Este trabajo fue financiado por el Instituto Nacional de General médica Ciencias de los institutos nacionales de salud con el número de concesión R35GM124868 y por la Universidad de Duke.

1. configuración del diseño y alineación
<ol>
	<li>Instalación y colimación de la excitación de seguimiento láser<ol>
		<li>Coloque el láser para la tabla óptica usando un montaje casa construida. El soporte es una placa de aluminio simple con agujeros para la cabeza del láser y la óptica mesa de montaje. El láser debe sujetarse firmemente a un soporte metálico para la estabilidad y la disipación de calor. Para este trabajo, utilizar un 488 nm láser de estado sólido para la iluminación (figura 1), aunque la longitud de onda se puede seleccionar para adaptarse a un fluoróforo particular o experimento. Un factor crítico es que la longitud de onda de láser ajuste la gama de trabajo 2D-EOD, que está determinada principalmente por la placa de la onda entre los dos deflectores (figura 1: W2). El láser de 488 nm efectivamente puede excitar la verde o amarilla proteína fluorescente (GFP/YFP), que son etiquetas fluorescentes comunes en los experimentos de células vivas.</li>
		<li>Ajustar la altura del rayo láser y la dirección con un par de espejos dieléctricos (figura 1: M). Asegúrese de que el rayo láser es paralelo a la tabla óptica y ajustarlo a una altura adecuada. Nota: La altura debe elegirse en base a la plataforma de microscopio. Esta altura debería mantenerse para todos los espejos posteriores en este protocolo, aunque esto estará no explícitamente indicado.</li>
		<li>Colimar el rayo con un par de lentes (figura 1: L1 y L2). Las distancias focales de lentes debe ser elegidas cuidadosamente para evitar que el foco del láser ser recortado por la abertura de la 2D-EOD. Recorte es evidente por un cambio en la forma de haz láser pasando a través de la 2D-EOD. La calidad de colimación aquí es muy importante porque se amplificarán las aberraciones de lentes posteriores y cualquier divergencia deteriorará el rendimiento de la desviación de 2D-EOD. Idealmente, colimar el rayo concentrándose la viga a un punto por lo menos 20 metros.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Coloque un pequeño agujero (figura 1: PH) de tamaño adecuado en el foco de la primera lente de colimación (figura 1: L1).<ol>
		<li>Elegir un tamaño adecuado del agujero de alfiler. El tamaño del agujero de alfiler puede ser elegido según el siguiente cálculo: 
		<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56711/56711eq1.jpg"> Donde λ es la longitud de onda del laser, f es la distancia focal de la primera lente, y D es el diámetro de la viga de entrada.</li>
		<li>Montaje del agujero de alfiler en una etapa de traducción en 3D por lo que puede ser colocado precisamente en el foco de la primera lente de colimación.</li>
		<li>Ajuste la posición del agujero de alfiler. Coloque un medidor de potencia láser después del agujero de alfiler y ajustar la posición del agujero de alfiler en XYZ para aprovechar al máximo la lectura del medidor de energía. Si se observa un anillo de difracción, bloquear con un diafragma colocado antes de la 2D-EOD.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Instalación de polarizador de Glan-Thompson<ol>
		<li>Poner el polarizador de Glan-Thompson (figura 1: GP) después de la segunda lente de colimación (figura 1: L2) para limpiar la polarización del haz láser. Girar el polarizador para encontrar la máxima de la transmisión con el medidor de energía.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Instalación de EODs<ol>
		<li>Utilizar 2 EODs (figura 1: EOD1 &#38; EOD2) para desviar el láser en las direcciones X e Y. Maximizar la transmisión de láser mediante el ajuste de la orientación, la echada y la altura de cada EOD.</li>
		<li>Alinee los dos EODs respecto unos a otros con el alineación marcador proporcionado por el fabricante en el costado de cada deflector.</li>
		<li>Aplicar un patrón de prueba con el controlador 2D-EOD para inspeccionar la salida de la EOD. Esto puede ser recorrido de caballero (figura 2) mediante el FPGA se describe a continuación o una simple onda senoidal proporcionada por un generador de funciones. Para el mejor desempeño, la desviación de cada deflector debe ser paralela a X o Y dirección de la nanopositioner piezoeléctrico. Esta dirección es dictada por la dirección angular de los deflectores sobre el eje de transmisión. Para girar la dirección de desviación sin mover el 2D-EOD, colocar un prisma de dove después del 2D-EOD para alinear los ejes de flexión a los ejes de nanopositioner piezo.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Instalación de placa de media onda<ol>
		<li>Coloque una placa de media onda (figura 1: W1) entre el polarizador de Glan-Thompson (figura 1: GP) y el 2D-EOD para alinear el láser entrante haz de polarización con los ejes de la desviación de la 2D-EOD. Colocar una lente focal larga (300 mm) después de la EOD de 2D y una cámara sCMOS en el foco del láser. A continuación, encienda el 2D-EOD para generar tour del caballero que se describe a continuación (figura 2). Gire la placa de media onda hasta que una distribución de láser uniformemente cuadrado se observa en la cámara.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Instalación de una viga gastando lente par y par de lente de relé<ol>
		<li>Coloque un par de lentes (figura 1: L3 y L4) después de la 2D-EOD para expandir el haz para rellenar la abertura posterior de la lente del objetivo (figura 1: OL) y otro par de lentes (figura 1: L5 y L6) a relé del plano focal del objetivo del microscopio. Asegúrese de dejar suficiente espacio entre estos dos pares de lentes como el objetivo de la etiqueta se instalará entre ellos en un paso posterior.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Instale el filtro dicroico divisor de viga de 10/90, de enfoque objetivo, APD, objetivo, filtro de emisión de fluorescencia para completar la vía de detección.<ol>
		<li>Instale el filtro dicroico (figura 1: DC) para reflejar el láser hacia el objetivo. Alinear el láser para ir directamente a través del centro de la lente del objetivo con dos iris en la parte superior e inferior de un tubo largo.</li>
		<li>Instalar un divisor de viga de 10/90 (figura 1: BS) por que el 10% de la luz se refleja para la proyección de imagen por una cámara de sCMOS (descrito a continuación) y 90% de pasa a través del APD para el seguimiento.</li>
		<li>Alinee el APD. Enfocar el láser en un cubreobjetos por la lente del objetivo. Utilice la reflexión de lo cubreobjetos para alinear elementos todo abajo por poner un cubreobjetos en el foco objetivo y comprobar la intensidad de la lectura de la APD. Después del divisor de viga, instalar el APD enfoque objetivo (figura 1: L7) seguido por el APD en una etapa de traducción en 3D. Coloque la lente que el reflejo del láser el objetivo pasa por el centro de la lente.</li></ol></li></ol>La posición de APD se puede optimizar ajustando la posición 3D para maximizar la intensidad de la reflexión del láser sobre el cubreobjetos. La posición de la APD está en la posición óptima cuando una medida de la posición del detector en cualquier dirección disminuye la intensidad.
		<li>Instalar un filtro longpass de emisión de fluorescencia (figura 1: F) antes del divisor de viga para eliminar la luz reflejada y dispersada.</li>
	
	
	<li>Instalación de la lente etiqueta<ol>
		<li>Coloque la lente de la etiqueta entre los dos pares de lentes (entre figura 1: L4 y L5) mencionado antes como se muestra en la figura 1. Ajustar el desvío, paso, altura y posición lateral tal que el rayo perpendicular pasa por la lente del centro de la etiqueta.</li>
	</ol>
	</li>

2. muestra preparación.
<ol>
	<li>Preparación de partícula fija<ol>
		<li>Diluir los granos fluorescentes de 190 nm a ~ 5 × 108 granos/mL en PBS. Añadir 400 μL granos solución sobre un cubreobjetos y Monte en el soporte de la muestra de la etapa piezoeléctrico (el volumen de granos dependerá el portamuestras; el diámetro de la cámara de soporte de muestra utilizada aquí es 18 m m). Para los granos aquí, PBS hace que las partículas en el cubreobjetos.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Preparación de partículas móviles gratis<ol>
		<li>Diluir los granos fluorescentes de 110 nm a ~ 5 × 108 granos/mL con agua desionizada. Añadir 400 μL solución de granos en un cubreobjetos y montar sobre el soporte de la muestra de la etapa piezoeléctrico.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. optimizar los parámetros de seguimiento
<ol>
	<li>Exploración de trama fijada las partículas<ol>
		<li>Poner una muestra de partículas fijas en el microscopio.</li>
		<li>Activar el láser, controlador micropositioner, piezo nanopositioner controlador, controlador de la lente de etiqueta y EOD controlador. Tenga en cuenta que el orden no es crítico. Ejecute el nanopositioner piezoeléctrico en lazo cerrado.</li>
		<li>Raster scan muestra en XYZ con un personalizado análisis programa de software (Figura S3, software disponible a petición de los autores), que impulsa el 2D-EOD en visita de un caballero (figura 2), recoge las cuentas del APD, conduce el piezo nanopositioner y realiza el cálculo de posición (Figura S2). El tamaño de paso es de 40 nm y la gama de la exploración es 2 μm.<ol>
			<li>Para colocar el cubreobjetos en el foco del objetivo, extraer el filtro de emisión de fluorescencia y utilizar la reflexión del láser de cubreobjetos para maximizar la intensidad de señal en función de la posición Z de la micropositioner. Después de colocar la muestra en el plano focal, coloque nuevamente el filtro de emisión de fluorescencia.</li>
			<li>Abrir el programa de exploración. Fijar la gama de la exploración y el tamaño de paso escribiendo el número en la 'start', 'Finalizar' y 'al paso'. En primer lugar establecer una amplia gama de la exploración y el tamaño de paso para localizar una partícula (por ejemplo, 10 x 10 μm rango con tamaño de paso de 200 nm). Después de encontrar la partícula, la gama de la exploración del encogimiento y disminuir el tamaño de paso (por ejemplo, 2 x 2 μm rango con tamaño de paso de 100 nm). Haga clic en el botón 'scan' para realizar un análisis de trama 3D para encontrar el foco fluorescente.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Configuración de la lente de etiqueta (vea la figura 3)<ol>
		<li>Haga clic en el software de control de lente de etiqueta. Haga clic en 'connect', 'encender' secuencialmente.</li>
		<li>Para cambiar la fase de salida de las señales de disparo, es necesario cambiar el modo de disparo de salida. Primero cambiar el modo de 'RGB' a 'Multiplane' y luego cambiar nuevamente. Ahora la fase puede ser cambiado (figura 3b).</li>
		<li>Establecer la fase de salida a 0 °, 90 ° y 270 °. Si bien pueden utilizarse cualquier tres fases que cubren el espacio de fase, estos tres se encuentran trabajando bien empíricamente (Figura 3C).</li>
		<li>Seleccione el ajuste de frecuencia Hz 68.500.</li>
		<li>Para encontrar la frecuencia óptima a menudo es necesario cambiar las frecuencias de búsqueda. Haga clic en 'avanzado', 'ajuste'. Cambio el ' Max. FREQ(Hz)' de la columna 0 de 70.000 Hz a Hz 71.500. Esto se puede ajustar a cualquier rango de frecuencia es apropiado. Haga clic en "Guardar calibración', 'salir de la calibración" (Figura 3d).</li>
		<li>Para hacer la nueva calibración efectiva, cambiar la resonancia a otra frecuencia (por ejemplo, 189.150 Hz) y luego cambiar a la configuración de frecuencia de 68.500 Hz (figura 3e).</li>
		<li>Cambiar gradualmente la amplitud al 35%. Haga clic en 'Bloquear la resonancia'. La frecuencia está bloqueada, haga clic en 'Desbloquear resonancia' (figura 3e). El objetivo de la etiqueta está listo para usar ahora.</li>
		<li>Para calibrar, cambiar los parámetros que se utilizan en la estimación para hacer la posición estimada igual a la posición real, como se muestra en la Figura 4e, f. entrada a la gama de la exploración de x, y y z y haga clic en 'scan' botón para analizar la muestra en XYZ para mover el partícula a través del foco del láser móvil. La posición de la partícula como se analiza a través del foco del laser debe de acuerdo con la posición de la partícula aproximadamente determinada por el lazo de la estimación de posición (Figura S1). La relación entre la posición estimada y la posición real (figura 4 d) se puede extraer de las imágenes de posición estimada (figura 4f). Si no acepta las posiciones, ajuste los valores de la posición del láser (ck) utilizado en el circuito de estimación de posición (Figura S1).</li>
		<li>Alinear la lente etiqueta<ol>
			<li>Cuando el controlador de la lente de etiquetas está desactivada, la trama analiza imágenes de partículas (descritos abajo) tomadas antes de instalar el lente de la etiqueta y después instalación etiqueta debería mirar idéntica. A continuación, realizar pila de partículas fluorescentes Z escaneo moviendo el objetivo con el nanopositioner de z para afinar la posición y el ángulo de la lente de la etiqueta (figura 4). Ajustar la posición de la lente de la etiqueta hasta que no hay deriva en las imágenes de partícula en el plano XY en la dirección Z, que se consigue cuando hay ningún cambio en la posición XY de la partícula en función de la posición de Z (figura 4 d). El sistema de seguimiento está listo para usar después de la alineación de la lente de la etiqueta.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Instalación de cámara sCMOS para monitoreo de partículas<ol>
		<li>Instalar una cámara sCMOS para visualizar las partículas mientras que están siendo rastreados. Instale el sCMOS sólo después de que todos los componentes del sistema de seguimiento instalados y optimizados.</li></ol></li></ol>Cargar una muestra fija de partículas fluorescentes en el microscopio y ejecutar el programa de seguimiento para una partícula en el volumen focal objetivo. A continuación, instale la lente de longitud focal de 100 mm (figura 1: L8) y sCMOS. Ajuste la posición del sCMOS por lo que la imagen de la partícula se centra en el punto más pequeño y más brillante.
	
	

4. en tiempo real seguimiento 3D de nanopartículas que difunde libremente
<ol>
	<li>Poner el 110 nm libre movimiento muestra de partículas en el microscopio.</li>
	<li>Encienda láser, regulador micro-posicionador, piezo nanopositioner controlador, controlador de la lente de etiqueta y controlador EOD. Ejecute el nanopositioner piezoeléctrico en lazo abierto. Configure el software de la lente de la etiqueta según el paso 3.2.</li>
	<li>Abra y ejecute el software de seguimiento (disponible a petición de los autores). Establecer la posición de parámetros de estimación los valores optimizados, que fueron encontrados en la sección 3.</li>
	<li>Para colocar el cubreobjetos en el foco del objetivo, extraer el filtro de emisión de fluorescencia y utilizar la reflexión del láser de cubreobjetos para maximizar la intensidad de señal en función de la posición Z de la micropositioner. Después de encontrar el cubreobjetos, aumentar el foco posición 15 μm para centrar el láser del cubreobjetos y en la solución. Coloque nuevamente el filtro de emisión de fluorescencia.</li>
	<li>Establecer las constantes de control integral. Las constantes de control integral pueden establecerse a partir de un valor bajo y aumentando lentamente hasta que las oscilaciones pueden verse en lecturas de posición de la partícula. Una vez que se observan oscilaciones, ajustar las constantes de control integral hasta el 80% del valor que causan las oscilaciones. Valores típicos será alrededor de 0.012 fines el XY' integral' y de 0.004 para el Z 'ganancia integral'.</li>
	<li>Establecer los umbrales de seguimiento en el 'Umbral de la pista' y 'Pista mínimo' y comienza el experimento de seguimiento haciendo clic en 'Buscar' y 'Auto Track'. El umbral para el rastreo de terminación es ligeramente más alto que el nivel de fondo y el umbral para la activación de seguimiento es aproximadamente dos veces mayor que el fondo. Aquí, el umbral para la activación de seguimiento es de 3 kHz y el umbral para poner fin a la trayectoria es 1,5 kHz.</li>
</ol>

<ol>
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Lett. 91 (22), (2007).</li><li>McHale, K., Mabuchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intramolecular+Fluorescence+Correlation+Spectroscopy+in+a+Feedback+Tracking+Microscope.">Intramolecular Fluorescence Correlation Spectroscopy in a Feedback Tracking Microscope.</a> Biophys. J. 99 (1), 313-322 (2010).</li><li>McHale, K., Mabuchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+Characterization+of+the+Conformation+Fluctuations+of+Freely+Diffusing+DNA:+Beyond+Rouse+and+Zimm.">Precise Characterization of the Conformation Fluctuations of Freely Diffusing DNA: Beyond Rouse and Zimm.</a> J. Am. Chem. Soc. 131 (49), 17901-17907 (2009).</li><li>McHale, K., Berglund, A. J., Mabuchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantum+Dot+Photon+Statistics+Measured+by+Three-Dimensional+Particle+Tracking.">Quantum Dot Photon Statistics Measured by Three-Dimensional Particle Tracking.</a> Nano Lett. 7 (11), 3535-3539 (2007).</li><li>Juette, M. F., Bewersdorf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Tracking+of+Single+Fluorescent+Particles+with+Submillisecond+Temporal+Resolution.">Three-Dimensional Tracking of Single Fluorescent Particles with Submillisecond Temporal Resolution.</a> Nano Lett. 10 (11), 4657-4663 (2010).</li><li>Katayama, Y., Burkacky, O., Meyer, M., Br&#228;uchle, C., Gratton, E., Lamb, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-Time+Nanomicroscopy+via+Three-Dimensional+Single-Particle+Tracking.">Real-Time Nanomicroscopy via Three-Dimensional Single-Particle Tracking.</a> ChemPhysChem. 10 (14), 2458-2464 (2009).</li><li>Perillo, E. P., Liu, Y. -. L., Huynh, K., Liu, C., Chou, C. -. K., Hung, M. -. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+and+high-resolution+three-dimensional+tracking+of+single+particles+using+nonlinear+and+multiplexed+illumination.">Deep and high-resolution three-dimensional tracking of single particles using nonlinear and multiplexed illumination.</a> Nat Commun. 6, (2015).</li><li>Hou, S., Lang, X., Welsher, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+real-time+3D+single-particle+tracking+using+a+dynamically+moving+laser+spot.">Robust real-time 3D single-particle tracking using a dynamically moving laser spot.</a> Opt. Lett. 42 (12), 2390-2393 (2017).</li><li>Chenouard, N., Smal, I., de Chaumont, F., Maska, M., Sbalzarini, I. F., Gong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Objective+comparison+of+particle+tracking+methods.">Objective comparison of particle tracking methods.</a> Nat Meth. 11 (3), 281-289 (2014).</li><li>Shechtman, Y., Weiss, L. E., Backer, A. S., Sahl, S. J., Moerner, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+3D+scan-free+multiple-particle+tracking+over+large+axial+ranges+with+Tetrapod+point+spread+functions.">Precise 3D scan-free multiple-particle tracking over large axial ranges with Tetrapod point spread functions.</a> Nano Lett. 15 (6), 4194-4199 (2015).</li><li>Lee, H. -. l. D., Sahl, S. J., Lew, M. D., Moerner, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+double-helix+microscope+super-resolves+extended+biological+structures+by+localizing+single+blinking+molecules+in+three+dimensions+with+nanoscale+precision.">The double-helix microscope super-resolves extended biological structures by localizing single blinking molecules in three dimensions with nanoscale precision.</a> Appl. Phys. Lett. 100 (15), 153701 (2012).</li><li>Pavani, S. R. P., Thompson, M. A., Biteen, J. S., Lord, S. J., Liu, N., Twieg, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional,+single-molecule+fluorescence+imaging+beyond+the+diffraction+limit+by+using+a+double-helix+point+spread+function.">Three-dimensional, single-molecule fluorescence imaging beyond the diffraction limit by using a double-helix point spread function.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (9), 2995-2999 (2009).</li><li>Sancataldo, G., Scipioni, L., Ravasenga, T., Lanzan&#242;, L., Diaspro, A., Barberis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+multiple-particle+tracking+with+nanometric+precision+over+tunable+axial+ranges.">Three-dimensional multiple-particle tracking with nanometric precision over tunable axial ranges.</a> Optica. 4 (3), 367-373 (2017).</li><li>Balzarotti, F., Eilers, Y., Gwosch, K. C., Gynn&#229;, A. H., Westphal, V., Stefani, F. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanometer+resolution+imaging+and+tracking+of+fluorescent+molecules+with+minimal+photon+fluxes.">Nanometer resolution imaging and tracking of fluorescent molecules with minimal photon fluxes.</a> Science. 355 (6325), 606 (2017).</li><li>Duocastella, M., Theriault, C., Arnold, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+particle+tracking+via+tunable+color-encoded+multiplexing.">Three-dimensional particle tracking via tunable color-encoded multiplexing.</a> Opt. Lett. 41 (5), 863-866 (2016).</li><li>Duocastella, M., Sun, B., Arnold, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+imaging+of+multiple+focal+planes+for+three-dimensional+microscopy+using+ultra-high-speed+adaptive+optics.">Simultaneous imaging of multiple focal planes for three-dimensional microscopy using ultra-high-speed adaptive optics.</a> BIOMEDO. 17 (5), (2012).</li><li>Mermillod-Blondin, A., McLeod, E., Arnold, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-speed+varifocal+imaging+with+a+tunable+acoustic+gradient+index+of+refraction+lens.">High-speed varifocal imaging with a tunable acoustic gradient index of refraction lens.</a> Opt. Lett. 33 (18), 2146-2148 (2008).</li><li>Wang, Q., Moerner, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+strategy+for+trapping+single+fluorescent+molecules+in+solution+using+the+ABEL+trap.">Optimal strategy for trapping single fluorescent molecules in solution using the ABEL trap.</a> Appl. Phys. B. 99 (1), 23-30 (2010).</li><li>Fields, A. P., Cohen, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+tracking+of+a+Brownian+particle.">Optimal tracking of a Brownian particle.</a> Opt. Express. 20 (20), 22585-22601 (2012).</li><li>Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+Nanometer+Localization+Analysis+for+Individual+Fluorescent+Probes.">Precise Nanometer Localization Analysis for Individual Fluorescent Probes.</a> Biophys. J. 82 (5), 2775-2783 (2002).</li></ol>

Los autores no declaran a intereses financieros en competencia.

Aunque muchas variedades de 3D sola partícula seguimiento métodos han surgido en los últimos años, robusto rastreo en tiempo real de la difusión de 3D de alta velocidad en tasas de conteo de fotones bajo con una configuración simple es todavía un reto, que limita su aplicación a la biológica importante problemas. El método 3D-DyPLoT había descrito en esta dirección estos retos en varios sentidos. En primer lugar, las vías de excitación y detección se simplifican considerablemente en comparación con otras implementaciones de hacer alineación sencilla y robusta. En segundo lugar, el punto móvil láser y algoritmo de estimación de posición proporcionan estimaciones de la posición exacta para el bucle de retroalimentación, haciendo la retroalimentación más estable. En tercer lugar, el rango de detección con eficacia grandes (1 x 1 x 4 μm) del punto láser dinámicamente móviles permite seguimiento de partículas de movimiento rápidas. Para ver por qué esta área de detección grande es fundamental, es importante considerar el tiempo de respuesta intrínseco de la nanopositioner piezoeléctrico. Etapas piezoeléctrico de alta velocidad tienen resonancias del orden de 1 kHz, limitando el tiempo de respuesta a ser del orden de 1 ms. en 1 ms, una nanopartícula 100 de nm con un coeficiente de difusión de 4 μm2/s, se difundirán en promedio 90 nm desde el centro de la difracción-li volumen de la Mited de la detección. Esto es sólo el desplazamiento promedio y movimiento verdaderamente al azar exhibirá pasos mucho más grandes que esto, conduce a la partícula dejando el volumen focal y acabar con la trayectoria actual. La situación es aún peor para las partículas más pequeñas, donde cada vez más pasos difusivas térmicas conducen a la pérdida de seguimiento. El área de detección con eficacia grande permite el sistema de seguimiento superar retraso intrínseco etapa piezoeléctrico y recuperarse de grandes saltos difusivos en la posición de la partícula, aumentando la robustez general del mecanismo de seguimiento. Finalmente, el área de exploración grande permite que el sistema recoger fácilmente nuevas partículas, permitiendo trayectorias consecutivas a adquirirse rápidamente grandes conjuntos de datos recopilados.
El usuario debe tener en cuenta que hay algunos pasos críticos. En primer lugar, la alineación de la EOD de 2D y el objetivo de la etiqueta son críticos. Ambos deben estar bien alineados para obtener la precisión óptima. En segundo lugar, los parámetros que se utilizan en la estimación de la posición de la partícula fija paso la exploración deben ser bien calibrados (ver figura 4). La posición de la partícula estimada debe coincidir con la posición de la partícula correspondiente al centro de la gama de escaneo láser. Finalmente, las constantes de retroalimentación integral (K) deben ajustarse cuidadosamente, a partir de un valor pequeño y rampas hasta que las oscilaciones se observan a continuación, respaldo aproximadamente el 80% de ese valor.
Hay algunas advertencias acerca de 3D-DyPLoT a tener en cuenta dependiendo de la aplicación deseada. Mientras que la estimación de posición optimizada está diseñada para su uso con movimiento browniano, está también bien adaptado para el movimiento direccional. El algoritmo puede aplicarse directamente a cualquier tipo de movimiento ya que es sólo la incertidumbre de la posición que se asume para ser Gaussian, no la posición de la partícula real. Para casos donde se espera que la persistente movimiento lineal, se puede Agregar un término adicional al término de la predicción en el algoritmo de estimación de posición (ver ecuación 3 en la Información complementaria).
La selección de los parámetros para el 2D-EOD y la etiqueta debe considerarse cuidadosamente cuando se configura el 3D-DyPLoT. De particular importancia es el uso de bin para recorrido de caballero por 2D-EOD. En un escenario ideal, tour del caballero estar sincronizado para el período de la lente de la etiqueta para asegurar la eficiente toma de muestras. Sin embargo, es fundamental considerar el tiempo de respuesta de la 2D-EOD a cambios en el voltaje. Para la unidad de aquí, hay un tiempo de respuesta 2-3 μs después de que la tensión se aplica antes de alcanza el punto deseado. Al tiempo de bin de 20 μs, se trata de unos 10-15% del tiempo de colección. Reducir el tiempo para que coincida con el período de la lente de etiqueta de ~ 14 μs aumenta la fracción de tiempo bin, que es el tiempo de la 2D-EOD. Esto conduce a valores incorrectos de la posición del láser y la posición incorrecta las estimaciones.
Otro factor para el experimentador a tener en cuenta es la resolución temporal. Mientras que los datos mostrados aquí son recogidos en una tarifa de datos de 100 kHz, la máxima resolución temporal se define en última instancia, por que los datos son utilizados para la medición de la posición. Si la lectura de la nanopositioner se utiliza como la posición de la partícula (figura 6), la resolución temporal depende del valor de la constante de control integral. Por ejemplo, para el control integral se muestra en la Figura 6a–d, la respuesta de la etapa es del orden de 1 ms, mientras que para la figura 6e–h, es del orden de 10 de la Sra. Si se desea mayor rapidez resolución temporal, entonces el fotones por fotón resultado del algoritmo de estimación de posición se correlaciona con la tasa de conteo de fotones. Por ejemplo, una tasa de emisión de 10 kHz produce 100 μs resolución temporal y una tasa de emisión de 100 kHz produce una resolución temporal de 10 μs. Además, desde la precisión sigue una <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56711/56711eq2.jpg"> relación41, se juntan la precisión espacial y temporal. Como resultado, el brillo de la punta de prueba determina la precisión espacial y temporal.
En este protocolo describen la configuración, diseño y alineación de una alta velocidad en tiempo real 3D sola partícula método que utiliza un 2D-EOD y la lente de la etiqueta a mover dinámicamente un punto láser enfocada a lograr la estimación de partículas rápido posición de seguimiento. Luego nos describe métodos de muestra preparación y parámetro de optimización. 3D-DyPLoT ofrece un método relativamente simple y robusto para bloqueo de movimiento rápido y humildes emitiendo partículas difusas. El diseño óptico simple le permite agregar fácilmente en el puerto lateral de cualquier soporte existente de microscopio que puede combinarse con módulos de imágenes. Con este protocolo, esperamos que los RT-3D-SPT puede ser que más ampliamente implementado por investigadores más rápido, abordar tres dimensiones procesos biológicos.

La aparición de técnicas de imagen avanzadas ha abierto una ventana para ver la estructura cada vez más detallada de los fenómenos celulares, hasta el nivel molecular. Métodos tales como la reconstrucción óptica estocástica (tormenta) la microscopia1,2,3, Foto-activado localización microscopia (Palma)4,5,6,7 , estructurado iluminación microscopia (SIM)8,9,10,11y estimuló la emisión (STED) la microscopia de agotamiento de12,13, 14 han ido mucho más allá del límite de difracción para entregar de detalle sin precedentes en la estructura y función de células vivas. Sin embargo, el completo entendimiento de cómo estos sistemas se comportan requiere información dinámica así como la información estructural. Los métodos de resolución súper mencionados implican una relación inversa entre la resolución espacial y resolución temporal, limitando la precisión temporal con la que pueden ser explorados procesos dinámicos. Un método que proporciona alta precisión espacial y resolución temporal es RT-3D-SPT15,16,17,18,19,20, 21,22,23,24,25,26,27,28,29. Aquí, dibujamos una distinción entre tradicionales 3D-SPT30 y RT-3D-designado tradicional SPT 3D simplemente requiere de una serie temporal de datos de imagen tridimensional (que se pueden adquirir ya sea mediante un microscopio confocal o un microscopio de epifluorescencia Dada la configuración correcta). En tradicional 3D-SPT, las coordenadas de la partícula se determinan después de la recolección de datos de localización de la partícula en cada pila imagen y concatenación de las ubicaciones en sucesivos volúmenes para crear una trayectoria. Estos métodos, la máxima resolución temporal está determinada por la tasa de proyección de imagen volumétrica. Para microscopios confocales, es fácilmente en la escala de segundos a decenas de segundos. Métodos de epifluorescencia, en donde el camino óptico es manipulado para que la información de localización axial puede ser extraída, la resolución temporal está limitada por el tiempo de exposición o lectura de cámara. Estos métodos epifluorescente están limitados en la gama que puede recopilarse información axial, aunque recientes avances en la fase del plano de Fourier máscaras diseño y óptica adaptativa está ampliando estas gamas a 10 μm o más31,32 , 33 , 34.
Por el contrario, RT-3D-SPT no se basa en adquirir una pila de imágenes 3D y la búsqueda de las partículas después del hecho. Por el contrario, se extrae información de ubicación en tiempo real a través de detectores de punto único y regeneración se aplica a efectivamente "bloquear" la partícula en el volumen focal de la lente del objetivo mediante el uso de una etapa piezoeléctrico de alta velocidad. Esto permite la medición continua de la posición de la partícula limitada sólo por cuántos fotones se pueden recoger. Además, este método permite interrogatorio espectral de la partícula que se mueve en gamas largas. RT-3D-SPT en efecto funciona similar a una trampa óptica fuerza-libre para objetos de escala nanométrica, donde la partícula continuamente es explorada y medida en tiempo real sin necesidad de poderes grandes láser u óptica de las fuerzas. Dado que RT-3D-SPT constituye una forma de interrogatorio continuo de objetos rápida difusión (hasta 20 μm2/s)25,29 en tres dimensiones en el fotón bajo cuenta tarifas20,29, 35, debe proporcionar una ventana en procesos biológicos rápidos o transitorios como transporte de carga intracelular, Unión ligando-receptor y la dinámica extracelular de viriones individuales. Sin embargo, a este punto, la aplicación de la RT-3D-SPT se ha limitado a ese puñado de grupos de trabajo para avanzar en esta tecnología.
Una barrera es la complejidad del diseño óptico requerida métodos de RT-3D-SPT, que son muy variados. Para la mayoría de los métodos, la retroalimentación óptica proporciona una etapa piezoeléctrica. Como los partícula hace pequeños movimientos en X, Y, o Z, lecturas de punto único detectores están convertidos a funciones de error y en alta velocidad a un nanopositioner piezoeléctrico, que en su vez mueve la muestra para contrarrestar el movimiento de la partícula, con eficacia bloqueo en su lugar con respecto a la lente del objetivo. Para medir pequeños movimientos posicionales en X, Y y Z, múltiples detectores (4 o 5 dependiendo de la implementación)15,18,21 o múltiples puntos de excitación (2-4, el menor de los cuales se puede aplicar si una amplificador de bloqueo se utiliza para extraer X y posición Y mediante una rotación láser spot) se aplican25,28 . La superposición de estas múltiples puntos de detección y emisión de hacer los sistemas difíciles de alinear y mantener.
Adjunto, presentamos un método de alta velocidad 3D objetivo bloqueado-SPT con un diseño óptico simplificado llamado 3D-DyPLoT29. 3D-DyPLoT utiliza una EOD 2D y una etiqueta lente36,37,38 para mover dinámicamente un punto láser enfocado a través del volumen focal objetivo a una velocidad alta (50 kHz XY, Z de 70 kHz). Combinando la posición de foco del láser y el tiempo de llegada de fotones permite posición 3D del objeto a obtenerse rápidamente incluso en tasas de conteo de fotones baja. 2D-EOD conduce el enfoque láser en visita patrón39 con un tamaño de cuadrado de 1 x 1 μm en el plano X-Y de un caballero y el objetivo de la etiqueta mueve el enfoque láser en dirección axial con una gama de 2-4 μm. La posición de la partícula 3D se obtiene con una posición optimizada estimación algoritmo29,40 en 3D. El control del 3D dinámicamente móviles laser punto, fotón contando desde el fotodiodo de avalancha (APD), cálculo de posición de partículas en tiempo real, piezoeléctrico etapa retroalimentación y registro de datos se realizan en un arreglo de compuertas programables en campo (FPGA).En este protocolo, se describe cómo construir un microscopio 3D-DyPLoT paso a paso, incluyendo alineación óptica, calibración con partículas fijas y finalmente libre seguimiento de partículas. Como demostración, perlas fluorescentes de 110 nm fueron seguidos continuamente en el agua durante minutos a la vez.
El método descrito en este documento es una opción ideal para cualquier aplicación donde se desea monitorear continuamente una sonda fluorescente rápidos en niveles de luz bajos, incluyendo virus, nanopartículas y vesículas de endosomas. En contraste con los métodos anteriores, existe sólo una única excitación y detección solo camino, hacer alineación y mantenimiento sencillo. Además, el área de detección grande permite este microscopio fácilmente recoger rápidamente difundiendo partículas, mientras que la capacidad de seguimiento de nivel de señal baja (hasta 10 kHz) hace este método ideal para aplicaciones de baja luz29.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1075">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">2D Electro-optic Deflector&#160;</td>
			<td style="width:145px;">ConOptics</td>
			<td style="width:160px;">M310A</td>
			<td style="width:541px;">2 required</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Power supply for EOD</td>
			<td style="width:145px;">ConOptics</td>
			<td style="width:160px;">412</td>
			<td>Converts FPGA ouput to high voltage for EOD</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">TAG&#160; Lens</td>
			<td style="width:145px;">TAG Optics</td>
			<td style="width:160px;">TAG 2.0</td>
			<td>Used to deflect laser along axial direction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">XY piezoelectric nanopositioner</td>
			<td style="width:145px;">MadCity Labs</td>
			<td style="width:160px;">Nano-PDQ275HS</td>
			<td>Used for moving the sample to lock the particle in the objective focal volume in&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Z piezoelectric nanoposiitoner</td>
			<td style="width:145px;">MadCity Labs</td>
			<td style="width:160px;">Nano-OP65HS</td>
			<td>Used to move the objective lens to follow the diffusing particle</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Micropositioner</td>
			<td style="width:145px;">MadCity Labs</td>
			<td style="width:160px;">MicroDrive</td>
			<td>Used to coarsely position sample and evaluate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Objective Lens</td>
			<td style="width:145px;">Zeiss</td>
			<td style="width:160px;">PlanApo</td>
			<td>High numerical aperture required for best sensitivity. 100X, 1.49 NA, M27, Zeiss</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">sCMOS camera</td>
			<td style="width:145px;">PCO</td>
			<td style="width:160px;">pco.edge 4.2</td>
			<td>Used to monitor the particle&#39;s position</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">APD</td>
			<td style="width:145px;">Excelitas</td>
			<td style="width:160px;">SPCM-ARQH-15</td>
			<td>Lower dark counts beneficial</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Field programmable gate array</td>
			<td style="width:145px;">National Instruments</td>
			<td style="width:160px;">NI-7852r</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Software</td>
			<td style="width:145px;">National Instruments</td>
			<td style="width:160px;">LabVIEW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Tracking excitation laser</td>
			<td style="width:145px;">JDSU</td>
			<td style="width:160px;">FCD488-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Lens</td>
			<td style="width:145px;">ThorLabs</td>
			<td style="width:160px;">AC254-150-A-ML</td>
			<td>L1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Lens</td>
			<td style="width:145px;">ThorLabs</td>
			<td style="width:160px;">AC254-200-A-ML</td>
			<td>L2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Pinhole</td>
			<td style="width:145px;">ThorLabs</td>
			<td style="width:160px;">P75S</td>
			<td>PH</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Glan-Thompson Polarizer</td>
			<td style="width:145px;">ThorLabs</td>
			<td style="width:160px;">GTH5-A</td>
			<td>GT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Half-wave plate</td>
			<td style="width:145px;">ThorLabs</td>
			<td style="width:160px;">WPH05M-488</td>
			<td>WP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Lens</td>
			<td style="width:145px;">ThorLabs</td>
			<td style="width:160px;">AC254-75-A-ML</td>
			<td>L3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Lens</td>
			<td style="width:145px;">ThorLabs</td>
			<td style="width:160px;">AC254-250-A-ML</td>
			<td>L4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Lens</td>
			<td style="width:145px;">ThorLabs</td>
			<td style="width:160px;">AC254-200-A-ML</td>
			<td>L5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Lens</td>
			<td style="width:145px;">ThorLabs</td>
			<td style="width:160px;">AC254-200-A-ML</td>
			<td>L6</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Dichroic Mirror</td>
			<td style="width:145px;">Chroma</td>
			<td style="width:160px;">ZT405/488/561/640rpc</td>
			<td>DC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Fluorescence Emission Filter</td>
			<td style="width:145px;">Chroma</td>
			<td style="width:160px;">D535/40m</td>
			<td>F</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">10/90 beamsplitter</td>
			<td style="width:145px;">Chroma</td>
			<td style="width:160px;">21012</td>
			<td>BS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">190 nm fluorescent nanoparticles</td>
			<td>Bangs laboratories</td>
			<td>FC02F/9942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">110 nm fluorescent nanoparticles</td>
			<td>Bangs laboratories</td>
			<td>FC02F/10617</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Coverslip</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Powermeter</td>
			<td style="width:145px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:160px;">PM100D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">CMOS</td>
			<td style="width:145px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:160px;">DCC1545M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Iris</td>
			<td style="width:145px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:160px;">SM1D12D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscope</td>
			<td style="width:145px;">Mad City Labs</td>
			<td style="width:160px;">RM21</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a protocol for real-time 3d single particle tracking

Sola partícula tridimensional en tiempo real (RT-3D-SPT) de seguimiento tiene el potencial de arrojar luz sobre procesos rápidos y 3D en sistemas celulares. Aunque varios métodos de RT-3D-SPT han presentado en los últimos años, seguimiento de alta velocidad 3D difundiendo partículas en tasas de conteo de fotones baja sigue siendo un desafío. Por otra parte, configuraciones RT-3D-SPT son generalmente complejas y difíciles de implementar, limitar su aplicación generalizada a problemas biológicos. Este protocolo presenta un sistema RT-3D-SPT llamado 3D dinámica del fotón localización seguimiento (3D-DyPLoT), que puede rastrear partículas con difusores de alta velocidad (hasta 20 μm/s2) en tasas de conteo de fotones bajas (hasta 10 kHz). 3D-DyPLoT emplea un deflector de electro-óptico 2D (2D-EOD) y una lente de gradiente acústico armonioso (etiqueta) para conducir un único centrado láser punto dinámicamente en 3D. Combinado con un algoritmo de estimación de posición optimizada, 3D-DyPLoT puede trabar sobre partículas individuales con seguimiento de alta velocidad y precisión de localización alta. Debido a la excitación individual y diseño de ruta solo detección, 3D-DyPLoT es robusto y fácil de configurar. Este protocolo describe cómo construir paso a paso de 3D-DyPLoT. En primer lugar, se describe el diseño óptico. A continuación, el sistema es calibrado y optimizado por trama exploración una tira fluorescente de 190 nm con el nanopositioner piezoeléctrico. Finalmente, para demostrar la capacidad de seguimiento de tiempo real 3D, perlas fluorescentes de 110 nm se realiza un seguimiento en el agua.

Partículas fijas (figura 4) la exploración y difusión libremente 110 nm fluorescente rastreo de partículas (figura 5) fueron realizadas siguiendo el protocolo anterior. El análisis de partículas se realizó moviendo los fotones nanopositioner y bin piezoeléctricos mientras que simultáneamente, calcular la partícula había estimado posición en cada punto en la exploración. La exploración muestra un cuadrado de la intensidad uniforme (figura 4a) y las posiciones estimadas muestran una relación lineal con la posición real de la partícula sobre un 1 × 1 × 2 μm rango en x, y y z dirección (Figura 4b–f).
Para demostrar el seguimiento en tiempo real, las partículas fluorescentes de 110 nm fueron seguidas en el agua por 3D-DyPLoT (figura 5a, b). El análisis de desplazamiento (MSD) cuadrado medio muestra un comportamiento lineal típico característico de movimiento browniano (figura 5C). Análisis MSD de 30 trayectorias mostraron un diámetro hidrodinámico medio de 110 nm, de acuerdo con las especificaciones del fabricante para el tamaño de las nanopartículas fluorescentes rastreadas (Figura 5D). Además, 1 de película muestra las lecturas en tiempo real nanopositioner piezoeléctrico y sincronizados sCMOS imágenes para una 2 minutos larga trayectoria de una partícula fluorescente libremente difundiendo de 110 nm.
Además de pista de alta velocidad, las partículas de movimiento lento pueden localizarse con alta precisión. Figura 6a - d muestra la aplicación del sistema 3D-DyPLoT a las partículas fijas utilizando los mismos parámetros de retroalimentación utilizado para la alta velocidad de seguimiento, mostrando una precisión de 17.6, 26.4 y 53,4 nm en X, Y y Z, respectivamente, con tasa de conteo de fotones de 105. Figura 6e - h muestra la precisión bajo control de retroalimentación reducida por un factor de 10, efectivamente cambiar velocidad por precisión y exhibe una precisión de 6.5 y 8.3 10.5 nm en X, Y y Z, respectivamente.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56711/56711fig1.jpg"> 
Figura 1. Esquema de sistema de seguimiento 3D. 2D-EOD (EOD1 &#38; EOD2) y la lente de la etiqueta (TAG) desviar el láser a lo largo de las direcciones XY y Z, respectivamente. El APD (APD) se utiliza para recoger fotones fluorescencia, que son enviados a la FPGA (FPGA). FPGA se utiliza para el algoritmo de cálculo de posición, conteo de fotones, control 2D-EOD así como control y lectura de nanopositioner piezoeléctrico (NSxy y NZz). Otros componentes en la figura: espejos (M); lentes (L #); agujero de alfiler (PH); Polarizador de Glan-Thompson (GP); placa de media-onda (W1); filtro dicroico (DC); objetivo (OL, NA X 100 = 1.49); filtro de emisión de fluorescencia (F); divisor de viga (BS); XY micropositioner fase (MSxy); Etapa de micropositioner Z (MSz). <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56711/56711fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56711/56711fig2.jpg"> 
Figura 2. Coordina para recorrido de caballero en 3D-DyPLoT. Eje 1 y eje 2 deben estar alineados a lo largo del eje X o Y por la alineación apropiada de la 2D-EOD. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56711/56711fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56711/56711fig3.jpg"> 
Figura 3. Configuración de software de lente etiqueta. Ver configuración de lente de etiqueta de sección 4.2 para obtener más información. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56711/56711fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56711/56711fig4.jpg"> 
Figura 4. Estimación de análisis y posición partícula. (a) exploración de imagen de fluorescentes nm 190 granos con 2D-EOD conduce el láser en un 1 μm × 1 plaza patrón de recorrido del caballero. Intensidad de fluorescencia es denotado por el color. Unidad: kHz. (b) estimación de xk, posición de la partícula en relación con el centro de la 2D-EOD escanee en micrómetros. El color en b, cy d denota la posición estimada. Unidad: μm. (c) estimación de yk en micrómetros. (d) la estimación de zk, posición de la partícula en relación con el centro axial de la lente etiqueta exploración en micrómetros. sobre la red entera de (c) un promedio de posición (e) Estimado partícula posición yk como una función de la etapa. Tenga en cuenta que la posición de la partícula estimada adquirida en el algoritmo de estimación de posición (yk) está de acuerdo con la posición real. (f) estimado de posición partícula zk en función de la etapa en la posición media sobre la red entera de (d). La posición estimada muestra una relación lineal con la posición real de partículas en 1 × 1 × 2 μm rango en dirección X, Y y Z. Tenga en cuenta que la posición de la partícula estimada adquirida en el algoritmo de estimación de posición (zk) está de acuerdo con la posición real. La posición estimada muestra una relación lineal con la posición real de la partícula en un 1 × 1 × 2 μm rango en X, Y y Z dirección. De la escala blanca bares (un–c) representan 500 nm y la barra de escala negra en (d) representa 2 μm. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56711/56711fig4large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56711/56711fig5.jpg"> 
Figura 5.Seguimiento de partículas fluorescentes de 110 nm en el agua con 3D-DyPLOT. (a) trayectoria 3D de una libre difusión nanopartícula fluorescente 110 nm en el agua. (b) intensidad fluorescente en función del tiempo de la trayectoria en (un). (c) MSD de la trayectoria en (un). La línea azul es el MSD medida mientras que la línea roja punteada es la mejor línea de ajuste de regresión lineal. (d) MSD análisis de trayectorias de 30, que muestran un diámetro hidrodinámico medio de 110 nm, en acuerdo con el tamaño de las nanopartículas fluorescentes rastreadas. El diámetro de las partículas se calculó mediante la relación de Stokes-Einstein. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56711/56711fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56711/56711fig6.jpg"> 
Figura 6. Precisión de rastreo de partículas fijo. (a) A partícula fija es rastreada por 3D-DyPLoT en tasas de conteo diferente. La precisión es nm (b) 17.6 x y (c) 26.4 nm Y nm (d) 53.4 en Z a una tasa de emisión de 100 kHz. (e) cuando sondeo procesos más lentos, el control de la retroalimentación constante (K) puede reducirse por un factor de 10 para aumentar la precisión. Bajo este control retroalimentación reducido, la precisión es nm (f) 6.5 x y (g) 8.3 nm Y nm (h) 10.5 en Z a una tasa de emisión de 100 kHz. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56711/56711fig6large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Figura S1. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56711/fig_S1_position_estimation-01.pdf">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Figura S2. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56711/fig_s2_TAG_operation.pdf">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Figura S3. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56711/fig_s3_software.pdf">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Información complementaria. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56711/170802_software_description.pdf">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

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A Protocol for Real-time 3D Single Particle Tracking

Datos de este protocolo la construcción y operación de un microscopio de seguimiento en tiempo real 3D sola partícula capaz de seguimiento nanoescala fluorescente puntas de prueba a altas velocidades difusivos y tasas de conteo de fotones baja.

Un protocolo para el seguimiento en tiempo real 3D sola partícula

Real-time three-dimensional single particle tracking (RT-3D-SPT) has the potential to shed light on fast, 3D processes in cellular systems. Although ...

a-protocol-for-real-time-3d-single-particle-tracking

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.8K vistas.  Duke University. Datos de este protocolo la construcción y operación de un microscopio de seguimiento en tiempo real 3D sola partícula capaz de seguimiento nanoescala fluorescente puntas de prueba a altas velocidades difusivos y tasas de conteo de fotones baja.

Video: A Protocol for Real-time 3D Single Particle Tracking

A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids

Studies of cell-cell cohesion and cell-substratum adhesion have historically been performed on monolayer cultures adherent to rigid substrates. Cells within a tissue, however, are typically encased within a closely packed tissue mass in which cells establish intimate connections with many near-neighbors and with extracellular matrix components. Accordingly, the chemical milieu and physical forces experienced by cells within a 3D tissue are fundamentally different than those experienced by cells grown in monolayer culture. This has been shown to markedly impact cellular morphology and signaling. Several methods have been devised to generate 3D cell cultures including encapsulation of cells in collagen gels1or in biomaterial scaffolds2. Such methods, while useful, do not recapitulate the intimate direct cell-cell adhesion architecture found in normal tissues. Rather, they more closely approximate culture systems in which single cells are loosely dispersed within a 3D meshwork of ECM products. Here, we describe a simple method in which cells are placed in hanging drop culture and incubated under physiological conditions until they form true 3D spheroids in which cells are in direct contact with each other and with extracellular matrix components. The method requires no specialized equipment and can be adapted to include addition of any biological agent in very small quantities that may be of interest in elucidating effects on cell-cell or cell-ECM interaction. The method can also be used to co-culture two (or more) different cell populations so as to elucidate the role of cell-cell or cell-ECM interactions in specifying spatial relationships between cells. Cell-cell cohesion and cell-ECM adhesion are the cornerstones of studies of embryonic development, tumor-stromal cell interaction in malignant invasion, wound healing, and for applications to tissue engineering. This simple method will provide a means of generating tissue-like cellular aggregates for measurement of biomechanical properties or for molecular and biochemical analysis in a physiologically relevant model.

We describe a simple, rapid method of generating 3D tissue-like spheroids and their potential application to quantify differences in cell-cell interactions.

Una simple gota colgante celular Cultura Protocolo para la generación de esferoides 3D

Studies of cell-cell cohesion and cell-substratum adhesion have historically been performed on monolayer cultures adherent to rigid substrates. Cells ...

Investigación

Bioingeniería

Longitudinal Measurement of Extracellular Matrix Rigidity in 3D Tumor Models Using Particle-tracking Microrheology

The mechanical microenvironment has been shown to act as a crucial regulator of tumor growth behavior and signaling, which is itself remodeled and modified as part of a set of complex, two-way mechanosensitive interactions. While the development of biologically-relevant 3D tumor models have facilitated mechanistic studies on the impact of matrix rheology on tumor growth, the inverse problem of mapping changes in the mechanical environment induced by tumors remains challenging. Here, we describe the implementation of particle-tracking microrheology (PTM) in conjunction with 3D models of pancreatic cancer as part of a robust and viable approach for longitudinally monitoring physical changes in the tumor microenvironment, in situ. The methodology described here integrates a system of preparing in vitro 3D models embedded in a model extracellular matrix (ECM) scaffold of Type I collagen with fluorescently labeled probes uniformly distributed for position- and time-dependent microrheology measurements throughout the specimen. In vitro tumors are plated and probed in parallel conditions using multiwell imaging plates. Drawing on established methods, videos of tracer probe movements are transformed via the Generalized Stokes Einstein Relation (GSER) to report the complex frequency-dependent viscoelastic shear modulus, G*(&#969;). Because this approach is imaging-based, mechanical characterization is also mapped onto large transmitted-light spatial fields to simultaneously report qualitative changes in 3D tumor size and phenotype. Representative results showing contrasting mechanical response in sub-regions associated with localized invasion-induced matrix degradation as well as system calibration, validation data are presented. Undesirable outcomes from common experimental errors and troubleshooting of these issues are also presented. The 96-well 3D culture plating format implemented in this protocol is conducive to correlation of microrheology measurements with therapeutic screening assays or molecular imaging to gain new insights into impact of treatments or biochemical stimuli on the mechanical microenvironment.

Particle-tracking microrheology can be used to non-destructively quantify and spatially map changes in extracellular matrix mechanical properties in 3D tumor models.

Medida longitudinal de la matriz extracelular Rigidez en modelos de tumores en 3D utilizando partículas de seguimiento Microrheology

The mechanical microenvironment has been shown to act as a crucial regulator of tumor growth behavior and signaling, which is itself remodeled and ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a modified two-photon microscope1. As opposed to conventional approaches (raster scan or wide field based on a stack of frames), the 3D orbital tracking allows to localize and follow with a high spatial (10 nm accuracy) and temporal resolution (50 Hz frequency response) the 3D displacement of a moving fluorescent particle on length-scales of hundreds of microns2. The method is based on a feedback algorithm that controls the hardware of a two-photon laser scanning microscope in order to perform a circular orbit around the object to be tracked: the feedback mechanism will maintain the fluorescent object in the center by controlling the displacement of the scanning beam3-5. To demonstrate the advantages of this technique, we followed a fast moving organelle, the lysosome, within a living cell6,7. Cells were plated according to standard protocols, and stained using a commercially lysosome dye. We discuss briefly the hardware configuration and in more detail the control software, to perform a 3D orbital tracking experiment inside living cells. We discuss in detail the parameters required in order to control the scanning microscope and enable the motion of the beam in a closed orbit around the particle. We conclude by demonstrating how this method can be effectively used to track the fast motion of a labeled lysosome along microtubules in 3D within a live cell. Lysosomes can move with speeds in the range of 0.4-0.5 &#181;m/sec, typically displaying a directed motion along the microtubule network8.

In this video protocol we track - at high speed and in three dimensions - fluorescently labeled lysosomes within living cells, using the orbital tracking method in a modified two-photon microscope.

Rastreo Orbital 3D en un microscopio de dos fotones Modificado: una aplicación para el Seguimiento de vesículas intracelulares

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

Ordering Single Cells and Single Embryos in 3D Confinement: A New Device for High Content Screening

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening based on cells in such environments have therefore serious limitations: cell organelles show extreme phenotypes, cell morphologies and sizes are heterogeneous and/or specific cell organelles cannot be properly visualized. In addition, cells in vivo are located in a 3D environment; in this situation, cells show different phenotypes mainly because of their interaction with the surrounding extracellular matrix of the tissue. In order to standardize and generate order of single cells in a physiologically-relevant 3D environment for cell-based assays, we report here the microfabrication and applications of a device for in vitro 3D cell culture. This device consists of a 2D array of microcavities (typically 105 cavities/cm2), each filled with single cells or embryos. Cell position, shape, polarity and internal cell organization become then normalized showing a 3D architecture. We used replica molding to pattern an array of microcavities, &#8216;eggcups&#8217;, onto a thin polydimethylsiloxane (PDMS) layer adhered on a coverslip. Cavities were covered with fibronectin to facilitate adhesion. Cells were inserted by centrifugation. Filling percentage was optimized for each system allowing up to 80%. Cells and embryos viability was confirmed. We applied this methodology for the visualization of cellular organelles, such as nucleus and Golgi apparatus, and to study active processes, such as the closure of the cytokinetic ring during cell mitosis. This device allowed the identification of new features, such as periodic accumulations and inhomogeneities of myosin and actin during the cytokinetic ring closure and compacted phenotypes for Golgi and nucleus alignment. We characterized the method for mammalian cells, fission yeast, budding yeast, C. elegans with specific adaptation in each case. Finally, the characteristics of this device make it particularly interesting for drug screening assays and personalized medicine.

We report a device and a new method to study cells and embryos. Single cells are precisely ordered in microcavity arrays. Their 3D confinement is a step towards 3D environments encountered in physiological conditions and allows organelle orientation. By controlling cell shape, this setup minimizes variability reported in standard assays.

Ordenando las células individuales y solo los embriones en 3D Confinamiento: un nuevo dispositivo para la selección de alto contenido

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening ...

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances (EPS). The EPS serves as a physical and protective scaffold that houses the bacterial cells and consists of a variety of materials that includes proteins, exopolysaccharides and DNA. The composition of the EPS may change, which remodels the mechanic properties of the biofilm to further develop or support alternative biofilm structures, such as streamers, as a response to environmental cues. Despite this, there are little quantitative descriptions on how EPS components contribute to the mechanical properties and function of biofilms. Rheology, the study of the flow of matter, is of particular relevance to biofilms as many biofilms grow in flow conditions and are constantly exposed to shear stress. It also provides measurement and insight on the spreading of the biofilm on a surface. Here, particle-tracking microrheology is used to examine the viscoelasticity and effective crosslinking roles of different matrix components in various parts of the biofilm during development. This approach allows researchers to measure mechanic properties of biofilms at the micro-scale, which might provide useful information for controlling and engineering biofilms.

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

Particle-tracking microrheology investigates the viscoelasticity of materials. Here, the technique is used to determine the viscoelasticity, creep compliance and effective crosslinking roles of different matrix components of a bacterial biofilm. The matrix consists of polymeric substances secreted by the bacteria and its components determine biofilm structure and mechanical properties.

En Mapping in situ de las propiedades mecánicas de biopelículas por partículas de seguimiento Microrheology

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances ...

Real Time Monitoring of Intracellular Bile Acid Dynamics Using a Genetically Encoded FRET-based Bile Acid Sensor

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. Biosensors relying on the principle of FRET have enabled real-time visualization of subcellular signaling events in live cells with high temporal and spatial resolution. Here, we describe the application of a genetically encoded Bile Acid Sensor (BAS) that consists of two fluorophores fused to the farnesoid X receptor ligand binding domain (FXR-LBD), thereby forming a bile acid sensor that can be activated by a large number of bile acids species and other (synthetic) FXR ligands. This sensor can be targeted to different cellular compartments including the nucleus (NucleoBAS) and cytosol (CytoBAS) to measure bile acid concentrations locally. It allows rapid and simple quantitation of cellular bile acid influx, efflux and subcellular distribution of endogenous bile acids without the need for labeling with fluorescent tags or radionuclei. Furthermore, the BAS FRET sensors can be useful for monitoring FXR ligand binding. Finally, we show that this FRET biosensor can be combined with imaging of other spectrally distinct fluorophores. This allows for combined analysis of intracellular bile acid dynamics and i) localization and/or abundance of proteins of interest, or ii) intracellular signaling in a single cell.

We provide a detailed protocol to study bile acid dynamics in living cells using a genetically encoded BAS FRET sensor. This Bile Acid Sensor represents a unique tool to study (regulation of) bile acid transport and FXR activation in a wide range of cell types.

Monitoreo en tiempo real de intracelular del ácido biliar Dinámica El uso de un sensor de ácido biliar basada FRET-codificados genéticamente

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass based substrates, and hydrogel-based tube formation assays. These assays, while informative, do not recapitulate lumen geometry, proper extracellular matrix, and multi-cellular proximity, which play key roles in modulating vascular function. This manuscript describes an injection molding method to generate engineered vessels with diameters on the order of 100 &#181;m. Microvessels are fabricated by seeding endothelial cells in a microfluidic channel embedded within a native type I collagen hydrogel. By incorporating parenchymal cells within the collagen matrix prior to channel formation, specific tissue microenvironments can be modeled and studied. Additional modulations of hydrodynamic properties and media composition allow for control of complex vascular function within the desired microenvironment. This platform allows for the study of perivascular cell recruitment, blood-endothelium interactions, flow response, and tissue-microvascular interactions. Engineered microvessels offer the ability to isolate the influence from individual components of a vascular niche and precisely control its chemical, mechanical, and biological properties to study vascular biology in both health and disease.

This manuscript presents an injection molding method to engineer microvessels that recapitulate physiological properties of endothelium. The microfluidic-based process creates patent 3D vascular networks with tailorable conditions, such as flow, cellular composition, geometry, and biochemical gradients. The fabrication process and examples of potential applications are described.

Micropatterning y Montaje de Microvasos 3D

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

Bioprinting of Cartilage and Skin Tissue Analogs Utilizing a Novel Passive Mixing Unit Technique for Bioink Precellularization

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both cartilage and skin analogs were fabricated after bioink pre-cellularization utilizing a novel passive mixing unit technique. This technique was developed with the aim to simplify the steps involved in the mixing of a cell suspension into a highly viscous bioink. The resolution of filaments deposited through bioprinting necessitates the assurance of uniformity in cell distribution prior to printing to avoid the deposition of regions without cells or retention of large cell clumps that can clog the needle. We demonstrate the ability to rapidly blend a cell suspension with a bioink prior to bioprinting of both cartilage and skin analogs. Both tissue analogs could be cultured for up to 4 weeks. Histological analysis demonstrated both cell viability and deposition of tissue specific extracellular matrix (ECM) markers such as glycosaminoglycans (GAGs) and collagen I respectively.

Cartilage and skin analogs were bioprinted using a nanocellulose-alginate based bioink. The bioinks were cellularized prior to printing via a single step passive mixing unit. The constructs were demonstrated to be uniformly cellularized, have high viability, and exhibit favorable markers of differentiation.

Bioprinting de cartílago y piel análogos de tejido utilizando un pasivo novela mezcla de unidad técnica de Bioink Precellularization

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both ...

In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses

In situ monitoring in microbial bioprocesses is mostly restricted to chemical and physical properties of the medium (e.g.,pH value and the dissolved oxygen concentration). Nevertheless, the morphology of cells can be a suitable indicator for optimal conditions, since it changes with dependence on the growth state, product accumulation and cell stress. Furthermore, the single-cell size distribution provides not only information about the cultivation conditions, but also about the population heterogeneity. To gain such information, a photo-optical in situ microscopy device1 was developed to enable the monitoring of the single-cell size distribution directly in the cell suspension in bioreactors. An automated image analysis is coupled to the microscopy based on a neural network model, which is trained with user-annotated images. Several parameters, which are gained from the captures of the microscope, are correlated to process relevant features of the cells, like their metabolic activity. Until now, the presented in situ microscopy probe series was applied to measure the pellet size in filamentous fungi suspensions. It was used to distinguish the single-cell size in microalgae cultivation and relate it to lipid accumulation. The shape of cellular particles was related to budding in yeast cultures. The microscopy analysis can be generally split into three steps: (i) image acquisition, (ii) particle identification, and (iii) data analysis, respectively. All steps have to be adapted to the organism, and therefore specific annotated information is required in order to achieve reliable results. The ability to monitor changes in cell morphology directly in line or on line (in a by-pass) enables real-time values for monitoring and control, in process development as well as in production scale. If the off line data correlates with the real-time data, the current tedious off line measurements with unknown influences on the cell size become needless.

In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses

A photo-optical in situ microscopy device was developed to monitor the size of single cells directly in the cell suspension. The real-time measurement is conducted by coupling the photo-optical sterilizable probe to an automated image analysis. Morphological changes appear with dependence on the growth state and cultivation conditions.

In Situ Microscopía para la determinación en tiempo real de la morfología de una sola célula en bioprocesos

In situ monitoring in microbial bioprocesses is mostly restricted to chemical and physical properties of the medium (e.g.,pH value and the dissolved ...

Manufacturing of a Nafion-coated, Reduced Graphene Oxide/Polyaniline Chemiresistive Sensor to Monitor pH in Real-time During Microbial Fermentation

Here, we report the engineering of a solid-state micro pH sensor based on polyaniline-functionalized, electrochemically reduced graphene oxide (ERGO-PA). Electrochemically reduced graphene oxide acts as the conducting layer and polyaniline acts as a pH-sensitive layer. The pH-dependent conductivity of polyaniline occurs by doping of holes during protonation and by the dedoping of holes during deprotonation. We found that an ERGO-PA solid-state electrode was not functional as such in fermentation processes. The electrochemically active species that the bacteria produce during the fermentation process interfere with the electrode response. We successfully applied Nafion as a proton-conducting layer over ERGO-PA. The Nafion-coated electrodes (ERGO-PA-NA) show a good sensitivity of 1.71 &#937;/pH (pH 4 - 9) for chemiresistive sensor measurements. We tested the ERGO-PA-NA electrode in real-time in the fermentation of Lactococcus lactis. During the growth of L. lactis, the pH of the medium changed from pH 7.2 to pH 4.8 and the resistance of the ERGO-PA-NA solid-state electrode changed from 294.5 &#937; to 288.6 &#937; (5.9 &#937; per 2.4 pH unit). The pH response of the ERGO-PA-NA electrode compared with the response of a conventional glass-based pH electrode shows that reference-less solid-state microsensor arrays operate successfully in a microbiological fermentation.

Here, we report the protocol for the fabrication of a Nafion-coated, polyaniline-functionalized, electrochemically reduced graphene oxide chemiresistive micro pH sensor. This chemiresistor-based, solid-state micro pH sensor can detect pH changes in real-time during a Lactococcus lactis fermentation process.

Fabricación de una cubierta de Nafion, reduce el óxido/polianilina Chemiresistive Sensor de pH Monitor en tiempo real durante la fermentación microbiana

Here, we report the engineering of a solid-state micro pH sensor based on polyaniline-functionalized, electrochemically reduced graphene oxide (ERGO-PA). ...