אנחנו אסירי תודה, רוברט Graffin, פאולין Duhant לתמיכה טכנית שלהם

פרוטוקול הניסוי נערך בהתאם להוראות מועצת הקהילות באירופה לניסוי בעל חיים (2010/63/האיחוד האירופי, 86/609/EEC ו- 87-848/EEC), אושרה על ידי החיה אתיקה הוועדה של אוניברסיטת נאמור (מוסר פרוייקט n ° 17-284 ). איור 1 מציג את שתי הגישות בהתאמה: transdiaphragmatic או זריקות אקו. השתמש עכברים C57bl/6J זכר (n = 18), בגילאי 3 עד 4 חודשים במחקר.
1. הכנת CTB פתרון
<ol><li>לזריקות transdiaphragmatic:<ol>
<li>להמיס את הכוח CTB במים סטריליים לריכוז 0.2% (w/v).</li>
		<li>טען µL 7.5 של CTB פתרון (0.2% w/v) ב סטרילי 10-µL-microsyringe עם מחט בקוטר 33 המצורפת (שיקוע בוטה או קצר) עבור כל עכבר.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להזרקה אקו:<ol>
<li>להמיס את הכוח CTB במים סטריליים לריכוז 0.1% (w/v).</li>
		<li>לטעון µL 20 של CTB פתרון (0.1% w/v) מזרק 500-µl-אינסולין סטרילי עם מחט 27-מד משופע עבור כל עכבר. הערה: הקפד להשתמש במים מזוקקים, סטרילי, כראוי להמיס את האבקה CTB. הפתרון ניתן לשמור ב 4 מעלות צלזיוס למשך חודש (לא להקפיא). את התמיסה שעלולים להיווצר לאחר כמה ימים. להביא את הפתרון לטמפרטורת החדר ומערבבים היטב בעזרת פיפטה לפני השימוש.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. הכנה לפני זריקות Intrapleural
<ol><li>לחטא כלי ניתוח לפני הניתוח, באמצעות מעקר אוטוקלב או חרוזי זכוכית. להכין מעיל נקיים לעשות ניתוח, להיפטר כלים כירורגיים. הערה: כל חומר המשמש במהלך הליך כירורגי צריך להיות סטרילי. כלי זה לא ניתן לעקר כגון microsyringe שאמור להימחק עם חומר מחטא (chlorhexidine) או צריך להיות חד-פעמי בלבד. המנתח צריך לשטוף את הידיים שלו עם חומר מחטא (chlorhexidine סקראב) לפני תחילת הניתוח. המנתח צריך ללבוש כפפות סטריליות facemask, חלוק נקי.</li>
	<li>שוקל חיה, ולפקח על המינון המתאים של הרדמה: הזרקה בקרום הבטן של הרדמה קוקטייל (למשל קטמין 100 מ"ג/ק"ג, חריגות השירותים הווטרינריים 5 מ"ג/ק"ג).</li>
	<li>לצבוט הבוהן ו/או לבדוק ההפסד של רפלקס palpebral כדי לקבוע אם העכבר הוא מורדם כראוי. להחיל משחה הוטרינר כדי להגן על הקרנית.</li>
	<li>לגלח בקפידה את העור הגחון (עבור הליך transdiaphragmatic) או ימנית צדדית בית החזה העור (עבור הליך אקו), בעזרת קוצץ שיער חשמלי. מגלחת טוב ורחב מספיק כדי למנוע שיער מקבל לתוך שדה הניתוח.</li>
	<li>להבטיח תנאים aseptic על-ידי יישום מקומי של 10% הפתרון יוד על האזור המגולח. להשתתף באתר כירורגית עם הפתרון יוד, וישתדלו לקרצף מהמרכז של האתר לעבר הפריפריה.</li>
	<li>השתמש כרית homeothermic לאורך כל הניתוח כדי לשמור על טמפרטורת גוף של החיה.</li>
</ol>3. Intrapleural זריקות באמצעות גישה Transdiaphragmatic
<ol><li>. תשכבי על העכבר anesthetized במצב פרקדן על משטח חימום מקם כרית גזה מגולגלת מתחת לצוואר של החיה. העכבר למבוגרים, להשתמש בפתקים גזה מגולגלת 0.5 ס מ עובי. קלטת זו pad ללוח ניתוח כדי למנוע תנועה אם בכלל.</li>
	<li>באמצעות להב אזמל, פצעים וחתכים בעור הגחון לאורך הקו האמצעי: בחתך של הסרעפת באזור הטבור תוך מתיחת עור רוחבית עם היד השנייה כדי להפוך את העור מתוח. אל תחיל לחץ רב מדי על הלהב כדי למנוע נזק איברים המשמש כבסיס.</li>
	<li>בעזרת מספריים קטנות, ניתוק בקפידה את העור מפני שרירי הבטן סביב החתך. הליך זה יעזור לתפירת השרירים ואת העור בנפרד בסוף הניתוח.</li>
	<li>לבצע בעזרת מספריים קטנות laparotomy. פתח את חלל הבטן על ידי ביצוע חתך בדש ברמה של הטבור. תחתכי את שרירי הבטן לאורך הקו הלבן ("linea alba") עד הסרעפת.</li>
	<li>על מנת להמחיש את פני הבטן הסרעפת, משכי שרירי הבטן בעזרת רטרקטורים מסחריים או תוצרת בית. הערה: אלה רטרקטורים יכול להיעשות מתוך מהדקי נייר בגודל midi בצורת L-הוק19.</li>
	<li>למתוח את שני הצדדים של פתיחת בטן, וכן הקלטת למטה דרק המעיל ספסל. למטב את ההארה של שדה הראייה כך פני הבטן הסרעפת היא לא יותר בתוך הצללים. המכשיר תאורה החזקים ביותר למטרה זו הוא מנורת LED עם קרני האור orientable.</li>
	<li>באמצעות פינצטה רך ביד אחת, תרים את התוספתן xyphoid ולפתוח האונות לרוחב של הכבד (איור 2 א). בעזרת מספריים קטנות ביד אחרים, בזהירות לחתוך רצועה suspensory, ללא פגיעה בכיס המרה או הסרעפת (איור 2B).</li>
	<li>באמצעות פינצטה רך ביד אחת, הרם את התוספתן xyphoid. לתפוס את המזרק המילטון וביד השנייה. יעד שלושה אתרים של הזרקת ב ריקמת לכסות את בחזה ובצלעות, בהתאמה, את האמצעי ואת האזורים crural (איור 3A, כניסה ב- 3B איור).</li>
	<li>כמו העובי הסרעפת מ 0.37 מ בסביבה עכברים7, הכנס את המחט לא יותר מ 1 או 2 מ מ מעבר הגיליון הסרעפת כדי למנוע נזקים ריאות במהלך הנשימה. לספק µL 2.5 של CTB פתרון (0.2% w/v) דרך הסרעפת נכון בכל אתר (איור 4B). ייצוב של הסרעפת אינה נדרשת.</li>
	<li>חזור על הליך זה עבור שלושת האתרים חולשת של הזרקה (איור 1 א'), ו contralaterally עבור תיוג דו צדדיים של הבריכה PhMN.</li>
	<li>כדי לסגור את האתר פתיחת בטן, תפר שרירי הבטן עם resorbable 4-0 בתפר. שימוש תפרים קטעה במרווחים קבועים על ידי 3 מ מ. הידוק העור סגור עם קטעי 9.0 mm פצע. הדק סיכות כדי למנוע חיה חליצה סטייפלס. שטח סטייפלס כ 5 מ מ אחד מהשני. יתר להדק את הפריטים הפצע, כמו זה יכול להוביל לריפוי לקוי.</li>
	<li>המזרק מיקרו לנקות עם מים מזוקקים למניעת סתימת. לאט לאט למשוך ולהוציא 2 - 3 פעמים. אל תצייר אוויר לתוך מזרק.</li>
</ol>4. Intrapleural הזרקת בגישה אקו
הערה: שיטה זו השראה מן ההליך המתואר חולדות4 , הותאם העכבר.
<ol><li>. תשכבי העכבר השמאלי למקם חמצן לרוחב, על כרית החימום (איור 4A) anesthetized</li>
	<li>לזהות את הצלעות השישית לשביעית תחת באזור המרפק על ידי מישוש ידני (איור 4B).</li>
	<li>בעוד עוזרת מרחיב נכון קידמה - ו הינד-הגפיים (איור 5A), הכנס את המזרק אוריינטציה cranially, tangentially תחת השישי או הצלע השביעית, 3 מ מ עמוקה מהעור, עם שפוע למטה (איור 1B , איור 5B).</li>
	<li>לרומם את המחט בעדינות כדי לאשר, על-ידי הרמת הצלעות למעלה, זה היא ממוצבת היטב לתוך חלל בית החזה (איור 5C, כניסות ב איור 1B).</li>
	<li>ייצוב נושם תנועות החזה על ידי הפעלת לחץ קל עם שתי אצבעות על הקיר החזה.</li>
	<li>בעוד אתה מחזיק את המזרק ביד אחרים, לספק 20 µL של CTB פתרון (0.1% w/v) זריקה אחת.</li>
</ol>5. לאחר הניתוח טיפול
<ol><li>מיד לאחר הניתוח, להניח את העכבר במצב חימום הימנית על משטח homeothermic להתאוששות. זה מבטיח את רכיב המעקב למרוח אותו על הצד הימני של חלל פלאורלי, מאפשר ניטור הנשימה של בעלי החיים.</li>
	<li>מחלקים 1 מ"ל של תמיסת סטרילית i.p. subcutaneously. לספק זריקות המשך טיפול אם החיה מופיע מיובש ו/או תשוש.</li>
	<li>ניהול subcutaneously 0.1 מ"ג/ק"ג של הבופרנורפין, פעמיים ביום במשך יומיים שלאחר הניתוח הראשון, כדי למזער את כאב פוטנציאליים. הערה: מוסדות רבים ממליצים שיכוך כאבים עם מודאלים מרובים עבור הליכים פולשניים, כגון פתיחת בטן מתוארים כאן. הדבר עשוי לכלול שימוש תרופות אנטי דלקתיות לא סטרואידיות (NSAID) ו/או סוכן הרדמה מקומית באתר החתך. תרופות אלו מועברים בדרך כלל לפני החתך הראשוני כדי למזער את הכאב המכנית.</li>
	<li>לפקח על חיות מדי יום עד המתת חסד.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Webber, C. L., Wurster, R. D., Chung, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cat+phrenic+nucleus+architecture+as+revealed+by+horseradish+peroxidase+mapping.">Cat phrenic nucleus architecture as revealed by horseradish peroxidase mapping.</a> Exp Brain Res. 35 (3), 395-406 (1979).</li><li>Goshgarian, H. G., Rafols, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phrenic+nucleus+of+the+albino+rat:+a+correlative+HRP+and+Golgi+study.">The phrenic nucleus of the albino rat: a correlative HRP and Golgi study.</a> J Comp Neurol. 201 (3), 441-456 (1981).</li><li>Gordon, D. C., Richmond, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topography+in+the+phrenic+motoneuron+nucleus+demonstrated+by+retrograde+multiple-labelling+techniques.">Topography in the phrenic motoneuron nucleus demonstrated by retrograde multiple-labelling techniques.</a> J Comp Neurol. 292 (3), 424-434 (1990).</li><li>Mantilla, C. B., Zhan, W. Z., Sieck, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrograde+labeling+of+phrenic+motoneurons+by+intrapleural+injection.">Retrograde labeling of phrenic motoneurons by intrapleural injection.</a> J Neurosci Methods. 182 (2), 244-249 (2009).</li><li>Nicaise, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+phrenic+motor+neuron+loss+and+transient+respiratory+abnormalities+after+unilateral+cervical+spinal+cord+contusion.">Early phrenic motor neuron loss and transient respiratory abnormalities after unilateral cervical spinal cord contusion.</a> J Neurotrauma. 30 (12), 1092-1099 (2013).</li><li>Nicaise, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phrenic+motor+neuron+degeneration+compromises+phrenic+axonal+circuitry+and+diaphragm+activity+in+a+unilateral+cervical+contusion+model+of+spinal+cord+injury.">Phrenic motor neuron degeneration compromises phrenic axonal circuitry and diaphragm activity in a unilateral cervical contusion model of spinal cord injury.</a> Exp Neurol. 235 (2), 539-552 (2012).</li><li>Nicaise, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degeneration+of+phrenic+motor+neurons+induces+long-term+diaphragm+deficits+following+mid-cervical+spinal+contusion+in+mice.">Degeneration of phrenic motor neurons induces long-term diaphragm deficits following mid-cervical spinal contusion in mice.</a> J Neurotrauma. 29 (18), 2748-2760 (2012).</li><li>Qiu, K., Lane, M. A., Lee, K. Z., Reier, P. J., Fuller, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phrenic+motor+nucleus+in+the+adult+mouse.">The phrenic motor nucleus in the adult mouse.</a> Exp Neurol. 226 (1), 254-258 (2010).</li><li>Laskowski, M. B., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topographic+mapping+of+motor+pools+onto+skeletal+muscles.">Topographic mapping of motor pools onto skeletal muscles.</a> J Neurosci. 7 (1), 252-260 (1987).</li><li>Feldman, J. L., Loewy, A. D., Speck, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Projections+from+the+ventral+respiratory+group+to+phrenic+and+intercostal+motoneurons+in+cat:+an+autoradiographic+study.">Projections from the ventral respiratory group to phrenic and intercostal motoneurons in cat: an autoradiographic study.</a> J Neurosci. 5 (8), 1993-2000 (1985).</li><li>Gottschall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diaphragm+of+the+rat+and+its+innervation.+Muscle+fiber+composition;+perikarya+and+axons+of+efferent+and+afferent+neurons.">The diaphragm of the rat and its innervation. Muscle fiber composition; perikarya and axons of efferent and afferent neurons.</a> Anat Embryol (Berl). 161 (4), 405-417 (1981).</li><li>Lai, B. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholera+Toxin+B+Subunit+Shows+Transneuronal+Tracing+after+Injection+in+an+Injured+Sciatic+Nerve.">Cholera Toxin B Subunit Shows Transneuronal Tracing after Injection in an Injured Sciatic Nerve.</a> PLoS One. 10 (12), e0144030 (2015).</li><li>Torgersen, M. L., Skretting, G., van Deurs, B., Sandvig, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Internalization+of+cholera+toxin+by+different+endocytic+mechanisms.">Internalization of cholera toxin by different endocytic mechanisms.</a> J Cell Sci. 114 (Pt 20), 3737-3747 (2001).</li><li>Chinnapen, D. J., Chinnapen, H., Saslowsky, D., Lencer, W. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rafting+with+cholera+toxin:+endocytosis+and+trafficking+from+plasma+membrane+to+ER.">Rafting with cholera toxin: endocytosis and trafficking from plasma membrane to ER.</a> FEMS Microbiol Lett. 266 (2), 129-137 (2007).</li><li>Fujinaga, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gangliosides+that+associate+with+lipid+rafts+mediate+transport+of+cholera+and+related+toxins+from+the+plasma+membrane+to+endoplasmic+reticulm.">Gangliosides that associate with lipid rafts mediate transport of cholera and related toxins from the plasma membrane to endoplasmic reticulm.</a> Mol Biol Cell. 14 (12), 4783-4793 (2003).</li><li>Badizadegan, K., Wheeler, H. E., Fujinaga, Y., Lencer, W. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trafficking+of+cholera+toxin-ganglioside+GM1+complex+into+Golgi+and+induction+of+toxicity+depend+on+actin+cytoskeleton.">Trafficking of cholera toxin-ganglioside GM1 complex into Golgi and induction of toxicity depend on actin cytoskeleton.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 287 (5), C1453-C1462 (2004).</li><li>Abbott, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+axonal+transport+in+the+rat+visual+pathway.">Imaging axonal transport in the rat visual pathway.</a> Biomed Opt Express. 4 (2), 364-386 (2013).</li><li>Li, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+the+astrocyte+glutamate+transporter+GLT1+exacerbates+phrenic+motor+neuron+degeneration,+diaphragm+compromise,+and+forelimb+motor+dysfunction+following+cervical+contusion+spinal+cord+injury.">Overexpression of the astrocyte glutamate transporter GLT1 exacerbates phrenic motor neuron degeneration, diaphragm compromise, and forelimb motor dysfunction following cervical contusion spinal cord injury.</a> J Neurosci. 34 (22), 7622-7638 (2014).</li><li>Lepore, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraspinal+cell+transplantation+for+targeting+cervical+ventral+horn+in+amyotrophic+lateral+sclerosis+and+traumatic+spinal+cord+injury.">Intraspinal cell transplantation for targeting cervical ventral horn in amyotrophic lateral sclerosis and traumatic spinal cord injury.</a> J Vis Exp. (55), (2011).</li><li>Llado, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degeneration+of+respiratory+motor+neurons+in+the+SOD1+G93A+transgenic+rat+model+of+ALS.">Degeneration of respiratory motor neurons in the SOD1 G93A transgenic rat model of ALS.</a> Neurobiol Dis. 21 (1), 110-118 (2006).</li><li>Lepore, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focal+transplantation-based+astrocyte+replacement+is+neuroprotective+in+a+model+of+motor+neuron+disease.">Focal transplantation-based astrocyte replacement is neuroprotective in a model of motor neuron disease.</a> Nat Neurosci. 11 (11), 1294-1301 (2008).</li><li>Sieck, G. C., Fournier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diaphragm+motor+unit+recruitment+during+ventilatory+and+nonventilatory+behaviors.">Diaphragm motor unit recruitment during ventilatory and nonventilatory behaviors.</a> J Appl Physiol. 66 (6), 2539-2545 (1989).</li><li>Janicot, M., Clot, J. P., Desbuquois, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+of+cholera+toxin+with+isolated+hepatocytes.+Effects+of+low+pH,+chloroquine+and+monensin+on+toxin+internalization,+processing+and+action.">Interactions of cholera toxin with isolated hepatocytes. Effects of low pH, chloroquine and monensin on toxin internalization, processing and action.</a> Biochem J. 253 (3), 735-743 (1988).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

ניתן להחיל את פרוטוקול המתוארים בזאת כל זן של עכברים בוגרים או כל פרדיגמה נסיונית שבה ניתן להעריך את תקינות המעגלים דיאפרגמה-PhMN. למשל, נוירודגנרטיביות (ALS) פגיעה בחוט השדרה הצווארי (cSCI) הם תנאים הקשורים PhMN הפסד, anterograde ניוון של אקסונים הסרעפת ואת הבאים פשרה בדרכי הנשימה. מודלים חייתיים של ALS או cSCI לחקות histopathological ופונקציונליים גירעונות הנשימה שנצפתה מחלות אנושיות. דגמים אלה, טכניקות היסטולוגית מוחלים לעיתים קרובות כדי להעריך PhMN הישרדות בעקבות התערבויות טיפוליות שונות, מכוון PhMN neuroprotection18,20,21. בעיות של ספיגת על הסרעפת NMJ או תחבורה עצב יפגע ללא ספק את הכמות של CTB שנצבר בגופים תאים עצביים. אובדן של הסרעפת אקסונים או ניוון PhMN ברור יקטן הסכום של CTB retrotransported לתוך חוט השדרה.
בכל אחת מהגישות מינהל intrapleural יש יתרונות משלו, זריקות Transdiaphragmatic cons. הם די פולשני, המחייב פתיחת בטן, תפרים זהיר של כל שכבות העור למניעת התבקעות ו עוגב בליטה. פתיחת בטן מפריע נשימה נורמלית22 , אחד לא יכול לשלול כי זה עשוי להשפיע על יעילות פעילות או רטרו-תחבורה PhMN. עם זאת, פריט חזותי ישיר של הסרעפת במהלך ההזרקה מבטיחה מיקוד מוצלחת של המרחב פלאורלי כל הזמן. זריקות אקו-פולשנית לעומת זריקות transdiaphragmatic, יכול ובכך להיחשב הליך עבור עידון, בווריד של המושג "ר' שלושה". חסרון אחד הוא גדל הסיכוי להיות את-יעד למשתמש לא מנוסה (למשל, הרקמה התת עורית או בדופן בית החזה).
בעקבות פלורסנט-CTB intrapleural ניהול, סביר כי כל נוירון מוטורי מקרין על השרירים המצפים את חלל הצדר יסומנו כסעיפים, כולל PhMN, הבין-צלעי מוטורי לגלוקוז או אוכלוסיות שונות של גזע המוח מוטורי לגלוקוז. בחולדות למבוגרים, Mantilla et al. הוכיח כי הבין-צלעי מוטורי לגלוקוז גם תוויות ב הצופר הבטני של חוט השדרה החזי, כמו גם כמה נוירונים גנגליון העזוב שורש4. לא בדקנו הנוכחות של תאים התווית על-ידי CTB באתרים אחרים מאשר חוט השדרה הצווארי בעכברים.
בהתאם ההגדרות/ניסיוניות, התוצאה אמצעים יכולים לכלול את סידור טורי PhMNs לאורך חוט השדרה הצווארי, ניתוח מפורט של הנתונים הגיאומטריים אודות המיקום של כל PhMN או, כפי שמתואר כאן, כימות של PhMN מספר. הערכה מדויקת של סה כ PhMN תלוי שיקולים טכניים ואמינות המאבחן אינטר; בגלל ההשתנות של CTB עוצמת קרינה פלואורסצנטית, נוירון סומא גודל או צביעת הרקע. מניסיוננו באמצעות זריקות transdiaphragmatic של CTB-fluorophore, אנחנו מעריכים את מספר PhMN לכל hemicord העכבר בטווח בין 120 ל- 180 תאים, מספר של קצת פחות נתונים אחרים קבוצות8. אכן, קיימות שתי מגבלות המחקר. ראשית, מספר מצומצם של בעלי חיים מוזרקים באמצעות גישה אקו, השני ויש אי על תיוג מלא של הבריכה PhMN. מטבל עצב הסרעפת (לאחר חיתוך העצב) או זריקות intraneural עם פלורסנט מעקב neuroanatomical טכניקות משלימים ניתן לתייג באופן מדויק יותר את כל PhMNs. ללימודים בעתיד, מומלץ לספור PhMNs על ידי שיטות לא משוחדת כמו stereology.
מניסיוננו, לא הבחנו כל ברור קשב בדרכי הנשימה או סיבוכים (מצוקה נשימתית) כגון דימום או חזה הליך זה. עם זאת, אם הסרעפת ניזוק במהלך זריקות transdiaphragmatic, שקול להשתמש מחט של קוטר קטן יותר או עם שיפוע חד.
כדי למנוע מוות בעלי חיים במהלך או לאחר הניתוח בדוק הריכוזים של כל רכיב בקוקטייל ההרדמה. להימנע מפציעות על גבי המשטחים של הכבד, המעי, כיס המרה או הסרעפת.
לא או תיוג נמוך של PhMN יכול להיות בגלל מספר בעיות. אם הזריקה אקו מפספס את חלל הצדר, מחדש, בדוק על ידי מישוש ידני כי המחט מוחדרת תחת הצלעות או לא פופ החוצה דרך העור. אין בועות יוצרות על הזרקה של CTB פתרון. זכור גם כי הפנמת האמונה CTB התא לחוץ הוא תלוי-pH23: pH חומצי ונייטרלי הם אופטימלית ואילו pH בסיסי מחליש את ספיגת של הרעלן. מומלץ resuspend אבקת CTB במים, בתוך תמיסת מלח או במאגר PBS. שקול את הזמן התמדה של הרעלן שכותרתו בגוף תאים עצביים. מניסיוננו, אנו היתה אפשרות לזהות תאים התווית על-ידי CTB בחלון הזמן בין ארבעה ימים שבועיים לאחר הלידה intrapleural. הפחתת הזמן המוקצים ייסוג תחבורה או הגדלת הזמן בין intrapleural משלוח והקרבה שיכול לסכן גילוי אופטימלית של פלורסנט-CTB ברקמה.
כדי להימנע פלורסצנטיות נמוגה השיטה הנכונה מקבע. אנו מציעים פרפוזיה גוף החיה עם paraformaldehyde 4% במאגר. לאחר האיסוף חוט השדרה, תדגור לשבועיים באותו לילה Cryoprotect החוט בפתרון 30% סוכרוז למשך 72 שעות עד שוקע, ואז להטביע התרחבות צוואר הרחם (כ 8 מ מ) O.C.T. בינוני. לא מייבשים או להטביע את הדגימה פרפין. להגן על דוגמאות בעמוד השדרה או מקטעי רקמת אור במהלך עיבוד שלאחר כל. שידרה כל קבוע יכול להישמר ב 4 מעלות צלזיוס למשך חודשים אם תימרוסל מתווסף הפתרון cryoprotectant (אין להוסיף אזיד הנתרן כמו זה לעורר פלורסצנטיות דהייה). ניתן לשמור מקטעי רקמת ב-20 מעלות צלזיוס במשך חודשים מן האור. לבסוף, אנו ממליצים להרכיב השקופיות עם ריאגנט נגד דהייה. אם ידי קרינה פלואורסצנטית נעלם, זה עדיין ניתן לזהות באמצעות אימונוהיסטוכימיה CTB.

מטרת המחקר היא להציג שיטה אמינה כדי לזהות הסרעפת מוטורי לגלוקוז (PhMN) על העכבר בחוט השדרה חלקים. הזרקה של מכשיר מעקב neuroanatomical פלורסנט בחלל פלאורלי נבחרה שיטת המשלוח יגיע ההשתקפויות עצב-שריר הסרעפת אל הסרעפת, להשתמש בתחבורה רטרוגרדית לאורך האקסונים הסרעפת לתייג גופות תא הסרעפת. שתי טכניקות מסירה intrapleural מתוארים: transdiaphragmatic נגד אקו.
הסרעפת מוטורי לגלוקוז הם תאים ממסר בעמוד השדרה אשר אקסונים להתכנס לתוך הסרעפת העצבים, אשר בסופו של דבר innervate הסרעפת. אלה נמוך מוטורי לגלוקוז הכונן inspiratory ממרכזי נשימה bulbar וקבלת העברתו אל צמתי neuro-שרירים הסרעפת (NMJ). PhMN בנויות לתוך שתי עמודות מוטוריים, אחד עבור כל hemicord, פועל לאורך עמוד השדרה אמצע-צוואר הרחם. ברוב זני יונקים לרבות בני אדם, העמודות מנוע הסרעפת התפשט ברמות C3 C61,2,3. אנחנו ואחרים אישרו כי PhMN מרוכז ברמות C3-C5 עכבר ועכבר חוט השדרה4,5,6,7,8. התפלגות הטופוגרפי של תאים הסרעפת אינו אקראי; מוטורי לגלוקוז innervating החלק בחיתוך של הסרעפת מופצים יותר בצפיפות בחלק הגולגולת של הסרעפת בתחזוקת (C3), בעוד מוטורי לגלוקוז innervating החלק crural הם יותר סימטרית (C5)9. יתר על כן, PhMN מקובצים בדרכים שונות בהחומר האפור קרן הגחון. בגובה C3, האשכולות של תאים הסרעפת לשקר רוחבית, ואז הם משמרת בכיוון ventrolateral נמצאים ventromedially ביותר סימטרית רמות10,11.
בהינתן תפקידם חיוני במהלך השראה, זה חשיבות עליונה כדי לזהות במדויק PhMN בחוט השדרה בריא אך גם לעקוב אחר גורלם במהלך מצבים פתולוגיים, כמו מחלות ניווניות או פציעה טראומטית של חוט השדרה. מאחר PhMN לא נבדלים מורפולוגית אחרים צוואר הרחם מוטורי לגלוקוז, זיהוי של PhMN מסתמך על מסירת יישוב המשדרים neuroanatomical או ברמה של מרכזי הנשימה העיקרי8, או ב- NMJ הסרעפת7 או ב עצב הסרעפת4. רכיב המעקב הוא נלקח על ידי סיבי העצב ונשא עד הגופים תא הסרעפת בעמוד השדרה הצווארי, שם זה ניתן לאבחן באמצעות מערכות זיהוי ישיר או עקיף. ואחר כך נסיגה או anterograde המשדרים זמינים מסחרית עם מגוון רחב של conjugates. ראוי לציין, מעקב כל אחד ניחן לא, יכולות נמוך או גבוה לעקיבה סינפטית טרנס.
במחקר הנוכחי, בחרנו את יחידת משנה של בטא של הרעלן כולרה (CTB) functionalized עם אלקסה עבור חיל הים 555 (המכונה מעתה ואילך CTB-fluorophore) כתווית פלורסנט, ומאפשר פריט חזותי ישיר של PhMN על חלקים קפואים בחוט השדרה. CTB מתואר בדרך כלל מכשיר מעקב monosynaptic למרות נתוני הניסוי נוטים להראות עם המעבר transneuronal12. CTB יש את היכולת לאגד את ganglioside GM1-קרום הפלזמה של הסוף עצב. CTB הוא הפנימו דרך clathrin תלוית או - עצמאית מנגנונים ו- traffics דרך הרשת הטרנס-גולג'י לתוך רשתית תוך-פלזמית13,אופנה רטרוגרדית14. הפנמה של תחבורה רטרוגרדית נראה אסתמך על ה15,שלד התא אקטין16 כמו גם על רשת microtubule17.
כדי להדגים את התועלת של CTB בתור מכשיר מעקב neuroanatomical רטרוגרדית תיוג דיאפרגמה-PhMN המעגלים, נמסרה CTB-fluorophore intrapleurally. CTB היה מנוהל באמצעות שתי שיטות: הראשון כולל פתיחה של הבטן זריקות transdiaphragmatic מרובים; השני, פחות פולשני, להשתמש זריקה אקו ייחודי. ארבעה ימים מאוחר יותר, שכותרתו fluorescently PhMNs היו לכמת בחוט השדרה הצווארי מן בריא והן מחיות (C4) נפגע spinally.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Glass-bead sterilizer Steri 250</td>
			<td>Keller</td>
			<td>31-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small scissors</td>
			<td>F.S.T.</td>
			<td>14058-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soft tweezers</td>
			<td>F.S.T.</td>
			<td>11042-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blades</td>
			<td>Swann Morton</td>
			<td>No.11 or 15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera toxin subunit beta conjugated to Alexa Fluor 555</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>C22843</td>
			<td>Bring at room temperature before use&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10ul Hamilton syringue, removable needle</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>701RN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>33-gauge needle for Hamilton syringue, 20mm length, point style 4</td>
			<td>Filter Service</td>
			<td>7803-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500ul insulin syringue MyJector, 27-gauge</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>BS05M2713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orientable LED lamp</td>
			<td>V.W.R.</td>
			<td>631-0995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resorbable 4/0 sutures</td>
			<td>S.M.I. AG</td>
			<td>15151519</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle holder</td>
			<td>F.S.T.</td>
			<td>12002-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9mm autoclips</td>
			<td>Bioseb</td>
			<td>205016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclip 9mm applier</td>
			<td>Bioseb</td>
			<td>MikRon 9mm</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

retrograde neuroanatomical tracing of phrenic motor neurons in mice

הסרעפת מוטורי לגלוקוז הם צוואר הרחם מוטורי לגלוקוז שמקורם C3 C6 רמות ב יונקים ביותר. תחזיות עצב להתכנס לתוך הסרעפת העצבים innervating הסרעפת בדרכי הנשימה. חוט השדרה פרוסות, הסרעפת מוטורי לגלוקוז אין אפשרות לזהות של אחרים מוטורי לגלוקוז על קריטריון מורפולוגי או ביוכימי. אנו מספקים את התיאור של נהלים להמחשת גופות תא הסרעפת נוירון מוטורי בעכברים, זריקות intrapleural הבאות של כולרה הרעלן יחידה משנית בטא (CTB) מצומדת כדי fluorophore. מעקב neuroanatomical פלורסנט הזה יש את היכולת שהסתבכת בצומת עצב-שריר הסרעפת, האקסונים הסרעפת מידך retrogradely ולהגיע הגופים תא הסרעפת. שתי גישות מתודולוגיים intrapleural CTB מסירה מושווים: transdiaphragmatic לעומת זריקות אקו. שתי הגישות מצליחים וגוררים מספר דומה של התווית על-ידי CTB הסרעפת מוטורי לגלוקוז. לסיכום, שיטות אלה ניתן להחיל באופן חזותי או לכמת את הסרעפת מוטורי לגלוקוז במחקרים ניסיוני שונים כגון אלה התמקדו המעגלים דיאפרגמה-הסרעפת.

עכברים C57bl/6J זכר (n = 18), בגילאי 3 עד 4 חודשים נכללו במחקר. ביום 0 של הניסוי, עכברים 8 עברה לחבורה C4 חד צדדית, ימנית צדדית, על-פי פרוטוקול שפורסמו7,18. כמו שאם שגרת, עכברים 10 עברה של laminectomy על C4 בלי החבורה. יום 3, עכברים הוכנו על הזריקות intrapleural של CTB-fluorophore על-פי שני ההליכים השונים שתוארו לעיל. יום 7, כל העכברים היו מורדמים בעקבות הרדמה (קטמין 100 מ"ג/ק"ג, חריגות השירותים הווטרינריים 5 מ"ג/ק"ג), דימום למוות.
כל שידרה נקטפו, קבוע ב- paraformaldehyde ו- cryoprotected ב- 30% סוכרוז על פי הנהלים מעבדה סטנדרטיים. התרחבות צוואר הרחם היה מבודד, מוטבע לתוך O.C.T., cryosectioned longitudinally או ערמוני-עובי של 30 מיקרומטר.
סעיפים האורך בעמוד השדרה נצפו עם מיקרוסקופ פלורסנטי מצויד עם מסנן קוביה לניתוח קרינה פלואורסצנטית (עירור: 560/20nm; פליטה: 635/30nm). פלורסנט מוטורי לגלוקוז ב הצופר הגחון אותרו כעמודה ליניארי של תאים C3 לרמות C5 (איור 6A, החלונית העליונה). כל התאים שכותרתו אותרו החומר האפור חולשת, הציג מורפולוגיה בקנה אחד עם מוטורי לגלוקוז (איור 6B). אצל בעלי חיים פצועים, לאובדן מרשים שכותרתו PhMN נצפתה ברמת C4, יחד עם הפרעה רקמות בעמוד השדרה (כוכבית ב 6A איור ו- 6 C). CTB+ PhMNs נספרו באופן ידני כל החמישי רוחבי בסעיף (רווח על ידי 150 מיקרומטר) חוטי השדרה שציווית ונפצעו C4 (איור 6C). הערכה של המספר הכולל של PhMNs שכותרתו מחושב על ידי הכפלת מספר התאים CTB+ שנספרו 5. בעכברים בריאים שציווית, המספר הכולל של PhMNs שכותרתו לכל hemicord נאמד ב 151 ± 9 בעת שימוש בגישה transdiaphragmatic (TDia), לעומת 178 ± 9 כאשר באמצעות גישה (TTho) אקו (6D איור). בעקבות פגיעה C4, מספרים אלה ירד בהתאמה ל ± ± 14 ו- 70 59 10. במחקר זה, אין הבדלים סטטיסטיים היו עדות בין שתי שיטות של משלוח intrapleural (p > 0.05, מבחן מאן-ויטני U; TDia לעומת TTho).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56758/56758fig1.jpg"> איור 1. זריקות Intrapleural באמצעות transdiaphragmatic או זריקות אקו- Transdiaphragmatic גישה כוללת פתיחה של הבטן, חשיפת פני הבטן הסרעפת (בצבע ורוד), שלוש זריקות באזורים בחזה ובצלעות, המדיאלי, crural A. לגישה אקו, העכבר מונח בתנוחה חמצן הלטראלי השמאלי. הצלעות השישית לשביעית מזוהים תחת באזור המרפק על ידי מישוש ידני B. המחט מוחדרת דרך העור, הרקמה התת עורית, שרירי בית החזה, השרירים הבין-צלעי את קרום הריאות הקודקוד כדי להגיע את חלל הצדר (אסטריקס). S, בחזה ובצלעות; m, המדיאלי; c, crural; S/SC, לעור ולרקמה התת-עורית; TM, שרירי בית החזה; IC, השרירים הבין-צלעי; pp; הקודקוד קרום הריאות; L, ריאות. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56758/56758fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56758/56758fig2.jpg"> באיור 2. דימומים עם נוף על הכבד, כיס המרה, פני הבטן הסרעפת. א הערה רצועה suspensory בין כיס המרה הסרעפת. B. רצועה בקפידה נחתך. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56758/56758fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56758/56758fig3.jpg"> איור 3. תצוגה על הסרעפת. ריקמת מזוהים את בחזה ובצלעות (s), המדיאלי (ז) ואזורי crural (ג). א שימו לב כי האזור crural האחורי כדי האונות בכבד. B. להזריק CTB בחלל פלאורלי, הכנס את המחט עמוק דרך הסרעפת-חמי נכון 1 מ"מ. הזריקה באזור המדיאלי הוא מאויר. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56758/56758fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56758/56758fig4.jpg"> באיור 4. הגישה אקו- כשהעכבר ממוקם בתוך חמצן הלטראלי השמאלי A. לזהות את השוליים costal של הסרעפת ובאזור המרפק. B. השישית לשביעית בצלעות מזוהים עמוק לאזור המרפק. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56758/56758fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56758/56758fig5.jpg"> איור 5. החללים הבין-צלעי השישית לשביעית מזוהים עמוק לאזור המרפק. א. קידמה - ו הינד-גפיים מורחבות. B. המזרק cranially מונחה ונוסף tangentially תחת השישי או הצלע השביעית, 3 מ מ עמוק דרך השרירים הבין-צלעי, עם שפוע הפוך. ג. המחט בעדינות הוא גבוה ואת הצלעות מוסרות כדי לאשר המחט היא ממוצבת היטב לתוך חלל בית החזה. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56758/56758fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56758/56758fig6.jpg"> איור 6. תאים CTB+ החומר האפור קרן הגחון של עכברים המוזרק intrapleurally. א spinally שציווית עכבר, CTB+ הסרעפת מוטורי לגלוקוז להפיץ לאורך חוט השדרה הצווארי של רמת C3 ל- C5. עכבר גורמים להתדרדות, רקמות השיבוש הוא ציין באופן חד צדדי עם הפסד של CTB+ הסרעפת מוטורי לגלוקוז ברמת C4 (אסטריקס). ב' שכותרתו CTB+ התאים היו ממוקמים בתוך החומר האפור חולשת, הציג מורפולוגיה בקנה אחד עם מוטורי לגלוקוז. ג מקטעים רוחבי של שידרה שימשו כדי לכמת את מספר התאים CTB+ במרחקים מסוימים לאורך חוט השדרה שציווית (משמאל) ועכברים (מימין) פצוע. למצוא את hemicord חולשת בעכברים שציווית או פצוע, בהתאם transdiaphragmatic (TDia) או בגישה אקו (TTho) של intrapleural CTB משלוח תאים של כימות של CTB+ ד . ברים מייצגים 250 מיקרומטר. הנתונים היו לבטא זאת אומרת ± שגיאת התקן של הממוצע (SEM). n = 5-7 עכברים בכל קבוצה TDia; n = 3 עכברים בכל קבוצה TTho. בוצעו בדיקות U מאן-ויטני Non-parametrical ואת תוצאות נחשבו שונה באופן משמעותי גם עבור p < 0.05. p < 0.001 עבור שציווית נגד פגיעה C4. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56758/56758fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Retrograde Neuroanatomical Tracing of Phrenic Motor Neurons in Mice at JoVE.com

Retrograde Neuroanatomical Tracing of Phrenic Motor Neurons in Mice

כאן, אנו מתארים את פרוטוקול לזיהוי הסרעפת מוטורי לגלוקוז בעכברים לאחר מסירת intrapleural fluorophore מצומדת כולרה הרעלן יחידה משנית בטא. שתי טכניקות מושווים להחדיר את חלל הצדר: transdiaphragmatic לעומת גישות אקו.

עקיבה Neuroanatomical רטרוגרדית של הסרעפת מוטורי לגלוקוז בעכברים

Phrenic motor neurons are cervical motor neurons originating from C3 to C6 levels in most mammalian species. Axonal projections converge into phrenic ...

retrograde-neuroanatomical-tracing-of-phrenic-motor-neurons-in-mice

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.5K Views.  Université de Namur. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול לזיהוי הסרעפת מוטורי לגלוקוז בעכברים לאחר מסירת intrapleural fluorophore מצומדת כולרה הרעלן יחידה משנית בטא. שתי טכניקות מושווים להחדיר את חלל הצדר: transdiaphragmatic לעומת גישות אקו.

Video: Retrograde Neuroanatomical Tracing of Phrenic Motor Neurons in Mice

Assessment of Motor Balance and Coordination in Mice using the Balance Beam

Brain injury, genetic manipulations, and pharmacological treatments can result in alterations of motor skills in mice. Fine motor coordination and balance can be assessed by the beam walking assay. The goal of this test is for the mouse to stay upright and walk across an elevated narrow beam to a safe platform. This test takes place over 3 consecutive days: 2 days of training and 1 day of testing. Performance on the beam is quantified by measuring the time it takes for the mouse to traverse the beam and the number of paw slips that occur in the process. Here we report the protocol used in our laboratory, and representative results from a cohort of C57BL/6 mice. This task is particularly useful for detecting subtle deficits in motor skills and balance that may not be detected by other motor tests, such as the Rotarod.

Deficits in fine motor coordination can be assessed with the balance beam test. Performance on the beam is quantified by the speed at which the beam is traversed and the number of times the mouse slips on the beam.

הערכת מאזן מוטורי ותיאום עכברים באמצעות קרן איזון

Brain injury, genetic manipulations, and pharmacological treatments can result in alterations of motor skills in mice.  Fine motor coordination and ...

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and evaluating mouse models of human disease. MRI is an excellent modality for investigating genetically altered animals. It is capable of whole brain coverage, can be used in vivo, and provides multiple contrast mechanisms for investigating different aspects of neuranatomy and physiology. The advent of high-field scanners along with the ability to scan multiple mice simultaneously allows for rapid phenotyping of novel mutations.
Effective mouse MRI studies require attention to many aspects of experiment design. In this article, we will describe general methods to acquire quality images for mouse phenotyping using a system that images mice concurrently in shielded transmit/receive radio frequency (RF) coils in a common magnet (Bock et al., 2003). We focus particularly on anatomical phenotyping, an important and accessible application that has shown a high potential for impact in many mouse models at our imaging centre. Before we can provide the detailed steps to acquire such images, there are important practical considerations for both in vivo brain imaging (Dazai et al., 2004) and ex vivo brain imaging (Spring et al., 2007) that should be noted. These are discussed below.

Magnetic resonance imaging (MRI) has become an increasingly popular tool for examining the phenotype of genetically altered mice. This article illustrates the methods necessary to achieve high-throughput phenotyping of genetically altered mice using multiple-mouse MRI.

מרובה עכבר Neuroanatomical תהודה מגנטית

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

Measuring Motor Coordination in Mice

Mice are increasingly being used in behavioral neuroscience, largely replacing rats as the behaviorist's animal of choice. Before aspects of behavior such as emotionality or cognition can be assessed, however, it is vital to determine whether the motor capabilities of e.g. a mutant or lesioned mouse allow such an assessment. Performance on a maze task requiring strength and coordination, such as the Morris water maze, might well be impaired in a mouse by motor, rather than cognitive, impairments, so it is essential to selectively dissect the latter from the former. For example, sensorimotor impairments caused by NMDA antagonists have been shown to impair water maze performance2. 
Motor coordination has traditionally been assessed in mice and rats by the rotarod test, in which the animal is placed on a horizontal rod that rotates about its long axis; the animal must walk forwards to remain upright and not fall off. Both set speed and accelerating versions of the rotarod are available.
The other three tests described in this article (horizontal bar, static rods and parallel bars) all measure coordination on static apparatus. The horizontal bar also requires strength for adequate performance, particularly of the forelimbs as the mouse initially grips the bar just with the front paws. 
Adult rats do not perform well on tests such as the static rods and parallel bars (personal observations); they appear less well coordinated than mice. I have only tested male rats, however, and male mice seem generally less well coordinated than females. Mice appear to have a higher strength:weight ratio than rats; the Latin name, Mus musculus, seems entirely appropriate. The rotarod, the variations of the foot fault test12 or the Catwalk (Noldus)15 apparatus are generally used to assess motor coordination in rats.

Protocols are presented for two established motor coordination tasks, the accelerating rotarod and horizontal bar, also two tests developed in Oxford recently, the static rods and parallel bars. These tests can detect motor impairments potentially of interest in their own right, as well as being possible variables in tests of other areas of behavior.

מדידת קואורדינציה מוטורית בעכברים

Mice are increasingly being used in behavioral neuroscience, largely replacing rats as the behaviorist's animal of choice. Before aspects of behavior such ...

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from individual neurons are critical for understanding how neural circuits function under natural conditions. Traditionally, these recordings have been performed 'blind', meaning the identity of the recorded cell is unknown at the start of the recording. Cellular identity can be subsequently determined via intracellular1, juxtacellular2 or loose-patch3 iontophoresis of dye, but these recordings cannot be pre-targeted to specific neurons in regions with functionally heterogeneous cell types. Fluorescent proteins can be expressed in a cell-type specific manner permitting visually-guided single-cell electrophysiology4-6. However, there are many model systems for which these genetic tools are not available. Even in genetically accessible model systems, the desired promoter may be unknown or genetically homogenous neurons may have varying projection patterns. Similarly, viral vectors have been used to label specific subgroups of projection neurons7, but use of this method is limited by toxicity and lack of trans-synaptic specificity. Thus, additional techniques that offer specific pre-visualization to record from identified single neurons in vivo are needed. Pre-visualization of the target neuron is particularly useful for challenging recording conditions, for which classical single-cell recordings are often prohibitively difficult8-11. The novel technique described in this paper uses retrograde transport of a fluorescent dye applied using tungsten needles to rapidly and selectively label a specific subset of cells within a particular brain region based on their unique axonal projections, thereby providing a visual cue to obtain targeted electrophysiological recordings from identified neurons in an intact circuit within a vertebrate CNS.
The most significant novel advancement of our method is the use of fluorescent labeling to target specific cell types in a non-genetically accessible model system. Weakly electric fish are an excellent model system for studying neural circuits in awake, behaving animals12. We utilized this technique to study sensory processing by "small cells" in the anterior exterolateral nucleus (ELa) of weakly electric mormyrid fish. "Small cells" are hypothesized to be time comparator neurons important for detecting submillisecond differences in the arrival times of presynaptic spikes13. However, anatomical features such as dense myelin, engulfing synapses, and small cell bodies have made it extremely difficult to record from these cells using traditional methods11, 14. Here we demonstrate that our novel method selectively labels these cells in 28% of preparations, allowing for reliable, robust recordings and characterization of responses to electrosensory stimulation.

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde transport of fluorescent dye labels a sub-population of neurons based on anatomical projection. Labeled axons can be visually targeted in vivo, permitting extracellular recording from identified axons. This technique facilitates recording when neurons cannot be labeled through genetic manipulation or are difficult to isolate using 'blind' in vivo approaches.

תיוג של פלורסנט מדרדר מאפשר להקלטה ממוקדת חד תאית מיחידת נוירונים שזוהו<em&gt; בvivo</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Extracellularly Identifying Motor Neurons for a Muscle Motor Pool in Aplysia californica

In animals with large identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using intracellular techniques1,2,3,4. Recently, we developed a technique to extracellularly stimulate and record individual neurons in Aplysia californica5. We now describe a protocol for using this technique to uniquely identify and characterize motor neurons within a motor pool.
This extracellular technique has advantages. First, extracellular electrodes can stimulate and record neurons through the sheath5, so it does not need to be removed. Thus, neurons will be healthier in extracellular experiments than in intracellular ones. Second, if ganglia are rotated by appropriate pinning of the sheath, extracellular electrodes can access neurons on both sides of the ganglion, which makes it easier and more efficient to identify multiple neurons in the same preparation. Third, extracellular electrodes do not need to penetrate cells, and thus can be easily moved back and forth among neurons, causing less damage to them. This is especially useful when one tries to record multiple neurons during repeating motor patterns that may only persist for minutes. Fourth, extracellular electrodes are more flexible than intracellular ones during muscle movements. Intracellular electrodes may pull out and damage neurons during muscle contractions. In contrast, since extracellular electrodes are gently pressed onto the sheath above neurons, they usually stay above the same neuron during muscle contractions, and thus can be used in more intact preparations.
To uniquely identify motor neurons for a motor pool (in particular, the I1/I3 muscle in Aplysia) using extracellular electrodes, one can use features that do not require intracellular measurements as criteria: soma size and location, axonal projection, and muscle innervation4,6,7. For the particular motor pool used to illustrate the technique, we recorded from buccal nerves 2 and 3 to measure axonal projections, and measured the contraction forces of the I1/I3 muscle to determine the pattern of muscle innervation for the individual motor neurons.
We demonstrate the complete process of first identifying motor neurons using muscle innervation, then characterizing their timing during motor patterns, creating a simplified diagnostic method for rapid identification. The simplified and more rapid diagnostic method is superior for more intact preparations, e.g. in the suspended buccal mass preparation8 or in vivo9. This process can also be applied in other motor pools10,11,12 in Aplysia or in other animal systems2,3,13,14.

Extracellularly Identifying Motor Neurons for a Muscle Motor Pool in Aplysia californica

In animals with large identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using intracellular techniques1,2,3,4. Recently, we developed a technique to extracellularly stimulate and record individual neurons in Aplysia californica5. We now describe a protocol for using this technique to uniquely identify and characterize motor neurons within a motor pool.

Extracellularly זיהוי תאי עצב מוטורי לשריר בברכת מוטור<em&gt; Aplysia californica</em

In animals with large  identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using  intracellular techniques1,2,3,4. Recently,  we developed ...

Conditional Genetic Transsynaptic Tracing in the Embryonic Mouse Brain

Anatomical path tracing is of pivotal importance to decipher the relationship between brain and behavior. Unraveling the formation of neural circuits during embryonic maturation of the brain however is technically challenging because most transsynaptic tracing methods developed to date depend on stereotaxic tracer injection. To overcome this problem, we developed a binary genetic strategy for conditional genetic transsynaptic tracing in the mouse brain. Towards this end we generated two complementary knock-in mouse strains to selectively express the bidirectional transsynaptic tracer barley lectin (BL) and the retrograde transsynaptic tracer Tetanus Toxin fragment C from the ROSA26 locus after Cre-mediated recombination. Cell-specific tracer production in these mice is genetically encoded and does not depend on mechanical tracer injection. Therefore our experimental approach is suitable to study neural circuit formation in the embryonic murine brain. Furthermore, because tracer transfer across synapses depends on synaptic activity, these mouse strains can be used to analyze the communication between genetically defined neuronal populations during brain development at a single cell resolution. Here we provide a detailed protocol for transsynaptic tracing in mouse embryos using the novel recombinant ROSA26 alleles. We have utilized this experimental technique in order to delineate the neural circuitry underlying maturation of the reproductive axis in the developing female mouse brain.

Capitalizing on a binary genetic strategy we provide a detailed protocol for neural circuit tracing in mice that express complementary transsynaptic tracers after Cre-mediated recombination. Because cell-specific tracer production is genetically encoded, our experimental approach is suitable to study the formation and maturation of neural circuitry during murine embryonic brain development at a single cell resolution.

מותנה הגנטי Transsynaptic איתור במוח העכבר עוברי

Anatomical path tracing is of pivotal importance to decipher the relationship between brain and behavior. Unraveling the formation of neural circuits ...

Functional and Morphological Assessment of Diaphragm Innervation by Phrenic Motor Neurons

This protocol specifically focuses on tools for assessing phrenic motor neuron (PhMN) innervation of the diaphragm at both the electrophysiological and morphological levels. Compound muscle action potential (CMAP) recording following phrenic nerve stimulation can be used to quantitatively assess functional diaphragm innervation by PhMNs of the cervical spinal cord in vivo in anesthetized rats and mice. Because CMAPs represent simultaneous recording of all myofibers of the whole hemi-diaphragm, it is useful to also examine the phenotypes of individual motor axons and myofibers at the diaphragm NMJ in order to track disease- and therapy-relevant morphological changes such as partial and complete denervation, regenerative sprouting and reinnervation. This can be accomplished via whole-mount immunohistochemistry (IHC) of the diaphragm, followed by detailed morphological assessment of individual NMJs throughout the muscle. Combining CMAPs and NMJ analysis provides a powerful approach for quantitatively studying diaphragmatic innervation in rodent models of CNS and PNS disease.

Compound muscle action potential recording quantitatively assesses functional diaphragm innervation by phrenic motor neurons. Whole-mount diaphragm immunohistochemistry assesses morphological innervation at individual neuromuscular junctions. The goal of this protocol is to demonstrate how these two powerful methodologies can be used in various rodent models of spinal cord disease.

הערכה תפקודית ומורפולוגי של סרעפת עצבוב על ידי סרעפת מנוע נוירונים

This protocol specifically focuses on tools for assessing phrenic motor neuron (PhMN) innervation of the diaphragm at both the electrophysiological and ...

Laser-guided Neuronal Tracing In Brain Explants

We present a technique which combines an in vitro tracer injection protocol, which uses a series of electrical and pressure pulses to increase dye uptake through electroporation in brain explants with targeted laser illumination and matching filter goggles during the procedure. The described technique of in vitro electroporation by itself yields relatively good visual control for targetting certain areas of the brain. By combining it with laser excitation of fluorescent genetic markers and their read-out through band-passing filter goggles, which can pick up the emissions of the genetically labeled cells/nuclei and the fluorescent tracing dye, a researcher can substantially increase the accuracy of injections by finding the area of interest and controlling for the dye-spread/uptake in the injection area much more efficiently. In addition, the laser illumination technique allows to study the functionality of a given neurocircuit by providing information about the type of neurons projecting to a certain area in cases where the GFP expression is linked to the type of transmitter expressed by a subpopulation of neurons.

We describe a technique to label neurons and their processes via anterograde or retrograde tracer injections into brain nuclei using an in vitro preparation. We modified an existing method of in vitro tracer electroporation by taking advantage of fluorescently labeled mouse mutants and basic optical equipment in order to increase labeling accuracy.

Explants מוח מונחי לייזר עצבי איתור ב

We present a technique which combines an in vitro tracer injection protocol, which uses a series of electrical and pressure pulses to increase dye uptake ...

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

The establishment of functional neuromuscular circuits relies on precise connections between developing motor axons and target muscles. Motor neurons extend growth cones to navigate along specific pathways by responding to a large number of axon guidance cues that emanate from the surrounding extracellular environment. Growth cone target recognition also plays a critical role in neuromuscular specificity. This work presents a standard immunohistochemistry protocol to visualize motor neuron projections of late stage-16 Drosophila melanogaster embryos. This protocol includes a few key steps, including a genotyping procedure, to sort the desired mutant embryos; an immunostaining procedure, to tag embryos with fasciclin II (FasII) antibody; and a dissection procedure, to generate filleted preparations from fixed embryos. Motor axon projections and muscle patterns in the periphery are much better visualized in flat preparations of filleted embryos than in whole-mount embryos. Therefore, the filleted preparation of fixed embryos stained with FasII antibody provides a powerful tool to characterize the genes required for motor axon pathfinding and target recognition, and it can also be applied to both loss-of-function and gain-of-function genetic screens.

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

This work details a standard immunohistochemistry method to visualize motor neuron projections of late stage-16 Drosophila melanogaster embryos. The filleted preparation of fixed embryos stained with FasII antibody provides a powerful tool to characterize the genes required for motor axon pathfinding and target recognition during neural development.

ויזואליזציה של דפוס היטל אקסונל של נוירונים מוטוריים עובריים ב<em&gt; תסיסנית</em

The establishment of functional neuromuscular circuits relies on precise connections between developing motor axons and target muscles. Motor neurons ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging methods exist for examining the brain tissue of live newborn mammals. Herein we summarize a protocol for imaging individual cortical neurons in living neonatal mice. This protocol includes the following two methodologies: (1) the Supernova system for sparse and bright labeling of cortical neurons in the developing brain, and (2) a surgical procedure for the fragile neonatal skull. This protocol allows the observation of temporal changes of individual cortical neurites during neonatal stages with a high signal-to-noise ratio. Labeled cell-specific gene silencing and knockout can also be achieved by combining the Supernova with RNA interference and CRISPR/Cas9 gene editing systems. This protocol can, thus, be used for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

We present an in vivo two-photon imaging protocol for imaging the cerebral cortex of neonatal mice. This method is suitable for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, the molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and the changes in neuronal dynamics in disease models.

אין ויוו שני הפוטונים הדמיה של נוירונים בקליפת המוח בעכברים Neonatal

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...