配信循環に注射器にハードにプッシュすることがなく。腫瘍細胞をプッシュするは難しいが場合、彼らほとんど挿入されている尾静脈外の皮下組織に。</li>
	<li>マウス静脈内 CFSE 分類された腫瘍細胞を受信した 2 つのグループに分ける: 1 つのグループは共焦点顕微鏡に続いて肺灌流を受けるし、肺植民地化アッセイおよび他の 1 の ImageJ 定量化が残される 4 - 5 だけで長期肺植民地における週間の試金します。</li>
	<li>20、38、45 h 以上との時間コースと用量依存の滴定の間に静脈内注入 1 × 106腫瘍細胞はよく受け入れられ、適切な anesthetizer2350 75 mg/kg zoletil 50, 担癌マウスを麻酔します。 注: 麻酔中の乾燥を防ぐためのマウスの目に獣医軟膏を使用。</li>
	<li>縦外科はさみで皮膚と胸部に腹部から皮下組織を切る。外科はさみと心臓と肺を完全に公開するための鉗子で胸腔内を開きます。 注: 血管を切断しないように注意ください。</li>
	<li>上大静脈 (SVC) と下大静脈 (IVC) 肺灌灌流液の逆流を防ぐために滅菌手術用縫合糸とを結ぶ。</li>
	<li>肺から灌流液を排出する裂 (約 2-4 mm) を開く手術ハサミで左心室の壁をカットします。</li>
	<li>1x PBS を右心室に 3 mL 注射器で注入し、肺は完全に薄いに赤みを帯びた色からターンまで肺灌一定の吸引、排水ソリューションを削除します。</li>
</ol>5. 共焦点顕微鏡イメージングと肺植民地化腫瘍細胞の解析
<ol><li>胸腔内から今薄い肺を取り外し、外科はさみ鉗子24と気管と結合組織の靭帯の切除によって 5 つの葉。</li>
	<li>肺葉の配置の 2 つの棒の間にスペースを持つ網状テクスチャーを生成する担架のような肺ホルダーに示すよう図 3 bにナイロン縫合糸を巻き約二本の金属棒を用意します。6 cm 皿肺ホルダーをセットします。 注: 肺ホルダーは、共焦点顕微鏡の対物レンズの下に肺葉を安定させるために使用されます。</li>
	<li>ロッジ、肺ホルダーの網状組織、肺葉を修正します。1x PBS で肺葉を湿らすし、カバーします。</li>
	<li>件名記録肺植民地化腫瘍細胞蛍光画像をキャプチャする共焦点顕微鏡に肺のホルダーに肺葉をかくまっている 6 cm 培養皿です。</li>
	<li>イメージングのための対物レンズを使用して、(5 X、MPLN、NA: 0.1、WD: 20、空気)。</li>
	<li>NIBA (励起/蛍光; 470-495 nm/510-550 nm) にフィルター ホイールを回転、488 nm レーザーを使って、エキサイト CFSE 明らかに肺の葉に蛍光ドットのイメージを視覚化します。</li>
	<li>(マイタイ HP DeepSee レーザー) のフィルター ホイール R690 を回転 2.0 でスキャンする μ s/ピクセル スキャン速度し、HV、ゲインとオフセットを最適化レベル。</li>
	<li>10 で顕微鏡のソフトウェアを使用して蛍光画像 (512 × 512 ピクセル) をキャプチャ μ s/ピクセル スキャン速度。</li>
	<li>定量化し、前述21として ImageJ とグラフパッド ソフトウェアを用いた顕微鏡画像の統計的な分析します。</li>
</ol>6. 長期的な肺の植民地化の試金
メモ: 手順 4.1 4.5 から繰り返します。
<ol><li>4-5 週間の腫瘍細胞接種後マウスを犠牲にし、1 ~ 2 日間ブアン液25彼らの肺を修正します。</li>
	<li>定量化し、統計的に分析ソフトウェア21マウス肺から腫瘍結節。</li>
</ol>

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一緒に長期間肺植民地化アッセイ、短期的には遠く離れた臓器に Ctc によって肺菌を体内を用いてここで我々 の方法論は明確に発表し、植民地化で Ctc に組み立てられた polyFN の特定の役割を区別肺の血管外漏出と転移プロセス18,19,20,21につながった。直接確認できなかった長期の細胞追跡 CFSE 肺灌流前まで 3 日間静脈内注入の Ctc をトレースし、定量的な目的のために十分な緑の蛍光性を保持することができましたと細胞をラベルが腫瘍細胞が血管内腔内に位置していたかはすでにに血管からバリウムしました。この問題、赤い蛍光を解決するためにローダミン標識デキストラン レクチンの内皮細胞に発現する非具体的バインドすることができるが肺灌流28,29,中に肺血管をラベルに使用することがあります。30. にもかかわらず CFSE が長期の細胞追跡、その蛍光強度であるという事実が半減すべての細胞分裂の27、ラベリング技術における it 活用の可能性を制限します。この問題を回避するためにそれが望まれるラベリング CFSE 量は体内の全期間の実験し、セルに任意の治療が適用されているセルに影響を与えませんの検出可能なままに細胞の十分です増殖。肺植民地化 shScr と shFN Ctc の定量化と比較は、別のマウスで行われた、2 つのグループ間の違いの個人差によるものであると主張可能性があります。異なるラベルの付いたセル蛍光を発する色素 (例えばCFSE/CM-diI) または安定 GFP/した dsRed 発現は腫瘍の 2 つのタイプの混合物、このような変化を除外するには、肺植民地で同じ動物に付随して静脈内注入される可能性があります。31,32,33の試金します。クローン効果細胞クローンを安定して整理した技術から生じる蛍光蛋白質を発現させた細胞はクローン十分に強い蛍光34,35,と注目に値する36,37全体異種個体集団38,39,40を表す典型的でないクローンの細胞になります。肺植民地化アッセイに腫瘍のセルに任意の蛍光タンパク質の安定したトランスフェクションを希望する場合全体として腫瘍細胞のトランスフェクション効率を高める必要がありますより良い特性を維持元セルのクローン作成よりも十分な蛍光41,42を持つ集団。
肺血流のアッセイは、肺毛管システムを具体的には逮捕ではなく、いくつかの静脈内に注入された腫瘍細胞が機械的にトラップおよび肺の毛細血管網内で詰まりがちで必要な肺の植民地化の手順します。肺毛細血管内腔43,44の幅より Ctc の平均的より大きい直径のための組織。肺の灌なし肺植民地化腫瘍細胞の定量が誤って機械的に詰まった細胞45,46,47を数えることによって過大評価であります。肺が灌流されて、場合でも、その他の問題は残る。例えば、まだ肺植民地化腫瘍細胞内腔内皮細胞上にあるまたはが既に血管からバリウムしたかどうかを区別することは困難です。この問題を解決するには前述のデキストランのローダミン共役と血管を染色が役に立つ30,48,49あります。また、腫瘍の血管外漏出の定量化が必要な場合カルシウム キレート剤 EDTA/グリコールエーテルジアミン四酢酸または非特異的プロテアーゼ トリプシンで使用できます灌流バッファー カルシウム依存性および非依存を阻害する腫瘍細胞接着イベント50,51,52。 したがって、残りの肺組織に腫瘍細胞が見なされるバリウムしました。
肺植民地化腫瘍細胞の定量化, 灌流肺しばしば伝統的な共焦点顕微鏡にさらされます。ただし、組織の深さの可測性は組織の自家蛍光特性と蛍光散乱効果、レンダリングより深い組織検出できない53,54の一部のために制限されます。従来の共焦点顕微鏡よりも高感度 2 光子顕微鏡は、近赤外線で生体試料 UV よりも大幅に少ない吸収と 2 光子励起に使用されてこのような問題の解決に適しているか厚い標本55,56,57をイメージングに適した手法を青-緑色の光になります。腫瘍細胞の肺植民地化は、個々 の動物の全体の肺内肺植民地化腫瘍細胞の全体の数が含まれていないいくつかの代表的な共焦点画像で腫瘍細胞の数を平均することによってカウントされます。肺の植民地化の試金で全体の肺を定量化する安定ルシフェラーゼを発現する腫瘍細胞を用いることができるし、灌流の肺は、IVIS 中断された腫瘍細胞の存在下での静脈内接種後の画像を受けることがルシフェリン46,58,59。また、灌流の肺を部分にみじん切り、プロテアーゼ、例えば懸濁液60,61に単一細胞を放出、コラゲナーゼ酵素消化を受ける可能性があります。腫瘍細胞の蛍光染料でまたは安定発現する蛍光タンパク質は蛍光活性化セル (FACS) 解析56,62を並べ替え、定量化できます。

転移癌死1,2の主要な原因であります。主な組織由来腫瘍細胞懸濁液の循環を入力し、彼らの前に様々 な血行性課題、例えばアノイーキス、免疫の攻撃および血圧や幾何学的な制約からせん断応力に起因する損害を生き残る遠隔臓器転移3,4,5,6の成功を口述の重要なステップを植民地化することができます。そのため、積極的な努力は現在循環腫瘍細胞 (CTCs) を特徴付けると腫瘍悪性度、転移、がん患者7,8の生存率とこれらの特性を関連付けることで行われています。,9. がん転移のプロセスは特に体内イベントを示しています、動物モデルは転移10、11,12 の完全全身プロセスをキャプチャする唯一の方法.
CTCs 遠隔臓器1,2の植民地化を含む複数の携帯電話イベントを介して転移腫瘍組織になります。ただし、最も一般的に使用される転移アッセイ13,14,15は遠隔臓器の CTC を植民地化を観察する方法を行いません。したがって、CTC の植民地化の可視化のため体内の分析設計が急務します。いくつか体内と体外の短い用語肺植民地化の試金に設計されている、問題および不利な点のまま。例えば、緑色蛍光タンパク質 (GFP) をしながらの試金の過剰発現の腫瘍細胞は、これらに使用されている22,23, 安定 transfect し、十分な GFP の蛍光強度の下で腫瘍細胞クローンの作成にかかる時間顕微鏡。同様が長期細胞トレーサー CFSE による腫瘍細胞の一時的な染色は、gfp 発現する腫瘍細胞を置き換えるに雇われている、それは CFSE 分類された腫瘍細胞が接続されているかどうかを判断することは困難または内だけに存在します摘出臓器16,17の血管。
批判的に転移腫瘍組織18,19,20,21,22 の最終的な確立に貢献する高分子フィブロネクチン (polyFN) Ctc の表面上で組み立てが見つかりました.ここでは、短期的には肺の植民地化の試金が中断されたルイス肺癌細胞 (Llc) 安定 FN shRNA (shFN) またはスクランブル shRNA (shScr) を表現し、事前の付いた CFSE c57bl/6 マウスに静脈内接種を行った。2 〜 3 日後マウス肺最初灌リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 受ける前に血管内の未接続の Ctc を完全に削除する共焦点顕微鏡と肺をくわえて Llc の定量化します。明確に示した肺植民地化 shFN Llc の数と腫瘍結節はあった shScr Llc、実質的に植民地化の Ctc の成長を促進する上で Ctc で polyFN アセンブリの役割を裏付けると比較して大幅に削減、肺。我々 の研究は癌転移における polyFN の役割の検討をさらに保証します。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin&#160;(BSA)</td>
			<td>Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan)</td>
			<td>101-9048-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bouin&#39;s Fluid</td>
			<td>MCC(medical chemical corporation)/POISON</td>
			<td>456-A-1GL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFSE Proliferation Dye</td>
			<td>ebiosciences</td>
			<td>65-0850-85</td>
			<td>Full name: Carboxyfluorescein succinimidyl ester</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Media (DMEM)&#160;</td>
			<td>(Gibco)ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12100-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan)</td>
			<td>101-6381-92-6</td>
			<td>For prepared trypsin-EDTA solution( Final concentration: 0.53mM )&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>(Gibco)ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10437-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lewis lung carcinoma (LLC)</td>
			<td>ATCC, Manassas, VA, USA</td>
			<td>CRL-1642</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine, USP&#160;</td>
			<td>(Gibco)ThermoFisher Scientific</td>
			<td>21051-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan)</td>
			<td>101-7447-40-7</td>
			<td>For prepared 1X PBS ( Final concentration: 2.7mM )</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic (KH2PO4)</td>
			<td>Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan)</td>
			<td>101-7778-77-0</td>
			<td>For prepared 1X PBS ( Final concentration: 1.8mM )</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan)</td>
			<td>101-7647-14-5</td>
			<td>For prepared 1X PBS ( Final concentration: 137mM )</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4)</td>
			<td>Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan)</td>
			<td>101-10039-32-4</td>
			<td>For prepared 1X PBS ( Final concentration: 10mM )</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T6146</td>
			<td>0.5 g mix with 100 mL 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T4799</td>
			<td>For prepared trypsin-EDTA solution ( Final concentration: 5g/L )</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zoletil 50</td>
			<td>Virbac</td>
			<td></td>
			<td>To dilute with 1X PBS&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact Tabletop Centrifuge 2420</td>
			<td>KUBOTA Co.</td>
			<td>2420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture dish (6cm)</td>
			<td>Wuxi NEST Biotechnology Co.</td>
			<td>705001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable syringe (with needle)</td>
			<td>Perfect Medical Industry Co.</td>
			<td></td>
			<td>24G/3 cm;3 ml &#38; 26G/0.5 cm;1 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>End over end mixer</td>
			<td>C.T.I YOUNG CHENN</td>
			<td>TS-20</td>
			<td>For suspended cells recovery&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSCalibur (FACS)</td>
			<td>BD biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Dimeda</td>
			<td>10.102.14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forma Direct Heat CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td>HEPA CLASS 100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse restrainer (Cylindrical Restrainer 15-30 gm)</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>51338</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiphoton Confocal Microscope BX61WI</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV1000MPE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer counting chamber</td>
			<td>Marienfeld-Superior</td>
			<td>640010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissor</td>
			<td>Dimeda</td>
			<td>08.370.11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical sutures&#160;</td>
			<td>UNIK SURGICAL SUTURES MFG. CO.</td>
			<td>NO. 0034</td>
			<td>Black Braided silk; non-absorbable (25YD; U.S.P. 4/0)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>Wuxi NEST Biotechnology Co.</td>
			<td>615001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Greiner tube</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>188271</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the establishment of a lung colonization assay for circulating tumor cell visualization in lung tissues

転移は癌死の主要な原因です。血中循環がん細胞 (Ctc) Ctc によって肺を植民地化が非常に初期の肺転移過程に貢献、がん転移を促進する上での役割を積極的に検討されている.そのため、動物モデルが完全全身転移プロセスをキャプチャする唯一の方法です。体内の肺植民地化アッセイを設けて血管漏出する Ctc の貢献を調べるため実験的デザインの以前に問題が発生したことを考える長期的蛍光セル-トレーサー、carboxyfluoresceinサクシニミジルエステル (CFSE) が中断された腫瘍細胞をラベルに使用した、閉じ込められた Ctc 以外特に肺の除去、共焦点イメージングと定量前をクリアする肺灌流を行った。CTC 表面組み立てられた高分子フィブロネクチン (polyFN) は、転移性腫瘍組織の最終的な確立で肺を植民地化を仲介する発見されています。ここでは、特に肺の植民地化および血管外漏出の Ctc で polyFN アセンブリの要件をテストするため短期を行った肺植民地化アッセイを中断ルイス肺癌細胞 (Llc) (shFN) の FN-shRNA を安定に発現するかスクランブル shRNA (shScr) と 20 の前にラベルが付いた CFSE の μ M は c57bl/6 マウスに静脈内接種しました。マウス肺を植民地化する shFN LLC 細胞の能力は shScr LLC 細胞と比較すると大幅減少したことを実証します。したがって、この短期的な方法論が広く適用特に肺を植民地化する循環内で Ctc の能力を発揮する可能性があります。

体内の肺の植民地化分析を実行する前に肺の植民地化および/または転移を促進する管外中断された腫瘍細胞上の polyFN を仲介するかどうかをテストするのには、図 1 aに示されているように我々 まず滴定別CFSE は細胞透過性と共有抱合体細胞内アミン含有分子26,27中断された腫瘍細胞のと時間のかなり長い期間、細胞のままである蛍光化合物の濃度。その腫瘍細胞が効果的にラベルの付いた CFSE に示す図 1 bとしての用量依存的にわかった。6 CFSE 分類5 LLC 細胞/ml として 20 μ M の高原に達してほぼ x10 は図 1に示します。
オフに閉じ込められた CTCs 非具体的に肺静脈内注入マウス付けの灌流 CFSE ラベル LLC 細胞を行ったおかげで、豊富な狭窄キャピラリー システム CTCs の肺血管内の流れを妨げる可能性があります物理的に、図 4に示すように、各時点での肺の除去の前に図 1 aに示されています。示すよう、灌流前に、肺が血の存在のために明らかに赤みを帯びた、 の左パネル図 2。肺になったの右側のパネルの図 2で示されているように 10-15 ml の 1x PBS、灌流後薄かった。
灌流のマウス肺は胸膜腔から削除された、直後後、肺葉が分離し、1x PBS、肺葉を徹底的にカバーを図 3 aに示すように、料理に肺ホルダーにマウントされています。図 3Bに示すよう肺ホルダーにマウントされている肺葉は共焦点蛍光顕微鏡図 3 aに示すように服従しました。肺を植民地化 CFSE 分類された腫瘍細胞に示すようをイメージしました、 の上部のパネル図 3 に示すように白黒画像になって、 の下のパネル図 3画像 J ソフトウェアと肺を植民地化の定量化を容易にします。
我々 は 20 μ m CFSE 分類され肺 perfusions と共焦点顕微鏡イメージングを実行する前にから 24-72 時間の経過を待っていた shScr または shFN のいずれかの LLC 細胞を静脈内注射しました。図 4 b のに示されている 6 マウス ImageJ ソフトウェアを図 4 aに示すように細胞をこと大幅 shScr LLC 細胞より少ない shFN LLC 細胞として数えられ 38 h、45 h 時点で明らかに肺植民地化腫瘍の定量化.肺植民地 shScr と shFN LLC 細胞が徐々 に減少された循環の既に植民地化された LLC 細胞に対しても免疫によって出される連続的な細胞毒性による可能性が高い理由。完全に、示唆された Ctc の組み立て、polyFN 確かに静脈内の因数を受信するいくつかのマウスの結果によって明らかにされた肺の完全な転移につながる LLC 細胞肺植民地を調停する際に必要なAloneuntil 肺腫瘍結節は実験的腫瘍転移アッセイで開発された図 5 aに示すように残された肺植民地化アッセイの図 4に示すように CFSE 分類された shScr と shFN LLC 細胞と 5B 。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56761/56761fig1.jpg"> 図 1: CFSE 濃度肺植民地化アッセイにおける腫瘍細胞の分類のための滴定します。(A)肺の植民地化の試金のプロトコル] セクションで詳細として実験的転移の分析手順の模式図。(B)を各種濃度の CFSE 染色された LLC 細胞 CFSE の蛍光強度の FACS 解析。(C)蛍光強度は、CFSE 濃度の関数としてプロットされました。<a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56761/56761fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56761/56761fig2.jpg"> 図 2: 肺灌流の前後にします。前に肺の代表的なイメージ (unperfused;Unperf。)その後 (潅流;Perf。)肺灌流を行います。金の星: 心。白い矢印: IVC/SVC を閉じてネクタイ。赤い矢印: 灌流の前後に同じマウスの肺。<a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56761/56761fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56761/56761fig3.jpg"> 図 3: 肺ホルダー蛍光共焦点の顕微鏡検査のために潅流肺葉の取り付け。共焦点の顕微鏡検査のため肺ホルダーに肺取付の(A)の方式です。(B)肺ホルダー 3 灌流, 肺を肺葉の代表的なイメージ。(C) CFSE 蛍光画像 J ソフトウェアによって定量化のための LLC 細胞の肺植民地化の代表的なイメージ。上部パネル: レギュラー イメージングします。下部のパネル: 白黒イメージを反転します。<a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56761/56761fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56761/56761fig4.jpg"> 図 4: 肺植民地化アッセイにおける肺灌流後植民地 shScr と shFN LLC 細胞に時間コース イメージング、定量化、および肺の統計的解析します。(A)代表的な白黒のイメージ (蛍光画像から変換) 広範な肺灌流後の図のようにさまざまな時点で肺の血管系の植民地化された shScr および shFN の LLC 細胞の。点線は、フォーカス共焦点肺組織領域のエッジを表します。(B)として肺植民地化 LLC 細胞に関する統計分析の定量化及びは 5 絶対代表画像/肺葉/マウスを平均することによって (A) で視覚化。注: 各バーは、各フォーカスで共焦点領域の平均蛍光強度を示します。データを統計的に 6 匹のマウスから分析し、報告平均 ± SD;n. s. を意味する意味;* p を意味する < 0.05;* * p を意味する < 0.01;二元。<a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56761/56761fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56761/56761fig5.jpg"> 図 5: 体内 CTC 植民地化アッセイで長期的に肺の腫瘍結節を減少 CFSE ラベル LLC 細胞における FN 発現をサイレンシングします。(A)ブアン液固定マウス肺腫瘍ノジュールは CFSE 分類された shScr または shFN LLC 細胞に由来。(B)の定量化と肺の腫瘍結節統計分析。平均 ± SD のデータが報告されます。: p < 0.001;n = グループあたり 6対になっていない t 検定。<a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56761/56761fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

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The Establishment of a Lung Colonization Assay for Circulating Tumor Cell Visualization in Lung Tissues

血中循環がん細胞 (Ctc) がん転移中に肺を植民地化を促進する上での役割を解読する動物モデルです。ここでは、私たちが設立され、正常に実行体内法を具体的にテスト肺植民地化の Ctc の高分子フィブロネクチン (polyFN) アセンブリの要件。

肺組織に腫瘍のセルの視覚化を循環させるため肺植民地化アッセイの確立

Metastasis is the major cause of cancer death. The role of circulating tumor cells (CTCs) in promoting cancer metastasis, in which lung colonization by ...

the-establishment-lung-colonization-assay-for-circulating-tumor-cell

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Cancer Research

9.2K ビュー.  National Cheng Kung University. 血中循環がん細胞 (Ctc) がん転移中に肺を植民地化を促進する上での役割を解読する動物モデルです。ここでは、私たちが設立され、正常に実行体内法を具体的にテスト肺植民地化の Ctc の高分子フィブロネクチン (polyFN) アセンブリの要件。

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Lung Tumor Cell Recruitment Assay

To investigate the molecular mechanisms governing tumor metastasis, various assays using the mouse as a model animal have been proposed. Here, we demonstrate a simple assay to evaluate tumor cell extravasation or micrometastasis. In this assay, tumor cells were injected through the tail vein, and after a short period, the lungs were dissected and digested to count the accumulated labeled tumor cells. This assay skips the initial step of primary tumor invasion into the blood vessel and facilitates the study of events in the distant organ where tumor metastasis occurs. The number of cells injected into the blood vessel can be optimized to observe a limited number of metastases. It has been reported that stromal cells in the distant organ contribute to metastasis. Thus, this assay could be a useful tool to explore potential therapeutic drugs or devices for prevention of tumor metastasis.

This manuscript describes a method to quantify tumor cell accumulation in the lungs in an animal model of tumor metastasis.

肺腫瘍細胞募集試験

To investigate the molecular mechanisms governing tumor metastasis, various assays using the mouse as a model animal have been proposed. Here, we ...

がん研究

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the context of a whole organism. Sophisticated techniques to generate genetic mosaics facilitate induction of visually marked, genetically defined clones surrounded by normal tissue. The clones can be analyzed through diverse molecular, cellular and omics approaches. This study describes how to generate fluorescently labeled clonal tumors of varying malignancy in the eye/antennal imaginal discs (EAD) of Drosophila larvae using the Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. It describes procedures how to recover the mosaic EAD and brain from the larvae and how to process them for simultaneous imaging of fluorescent transgenic reporters and antibody staining. To facilitate molecular characterization of the mosaic tissue, we describe a protocol for isolation of total RNA from the EAD. The dissection procedure is suitable to recover EAD and brains from any larval stage. The fixation and staining protocol for imaginal discs works with a number of transgenic reporters and antibodies that recognize Drosophila proteins. The protocol for RNA isolation can be applied to various larval organs, whole larvae, and adult flies. Total RNA can be used for profiling of gene expression changes using candidate or genome-wide approaches. Finally, we detail a method for quantifying invasiveness of the clonal tumors. Although this method has limited use, its underlying concept is broadly applicable to other quantitative studies where cognitive bias must be avoided.

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

This protocol demonstrates how to generate fluorescently marked, genetically defined clonal tumors in the Drosophila eye/antennal imaginal discs (EAD). It describes how to dissect the EAD and brain from the third instar larvae and how to process them to visualize and quantify gene expression changes and tumor invasiveness.

ザ<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;成虫盤腫瘍モデル：遺伝的モザイクを用いた遺伝子発現と腫瘍侵襲性の可視化と定量化

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Practical Considerations in Studying Metastatic Lung Colonization in Osteosarcoma Using the Pulmonary Metastasis Assay

The pulmonary metastasis assay (PuMA) is an ex vivo lung explant and closed cell culture system that permits researchers to study the biology of lung colonization in osteosarcoma (OS) by fluorescence microscopy. This article provides a detailed description of the protocol, and discusses examples of obtaining image data on metastatic growth using widefield or confocal fluorescence microscopy platforms. The flexibility of the PuMA model permits researchers to study not only the growth of OS cells in the lung microenvironment, but also to assess the effects of anti-metastatic therapeutics over time. Confocal microscopy allows for unprecedented, high-resolution imaging of OS cell interactions with the lung parenchyma. Moreover, when the PuMA model is combined with fluorescent dyes or fluorescent protein genetic reporters, researchers can study the lung microenvironment, cellular and subcellular structures, gene function, and promoter activity in metastatic OS cells. The PuMA model provides a new tool for osteosarcoma researchers to discover new metastasis biology and assess the activity of novel anti-metastatic, targeted therapies.

The goal of this article is to provide a detailed description of the protocol for the pulmonary metastasis assay (PuMA). This model permits researchers to study metastatic osteosarcoma (OS) cell growth in lung tissue using a widefield fluorescence or confocal laser-scanning microscope.

肺転移アッセイを用いた骨肉腫の肺転移を植民地化の勉強に実用的な考慮事項

The pulmonary metastasis assay (PuMA) is an ex vivo lung explant and closed cell culture system that permits researchers to study the biology of lung ...

Utilization of Ultrasound Guided Tissue-directed Cellular Implantation for the Establishment of Biologically Relevant Metastatic Tumor Xenografts

Preclinical testing of anticancer therapies relies on relevant xenograft models that mimic the innate tendencies of cancer. Advantages of standard subcutaneous flank models include procedural ease and the ability to monitor tumor progression and response without invasive imaging. Such models are often inconsistent in translational clinical trials and have limited biologically relevant characteristics with low proclivity to produce metastasis, as there is a lack of a native microenvironment. In comparison, orthotopic xenograft models at native tumor sites have been shown to mimic the tumor microenvironment and replicate important disease characteristics such as distant metastatic spread. These models often require tedious surgical procedures with prolonged anesthetic time and recovery periods. To address this, cancer researchers have recently utilized ultrasound-guided injection techniques to establish cancer xenograft models for preclinical experiments, which allows for rapid and reliable establishment of tissue-directed murine models. Ultrasound visualization also provides a noninvasive method for longitudinal assessment of tumor engraftment and growth. Here, we describe the method for ultrasound-guided injection of cancer cells, utilizing the adrenal gland for NB and renal sub capsule for ES. This minimally invasive approach overcomes tedious open surgery implantation of cancer cells in tissue-specific locations for growth and metastasis, and abates morbid recovery periods. We describe the utilization of both established cell lines and patient derived cell lines for orthotopic injection. Pre-made commercial kits are available for tumor dissociation and luciferase tagging of cells. Injection of cell suspension using image-guidance provides a minimally invasive and reproducible platform for the creation of preclinical models. This method is utilized to create reliable preclinical models for other cancers such as bladder, liver and pancreas exemplifying its untapped potential for numerous cancer models.

Here, we present a protocol to utilize ultrasound-guided injection of neuroblastoma (NB) and Ewing's sarcoma (ES) cells (established cell lines and patient-derived tumor cells) at biologically relevant sites to create reliable preclinical models for cancer research.

超音波の利用ガイド生物学的関連性の転移性腫瘍の異種移植片の確立のため組織指示細胞注入

Preclinical testing of anticancer therapies relies on relevant xenograft models that mimic the innate tendencies of cancer. Advantages of standard ...

Acellular and Cellular Lung Model to Study Tumor Metastasis

It is difficult to isolate tumor cells at different points of tumor progression. We created an ex vivo lung model that can show the interaction of tumor cells with a natural matrix and continual flow of nutrients, as well as a model that shows the interaction of tumor cells with normal cellular components and a natural matrix. The acellular ex vivo lung model is created by isolating a rat heart-lung block and removing all the cells using the decellularization process. The right main bronchus is tied off and tumor cells are placed in the trachea by a syringe. The cells move and populate the left lung. The lung is then placed in a bioreactor where the pulmonary artery receives a continual flow of media in a closed circuit. The tumor grown on the left lung is the primary tumor. The tumor cells that are isolated in the circulating media are circulating tumor cells and the tumor cells in the right lung are metastatic lesions. The cellular ex vivo lung model is created by skipping the decellularization process. Each model can be used to answer different research questions.

Here, we present a protocol for an ex vivo lung cancer model that mimics the steps of tumor progression and helps to isolate a primary tumor, circulating tumor cells, and metastatic lesions.

無細胞性と細胞の肺転移モデル

It is difficult to isolate tumor cells at different points of tumor progression. We created an ex vivo lung model that can show the interaction of tumor ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as tumors. Because digital polymerase chain reactions (PCR) enable the precise quantification of DNA copy number variants, they are becoming an essential tool for detecting rare genetic variations, such as drug-resistant mutations. It is expected that molecular diagnoses using digital PCR (dPCR) will be available in clinical practice in the near future; thus, how to efficiently conduct dPCR with human genetic material is a hot topic. Here, we introduce a method to detect Adenomatous polyposis coli (APC) somatic mosaicism using dPCR with the chip-in-a-tube format, which allows eight dPCR reactions to be simultaneously conducted. Care should be taken when filling and sealing the reaction mixture on the chips. This article demonstrates how to avoid the over- and underestimation of positive partitions. Furthermore, we present a simple procedure for collecting the dPCR product from the partitions on the chips, which can then be used to confirm the specific amplification. We hope that this methods report will help promote the dPCR with the chip-in-a-tube method in genetic research.

Digital polymerase chain reaction (PCR) is a useful tool for the high-sensitivity detection of single nucleotide variants and DNA copy number variants. Here, we demonstrate key considerations for measuring rare variants in the human genome using digital PCR with the chip-in-a-tube format.

チップ チューブ形式を使用して散発的な家族性大腸腺腫症患者の遺伝的変異のデジタル ポリメラーゼ連鎖反応分析

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

Digital Analysis of Immunostaining of ZW10 Interacting Protein in Human Lung Tissues

The purpose of this study is to introduce a methodology of the immunostaining of human lung tissues, followed by whole-slide digital scanning and image analysis. Digital scanning is a fast way to scan a stack of slides and produce digital images with high quality. It can produce concordant results with conventional light microscopy (CLM) by pathologists. Furthermore, the availability of digital images makes it possible that the same slide can be concurrently observed by multiple people. Moreover, digital images of slides can be stored in a database, which means the long-term deterioration of glass slides is avoided. The limitations of this technique are as follows. First, it needs high-quality prepared tissue and the original immunohistochemistry (IHC) slides without any damage or excess sealant residue. Second, tumor or nontumor areas should be specified by experienced pathologists before the analysis using software, in order to avoid any confusion about the tumor or nontumor areas during scoring. Third, the operator needs to control the color reproduction throughout the digitization process in whole-slide imaging.

ZW10 interacting protein (ZWINT) participates in the mitotic spindle checkpoint and the pathogenesis of carcinoma. Here, we introduce a methodology of the immunostaining of ZWINT in human lung cancer tissues, followed by the digital scanning of whole slides and image analysis. This methodology can provide high-quality digital images and reliable results.

ヒト肺組織におけるZW10相互作用タンパク質の免疫染色のデジタル解析

The purpose of this study is to introduce a methodology of the immunostaining of human lung tissues, followed by whole-slide digital scanning and image ...

Detection and Monitoring of Tumor Associated Circulating DNA in Patient Biofluids

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular sub-classification and temporal monitoring of tumor response to therapy. Here, we describe our dPCR-based method for the detection of tumor somatic mutations in cell free DNA (cfDNA), readily available in&#160;patient biofluids. Although limited in the number of mutations that can be tested for in each assay, this method provides a high level of sensitivity and specificity. Monitoring of mutation abundance, as calculated by MAF, allows for the evaluation of tumor response to therapy, thereby providing a much-needed supplement to radiographic imaging.

Here, we present a protocol to detect tumor somatic mutations in circulating DNA present in patient biological fluids (biofluids). Our droplet digital polymerase chain reaction (dPCR)-based method enables quantification of the tumor mutation allelic frequency (MAF), facilitating a minimally invasive complement to diagnosis and temporal monitoring of tumor response.

患者の生体流体における腫瘍関連循環DNAの検出とモニタリング

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular ...

Semi-automatic PD-L1 Characterization and Enumeration of Circulating Tumor Cells from Non-small Cell Lung Cancer Patients by Immunofluorescence

Circulating tumor cells (CTCs) derived from the primary tumor are shed into the bloodstream or lymphatic system. These rare cells (1&#8722;10 cells per mL of blood) warrant a poor prognosis and are correlated with shorter overall survival in several cancers (e.g., breast, prostate and colorectal). Currently, the anti-EpCAM-coated magnetic bead-based CTC capturing system is the gold standard test approved by the U.S. Food and Drug Administration (FDA) for enumerating CTCs in the bloodstream. This test is based on the use of magnetic beads coated with anti-EpCAM markers, which specifically target epithelial cancer cells. Many studies have illustrated that EpCAM is not the optimal marker for CTC detection. Indeed, CTCs are a heterogeneous subpopulation of cancer cells and are able to undergo an epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) associated with metastatic proliferation and invasion. These CTCs are able to reduce the expression of cell surface epithelial marker EpCAM, while increasing mesenchymal markers such as vimentin. To address this technical hurdle, other isolation methods based on physical properties of CTCs have been developed. Microfluidic technologies enable a label-free approach to CTC enrichment from whole blood samples. The spiral microfluidic technology uses the inertial and Dean drag forces with continuous flow in curved channels generated within a spiral microfluidic chip. The cells are separated based on the differences in size and plasticity between normal blood cells and tumoral cells. This protocol details the different steps to characterize the programmed death-ligand 1 (PD-L1) expression of CTCs, combining a spiral microfluidic device with customizable immunofluorescence (IF) marker set.

The characterization of circulating tumor cells (CTCs) is a popular topic in translational research. This protocol describes a semi-automatic immunofluorescence (IF) assay for PD-L1 characterization and enumeration of CTCs in non-small cell lung cancer (NSCLC) patient samples.

免疫蛍光による非小細胞肺癌患者からの循環腫瘍細胞の半自動PD-L1特性図と列挙

Circulating tumor cells (CTCs) derived from the primary tumor are shed into the bloodstream or lymphatic system. These rare cells (1&#8722;10 cells per mL ...

Detection of Lung Tumor Progression in Mice by Ultrasound Imaging

With ~1.6 million victims per year, lung cancer contributes tremendously to the worldwide burden of cancer. Lung cancer is partly driven by genetic alterations in oncogenes such as the KRAS oncogene, which constitutes ~25% of lung cancer cases. The difficulty in therapeutically targeting KRAS-driven lung cancer partly stems from having poor models that can mimic the progression of the disease in the lab. We describe a method that permits the relative quantification of primary KRAS lung tumors in a Cre-inducible LSL-KRAS G12D mouse model via ultrasound imaging. This method relies on brightness (B)-mode acquisition of the lung parenchyma. Tumors that are initially formed in this model are visualized as B-lines and can be quantified by counting the number of B-lines present in the acquired images. These would represent the relative tumor number formed on the surface of the mouse lung. As the formed tumors develop with time, they are perceived as deep clefts within the lung parenchyma. Since the circumference of the formed tumor is well-defined, calculating the relative tumor volume is achieved by measuring the length and width of the tumor and applying them in the formula used for tumor caliper measurements. Ultrasound imaging is a non-invasive, fast and user-friendly technique that is often used for tumor quantifications in mice. Although artifacts may appear when obtaining ultrasound images, it has been shown that this imaging technique is more advantageous for tumor quantifications in mice compared to other imaging techniques such as computed tomography (CT) imaging and bioluminescence imaging (BLI). Researchers can investigate novel therapeutic targets using this technique by comparing lung tumor initiation and progression between different groups of mice.

This protocol describes the steps taken to induce KRAS lung tumors in mice as well as the quantification of formed tumors by ultrasound imaging. Small tumors are visualized in early timepoints as B-lines. At later timepoints, relative tumor volume measurements are achieved by the measurement tool in the ultrasound software.

超音波画像によるマウスにおける肺腫瘍の進行の検出

With ~1.6 million victims per year, lung cancer contributes tremendously to the worldwide burden of cancer. Lung cancer is partly driven by genetic ...