Yazarlar minnetle Dr Mohamad Navab, Alan Fogelman ve Srinivasa Reddy iş geliştirme, önceki yineleme bu modelin içindeki anahtar rolü için kabul. T.A.A. bir RMIT Üniversitesi-Şansölye Yardımcısı'nın doktora sonrası bursu tarafından desteklenir. AJ ve AA NHMRC proje desteği 1108792 tarafından desteklenir. TK tarafından desteklenmektedir NIH NIH K08AI08272, NIH/NCATS Grant # µL1TR000124 verir.

tüm deneylerin insan biyolojik numuneleri kullanılarak etik onayıyla California Los Angeles, Los Angeles ve Alfred hastane insan Etik Komitesi, Melbourne Üniversitesi'nden gerçekleştirilmiştir.
 Not: fluorochrome HDL işlevi tahlil (bkz: tartışma) 32 birçok varyasyonu vardır. Aşağıda en tutarlı ve tekrarlanabilir sonuçlar verir Protokolü anlatacağız. Genel testin Şekil 2 ' deki.
 1. numune işleme <ol><li>Kullanım taze, Sigara hemolyzed serum (serum ayırıcı tüplerde toplanan olabilir) veya sitrat plazma elde edilen 12-14 saat sonra oruç. Bu protokol için açıklandığı gibi uygun denetim cryopreserved örnekleri kullanıyorsanız, dahil.</li>
</ol> 2. Tahlil için gün 0-hazırlık <ol><li>hazırlama çalışma düzenini uygun denetimleri ile deneme örnekleri ve çoğaltır. Her örnek en az triplicates içinde çalıştırın. Bir temsilcisi 96 iyi düzen şekil 3 ' te gösterilen.</li>
	<li>Örnekleri ve çoğaltır sayısına göre tahlil için kullanılan reaktifler tüm birimleri hesaplamak. 
	Not: her çalışma hisse senedi yeterli hacim belirli deneme için her reaktif için olduğundan emin olmak için ek bir % 10 birim içerir.</li>
	<li>Etiket HDL, HDL-C (isteğe bağlı) ölçümü ve fluorochromeassay ayrılması için testin tüm farklı adımlar için gerekli tüm tüpler.</li>
</ol> 3. Gün 1-hazırlık denetimleri <ol><li>çalışma özel havuza alınan denetim hazırlanması <ol><li>oluşturma bir denetimi örneğini havuza alınan plazma veya serum tüm çalışma örnekleri. 20 örnekleri her plaka nüsha olarak çalışıyorsa, her örnek üzerinden 10 µL 200 µL havuza alınmış denetime birleştirin. Bu denetimin HDL-C değeri belirlemek için klinik laboratuvar için havuza alınan bu denetimin ayrı bir aliquot verin. 
		Not: Bu havuza alınan denetim tahlil standartlaştırmak ve olası tüm bilinen için hesap için kullanın (örneğin plazma, donma-çözülme çevrimleri, dondurma karşı bir matris serum yazın) ve deneysel değişkenlik etkileyebilir bilinmeyen kaynaklanan 27 , 28.</li>
	</ol></li> <li>Özel kalite kontrol (QCs) hazırlanması <ol><li>her laboratuvar (örneğin 5 mL plazma 10 sağlıklı bağışçılardan de gelen izole HDL) HDL büyük bir hazır hazırlamak ve bu birkaç aliquots cryopreserve hisse senedi donma-çözülme döngüsü en aza indirmek için.</li>
		<li>Kullanımı en az 10 farklı HDLox ortalama değerini belirlemek için bu stoktan çoğaltır. Ölçülen HDLox kabul edilebilir bir aralık değerleri için her QC örnek her tahlil dahil içinde &#60; bu ortalama değer of varyasyon katsayısı % 15.</li>
		<li>Vermek ayrı bir aliquot havuza alınan bu denetimin bu denetimin (örneğin 40 mg/dL) HDL-C değeri belirlemek için klinik laboratuvar. 
		Not: Daha detaylı bir yaklaşım kan kan bankalardan bu denetimleri oluşturmak için nasıl kullanılacağı açıklanan 27 , 28 , 32 olmuştur. Gerektiğinde ek QCs kullanın (örneğin bir sağlıklı bir donörden normal HDL işlevi ve bir büyük ölçüde anormal HDL iþlevi için bilinen bir donörden bilinmektedir.</li>
	</ol></li> <li>En iyi duruma getirme arka plan sinyal ve boş değerleri (isteğe bağlı) <ol><li>arka plan en aza indirmek için kurulan H 2 O hızla kaldırmak için kuluçka ortamda katalaz (1-4 U/mL) uygun miktarda ekleyin 2 nedeniyle kendiliğinden hava oksidasyon arabelleklerinin. 
		Not: değerleri boş kuyulardan (HDL) HDL örnekleri değerleri çıkarılan ve sonuçları olmak beri (yani aynı 96 iyi plaka dahil) bir havuza alınan denetimi göre rapor bu adımı değil pratikte affec mu bulduk t sonuçları. Böylece, katalaz ile arka plan sinyal duruma getirilmesi, gerekirse atlanabilir.</li>
	</ol></li></ol> 4. Gün 1-ayrılık HDL kolesterol HDL yağış kullanarak Not: bir ticari olarak mevcut standart HDL kolesterol Hizlandirici reaktif tükenmiş apoB serum üreticiye göre ayırmak için kullanın &#39; s talimatları. Bu reaktifler Renkölçer deneyleri HDL kolesterol düzeylerini belirlemek için yaygın olarak kullanılan.
<ol><li>Plazma veya serum örneği kullanmak taze (veya çözülme).</li>
	<li>Karışımı eşit miktarda (örneğin 80 µL) plazma ve HDL kolesterol reaktifi (% 20 w/v polietilen glikol glisin tampon pH 10.0 (25 ° C)) presipite.</li>
	<li>Mix de tarafından yukarı ve aşağı pipetting.</li>
	<li>, Santrifüj kapasitesi 1000-2000 g 10 dakika süreyle x</li>
	<li>Süpernatant (HDL kesir) Aspire edin.</li>
	<li>İdeal hemen izole HDL HDL lipid peroksidasyon fluorochromeassay için kullanın. Ancak, aynı gün içinde çeşitli örnekleri çalıştırmak ve HDL-kolesterol konsantrasyonu ölçümü yapılır Ayrıca gibi diğer adımları, sonra 4 ° C'de izole HDL kapaklarý takýlý bu ertesi gün fluorochromeHDL işlevi tahlil için.</li>
</ol> 5. Gün 1-HDL-C izole HDL tayini Not: HDL-C klinik laboratuvar değerini HDLox normale HDL-C miktar kadar kullanılırsa, isteğe bağlıdır.
<ol><li>Miktarını HDL-kolesterol plazma üzerinden, standart Renkölçer kullanarak 27 deneyleri. Kolesterol reaktif 50 µL her kuyuya ekleyin ve kolorimetrik plaka okuyucu ve bir kolesterol standart her Seti'nde sağlanan kullanarak kolesterol konsantrasyonu belirlemek.</li>
</ol> 6. Gün 2-reaktifler hazırlanması <ol><li>HRP 5 U/mL solüsyon (aralığı 1-10 U/mL) hazırlamak HRP ve kolesterol çözümler.</li>
	<li>20 mM fluorochrome (örneğin, Amplex kırmızı) çözümleri hazırlamak: bir şişe fluorochrome reaktif ve DMSO için oda sıcaklığında erimek. Kullanılmadan önce fluorochrome reaktifi (1 mg) DMSO 200 µL geçiyoruz. Saklamak hisse senedi çözüm dondurulup &#8804;-20 ° C, ışıktan korunan.</li>
	<li>Pozitif ve negatif kontrolleri hazırlayın: Kullanım 1 X &#39; reaksiyon arabellek &#39; kolesterol ve 20 mM H 2 O 2 çalışma çözüm negatif ve pozitif kontrol sırasıyla.</li>
</ol> 7. Gün 2-Fluorochrome tahlil <ol><li>Ekle 50 µL tepki arabellek boş (negatif kontrol) olarak x 1.</li>
	<li>İsteğe bağlı: olumlu denetim her plaka olarak 20 mM çalışma çözüm H 2 O 2 ekleyin.</li>
	<li>Deneysel değişkenlik en aza indirmek ve reaktifler ve örnekleri bu ek sağlamak için sürekli olarak yapılır ve zamanında, bir ayrı 96 de yuvarlak-alt, açık, polistren veya polipropilen plaka (plaka 1) örneklerinin tüm eklemeler gerçekleştirmek. Belirli birimlerdeki 3 96-şey kalıplara aktarmak için bir çok kanallı pipet kullanın (2-4 tabaklar: Polipropilen, düz botTom, siyah) (Bu aynı düzene sahip) ( Şekil 2, şekil 3).
	<ol><li>Örneğin, önce izole HDL 160 µL plaka 1 her şey/örnek ekleyin ve sonra çok kanallı pipet kullanımı ile HDL-kolesterol 50 µL 96-şey siyah kalıplara her şey/örnek aktarmak. Değiştirmek ipuçları arasında her satır/sütun ve filtre edilmemiş su ipuçlarını tüm transferler için kullanın.</li>
	</ol></li> <li>Bırakın örnekleri wells. Atmayın. Reaktifler eklenmesi arasında hiçbir yıkama adım vardır.</li>
	<li>Ekle 50 µL HRP çözüm 5 U/mL (0.25 U) her şey. 
	Not: Kullanım fluorochrome reaktif eklenmesi önce HRP.</li>
	<li>37 ° C'de 30 dk için kuluçkaya Örnekleri kuluçka (reaktifler eklemeler arasında hiçbir yıkama adımları) sonra atmayın.</li>
	<li>Fluorochromereagent 300 son bir konsantrasyon için Ekle 50 µL µM. Bu noktada, toplam reaksiyon birimdir 150 µL. iyice karıştırın ve ışıktan korumak.</li>
	<li>Değerlendirmek (karanlıkta) floresan okuma her dakika 120 dk bir floresan plaka okuyucu (530/590 nm filtreleri) ile 37 ° C'de. 
	Not: daha kısa bir 60 dakika aralığı ile taze örnekler kullanın. O 120 dakikalık tahlil cryopreserved örnekleri kullanımı ile daha fazla tekrarlanabilir veri verir bulduk.</li>
	<li>Kaydetmek uygun yazılımı kullanarak veri.</li>
</ol> 8. Gün 3-veri analizi <ol><li>fluorochrome reaktif ilavesi sonra 120 dakika boş wells de dahil olmak üzere tüm örnekleri için kayıt Floresans birimleri (rasgele adet) ve tüm denetimleri.</li>
	<li>Floresan birimleri ortalama değerini hesaplamak (temel alan en az triplicates) (HDL ox_sample). Aykırı kabul ediyor (&#62; 2 ortalama değer üzerinden SDs) içine dikkat.</li>
	<li>Aşağıdaki denklemi kullanarak arka plan Floresans çıkarma: 
	<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56325/56325eq1.jpg" /></li> <li>normalleştirme HDL kolesterol miktarı (HDL-C) için: HDL-C tarafından HDLox lipid peroksidasyon değeri (havuzda çalıştırılır denetimi dahil) her örnek için Normalize) (mg/dl). Sonuçları bölümü HDL öküz n HDL-c Duzeltme yansıtacak şekilde (HDL-C) HDLox ölçü olarak sunulur Aşağıdaki denklemi kullanın: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56325/56325eq2.jpg" /></li> <li>HDLox lipid peroksidasyon değeri her örnek havuza alınan bir denetimin değerini karşı ifade standartlaştırmak. (HDL-C) HDLox lipid peroksidasyon değeri (HDL-C için ayarlanabilir) her örnek için n n (HDL-C) HDLox lipid peroksidasyon havuza alınan denetiminin değerini normalleştirmek. Sonuçları bölümü HDL öküz deneysel değişkenliği ve HDL-c Duzeltme yansıtacak şekilde nHDL öküz ölçü olarak sunulur Aşağıdaki denklemi kullanın: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56325/56325eq3.jpg" /> Not: Bu yaklaşım diğer kurulan deneysel yaklaşımlar gibi deneysel ölçümler değişkenliği azaltmak için benzer Uluslararası oranı (INR) 44 , 45 normalleştirilmiş. Bu yaklaşım klinik çalışmalar 32 , 33 , 34 , 35 , 36 yılında doğrulandı , 37 , 38 , 39.</li> <li>kalite kontrol deneysel sonuçların standart kalite kontrol örnekleri kullanarak gerçekleştirmek. Her laboratuar kendi kalite denetimleri (QCs) oluşturmanız gerekir. İdeal olarak bir QC bilinen işlevsiz HDL ile bir örnekten nHDLox için ve bir QC için sağlıklı donör [örneğin kullanım havuza alınan örnekten kurulan kan Bankası bağışçılar ve hiçbir bilinen ektanı ve risk faktörleri için genç yetişkin bir örnekten nHDLox olduğunu Kardiyovasküler hastalık] yasaktır dahil olmak üzere. İkinci denetim sonuçları farklı laboratuvarlar arasında standartlaştıran. Ortalama bu QCs kurulan bağlı olarak en az 5 çoğaltır (genellikle 10 çoğaltır bu önemli adım için kullandığımız) değerleridir.
	<ol><li>Onay her tahlil ölçülen QCs olup olmadığını değerleri değer beklenen Aralık içinde. Bir kabul edilebilir en fazla deneysel değişkenliğin % 15 varsayarsak, deneysel ölçülen değerlerin kurulan QC bilinen ortalama değerlerden % 15'lik düşmek gerekir. Aşağıdaki denklemler kullanın: <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/56325/56325eq4.jpg" /> <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/56325/56325eq5.jpg" /> Not: ya dahil kalite kontrol örnekleri Eğer () normal işlevsiz HDL karşı) HDLox değerleri (her laboratuvar kurulu) beklenen aralığın dışında verir sonra denemeyi tekrarlamak.</li>
	</ol></li> <li>Kalite kontrol deneysel sonuçlar deneysel değişkenlik ölçmek için (CV) varyasyon katsayısı kullanarak gerçekleştirmek: MF % ile tüm örneklerini tekrar &#62; % 15. Aşağıdaki denklemi kullanın: <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/56325/56325eq6.jpg" /> Not: bir tipik Intra-tahlil (içinde aynı plaka) ve (arasında farklı tabak) arası tahlil deneysel değişkenlik &#60; %15. 2) tipik bir 1-%7 ve CV % 3-10 arasında olduğunu tipik bir interassay içi-tahlil CV olduğunu.</li>
</ol>

Bu iletişim kuralı ve tahlil patent PCT/US2015/018147 için uygundur.

Burada açıklanan protokol HDL işlev ateroskleroz ve insan hastalık rolü ile ilgili önemli araştırma soruları cevaplamak için güçlü bir araç sunar. Tahlil HDL lipid peroksit içeriği HDL-C enzimatik amplifikasyon (HRP) kullanarak mg başına quantifies. Bu yaklaşım kullanılan hücre türleri, okuma rapor türünü, standardizasyon eksikliği ve karıştırıcı etkileri açısından önemli heterojenite dahil olmak üzere önceki HDL işlevi deneyleri (örneğin kolesterol sızma tahlil) bilinen sınırlamaları önler trigliserid7,15,32. Biyolojik özelliklerini (örneğin kolesterol sızma) HDL yerine biyokimyasal belirlenmesi-ebilmek var olmak daha tekrarlanabilir. Arası tahlil deneysel değişkenliği &#60; % 10 karşılaştırır olumlu HDL işlevi, interassay deneysel değişkenlik nerede kez hücre tabanlı deneyleri ile &#62; % 15 (veya rapor değildir). Buna ek olarak, bu yaklaşım lipidler arasındaki biyokimyasal etkileşimler sınırlayabilir ve floresan probları32. HDL oksidasyon Kardiyovasküler hastalıkların atherogenesis 46patogenezinde önemli rol içinde Arteryel duvardaki oksidatif stres verilen bağlamda ilgili belirlenmesidir. Ateroskleroz ve insan immün yetmezlik virüsü (HIV) enfeksiyonu32gibi kronik oksidatif stres durumlarında Engelli HDL işlevi algılamaya fluorochrome HDL işlevi tahlil kullandık. Biyokimyasal tahlil HDL işlevi kullanarak, çeşitli çalışmalarda HDLox Derneği obezite ve kalp-damar hastalıkları 19,21,27,34,35 ile doğruladı ,36,47. Önemli ölçüde, insan pilot çalışmalar biz HDLox dernekleri ile doğrulanmış hücre tabanlı deneyleri, kalp-damar hastalıkları, sistemik inflamasyon, immün disfonksiyon önlemler vekil ve kardiyovasküler ve metabolik riski ilişkili gösterdi fenotipleri32,36. Bu tahlil çeşitli çalışmalarda farklı hastalıklar gibi kronik HIV enfeksiyonu32,38, HDL işlevinde rolü adrese yolculuklarında uygulanmış olsa ateroskleroz36 32 ve obezite, o artık olmak büyük ölçekli çalışmalar mevcut klinik bitiş noktaları CVD (örneğin kalp krizi) ile doğrulanmış.
Fluorochrome son derece floresan resorufin üretmek için HRP huzurunda peroksitler ile iyi kurulmuş 48,49tepkidir. HRP floresan floresan resorufin kırmızı50,51fluorochrome oksidasyonunu tromboksan. Bu oksidasyon endojen peroksitler tepki (OH-) mevcut ve HDL-lipid peroksitler (LOOH-) tarafından kurulabilir. Kolesterol oksidaz resorufin (HRP ile) içsel HDL lipid peroksit içeriği HDL kolesterol belirli bir miktarda ölçmek. Arka plan üretimini OH - hava oksidasyon arabelleği bir sonucu olarak her şey floresan okuma çıkarılır. Resorufin en az autofluorescence çoğu örnekleri vardır. Floresan okuma artış zaman içinde HDL lipid peroksitler tarafından tahrik edilir böylece katalaz (1-4 U/mL) tepki arabellekte eklenmesi hızlı bir şekilde endojen peroksitler azaltmak. Tahlil çok yönlü ve HDL Kolesteril ester ücretsiz HDL kolesterol32,48,49 karşı lipid peroksit içeriği değerlendirebilir.
Fluorochrome HDL işlevi tahlil32birçok varyasyonu vardır. Kısa bir süre en az 3 önemli yaklaşım vardır: bir) HDL (örneğin 50 µL) belirli bir birim başına iyi eklemek ve daha sonra normale HDL lipid peroksidasyon değer HDL-C klinik laboratuvarda; belirlenen düzeyi tarafından b) HDL-C konsantrasyonu standart Renkölçer kolesterol deneyleri üzerinde dayalı her örnek içinde belirlemek ve HDL-C (örneğin 1 µg) belirli bir miktarda iyi ücret ekleyin; ve c) HDL işlev okuma HDL veya apoA normalize-ben protein içerik32. Ayrıca HDL HDL lipid peroksidasyon deneyleri için izole konusunda en az 3 önemli yaklaşım vardır: a) HDL kolesterol yağış örneğin ile polietilen glikol; b) Immunoaffinity yakalama; ve c) HDL yalıtım µLtracentrifugation32gibi diğer standart değil yüksek üretilen iş yöntemleri. Buna ek olarak, tahlil çok yönlü ve HDL Kolesteril ester ücretsiz HDL kolesterol 32karşı lipid peroksit içeriği değerlendirebilir. Oranı bir havuza alınan denetim32sonuçlar örneğin rasgele Floresans birimleri, standart resorufin floresan birimleri, normalleştirilmiş bildirmek için çeşitli yolları vardır. Burada biz en tekrarlanabilir yaklaşım mevcut.
Plazma kullanılırsa plazma sodyum sitrat antikoagülan 27,28olarak var tüpler hazırlamak önemlidir. EDTA40 ve heparin sülfat ile oksidasyon reaksiyonları 41,42engelleyebilir. Heparin sülfat HDL işlevi 27,28biyokimyasal deneyleri ile etkileyebilir. Cryopreserved serum ve plazma lipidler, HDL fonksiyon ve HDL lipid peroksidasyon belirlenmesi için suboptimal olmakla birlikte, cryopreserved örnekleri HDL mg başına HDL lipid peroksidasyon göreli farklılıkları ölçmek. Belirli bir çalışma içinde tüm örnekleri tam olarak aynı şekilde (örneğin aynı donma-çözülme döngüsü) işlemek ve havuza alınan bir denetim için potansiyel confounders örnek işleme farklı çalışmalar arasında farklılıklar ile ilgili hesap her plaka dahil etmek önemlidir. Uzun vadeli dondurma HDL işlevi deneyleri43 sonuçlarını olumsuz etkileyebilir ama uygun bir havuza alınan denetim kullanılan 27ise HDL lipid peroksidasyon bir çalışma içinde örnekleri arasında göreceli farklılıklar hala değerlendirildi, 28.
Önemlisi, önceki HDL işlevi deneyleri standart değil. Burada nerede uygun kontrollerin kullanımı okuma standardizasyon sağlar bir yaklaşımı açıklamak. Özellikle HDL biyokimyasal deneyleri okuma etkileyebilecek bazı bilinen parametreler bulunur daha fazla dondurma, matris etkileri (serum vs yöntemi plazma hazırlık), albümin ve diğer proteinler varlığı gibi işlev donma-çözülme 32. HDL işlevi fluorochrome tahlil ticari olarak mevcut standartları ve deneysel reaktifler32kullanılarak standart. Ancak, orada dabirkaç bilinmeyen (veya kötü karakterize) kaynaklanan her çalışma ve HDL belirlenmesi etkileyebilir farklı kişiler arasında sonuçları işlev. Böylece, her tabak içinde faiz eserler ve kaynaklanan32en aza indiren (işlenen aynı şekilde) bir verilen çalışma içinde belirli örnekleri hazırlanan havuza alınan bir HDL denetimi kullanın. Plazma kan Bankası örnekleri ve HDL-C değerleri klinik laboratuvar kullanımı daha da tahlil32standart hale getirmek.
Biz daha önce farklı yöntemler HDL tecrit HDL işlevi 27,28,32 biyokimyasal deneyleri okuma önemli ölçüde etkileyebilir ama fluorochrome güvenilir bir şekilde HDLox bakılmaksızın ölçebilirsiniz göstermiştir HDL yalıtım 32tanesi. HDL izolasyon yöntemleri yüksek üretilen iş araştırmalar HDL işlevinin önemli kısıtlayıcı bir faktör vardır. Ultrasantrifüj başvuru yöntemi bugün kabul edilir, ancak bir zaman alıcı yöntemi52kalır. Elektroforez imprecise ve 53standart değil. HDL yağış yöntemleri polyanions polietilen glikol (HDL süpernatant 54yılında bırakarak düşük yoğunluklu lipoproteinler çökelti PEG) gibi kullanımı dahil. Her ne kadar bu yöntemler bazı sakıncaları numunelerde Serumlar ile değişken sonuçları ve enzimatik kolesterol yordamlar 55 önceki değişiklikler ile etkileşimler gibi ekranda özgün yordamı kullanarak ticari olarak mevcut standart reaktifler bir basit, güvenilir ve doğru yordam56verim. PEG yağış HDL21,57 hastanın serum üzerinden yalıtmak için yaygın olarak kullanılan yöntem olsa da, büyük bir sorun sigara HDL proteinler gibi albümin58varlığıdır. Immunoaffinity yalıtım HDL işlev 32albümin etkisini en aza indirmek için kullanılabilir. Özel yakalama yöntemi için HDLox içinde göreceli farklılıklar tespit edilebilir olsa da, HDL karşı belirli antikor karmaşık HDL yapıları yakalamak değil tamamen. Bu protokol için açıklandığı gibi uygun denetimleri kullanarak HDLox göreceli farklılıklar (PEG yağış tarafından izole) HDL örnekler arasında güvenilir bir şekilde belirlenebilir.
Bu yöntemi, HDL işlevinin diğer deneyleri gibi önemli sınırlamaları vardır. HDL in vivo oksidasyonunu Arteryel duvardaki oldukça karmaşık ve türdeş olmayan ve lipid peroksit içeriği yalnızca kısmen HDLox46yansıtıyor olabilir. HDL yapısı ve fonksiyonu sürekli vivo değiştirir ve HDL fonksiyon için bir timepoint ölçümü HDL disfonksiyon uç organ hastalığında etkisini saat59yansıtmıyor olabilir. Olmadığı bilinmiyor olup olmadığını HDLox okuma HDL-C veya HDL protein 22normalleştirilmiş. Gelecekteki klinik çalışmalar tahlil (HDL lipid peroksit içeriği HDL-C mg başına) okuma önemini doğrulamak.
Sonuç olarak, fluorochrome HDL işlevi tahlil HDL lipid peroksit içeriği HDL (HDLox) belirli miktarda ücret tespiti için güvenilir bir yöntemdir. Daha yüksek HDLox düşük HDL antioksidan işlevi ile ilişkili değerlerdir. Okuma Bu testin doğrulanmış hücre tabanlı deneyleri ile vekil önlemler kalp-damar hastalıkları, sistemik inflamasyon, immün disfonksiyon ve ilişkili kardiyovasküler ve metabolik risk fenotipleri 19, ilişkili 21,27,32,34,35,36,37,38,39, 47. bu yöntem HDL işlevi insan hastalığında rolünü inceleyen için uygun, ancak sağlam bir araç sunmaktadır.

Aterosklerotik kardiyovasküler hastalık (CVD) ölüm dünya çapında1,2önde gelen nedenidir. Epidemiyolojik çalışmalar yüksek yoğunluklu lipoprotein (HDL) kolesterol seviyesinin düşük genellikle ters ateroskleroz1,2gelişimi için risk ile ilişkili olduğunu göstermiştir. Çeşitli çalışmalarda HDL1,2için bir atheroprotective rol desteklese de, hangi tarafından HDL başlama ve ilerleme ateroskleroz zayıflar karmaşık 3,4mekanizmadır. Bu nedenle, karmaşık yapısı ve fonksiyonu mutlak düzeyi yerine HDL ateroskleroz 5,6,7,8daha doğru tahmin sürülmüştür. Ateroskleroz gibi inflamatuar Birleşik Devletleri, HDL fonksiyonu zarar HDL protein ve lipit kompozisyon değişiklikler oluşur. Bunlar i) azaltmak onun kolesterol sızma potansiyel 9, II) azaltın anti-enflamatuar ve artış pro-inflamatuar proteinler HDL ilişkili 6,7, III) azalma antioksidan faktör düzeyleri ve etkinlik ve HDL Düşük yoğunluklu Lipoprotein (LDLox)10 ve IV oksidasyonu inhibe yeteneği) lipid hydroperoxide içerik ve Redoks etkinliği (HDLox)9,11artırın. HDL pleotropic işlevleri (örneğin, kolesterol sızma, antioksidan işlevi) çizimle sağlam deneyleri HDL-HDL-C klinikte belirlenmesi tamamlayıcı.
HDL işlevi genellikle kolesterol sızma tahlil8,12,13,14gibi hücre tabanlı yöntemler tarafından değerlendirilir. Bu yöntemi kullanılan hücre türleri, okuma rapor türünü, standardizasyon eksikliği ve trigliserit 7,15karıştırıcı etkileri açısından önemli heterojenite dahil olmak üzere önemli sınırlamaları vardır. Bu sakıncaları zorluklar büyük klinik çalışmalar16için poz. Boş hücre deneyleri HDL işlevi hücre tabanlı deneyleri için kıyasla daha sağlam önlemler verebilir. Kolesterol sızma HDL en önemli işlevlerinden biridir ama hücre tabanlı deneyleri tarafından yalnızca belirlenebilir. Proteomik17,18,19,20,21,22,23gibi HDL işlevini belirlemek için diğer yaklaşımlar 24 ve hücre tabanlı monosit kemotaksisi deneyleri HDL işlevi 17,22,25 değil standardize ve büyük ölçekli insan çalışmalarda kullanılamaz.
HDL önemli antioksidan atheroprotective etkisi5,6,7,8vardır. Antioksidan işlevi HDL, LDL huzurunda önceki hücre ücretsiz Fluorometrik deneyleri 26yılında belirlenmiştir. Biyokimyasal Fluorometrik yöntemlerin HDL antioksidan işlevi başlangıçta Mohamad Navab ve Alan Fogelman ve onların iş arkadaşları26tarafından geliştirilmiştir. Her ne kadar birçok insan çalışmaları-si olmak kullanılmış bu yöntemler HDL işlevi 17,18,19,20,21,22,23 belirlemek için ,24, lipid (HDL)-lipid (LDL) ve lipid fluorochrome etkileşimleri bu hücre ücretsiz enzimatik olmayan biyokimyasal deneyleri HDL işlevi27,28tekrarlanabilirlik sınırlamak.
Son faiz lipidler ve HDL 27,29,30içinde protein oksidasyon sonucu HDL oksidasyon fonksiyonel sonuçları üzerinde odaklanmıştır. Önceki çalışmalar göstermiştir bu oksidasyonunu HDL HDL işlevi 27,29,30bozar. HDL lipid peroksit taşımacılığında önemli bir rolü vardır ve yüksek miktarda lipid peroksitler anormal HDL fonksiyonuyla ilişkilidir. Böylece HDL lipid peroksit içeriği HDL işlevi 9,17,20,31 belirlemek için kullanılan ve HDL işlev7önceki deneyleri bilinen sınırlamaları verilen, 15,27,32, HDL lipid peroksit içeriği (HDLox) 32quantifies alternatif bir Fluorometrik yöntem geliştirdik. Bu yöntem enzim horseradish peroksidaz (HRP) ve fluorochrome (kolesterol oksidaz) HDL-C 32mg başına lipid peroksit içeriği ölçmek Amplex kırmızı temel alır. Tahlil biyokimyasal prensibi şekil 1' de gösterilen. Biz bu floresan dayalı yaklaşım önceki HDL işlevi deneyleri27,28sınırlamaları yok göstermiştir. Bu tahlil edilmiş daha rafine ve böylece büyük ölçüde insan çalışmaları bile cryopreserved plazma 32,33,34, , güvenilir bir şekilde kullanılabilir bizim laboratuarda standart 35 , 36 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42. bu tahlil okuma doğrulanmış hücre tabanlı deneyleri, kalp-damar hastalıkları, sistemik inflamasyon, immün disfonksiyon ve ilişkili kardiyovasküler ve metabolik risk fenotipleri vekil önlemler çıktıları ile ilişkilidir 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 39. burada, HDL lipid peroksit içeriği (HDLox) ölçmek için bu basit ama güçlü yöntemi açıklanmaktadır. Bu tahlil bir aracı insan hastalığında HDL işlevinin rolü ile ilgili önemli araştırma soruları cevaplamak için sistemik inflamasyon, oksidatif stres ve okside lipidler (ateroskleroz gibi) önemli rol32olduğu kullanılabilir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Experimental Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HDL PEG (Polyethylene Glycol) Precipitating Reagent</td>
			<td>Pointe Scientific</td>
			<td>H7511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplex Red reagent.</td>
			<td>Life Technologies, Grand Island, NY</td>
			<td>A12216</td>
			<td>Amplex Red Cholesterol Assay Kit. 
			&#8226; &#8804;&#8211;20&#176;C &#8226; Desiccate 
			&#8226; Protect from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO.</td>
			<td>Life Technologies, Grand Island, NY</td>
			<td>A12216</td>
			<td>Amplex Red Cholesterol Assay Kit. 
			&#8226; &#8804;&#8211;20&#176;C &#8226; Desiccate 
			&#8226; Protect from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Radish Peroxidase (HRP)</td>
			<td>Life Technologies, Grand Island, NY</td>
			<td>A12216</td>
			<td>Amplex Red Cholesterol Assay Kit. 
			&#8226; &#8804;&#8211;20&#176;C &#8226; Desiccate 
			&#8226; Protect from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol Esterase.</td>
			<td>Life Technologies, Grand Island, NY</td>
			<td>A12216</td>
			<td>Amplex Red Cholesterol Assay Kit. 
			&#8226; &#8804;&#8211;20&#176;C &#8226; Desiccate 
			&#8226; Protect from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Cholesterol Reference standard</td>
			<td>Life Technologies, Grand Island, NY</td>
			<td>A12216</td>
			<td>Amplex Red Cholesterol Assay Kit. 
			&#8226; &#8804;&#8211;20&#176;C &#8226; Desiccate 
			&#8226; Protect from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Resorufin fluorescense Reference standard</td>
			<td>Life Technologies, Grand Island, NY</td>
			<td>A12216</td>
			<td>Amplex Red Cholesterol Assay Kit. 
			&#8226; &#8804;&#8211;20&#176;C &#8226; Desiccate 
			&#8226; Protect from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5x Reaction Buffer.</td>
			<td>Life Technologies, Grand Island, NY</td>
			<td>A12216</td>
			<td>Amplex Red Cholesterol Assay Kit. 
			&#8226; &#8804;&#8211;20&#176;C &#8226; Desiccate 
			&#8226; Protect from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HDL Cholesterol Automated Reagent</td>
			<td>ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, USA.</td>
			<td>TR39601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasticware&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates (polypropylene, flat bottom, clear).</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M0687</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates (polypropylene, flat bottom, black).</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M9936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Eppendorf tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 125.150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClipTip 200, sterile</td>
			<td>ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, USA.</td>
			<td>14-488-058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Multichannel Pipettes, 8-channel, 125&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, USA.</td>
			<td>&#160;14-387--955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gen5 2.01 software</td>
			<td>Biotek, Vermont, USA</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gen5 Plate reader</td>
			<td>Biotek, Vermont, USA</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell-free biochemical fluorometric enzymatic assay for high-throughput measurement of lipid peroxidation in high density lipoprotein

Düşük yüksek yoğunluklu lipoprotein (HDL-C) kolesterolü aterosklerotik kardiyovasküler hastalık (CVD) en güçlü bağımsız negatif belirleyicileri bulunmaktadır. Yapısı ve fonksiyonu HDL-C yerine HDL daha doğru ateroskleroz tahmin. Ateroskleroz gibi inflamatuar Birleşik Devletleri, HDL fonksiyonu zarar HDL protein ve lipit kompozisyon değişiklikler oluşur. HDL işlevi genellikle deneyleri kolesterol sızma tahlil ama bu deneyleri gibi sayısız sakıncaları standardizasyon eksikliği var dayalı hücre tarafından belirlenir. Boş hücre deneyleri HDL işlevi hücre tabanlı deneyleri için kıyasla daha sağlam önlemler verebilir. HDL oksidasyon HDL işlevini bozar. HDL lipid peroksit taşımacılığında önemli bir rolü vardır ve yüksek miktarda lipid peroksitler anormal HDL fonksiyonuyla ilişkilidir. Lipid-sonda etkileşim ne zaman enzimatik olmayan floresan Spektrometre sonuçlarını yorumlama lipid oksidatif devlet ölçmek için deneyleri düşünülmelidir. Bu bize HDL disfonksiyon katkıda bulunan HDL lipid peroksit içeriği (HDLox) değerlendirmek için bir boş hücre biyokimyasal enzimatik yöntem geliştirmek için motive. Bu yöntem enzim horseradish peroksidaz (HRP) ve fluorochrome (kolesterol oksidaz) HDL-c mg başına lipid peroksit içeriği ölçmek Amplex kırmızı dayanır Burada bir iletişim kuralı fluorochrome reaktif kullanarak HDL-lipid peroksidasyon belirlenmesi describedfor. Tahlil değişkenlik deneysel koşullar sıkı Standartlar Kuruluşu tarafından azaltılabilir. Daha yüksek HDLox düşük HDL antioksidan işlevi ile ilişkili değerlerdir. Bu testin okuma doğrulanmış hücre tabanlı deneyleri, kalp-damar hastalıkları, sistemik inflamasyon, immün disfonksiyon ve ilişkili kardiyovasküler ve metabolik risk fenotipleri vekil önlemler çıktıları ile ilişkilidir. Bu teknik yaklaşım HDL işlevi insan hastalığında sistemik inflamasyon, oksidatif stres ve okside lipidler (ateroskleroz gibi) önemli bir rol olduğu değerlendirmek için sağlam bir yöntemdir.

Her HDL örneğinin 50 µL adım 7,3 olduğu gibi her kuyuya eklenir. 50 µL HRP çözüm 5 U/mL (0.25 U) sonra adım 7.5 olduğu gibi her kuyuya ekledi. Örnekleri adım 7,6 olarak 37 ° C'de 30 dakika inkübe. Fluorochrome reaktif 50 µL sonra adım 7,7 (300 µM son konsantrasyonu) olduğu gibi her kuyuya eklenir. (Karanlıkta) floresan okuma sonra her dakika bir floresan plaka okuyucu (530/590 nm filtreleri) ile 37 ° C'de 120 dakika içinde değerlendirilir. Boş, havuza alınan denetim temsilcisi Floresans verileri, bilinen işlevsiz HDL ile örnek ve örnek normal HDL ile şekil 4' te gösterilmektedir. Ham temsilcisi veri ve adım adım analiz sonuçlarının Protokolü'nün 8 bölümünde açıklanan denklemleri kullanarak are göstermek içinde Tablo 1. Bu örnekte, taze HDL örnekleri kullanıldı ve daha yüksek HDLox değerleri genellikle taze HDL ile elde edilir. Örneğin, işlevsel olmayan temel alınarak bağımsız deneyleri HDL işlevinin ve HIV enfekte kişinin olduğu bilinen HDL yaklaşık logosuna 2 kat nispeten daha yüksek miktarda lipid peroksit sağlıklı katılımcılar için havuza alınan HDL karşılaştırıldığında vardı. Şekil 5 , HDL işlevi28,32engelliler için bilinen konular ile bir çalışma temsilcisi sonuçlarını gösterir. HIV enfekte kişilerin yaklaşık bulaşmamış kişilere göre HDL-lipid peroksit içeriği (başına mg HDL-c) Yani % 60 daha yüksek vardı. Önceden yayımlanmış çalışmalarımız cryopreserved HDL ile bu yöntem en az % 10 HDLox göreceli farklılıklar HDL için denetim grupları (olmadan hastalığı örneğin kronik HIV enfeksiyonu)36,37, karşılaştırıldığında göstermek başardı 38.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56325/56325fig1.jpg"> 
Resim 1: HDL lipid peroksit içeriği HDL-c belirli miktarı tayini Sistemik inflamasyon ve oksidatif stres Devletleri'nde HDL Engelli HDL işlevi ile ilişkili olan lipid peroksitler (LOOH) (HDLox) artmıştır. HRP floresan sigara fluorochrome floresan resorufin kırmızı için oksidasyon tromboksan. Bu oksidasyon endojen peroksitler tepki (OH-) mevcut ve HDL-lipid peroksitler (LOOH-) tarafından kurulabilir. Kolesterol oksidaz resorufin (HRP ile) içsel HDL lipid peroksit içeriği HDL kolesterol belirli bir miktarda ölçmek. Arka plan üretimini OH - hava oksidasyon arabelleği bir sonucu olarak her şey floresan okuma çıkarılır. Resorufin en az autofluorescence çoğu örnekleri vardır. Bu rakam değiştirilmiş 32olmuştur. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56325/56325fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56325/56325fig2.jpg"> 
Resim 2: HDL lipid peroksidasyon fluorochromeassay için iş akışı genel bakış. 0. gün: Tahlil hazırlık: A) 96 iyi plaka mizanpajlar tasarlayın, tahmin hacmi örnekleri (plazma/serum) ve Kimyasalları (HRP enzim, fluorochrome reaktif, arabellekleri, PEG reaktif) etiket tüpler Gün 1: Hazırlık tahlil ve HDL yalıtım için: A) hazırlık denetimleri (özel havuza alınmış çalışma kontrol, kalite kontrol, pozitif ve negatif denetimleri) B) HDL bulutlu PEG reaktif kullanarak. 2. gün: Hazırlık (gün 1'yapılmazsa) tahlil ve fluorochrome tahlil için: A) hazırlık denetimleri (özel havuza alınmış çalışma kontrol, kalite kontrol, pozitif ve negatif denetimleri) a) HDL örnekleri ilavesi: deneysel değişkenlik en aza indirmek için ve reaktifler ve örnekleri ek sürekli olarak yapılır ve zamanında bu örnekleri (e.g. 160 µL) tüm eklemeler bir ayrı 96 de yuvarlak alt, açık, polistiren veya polipropilen plaka (plaka 1) ilk yapılır tavsiye edilir emin olun. Bir çok kanallı pipet belirli birimleri (örneğin 50 µL) 3 96-şey kalıplara aktarmak için kullanılan daha sonra (2-4 tabaklar: Polipropilen, düz dipli, siyah levha) (Bu aynı düzene sahip). B) HRP ilavesi: Ekle 50 µL 5 U/her şey çok kanallı pipet C kullanarak ml (0.25 U)) Incubate 30 dk D için 37 ° C'de) ekle 50 µL 300 µM/her şey çok kanallı pipet E kullanarak için de fluorochrome reaktif) (karanlıkta) floresan okuma her dakika değerlendirmek 120 dakika boyunca bir floresan plaka okuyucu (530/590 nm filtreleri) ile 37 ° C'de. 3. gün: Veri analizi. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56325/56325fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56325/56325fig3.jpg"> 
Şekil 3: Fluorochrome HDL işlevinde tahlil genellikle kullanılan 96 iyi plakaların temsilcisi düzeni. HDL örnekleri ek bir tabak kuyu içine zamanlama farklılıkları spontan oksidasyon farklılıklar arasında farklı wells yol açabilir. Deneysel değişkenlik en aza indirmek için farklı kuyular arasında değişken spontan oksidasyon önlemek ve reaktifler ve örnekleri ek sürekli olarak yapılır ve zamanında, bu örnekleri (e.g. 160 µL) tüm eklemeler olduğunu tavsiye edilir emin olun ilk bir ayrı 96 de yuvarlak alt, açık, polistiren veya polipropilen plaka (plaka 1) yapılır. Bir çok kanallı pipet belirli birimleri (örneğin 50 µL) 3 96-şey kalıplara aktarmak için kullanılan daha sonra (2-4 tabaklar: Polipropilen, düz dipli, siyah levha) (Bu aynı düzene sahip). <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56325/56325fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56325/56325fig4.jpg"> 
Şekil 4: HDL lipid peroksidasyon testin temsilcisi veri. (Karanlıkta) floresan okuma sonra her dakika bir floresan plaka okuyucu (530/590 nm filtreleri) ile 37 ° C'de 120 dakika içinde değerlendirilir. Temsilcisi veri (rasgele adet) hastadan işlevsiz HDL (iki bağımsız HDL işlevine bağlı olarak bilinen boş (Hayır HDL; negatif denetimleri), pozitif kontrol (H2O2), havuza alınan HDL denetim ve HDL için gösterilir deneyleri-kolesterol sızma ve monosit kemotaksisi tahlil). <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56325/56325fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56325/56325fig5.jpg"> 
Şekil 5: HDL işlevinin lipid peroksit tahlil yüksek lipid peroksit HDL-C içinde vivobaşına belirli bir miktar içerik algılayabilir. HDL izole edildi ve HDLox 50 sağlıklı konular ve HIV enfeksiyonu olan 100 hastaya protokolündeki açıklandığı gibi tespit edilmiştir. Daha yüksek HDLox (1.59±0.53) (1.01±0.31) kontrollere göre HIV enfekte kişi vardı (p &#60; 0,001). Bu rakam değiştirilmiş 32olmuştur. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56325/56325fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Cell-free Biochemical Fluorometric Enzymatic Assay for High-throughput Measurement of Lipid Peroxidation in High Density Lipoprotein at JoVE.com

Cell-free Biochemical Fluorometric Enzymatic Assay for High-throughput Measurement of Lipid Peroxidation in High Density Lipoprotein

Biz burada bir Fluorometrik boş hücre biyokimyasal tahlil HDL-lipid peroksidasyon belirlenmesi için tarif. Bu hızlı ve tekrarlanabilir tahlil anlayışımız HDL fonksiyonunu kullanabilirsiniz insan hastalık katkıda bulunabilir ve büyük ölçekli çalışmalarda HDL işlevini belirlemek için kullanılabilir.

Boş hücre biyokimyasal Fluorometrik enzimatik tahlil yüksek yoğunluklu Lipoprotein Lipid peroksidasyon yüksek üretilen iş ölçümü için

Low high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C) levels are one of the most powerful independent negative predictors of atherosclerotic cardiovascular ...

cell-free-biochemical-fluorometric-enzymatic-assay-for-high

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.2K Görüntüleme.  University of California, Los Angeles. Biz burada bir Fluorometrik boş hücre biyokimyasal tahlil HDL-lipid peroksidasyon belirlenmesi için tarif. Bu hızlı ve tekrarlanabilir tahlil anlayışımız HDL fonksiyonunu kullanabilirsiniz insan hastalık katkıda bulunabilir ve büyük ölçekli çalışmalarda HDL işlevini belirlemek için kullanılabilir.

Video: Cell-free Biochemical Fluorometric Enzymatic Assay for High-throughput Measurement of Lipid Peroxidation in High Density Lipoprotein

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, precise diagnosis of the infecting strain and rapid high-throughput screening of vast numbers of clinical samples is paramount to control the spread of pandemic infections. Current clinical diagnoses of influenza infections are based on serologic testing, polymerase chain reaction, direct specimen immunofluorescence and cell culture 1,2.
Here, we report the development of a novel diagnostic technique used to detect live influenza viruses. We used the mouse-adapted human A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 to test the efficacy of this technique using MDCK cells 4. MDCK cells (104 or 5 x 103 per well) were cultured in 96- or 384-well plates, infected with PR8 and viral proteins were detected using anti-M2 followed by an IR dye-conjugated secondary antibody. M2 5 and hemagglutinin 1 are two major marker proteins used in many different diagnostic assays. Employing IR-dye-conjugated secondary antibodies minimized the autofluorescence associated with other fluorescent dyes. The use of anti-M2 antibody allowed us to use the antigen-specific fluorescence intensity as a direct metric of viral quantity. To enumerate the fluorescence intensity, we used the LI-COR Odyssey-based IR scanner. This system uses two channel laser-based IR detections to identify fluorophores and differentiate them from background noise. The first channel excites at 680 nm and emits at 700 nm to help quantify the background. The second channel detects fluorophores that excite at 780 nm and emit at 800 nm. Scanning of PR8-infected MDCK cells in the IR scanner indicated a viral titer-dependent bright fluorescence. A positive correlation of fluorescence intensity to virus titer starting from 102-105 PFU could be consistently observed. Minimal but detectable positivity consistently seen with 102-103 PFU PR8 viral titers demonstrated the high sensitivity of the near-IR dyes. The signal-to-noise ratio was determined by comparing the mock-infected or isotype antibody-treated MDCK cells.
Using the fluorescence intensities from 96- or 384-well plate formats, we constructed standard titration curves. In these calculations, the first variable is the viral titer while the second variable is the fluorescence intensity. Therefore, we used the exponential distribution to generate a curve-fit to determine the polynomial relationship between the viral titers and fluorescence intensities. Collectively, we conclude that IR dye-based protein detection system can help diagnose infecting viral strains and precisely enumerate the titer of the infecting pathogens.

This method describes the use of Infrared dye based imaging system for detection of H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) fluid of infected mice at a high sensitivity. This methodology can be performed in a 96- or 384-well plate, requires &lt;10 &mu;l volume of test material and has the potential for concurrent screening of multiple pathogens.

Gribi için yüksek verimlilik Tespit Yöntemi

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Cancer immunotherapy can harness the specificity of immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT) based on the adoptive transfer of T cells genetically modified to express a chimeric antigen receptor (CAR) has shown considerable promise in clinical trials1-4. There are several advantages to using CAR+ T cells for the treatment of cancers including the ability to target non-MHC restricted antigens and to functionalize the T cells for optimal survival, homing and persistence within the host; and finally to induce apoptosis of CAR+ T cells in the event of host toxicity5.
Delineating the optimal functions of CAR+ T cells associated with clinical benefit is essential for designing the next generation of clinical trials. Recent advances in live animal imaging like multiphoton microscopy have revolutionized the study of immune cell function in vivo6,7. While these studies have advanced our understanding of T-cell functions in vivo, T-cell based ACT in clinical trials requires the need to link molecular and functional features of T-cell preparations pre-infusion with clinical efficacy post-infusion, by utilizing in vitro assays monitoring T-cell functions like, cytotoxicity and cytokine secretion. Standard flow-cytometry based assays have been developed that determine the overall functioning of populations of T cells at the single-cell level but these are not suitable for monitoring conjugate formation and lifetimes or the ability of the same cell to kill multiple targets8.
Microfabricated arrays designed in biocompatible polymers like polydimethylsiloxane (PDMS) are a particularly attractive method to spatially confine effectors and targets in small volumes9. In combination with automated time-lapse fluorescence microscopy, thousands of effector-target interactions can be monitored simultaneously by imaging individual wells of a nanowell array. We present here a high-throughput methodology for monitoring T-cell mediated cytotoxicity at the single-cell level that can be broadly applied to studying the cytolytic functionality of T cells.

We describe a single-cell high-throughput assay to measure cytotoxicity of T cells when incubated with tumor target cells. This method employs a dense, elastomeric array of sub-nanoliter wells (~100,000 wells/array) to spatially confine the T cells and target cells at defined ratios and is coupled to fluorescence microscopy to monitor effector-target conjugation and subsequent apoptosis.

T Hücreleri İçin Kantitatif Yüksek throughput Tek hücreli Sitotoksisite Testi

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since several decades, the sudden burst of multi- and extensively-drug resistant strains is a serious threat for the control of tuberculosis. Therefore, it is essential to identify new targets and pathways critical for the causative agent of the tuberculosis, Mycobacterium tuberculosis (Mtb) and to search for novel chemicals that could become TB drugs. One approach is to set&#160;up methods suitable for the genetic and chemical screens of large scale libraries enabling the search of a needle in a haystack. To this end, we developed a phenotypic assay relying on the detection of fluorescently labeled Mtb within fluorescently labeled host&#160;cells using automated confocal microscopy. This in vitro assay allows an image based quantification of the colonization process of Mtb&#160;into the host and was optimized for the 384-well microplate format, which is proper for screens of siRNA-, chemical compound- or Mtb mutant-libraries. The images are then processed for multiparametric analysis, which provides read&#160;out inferring on the pathogenesis of Mtb&#160;within host cells.

Here, we describe a phenotypic assay applicable to the High-throughput/High-content screens of small-interfering synthetic RNA (siRNA), chemical compound, and Mycobacterium tuberculosis mutant libraries. This method relies on the detection of fluorescently labeled Mycobacterium tuberculosis within fluorescently labeled host&#160;cell using automated confocal microscopy.

Yüksek Verimli/Yüksek İçerikli Taramaya Uyarlanmış Hücre İçi Mikobakterilerin Nicelleştirilmesi için Mikroskobik Fenotipik Bir Tahlil

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat because of increased worldwide exchanges and human populations penetrating more and more natural ecosystems. A good example of such an emerging situation is chikungunya virus epidemics of 2005-2006 in the Indian Ocean. Recent progresses in our understanding of cellular pathways controlling viral replication suggest that compounds targeting host cell functions, rather than the virus itself, could inhibit a large panel of RNA viruses. Some broad-spectrum antiviral compounds have been identified with host target-oriented assays. However, measuring the inhibition of viral replication in cell cultures using reduction of cytopathic effects as a readout still represents a paramount screening strategy. Such functional screens have been greatly improved by the development of recombinant viruses expressing reporter enzymes capable of bioluminescence such as luciferase. In the present report, we detail a high-throughput screening pipeline, which combines recombinant measles and chikungunya viruses with cellular viability assays, to identify compounds with a broad-spectrum antiviral profile.

In vitro assays to measure virus replication have been greatly improved by the development of recombinant RNA viruses expressing luciferase or other enzymes capable of bioluminescence. Here we detail a high-throughput screening pipeline that combines such recombinant strains of measles and chikungunya viruses to isolate broad-spectrum antivirals from chemical libraries.

RNA Virüslerinin geniş spektrumlu Kimyasal Önleyicileri için yüksek verimli tarama

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

Salmonella species are zoonotic pathogens and leading causes of food borne illnesses in humans and livestock1. Understanding the mechanisms underlying Salmonella-host interactions are&#160;important to elucidate the molecular pathogenesis of Salmonella infection. The Gentamicin protection assay to phenotype Salmonella association, invasion and replication in phagocytic cells was adapted to allow high-throughput screening to define the roles of deletion mutants of Salmonella enterica serotype Typhimurium in host interactions using RAW 264.7 murine macrophages. Under this protocol, the variance in measurements is significantly reduced compared to the standard protocol, because wild-type and multiple mutant strains can be tested in the same culture dish and at the same time. The use of multichannel pipettes increases the throughput and enhances precision. Furthermore, concerns related to using less host cells per well in 96-well culture dish were addressed. Here, the protocol of the modified in vitro Salmonella invasion assay using phagocytic cells was successfully employed to phenotype 38 individual Salmonella deletion mutants for association, invasion and intracellular replication. The in vitro phenotypes are presented, some of which were subsequently confirmed to have in vivo phenotypes in an animal model. Thus, the modified, standardized assay to phenotype Salmonella association, invasion and replication in macrophages with high-throughput capacity could be utilized more broadly to study bacterial-host interactions.

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

A high-throughput assay to in vitro phenotype Salmonella or other bacterial association, invasion, and replication in phagocytic cells with high-throughput capacity was developed. The method was employed to evaluate Salmonella gene knockout mutant strains for their involvements in host-pathogen interactions.

Fenotipinin yüksek verim Deneyi<em&gt; Salmonella enterica</em&gt; Typhimurium Derneği, Invasion, ve Makrofagların Çoğaltma

Salmonella species are zoonotic pathogens and leading causes of food borne illnesses in humans and livestock1. Understanding the mechanisms underlying ...

High Throughput Fluorometric Technique for Assessment of Macrophage Phagocytosis and Actin Polymerization

The goal of fluorometric analysis is to serve as an efficient, cost effective, high throughput method of analyzing phagocytosis and other cellular processes. This technique can be used on a variety of cell types, both adherent and non-adherent, to examine a variety of cellular properties. When studying phagocytosis, fluorometric technique utilizes phagocytic cell types such as macrophages, and fluorescently labeled opsonized particles whose fluorescence can be extinguished in the presence of trypan blue. Following plating of adherent macrophages in 96-well plates, fluorescent particles (green or red) are administered and cells are allowed to phagocytose for varied amounts of time. Following internalization of fluorescent particles, cells are washed with trypan blue, which facilitates extinction of fluorescent signal from bacteria which are not internalized, or are merely adhering to the cell surface. Following the trypan wash, cells are washed with PBS, fixed, and stained with DAPI (nuclear blue fluorescent label), which serves to label nuclei of cells. By a simple fluorometric quantification through plate reading of nuclear (blue) or particle (red/green) fluorescence we can examine the ratio of relative fluorescence units of green:blue and determine a phagocytic index indicative of amount of fluorescent bacteria internalized per cell. The duration of assay using a 96-well method and multichannel pipettes for washing, from end of phagocytosis to end of data acquisition, is less than 45 min. Flow cytometry could be used in a similar manner but the advantage of fluorometry is its high throughput, rapid method of assessment with minimal manipulation of samples and quick quantification of fluorescent intensity per cell. Similar strategies can be applied to non adherent cells, live labeled bacteria, actin polymerization, and essentially any process utilizing fluorescence. Therefore, fluorometry is a promising method for its low cost, high throughput capabilities in the study of cellular processes.

Here we present a protocol to quantify phagocytosis of fluorescent particles by adherent macrophage cell line using a fluorometric method. This method facilitates a high throughput quantification of particle internalization as well as the resulting actin polymerization.

Makrofaj Fagositoz ve Aktin Polimerizasyon Değerlendirme Yüksek Verimli Florimetrik Tekniği

The goal of fluorometric analysis is to serve as an efficient, cost effective, high throughput method of analyzing phagocytosis and other cellular ...

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

Neutrophil granulocytes are the most abundant leukocytes in the human blood. Neutrophils are the first to arrive at the site of infection. Neutrophils developed several antimicrobial mechanisms including phagocytosis, degranulation and formation of neutrophil extracellular traps (NETs). NETs consist of a DNA scaffold decorated with histones and several granule markers including myeloperoxidase (MPO) and human neutrophil elastase (HNE). NET release is an active process involving characteristic morphological changes of neutrophils leading to expulsion of their DNA into the extracellular space. NETs are essential to fight microbes, but uncontrolled release of NETs has been associated with several disorders. To learn more about the clinical relevance and the mechanism of NET formation, there is a need to have reliable tools capable of NET quantitation. 
Here three methods are presented that can assess NET release from human neutrophils in vitro. The first one is a high throughput assay to measure extracellular DNA release from human neutrophils using a membrane impermeable DNA-binding dye. In addition, two other methods are described capable of quantitating NET formation by measuring levels of NET-specific MPO-DNA and HNE-DNA complexes. These microplate-based methods in combination provide great tools to efficiently study the mechanism and regulation of NET formation of human neutrophils.

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

High throughput assays are presented that in combination provide excellent tools to quantitate NET release from human neutrophils.

Ekstraselüler DNA Yayın Yüksek Verimli Ölçme ve İnsan Nötrofiller Kantitatif NET Oluşumu<em&gt; İn Vitro</em

Neutrophil granulocytes are the most abundant leukocytes in the human blood. Neutrophils are the first to arrive at the site of infection. Neutrophils ...

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins can give insights into their function by determining their localization within the cell and enabling interaction partner identification. We recently published a fast and scalable method to generate Trypanosoma brucei cell lines that express a tagged protein from the endogenous locus. The method was based on a plasmid we generated that, when coupled with long primer PCR, can be used to modify a gene to encode a protein tagged at either terminus. This allows the tagging of dozens of trypanosome proteins in parallel, facilitating the large-scale validation of candidate genes of interest. This system can be used to tag proteins for localization (using a fluorescent protein, epitope tag or electron microscopy tag) or biochemistry (using tags for purification, such as the TAP (tandem affinity purification) tag). Here, we describe a protocol to perform the long primer PCR and the electroporation in 96-well plates, with the recovery and selection of transgenic trypanosomes occurring in 24-well plates. With this workflow, hundreds of proteins can be tagged in parallel; this is an order of magnitude improvement to our previous protocol and genome scale tagging is now possible.

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Addition of a tag to a protein is a powerful way of gaining insight into its function. Here, we describe a protocol to endogenously tag hundreds of Trypanosoma brucei proteins in parallel such that genome scale tagging is achievable.

Yüksek verimli Gen Etiketleme içinde<em&gt; Trypanosoma brucei</em

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins ...

A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or cellular processes. With the advancement of biotechnologies and the high translational potential of small molecules, a number of innovative approaches in drug discovery have evolved, which explains the resurgent interest in the use of HTS. The oncology field is currently the most active research area for drug screening, with no major breakthrough made for the identification of new immunomodulatory compounds targeting transplantation-related complications or autoimmune ailments. Here, we present a novel in vitro murine fluorescent-based lymphocyte assay easily adapted for the identification of new immunomodulatory compounds. This assay uses T or B cells derived from a transgenic mouse, in which the Nur77 promoter drives GFP expression upon T- or B-cell receptor stimulation. As the GFP intensity reflects the activation/transcriptional activity of the target cell, our assay defines a novel tool to study the effect of given compound(s) on cellular/biological responses. For instance, a primary screening was performed using 4,398 compounds in the absence of a &#34;target hypothesis&#34;, which led to the identification of 160 potential hits displaying immunomodulatory activities. Thus, the use of this assay is suitable for drug discovery programs exploring large chemical libraries prior to further in vitro/in vivo validation studies.

We present in the current study a novel fluorescence-based assay using lymphocytes derived from a transgenic mouse. This assay is suitable for high-throughput screening (HTS) of small molecules endowed with the capacity of either inhibiting or promoting lymphocyte activation.

Küçük moleküllerin yüksek verimli tarama için uygun bir floresan bazlı lenfositi analizi

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or ...

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

The number of new drugs identified by traditional, in vitro screens has waned, reducing the success of this approach in the search for new weapons to combat multiple drug resistance. This has led to the conclusion that researchers do not only need to find new drugs, but also need to develop new ways of finding them. Amongst the most promising candidate methods are whole-organism, in vivo assays that use high-throughput, phenotypic readouts and hosts that range from Caenorhabditis elegans to Danio rerio. These hosts have several powerful advantages, including dramatic reductions in false positive hits, as compounds that are toxic to the host and/or biounavailable are typically dropped in the initial screen, prior to costly follow up.
Here we show how our assay has been used to interrogate host variation in the well-documented C. elegans&#8212;Pseudomonas aeruginosa liquid killing pathosystem. We also demonstrate several extensions of this well-worked out technique. For example, we are able to carry out high-throughput genetic screens using RNAi in 24- or 96-well plate formats to query host factors in this host-pathogen interaction. Using this assay, whole genome screens can be completed in only a few months, which can dramatically simplify the task of identifying drug targets, potentially without the need for laborious biochemical purification approaches.
We also report here a variation of our method that substitutes the gram-positive bacterium Enterococcus faecalis for the gram-negative pathogen P. aeruginosa. Much as is the case for P. aeruginosa, killing by E. faecalis is time-dependent. Unlike previous C. elegans&#8212;E. faecalis assays, our assay for E. faecalis does not require preinfection, improving its safety profile and reducing the chances of contaminating liquid-handling equipment. The assay is highly robust, showing ~95% death rates 96 h post infection.

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

Here we describe a protocol that is an adaptable, whole host, high-content screening tool that can be utilized to study host-pathogen interactions and be used for drug discovery.

Yüksek işlem hacmi, yüksek-içerik, sıvı tabanlı C. elegans Pathosystem

The number of new drugs identified by traditional, in vitro screens has waned, reducing the success of this approach in the search for new weapons to ...

Boş hücre biyokimyasal Fluorometrik enzimatik tahlil yüksek yoğunluklu Lipoprotein Lipid peroksidasyon yüksek üretilen iş ölçümü için

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler