Name: high-throughput assay to phenotype salmonella enterica typhimurium association, invasion, and replication in macrophages
Uploaded: 2014-08-11T18:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 10 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages at JoVE.com

Bu proje (AJB ve LGA, R01 AI076246 için) Sağlık NIAID National Institutes için bir hibe ile kısmen desteklenmiştir. Salmonella mutant koleksiyonu kısmen Ulusal Sağlık hibe Enstitüleri (MM için, U01 A152237-05, R01 AI07397-01, R01 ve R01 AI039557-11 AI075093-01) HKP, R21 kısmen Sağlık hibe Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından, (tarafından desteklenen AI083964-01, 1R0 1AI083646-01, 1R56AI077645, R01 AI075093). Biz kopya kaplama ve koleksiyonunda mutantlar teyit için Steffen Prowollik teşekkür ederim.

1. Sıçangil Makrofaj Hücre Kültür RAW264.7 <ol><li> Düşük geçiş sayısı sıçangil makrofaj hücreleri büyütmek,% 10 cenin sığır serumu ile takviye edilmiş Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) içinde, T-75 hücre kültür şişesi havalandırılmış kap içinde filtre RAW264.7 (ATCC ® sayısı TIB-71) (FBS) ,% 0.5 NaHCO3 ve% 1,% 5 CO2 inkübatöründe 37 ° C&#39;de 100 x esansiyel olmayan amino asitler (NEAA),. </li><li> Hücreler şişe içinde bir% 60-80 izdiham ulaştığınızda, hücreler hasat için bir hücre kazıyıcı kullanın ve bir hemasitometrede hücrelerin sayısı ve hücre konsantrasyonunu hesaplamak. </li><li> Hücrelerin tekrar taze DMEM hücre kültür ortamı içinde 2.5 x 10 5 ug / ml içine hücre seyreltilmesi. 96-iyi hücre kültür plakalarının her çukuruna 5 x 10 4 hücrelerini ihtiva eden DMEM hücre kültür aracı maddesi 200 ul plaka için çok kanallı pipet kullanın. </li><li> Her bir Salmonella soyu dört kuyu Plate. Bir dizi için üç ayrı tabak kurmakfagositik hücreler işgali testinin, sırasıyla, &quot;dernek&quot;, &quot;istila&quot; ve &quot;çoğaltma&quot; ile işaretleyin. </li><li> Makrofaj hücreleri kuyu altına bağlamak için izin vermek için 37 ° C de% 5 CO2 inkübatöründe tabak yerleştirin. </li></ol> Salmonella Yabani-tip ve Mutantlarının 2. Hazırlık <ol><li> RAW264.7 makrofaj hücrelerinin hazırlanması için aynı günde (vahşi tip tek koloniler (WT), Salmonella enterica serotip Typhimurium 14028s, Luria-Bertani içinde DinvA mutantı DphoP bir mutantı olduğu ve arzu edilen test mutant soyunun kültür bunları almak LB) et uygun antibiyotik ile takviye edilmiştir. 10 mutant suşlar (DinvA mutant ve DphoP mutant sırasıyla, işgali ve hücre içi çoğaltma kusurlu olan) kadar test etmek fagositik hücreler işgali tahlillerin her kümesi kullanın. </li><li> S, 37 ° C&#39;de 14 saat boyunca bakteri büyütünTabanı yuvarlak bir tüp içinde gevşek bir şekilde kapatılmış, 14 ml polipropilen, 5 ml LB sıvısı içinde her 220 rpm&#39;de Haking. LB suyu bizim durumumuzda, mutant suş en Kanamisin dirençli olan uygun antibiyotikleri içeren, 50 ug / ml </li><li> Ertesi gün, 220 rpm&#39;de sallama ile ilave 4 saat boyunca 1:50 oranında LB sıvılarına düz 5 ml Salmonella türlerinin kültürleri üzerinde her bir alt-kültürü. </li><li> Bir spektrofotometre ile OD her bakteri kültürü 600 değerlerini okuyun ve her okuma Salmonella patojenite ada-1 Tip III sekresyon sistemi işgali için (SPI-1 TTSS) gen ifadesini optimize 0,6-1,2 aralığında olmalıdır. </li><li> 1 OD formülünü kullanarak 600 = 7.5 x 10 8 CFU sonra, bakteri konsantrasyonu tahmin eden taze DMEM hücre kültür aracı maddesi içinde 5 x 10 6 CFU / ml &#39;lik bir konsantrasyona seyreltilmesi bakteri / ml olmuştur. </li></ol> 96 oyuklu bir kültür plakasına 3. Yayılması Deneyi <ol><li> Üç 96-çukurlu cel kaldırL kültür CO2 inkübatör plaka ve her bir kuyu yıkama 1x PBS tamponu içinde 200 ul bir kez. </li><li> PBS yıkama ve tamamen çıkarılmasından sonra her bir oyuğa 200 ul bakteri DMEM ortamında (yukarıya bakınız) ekleyin. Bu enfeksiyon çokluğu ve her bir oyuğa, 20 (MOI) olarak 1 x 10 6 Salmonella hucrelerinin ile sonuçlanır: 1 arasındadır. </li><li> Daha sonra 30 dakika boyunca 37 ° C,% 5 CO2 inkübatöründe plakaları (zaman sıfır) yerine, 10 dakika boyunca mühürlü bir taşıyıcı içinde 1000 x g&#39;de santrifüjleyin plakaları. Her suşu için, en az dört çift kuyu kurmak. </li><li> 30 dakika sonra inkübatörden plakaları kaldırmak ve ilişkilendirilmemiş bakterileri çıkartmak için 1x 200 ul PBS ile üç kez yıkanır. </li><li> Yıkamadan sonra, ileri tedavi için &quot;dernek&quot; ile etiketlenmiş plakasını kaydedin. Sipariş t &quot;işgal&quot; ve &quot;çoğaltma&quot; işaretli plakalarının her bir oyuğuna 100 ug / ml gentamisin ihtiva eden DMEM ortamı içinde 200 ulo. dışı Salmonella öldürmek ek bir saat boyunca 37 ° C,% 5 CO2 kuluçka plakaları dönün. </li><li> , Makrofaj hücre sayısını kaydetmek için, her enfekte türünden de sakla, 10 dakika boyunca% 1 Triton X-100 içeren PBS 1x 200 ul &quot;ilişki&quot; levha üzerindeki kuyu kalan tedavi. Triton çözüm makrofaj hücreleri lize ve ilişkili Salmonella yayınlayacak. </li><li> Her bir çukurdaki Hasat Salmonella ve 1.5 ml Eppendorf tüpleri içine yerleştirin. Her kuyudan hasat numuneler üzerinde 900μl PBS ile üç 1 x 10 kat seri seyreltmeleri yapın, girdap her seyreltme ile gerçekleştirilir. </li><li> Ya LB (WT) ya da LB Kan (mutantlar) plakalar üzerinde üçüncü seyreltme, 10 -3, Plate. Uygun Salmonella cinsi adı, seyreltme numarası, zaman noktasında ve tarih ile plakaları etiketleyin. </li><li> Üçüncü sulandırma tüp vorteks sonra, agar ve tekrar f yüzeyine 10 ul örnek dağıtım5 damla toplam için kez. Beş 10 ul Petri plakalar 7 üzerine eşit düşer alana emin olun. </li><li> Damla sonra agar plakaları üzerinde emmek edecek ve 37 ° C&#39;de,% 5 CO2 inkübatör bir gece boyunca inkübe edilir. </li><li> 10 dakika boyunca% 0.25 tripsin-EDTA ihtiva eden 150 ul 1xPBS ile makrofaj sayımı için kayıtlı kuyu tedavi edin. </li><li> Tripsinizasyondan sonra, 1.5 ml Eppendorf tüpleri içine yer makrofajlar ve tripsin / EDTA çözeltisi nötralize etmek için FBS 50 ul ile tedavi% 0.4 tripan mavisi ile hücrelerin leke ve hemasitometre aracılığıyla puan. </li><li> Bir saat inkübasyon geçtiğinde, CO 2 inkübatör &quot;işgali&quot; ve &quot;çoğaltma&quot; plakaları kaldırmak ve &quot;Adım 3.4&quot; de her yıkayın. </li><li> &quot;Adım 3,6-3,12&quot; gibi başka tedavi için &quot;işgal&quot; plakasını kaydedin. </li><li> 10 ug / ml gentamisin ihtiva eden DMEM ortamı içinde 200 ul&quot;çoğaltma&quot; plaka ortamda dışı Salmonella boşluğu korumak için. Ilave 22.5 saat daha% 5 CO2 kuluçka 37 ° C, plaka dönün. </li><li> Ertesi gün, 37 ° C,% 5 CO 2 inkübatör &quot;çoğaltma&quot; plaka kaldırmak ve her yıkama sıra &quot;Adım 3.4&quot; ve &quot;Adım 3,6-3,12&quot; olarak davranın. </li><li> Son olarak, 37 ° C inkübatör içinde bir gece boyunca inkübasyondan sonra agar plakaları kaldırmak ve bakteri kolonilerinin sayısı tam. </li><li> İyi bir koloni dağıtım koloniler, 10 ile 100, her spot yaklaşık 2 koloni 20, belli bir yerde fazla 20 koloni olsaydı skor zor olurdu içerir olmalıdır. Gerektiğinde sayısı çok düşük veya çok yüksek ise, ile örnek Replate yüksek veya daha düşük seyreltileri 10 kat. </li></ol> 4. Veri Analizi <ol><li> Kaplama dayalı her plakanın CFU (bir ml için koloni oluşturma birimleri) hesaplanırhacmi ve seyreltme faktörü. </li><li> Her cinsten gelen kaydedilmiş makrofaj hücre sayımı yoluyla, her makrofaga Salmonella sayısını teyit edin. </li><li> Sırasıyla hücre dernek, istila veya replikasyonu için, en az üç bağımsız deneyden makrofaj başına CFU, geometrik ortalamaları hesaplanır, ve göreli değer için WT daha normalleştirmek. </li><li> WT her zorlanma karşılaştırarak, sırasıyla Student t-testi ile dernek, işgali ve çoğaltma için verileri analiz ve p-değeri ile istatistiksel anlamlılık belirler. </li></ol>

<ol>
	<li>Haraga, A., Ohlson, M. B., Miller, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonellae+interplay+with+host+cells.">Salmonellae interplay with host cells.</a> Nat Rev Microbiol. 6, 53-66 (2008).</li><li>Mandell, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+intraleukocytic+bacteria+and+antibiotics.">Interaction of intraleukocytic bacteria and antibiotics.</a> The Journal of clinical investigation. 52, 1673-1679 (1973).</li><li>Elsinghorst, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+invasion+by+gentamicin+resistance.">Measurement of invasion by gentamicin resistance.</a> Methods Enzymol. 236, 405-420 (1994).</li><li>Elsinghorst, E. A., Weitz, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+cell+invasion+and+adherence+directed+by+the+enterotoxigenic+Escherichia+coli+tib+locus+is+associated+with+a+104-kilodalton+outer+membrane+protein.">Epithelial cell invasion and adherence directed by the enterotoxigenic Escherichia coli tib locus is associated with a 104-kilodalton outer membrane protein.</a> Infect Immun. 62, 3463-3471 (1994).</li><li>Behlau, I., Miller, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+PhoP-repressed+gene+promotes+Salmonella+typhimurium+invasion+of+epithelial+cells.">A PhoP-repressed gene promotes Salmonella typhimurium invasion of epithelial cells.</a> J Bacteriol. 175, 4475-4484 (1993).</li><li>Hueck, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+typhimurium+secreted+invasion+determinants+are+homologous+to+Shigella+Ipa+proteins.">Salmonella typhimurium secreted invasion determinants are homologous to Shigella Ipa proteins.</a> Mol Microbiol. 18, 479-490 (1995).</li><li>Steele-Mortimer, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+epithelial+cells+with+Salmonella+enterica.">Infection of epithelial cells with Salmonella enterica.</a> Methods Mol Biol. 431, 201-211 (2008).</li><li>Foster, J. W., Spector, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+Salmonella+survive+against+the+odds.">How Salmonella survive against the odds.</a> Annu Rev Microbiol. 49, 145-174 (1995).</li><li>Edwards, A. M., Massey, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasion+of+human+cells+by+a+bacterial+pathogen.">Invasion of human cells by a bacterial pathogen.</a> Journal of visualized experiments JoVE. 10, (2011).</li><li>Molinari, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+played+by+the+group+A+streptococcal+negative+regulator+Nra+on+bacterial+interactions+with+epithelial+cells.">The role played by the group A streptococcal negative regulator Nra on bacterial interactions with epithelial cells.</a> Mol Microbiol. 40, 99-114 (2001).</li><li>Van der Velden, A. W., Lindgren, S. W., Worley, M. J., Heffron, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+pathogenicity+island+1-independent+induction+of+apoptosis+in+infected+macrophages+by+Salmonella+enterica+serotype+typhimurium.">Salmonella pathogenicity island 1-independent induction of apoptosis in infected macrophages by Salmonella enterica serotype typhimurium.</a> Infect Immun. 68, 5702-5709 (2000).</li><li>Santos, R. L., Zhang, S., Tsolis, R. M., Baumler, A. J., Adams, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphologic+and+molecular+characterization+of+Salmonella+typhimurium+infection+in+neonatal+calves.">Morphologic and molecular characterization of Salmonella typhimurium infection in neonatal calves.</a> Vet Pathol. 39, 200-215 (2002).</li><li>Lawhon, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+SPI-1+secreted+effectors+in+acute+bovine+response+to+Salmonella+enterica+Serovar+Typhimurium+a+systems+biology+analysis+approach.">Role of SPI-1 secreted effectors in acute bovine response to Salmonella enterica Serovar Typhimurium a systems biology analysis approach.</a> PLoS One. 6, e26869 (2011).</li><li>Drecktrah, D., Knodler, L. A., Galbraith, K., Steele-Mortimer, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Salmonella+SPI1+effector+SopB+stimulates+nitric+oxide+production+long+after+invasion.">The Salmonella SPI1 effector SopB stimulates nitric oxide production long after invasion.</a> Cell Microbiol. 7, 105-113 (2005).</li></ol>

We have nothing to disclose.

Gentamisin koruma deneyi yaygın konakçı hücre içinde hücre içi bakteriyel patojenler işgali ve çoğaltma incelemek için kullanılır ve özellikle kimin işgali enfeksiyonu 1 kurulması için önkoşul adımdır Salmonella gibi patojenlerin eğitim için önemli bir biyolojik aracıdır. Salmonella araştırma camiasında standart Gentamisin koruma deneyi 24-kuyu kültür çanak 5 uygulanmaktadır. 48 ya da 96 oyuklu plakaların kullanımı, yüksek verimlilik kapasitesi 9 daha önce tartışılmış olsa da, gerçek bir protokol detaylı olarak gösterilmektedir ve başarılı mutantlar bakteriyel bir koleksiyon test etmek için kullanılmıştır. Burada, modifiye edilmiş ve standart bir protokol, Salmonella mutantları fenotipik 96 kuyulu kültür kaplarına kullanmak için geliştirilmiştir. Özellikle, bu protokol sadece Salmonella ve fagositik hücreler için test edildi ve böylece modifikasyonlar ve optimizasyon açıkçası tasarımlarıyla birlikte gerekli olacaktır<html> R, bakteri ya da konakçı hücreler sunar. Fagositik hücreler Salmonella dernek, işgali ve çoğaltma fenotipik modifiye Gentamisin koruma deneyi için çeşitli avantajları vardır. İlk olarak, 96-çukurlu kültür çanak biçiminde 10 kadar farklı suşlar yeterli istatistiksel analiz tekrarı ve iç kontrol ile eş zamanlı olarak test edilebilir, yüksek hacimli test ve analiz edilmesine izin verir. Farklı zamanlarda tekrar zaman İkinci olarak, tahlilin yüksek duyarlılığın, Gentamisin koruma deneyi ham veri teknik varyansları duyarlı olabilir. Bu şekilde değiştirilmiş bir protokol uyarınca, çeşitli ırklar varyans azaltılması süreci boyunca aynı koşullar altında fenotiplenir. Son olarak, çok kanallı pipet kullanımının verimliliğini artırır ve operatörün yorgunluğunu azaltır. Nicel, tekrarlanabilir büyük miktarlarda veri üretirken yeni bir protokol hızlı fenotipleme sayıda Salmonella mutantlar kolaylaştırdı. &quot;ove_content&gt; 96 oyuklu kültür tabaklarında işgali testleri yaparak bir mesele, oyuklar Bu sorunu gidermek için. az ökaryotik hücreleri içerir, ve bu nedenle nicelendirme tehlikeye olabilir ki, deneylerin büyük bir dizi tekrarlanabilirliği optimize etmek için yapıldı. Üretim bu protokolde kullanılan RAW264.7 makrofaj az 20 pasajlar vardı ve hücreler, analizden önce gece boyunca 96 oyuklu kültür kabı içine ekilmiştir İkinci olarak, İB 20 indirgendi:. 1 ya da: düzenli 50 ikinci ilâ 1 100: 1 MOI 20.:. 1 makrofaj% 99 stokastik noktasına göre Poisson dağılımı hesaplanmıştır 10-30 bakterilerle enfeksiyona maruz kalacağı Biyolojik faktörler ile sınırlı değildir, düşünülmektedir sağlar, hücre hasarı olabilir . ezici bakterilerden kaynaklanan fiziksel temaslar 10 Ayrıca, Salmonella işgali olumlu yüksek İçişleri Bakanlığı 11 ile ilişkili makrofaj apoptoz, uyarabilecek bir 20 MOI&#39;nin kullanma:. 1, hücresel damagE muhtemelen nedeniyle sınırlı bakteri makrofaj fiziksel temas için, minimum olduğu bulunmuştur. Üçüncü olarak, inkübasyon süresi aralığı üç zaman noktası için optimize edilmiştir: ilişki herhangi Gentamisin 30 dakika boyunca; 100 ug / ml gentamisin ilave bir 1 saat (toplam 1.5 saat Enfeksiyondan) için istilası; 10 ug / ml Gentamisın ilave 22.5 saat (toplam 24 saat sonra enfeksiyon) için çoğaltma. Bizim testte, 5 ug / ml Gentamisin ve böylece,% 10 hücre içermeyen DMEM içinde 100 ug sığır fetüsü serumu (yayınlanmamış veriler), tüm Salmonella öldürmek için yeterli olan / ml Gentamisin Hızlı öldürme ve 10 g sağlanması beklenir / ml Gentamisin gece boyunca inkübasyon için hücre kültürü ortamı içinde hücre dışı bakteri boşluğu korumak için in vivo olur, bu buzağı bağırsak epitel hücreleri 12,13 ile doku ile ilişkili Salmonella için yaklaşık 15 dakika sürer;. in vitro, 30 dakikalık kuluçka bildirilmektedir yabani tip için yeterli <em&gt; 14 istila etmek. Standart işgal tahlil için, ilk iki zaman noktasında iş yükü yıkama seri seyreltme ve kaplama nedeniyle oldukça yoğundur. Cihazın önemli ölçüde operatörün etkili ve doğru artar, çünkü her zaman noktası için kesin bir zaman aralığı, özelliği çok kanallı pipet kullanılarak elde edilmiştir. Ayrıca, numunenin kaplama tekniği, bunun yerine 100 ul kaplama ve el 10 ul 5 ayrı damlalar büyük ölçüde kaplama süresini azaltan ve doğruluğunu artırır yuvalı plakalar üzerinde her bir tekrar için kaplanmıştır, yayma, seri seyreltmeden sonra değiştirilmiş son sayım nedeniyle başına iyi 5 kaplama örneklerinden puanlanır. Toplu olarak, bu optimizasyon prosedürleri ve standardizasyon tahlilin tekrarlanabilirliğini artış, farklı operatörler farklı zamanlarda art arda tutarlı sonuçlar elde edilebilir. Bu protokol Bu deney için fagositik hücrelere yerine epitel hücrelerini kullanırdaha küçük bir 96 oyuklu bir formatta. Salmonelloz patojenezinin araştırılması, en yaygın olarak kullanılan epitel hücre hattı, insan epitelyum heterojen kolorektal adenokarsinomundan türetilen Caco-2&#39;dir. Caco-2 hücreleri ile normal 24-çukurlu kültür çanak istilası testi kullanarak, her bir zaman noktasında geri kazanılan bakteri gerçek sayısı, özel bir fenotipleme çoğaltma için 22.5 saat bir zaman noktasında, duruma göre çok daha düşük olacak şekilde J774 veya RAW264 gibi fagositik hücrelerin .7 makrofajlar, (yayınlanmamış veri) kullanılmıştır. Bu durumda, bu daha da her bir sıra daha az olan konakçı hücreler, 96 oyuklu bir kültür çanağı kullanarak fenotiplendirilmesini yapılmasını kolaylaştırır. Bu makrofajlar hücreleri aktif fazla bakteri içselleştirmiş kaybetmesine yol açabilecek bakteriler, yutmak olabileceği bilinmektedir ve aynı zamanda Salmonella görünüşe Caco-2 hücrelerinde daha yavaş çoğaltmak olduğunu göz ardı edilemez. Hayatta ve içinde makrofaj hücreleri çoğaltmak için Salmonella yeteneği patogenezinde önemli roller ile ilişkilidirsalmonelloz, yani, masif konak inflamasyon yanıtları tetikleme ve sistemik enfeksiyon 1 kolaylaştırılması. Biz esas konak etkileşimleri onların potansiyel nişan için hesaplama boru hattı seçilen genlerin büyük bir set fenotipik değiştirilmiş ve standardize Gentamisin koruma deneyi istihdam. Bu Salmonella mutantların yaklaşık% 50 fagositik hücreleri içinde hücre içi kopyeleme yapan genler gibi bireyler belirlenmiştir ortaya çıktı.

Tifoya yol açmayan Salmonella tüm omurgalıların enterik hastalıkların önemli nedenleri vardır. İnsanlarda Salmonella üst bakteriyel gıda kaynaklı hastalıklar 1 arasındadır. Onların hayvan ana Salmonella etkileşimleri destekleyen moleküler mekanizmaların Karakterizasyonu başta enfeksiyon, doku kültürü ve hayvan modellerinde Salmonella enterica serotip Typhimurium (STM) arasında çalışma ile elde edilir. STM-konak etkileşimleri anlayışlar kazanıyor bize Salmonella hayatta ve ev sahibi hücre içindeki büyümeye nasıl anlamanıza yardımcı olacaktır. Bu etkileşimlerin incelenmesinde ilk sorun host ve hem de patojen mümkün olduğunca çok sayıda katılımcı faktörleri belirlemek için, ama bu çabalar büyük ölçüde, aynı anda iki bağımsız karmaşık biyolojik sistemlerle, yani host ve Salmonella uğraşan önemli zorluklar tarafından engellenirse, fizyolojik koşullar altında. Buna ek olarak, büyük repertSalmonella oire ve potansiyel konak etkileşimleri rol faktörleri kodlayan genler konakçı bu meydan mücadele yüksek verim biyolojik platformu gerektirir. Modifiye, standardize edilmiş test olasılıkla Salmonella -host etkileşimleri çekici genlerin büyük bir set incelemek için geliştirilmiştir yüksek verimlilik kapasitesi ile makrofajlar Salmonella dernek, işgali ve çoğaltma fenotipik. Gentamisin koruma deneyi 1973 2 yılında geliştirilen, ama önce iyice 1994 yılında 3,4 Elsinghorst tarafından tarif edilmiştir. Şimdi Salmonella 5,6 olmak üzere, ex vivo birçok hücre içi bakteriyel patojenler, eğitim için standart bir araç haline gelmiştir. Içselleştirilmiş bakteriler ökaryot hücrelerin 3 nüfuz edemez Gentamisın gibi bazı antibiyotikler, tarafından öldürülüyor kaçınırım. Bu fenomenin avantajlarından yararlanarak, Gentamisin koruma deneyi hücre içi ba hayatta kalma ve büyüme ölçercterial bir patojen görülmüyordu. Enfeksiyon sırasında üç olay, yani ökaryotik hücreler, invazyon ve çoğaltma ile işbirliği içinde, enfeksiyon, Gentamisin tedavisi ve tekrar enkübe edildikten (Şekil 1) arasındaki zaman aralığına bağlı olarak hücre içi bakteriyel patojenler için değerlendirilebilir. Ökaryotik hücre hatları konak-patojen etkileşimi çalışmaları için ilgili hayvan modellerinde daha az karmaşık bir fizyolojik ortam sağlar. Gentamisin koruma deneyi STM konakçı etkileşimleri incelemek için uygun bir platform, ama 24-yuvalı kültür kaplarına bir şekilde standart analiz düşük verimlilik kapasitesine sahiptir. In vivo veri setleri Hesaplamalı analiz yaklaşık 300 konak gen ürünlerinin (yayınlanmamış veri) ile etkileşim tahmin edilmektedir 149 Salmonella gen ürünlerini belirledi. Standart Gentamisin koruma deneyi verimli mutantlar bu sayı fenotipik kapasiteye sahip değildir. Additiyon, Gentamisin koruma deneyi teorik hatta tek bir bakterinin işgali algılayabilir. Farklı zamanlarda tekrar geldiğinde çünkü bu doğal duyarlılık için ham veriler, teknik varyansları duyarlıdırlar. Iç kontrol ve normalleştirme sonrası göreli veri sunumu sonuçlarının anlamlı yorumlanması için gereklidir. Bu hususlar dikkate alındığında, modifiye, standardize Gentamisin koruma deneyi test kapasitesini geliştirmek ve hassasiyetini artırmak için geliştirilmiştir. Aşağıdaki protokol, detaylı ve 96 bölümlü kültür tabaklarına ve sıçangil makrofaj hücre çizgisi RAW264.7 kullanarak değiştirilmiş Gentamisin koruma deneyi gerçekleştirmek için resimli. 24-Kaynak kültür tabağı içindeki standart bir protokole göre, değiştirilmiş bir protokol, aşağıdaki avantajlara sahiptir: 1) 96-yuvalı kültür kaplarına kullanılması yeterli istatistiksel güç dahili pozitif ve negatif kontroller de dahil olmak üzere fenotiplenebilmektedir 10 farklı mutant suşları kadar izin verir;Mutant soylar olarak aynı kültür çanağı ve aynı zamanda test edilmiştir, çünkü 2) sonuç varyans önemli ölçüde azalır; Operatör yorgunluğunu azaltırken 3) çok kanallı pipetler kullanılması verimini arttırır. Son olarak, 24-çukurlu kültür tabaklarında karşılaştırarak, 96-çukurlu kültür kaplarına oyuk başına daha az konak hücre kabul protokol optimizasyonu ve standardizasyonu ile ele alınmıştır. Özetle, fagositik hücrelerde in vitro fenotip Salmonella ve diğer bakteriyel dernek, işgali ve çoğaltma değiştirilmiş, standardize edilmiş test hassasiyeti artar ve operatörün yorgunluğunu azaltırken yüksek verim kapasitesine ulaşır.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Life Technologies</td><td>11965</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>HyClone</td><td>SH30910.03</td><td></td></tr><tr><td>T-75 Cell culture flask vented filter cap</td><td>Nest Biotechnology</td><td>708003</td><td></td></tr><tr><td>100x Non-Essential Amino Acids</td><td>Life Technologies</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>Cell scraper</td><td>BD Falcon</td><td>353086</td><td></td></tr><tr><td>96-well Cell culture plate</td><td>Corning Incorporated</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>Luria-Bertani (LB) broth</td><td>MP Biomedicals</td><td>3002-075</td><td></td></tr><tr><td>14 ml Polypropylene Round-Bottom Tube</td><td>BD Falcon</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>PBS pH 7.4 (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>10010</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T-8787</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin solution</td><td>Sigma</td><td>K0254</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin solution</td><td>Sigma</td><td>G1272</td><td></td></tr><tr><td>0.25% Trypsin-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25200</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td></td></tr></tbody></table>

high-throughput assay to phenotype salmonella enterica typhimurium association, invasion, and replication in macrophages

Salmonella türleri zoonotik patojenler ve insanlarda ve hayvancılık 1 gıda kaynaklı hastalıkların önde gelen nedenidir. Salmonella host etkileşimleri altında yatan mekanizmaların anlaşılması, Salmonella enfeksiyonunun moleküler patogenezi aydınlatmak için önemlidir. Gentamisin koruma deneyi yüksek verimli tarama RAW 264.7 kemirgen makrofajlar kullanılarak konak etkileşimleri Salmonella enterica serotip Typhimurium silinmesi mutantların rolleri tanımlamak için izin uyarlanan fagositik hücrelerde Salmonella dernek, işgali ve çoğaltma fenotipik. Bu protokol uyarınca, varyansı vahşi tip ve birden çok mutant suş hem aynı kültürü çanağı içinde ve aynı anda kontrol edilebilir, çünkü ölçümler önemli ölçüde, standart bir protokole göre azalır. Çok kanallı pipetler kullanılması verimi arttırır ve hassasiyet geliştirir. Ayrıca, endişeler daha az ho kullanılmasıyla ilgili96-çukurlu kültür kaplarına oyuk başına ST hücreleri, ele alınmıştır. Burada, fagositik hücreler kullanılarak in vitro olarak modifiye edilmiş Salmonella yayılması deneyinin protokol başarılı bir şekilde ilişkili, invazyon ve hücre içi çoğaltma için 38 birey, Salmonella silme mutantları fenotipik için kullanılmıştır. In vitro fenotipleri bazıları, daha sonra bir hayvan modelinde in vivo fenotiplerini sahip olduğu teyit edilmiştir sunulmuştur. Böylece, modifiye, standardize edilmiş test yüksek verimli kapasiteli bakteriyel-konak etkileşimleri çalışmak için daha geniş yararlanılabilir ile makrofajlar Salmonella dernek, işgali ve çoğaltma fenotipik.

Veriler, değiştirilmiş fagositik hücre yayılması deneyinin göre çizilir sonra temsili sonuçlar (Şekil 2) bakınız. Veri çoğaltma 8 kusurlu olduğu bilinen beş farklı suşları, WT ΔinvA, ΔphoP mutant A ve yayılma açısından kusurlu olduğu bilinen mutant B Δ INVA, ve ΔphoP arasında, deney geçerliliğini değerlendirmek için pozitif kontrol olarak kullanılır . Gerçekten de, değiştirilmiş istila deneyinde, bir mutan ΔinvA RAW264.7 hücreleri tarafından içselleştirilir ve kötü bir ΔphoP mutan 24 saat sonra çoğaltma azalmıştı. Mutantlar A ve B bu protokolü kullanarak tahlil temsilcisi suşları vardır. Mutant A ΔphoP mutant Benzer çoğaltma (Şekil 2), önemli bir azalma göstermektedir; ilginç bir şekilde, mutant B çoğalmasında önemli bir artış (Şekil 2) göstermektedir. Veriler, net bir şekilde, bu iki Muta göstermektedirNTS makrofajlar işgali ve hayatta kalmak için fenotipleri değiştirmiştir. Özet olarak, bir çok Salmonella iptal mutantlarının ayrı modifiye istila deneyi kullanılarak RAW264.7 makrofaj bakteriyel dernek, invazyon ve kopyalama dahil olmak için bireyler belirlenmiştir. 38 test edilen mutantların yirmi kadar, makrofajların (Tablo 1), fagositik hücreler, in vitro fenotip Salmonella ve diğer bakteriyel federasyonu, invazyon ve çoğaltma hassas ve yüksek verimli kapasiteli süre arttırır ve bu nedenle, değiştirilmiş bir bakteriyel enfeksiyon tahlil değişken fakat önemli kusurları gösterildi: operatörün yorgunluğunu azaltır. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51759/51759fig1highres.jpg" width="500" /> Yüksek verimli bir deney Şekil 1. Çalışma düzeni. Gentamisin koruma deneyi modi olduğunuğı, 96 oyuklu plakalar içinde eş zamanlı olarak çok sayıda Salmonella mutantları fenotipik standardize edilir. Önemli adımlar RAW264.7 makrofaj hücrelerinde Salmonella dernek, işgali ve çoğaltma incelemek için yukarıdaki gibi yapılır. <img alt="Şekil 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51759/51759fig2highres.jpg" width="500" /> . WT, ΔinvA, ΔphoP, mutant A, ve mutant B - - Şekil 2. Temsilcisi sonuçları yüksek verimlilik analizleri Salmonella suşları için yapılır RAW264.7 makrofaj hücrelerinde. Ve her bir suş için her makrofaga CFU geometrik ortalamalar gösterilmektedir: WT ve grafik temsili için daha fazla normalleştirilmiş sırasıyla hücre federasyonu, invazyon ve çoğaltma için üç bağımsız deneyin, elde edilir. Hata çubukları standart hatayı temsil eder, ve her bir suş arasında istatistiksel olarak anlamlı referanslıWT Student t-testi ile belirlenmiştir. * P &lt;0.05. İçişleri Bakanlığı = 20. <img alt="Tablo 1" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51759/51759table1.jpg" width="400" /> Tablo aday genlerin 1. Fenotiplerinin. Aday Salmonella mutantlar RAW264.7 makrofaj hücrelerinde dernek, işgali ve çoğaltma için değiştirilmiş, standardize edilmiş deney tarafından fenotiplenir. 20 mutantlar dernek, işgal ve / veya çoğaltma önemli kusurları var.

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages at JoVE.com

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

In vitro olarak fenotip Salmonella veya diğer bakteri federasyonu, invazyon ve yüksek verimlilik kapasitesine sahip fagositik hücreler içerisinde replikasyon için yüksek verimli bir deney geliştirildi. Yöntem konak-patojen etkileşimleri onların tutulumlarla için Salmonella gen nakavt mutant suşlar değerlendirmek için kullanılmıştır.

Fenotipinin yüksek verim Deneyi<em&gt; Salmonella enterica</em&gt; Typhimurium Derneği, Invasion, ve Makrofagların Çoğaltma

Salmonella species are zoonotic pathogens and leading causes of food borne illnesses in humans and livestock1. Understanding the mechanisms underlying ...

high-throughput-assay-to-phenotype-salmonella-enterica-typhimurium

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

12.6K Görüntüleme.  Texas A&M University.  In vitro olarak fenotip Salmonella veya diğer bakteri federasyonu, invazyon ve yüksek verimlilik kapasitesine sahip fagositik hücreler içerisinde replikasyon için yüksek verimli bir deney geliştirildi. Yöntem konak-patojen etkileşimleri onların tutulumlarla için Salmonella gen nakavt mutant suşlar değerlendirmek için kullanılmıştır. 

Video: High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

Forward Genetics Screens Using Macrophages to Identify Toxoplasma gondii Genes Important for Resistance to IFN-&#947;-Dependent Cell Autonomous Immunity

Toxoplasma gondii, the causative agent of toxoplasmosis, is an obligate intracellular protozoan pathogen. The parasite invades and replicates within virtually any warm blooded vertebrate cell type. During parasite invasion of a host cell, the parasite creates a parasitophorous vacuole (PV) that originates from the host cell membrane independent of phagocytosis within which the parasite replicates. While IFN-dependent-innate and cell mediated immunity is important for eventual control of infection, innate immune cells, including neutrophils, monocytes and dendritic cells, can also serve as vehicles for systemic dissemination of the parasite early in infection. An approach is described that utilizes the host innate immune response, in this case macrophages, in a forward genetic screen to identify parasite mutants with a fitness defect in infected macrophages following activation but normal invasion and replication in na&#239;ve macrophages. Thus, the screen isolates parasite mutants that have a specific defect in their ability to resist the effects of macrophage activation. The paper describes two broad phenotypes of mutant parasites following activation of infected macrophages: parasite stasis versus parasite degradation, often in amorphous vacuoles. The parasite mutants are then analyzed to identify the responsible parasite genes specifically important for resistance to induced mediators of cell autonomous immunity. The paper presents a general approach for the forward genetics screen that, in theory, can be modified to target parasite genes important for resistance to specific antimicrobial mediators. It also describes an approach to evaluate the specific macrophage antimicrobial mediators to which the parasite mutant is susceptible. Activation of infected macrophages can also promote parasite differentiation from the tachyzoite to bradyzoite stage that maintains chronic infection. Therefore, methodology is presented to evaluate the importance of the identified parasite gene to establishment of chronic infection.

Forward Genetics Screens Using Macrophages to Identify Toxoplasma gondii Genes Important for Resistance to IFN-&#947;-Dependent Cell Autonomous Immunity

Forward genetics is a powerful approach to identify genes in intracellular pathogens important for resistance to cell autonomous immunity. The current approach uses innate immune cells, specifically macrophages, to identify novel Toxoplasma gondii genes important for immune evasion.

İleri Genetik tanımak makrofajlar kullanılarak Ekranlar<em&gt; Toxoplasma gondii</em&gt; Genler önemli direnç için IFN-γ-bağımlı hücre otonom bağışıklık

Toxoplasma gondii, the causative agent of toxoplasmosis, is an obligate intracellular protozoan pathogen. The parasite invades and replicates within ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like Shigella flexneri and Francisella novicida need to induce the rupture of the phagosome. In contrast, Salmonella typhimurium replicates in a vacuolar compartment, known as Salmonella-containing vacuole (SCV). However certain mutants of Salmonella fail to maintain SCV integrity and are thus released into the cytosol. The percentage of cytosolic vs. vacuolar bacteria on the level of single bacteria can be measured by differential permeabilization, also known as phagosome-protection assay. The approach makes use of the property of detergent digitonin to selectively bind cholesterol. Since the plasma membrane contains more cholesterol than other cellular membranes, digitonin can be used to selectively permeabilize the plasma membrane while leaving intracellular membranes intact. In brief, following infection with the pathogen expressing a fluorescent marker protein (e.g. mCherry among others), the plasma membrane of host cells is permeabilized with a short incubation in digitonin containing buffer. Cells are then washed and incubated with a primary antibody (coupled to a fluorophore of choice) directed against the bacterium of choice (e.g. anti-Salmonella-FITC) and washed again. If unmarked bacteria are used, an additional step can be done, in which all membranes are permeabilized and all bacteria stained with a corresponding antibody. Following the staining, the percentage of vacuolar and cytosolic bacteria can be quantified by FACS or microscopy by counting single or double-positive events. Here we provide experimental details for use of this technique with the bacterium Salmonella typhimurium. The advantage of this assay is that, in contrast to other assay, it provides a quantification on the level of single bacteria, and if analyzed by microscopy provides the exact number of cytosolic and vacuolar bacteria in a given cell.

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

We describe the quantification of cytosolic and vacuolar Salmonella typhimurium in bone-marrow derived macrophages using differential digitonin permeabilization.

Koful genel Sitosolik kantifikasyonu<em&gt; Salmonella</em&gt; Diferansiyel permeabilizasyon tarafından İlköğretim Makrofagların içinde

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like ...

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Brucella species are facultative intracellular pathogens that infect animals as their natural hosts. Transmission to humans is most commonly caused by direct contact with infected animals or by ingestion of contaminated food and can lead to severe chronic infections.
Brucella can invade professional and non-professional phagocytic cells and replicates within endoplasmic reticulum (ER)-derived vacuoles. The host factors required for Brucella entry into host cells, avoidance of lysosomal degradation, and replication in the ER-like compartment remain largely unknown. Here we describe two assays to identify host factors involved in Brucella entry and replication in HeLa cells. The protocols describe the use of RNA interference, while alternative screening methods could be applied. The assays are based on the detection of fluorescently labeled bacteria in fluorescently labeled host cells using automated wide-field microscopy. The fluorescent images are analyzed using a standardized image analysis pipeline in CellProfiler which allows single cell-based infection scoring.
In the endpoint assay, intracellular replication is measured two days after infection. This allows bacteria to traffic to their replicative niche where proliferation is initiated around 12 hr after bacterial entry. Brucella which have successfully established an intracellular niche will thus have strongly proliferated inside host cells. Since intracellular bacteria will greatly outnumber individual extracellular or intracellular non-replicative bacteria, a strain constitutively expressing GFP can be used. The strong GFP signal is then used to identify infected cells.
In contrast, for the entry assay it is essential to differentiate between intracellular and extracellular bacteria. Here, a strain encoding for a tetracycline-inducible GFP is used. Induction of GFP with simultaneous inactivation of extracellular bacteria by gentamicin enables the differentiation between intracellular and extracellular bacteria based on the GFP signal, with only intracellular bacteria being able to express GFP. This allows the robust detection of single intracellular bacteria before intracellular proliferation is initiated.

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Two assays for microscopy-based high-throughput screening of host factors involved in Brucella infection are described. The entry assay detects host factors required for Brucella entry and the endpoint assay those required for intracellular replication. While applicable for alternative approaches, siRNA screening in HeLa cells is used to illustrate the protocols.

Yer Alan Ana Faktörler yüksek verimli tarama mikroskopisi bazlı deneyler<em&gt; Brucella</em&gt; Hela Hücrelerinin Enfeksiyon

Brucella species are facultative intracellular pathogens that infect animals as their natural hosts. Transmission to humans is most commonly caused by ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. typhimurium bacteria are quickly detected and phagocytized by macrophages, and contained in vesicles known as phagosomes in order to be degraded. Isolation of S. typhimurium-containing phagosomes have been widely used to study how S. typhimurium infection alters the process of phagosome maturation to prevent bacterial degradation. Classically, the isolation of bacteria-containing phagosomes has been performed by sucrose gradient centrifugation. However, this process is time-consuming, and requires specialized equipment and a certain degree of dexterity. Described here is a simple and quick method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin-streptavidin-conjugated magnetic beads. Phagosomes obtained by this method can be suspended in any buffer of choice, allowing the utilization of isolated phagosomes for a broad range of assays, such as protein, metabolite, and lipid analysis. In summary, this method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes is specific, efficient, rapid, requires minimum equipment, and is more versatile than the classical method of isolation by sucrose gradient-ultracentrifugation.

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

We describe here a simple and quick method for the isolation of Salmonella typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin and streptavidin.

Salmonella typhimuriumyalıtım-makrofajlar üzerinden Phagosomes içeren

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses

There are a variety of strategies bacterial pathogens employ to survive and proliferate once inside the eukaryotic cell. The so-called 'cytosolic' pathogens (Listeria monocytogenes, Shigella flexneri, Burkholderia pseudomallei, Francisella tularensis, and Rickettsia spp.) gain access to the infected cell cytosol by physically and enzymatically degrading the primary vacuolar membrane. Once in the cytosol, these pathogens both proliferate as well as generate sufficient mechanical forces to penetrate the plasma membrane of the host cell in order to infect new cells. Here, we show how this terminal step of the cellular infection cycle of L. monocytogenes (Lm) can be quantified by both colony-forming unit assays and flow cytometry and give examples of how both pathogen- and host-encoded factors impact this process. We also show a close correspondence of Lm infection dynamics of cultured cells infected in vitro and those of hepatic cells derived from mice infected in vivo. These function-based assays are relatively simple and can be readily scaled up for discovery-based high-throughput screens for modulators of eukaryotic cell function.

We describe both in vitro and in vivo infection assays that can be used to analyze the activities of host-encoding factors.

Bakteriyel Pathogen sonda için hücresel ve Organismic düzeyi ana bilgisayar yanıt için kullanma

There are a variety of strategies bacterial pathogens employ to survive and proliferate once inside the eukaryotic cell. The so-called 'cytosolic' ...

Highly Efficient Transfection of Primary Macrophages with In Vitro Transcribed mRNA

Macrophages are phagocytic cells specialized in detecting molecules of non-self origin. To this end, they are equipped with a large array of pattern recognition receptors (PRRs). Unfortunately, this also makes macrophages particularly challenging to transfect as the transfection reagent and the transfected nucleic acids are often recognized by the PRRs as non-self. Therefore, transfection often results in macrophage activation and degradation of the transfected nucleic acids or even in suicide of the macrophages. Here, we describe a protocol that allows highly efficient transfection of murine primary macrophages such as peritoneal macrophages (PM) and bone marrow-derived macrophages (BMDM) with mRNA in vitro transcribed from DNA templates such as plasmids. With this simple protocol, transfection rates of about 50-65% for PM and about 85% for BMDM are achieved without cytotoxicity or immunogenicity observed. We describe in detail the generation of mRNA for transfection from DNA constructs such as plasmids and the transfection procedure.

Macrophages, especially primary macrophages, are challenging to transfect as they specialize in detecting molecules of non-self origin. We describe a protocol that allows highly efficient transfection of primary macrophages with mRNA generated from DNA templates such as plasmids.

In Vitro Transcribed mRNA ile Primer Makrofajların Yüksek Verimli Transföytüsü

Macrophages are phagocytic cells specialized in detecting molecules of non-self origin. To this end, they are equipped with a large array of pattern ...

NF-&#954;B-dependent Luciferase Activation and Quantification of Gene Expression in Salmonella Infected Tissue Culture Cells

The dimeric transcription factor NF-&#954;B regulates many cellular response pathways, including inflammatory pathways by inducing the expression of various cytokines and chemokines. NF-&#954;B is constitutively expressed and is sequestered in the cytosol by the inhibitory protein nuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer in B cells inhibitor, alpha (I&#954;B&#945;). Activation of NF-&#954;B requires the degradation of I&#954;B&#945;, which then exposes a nuclear localization signal on NF-&#954;B and promotes its trafficking to the nucleus. Once in the nucleus, NF-&#954;B binds to the promotor region of NF-&#954;B target genes such as interleukin 6 (IL-6) and IL-23, to promote their expression.
The activation of NF-&#954;B occurs independently of transcription or translation. Therefore, the activation state of NF-&#954;B must be measured either by quantifying NF-&#954;B specifically in the nucleus, or by quantifying expression of NF-&#954;B target genes. In this protocol, cells stably transfected with an NF-&#954;B::luciferase reporter construct are assayed for NF-&#954;B activation using in vitro tissue culture techniques. These cells are infected with Salmonella Typhimurium to activate NF-&#954;B, which traffics to the nucleus and binds to &#954;B sites in the promoter region of luciferase, inducing its expression. Cells are lysed and analyzed with the luciferase assay system. The amount of luciferase produced by the cells correlates with the intensity of the luminescence signal, which is detected by a plate reader. The luminescence signal generated by this procedure provides a quick and highly sensitive method by which to assess NF-&#954;B activation under a range of conditions. This protocol also utilizes quantitative reverse transcription PCR (RT-qPCR) to detect relative mRNA levels that are indicative of gene expression.

Here, we present a protocol to quickly and easily measure nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells (NF-&#954;B) activation in cell lines expressing NF-&#954;B::luciferase reporter constructs, via measurements of luminescence in the cell lysate. Additionally, gene expression is determined via RT-qPCR isolated from cells infected with Salmonella Typhimurium.

Salmonella Enfekte Doku Kültür Hücrelerinde NF-κB bağımlı Luciferase Aktivasyonu ve Gen Ekspresyonunun Nicelleştirilmesi

The dimeric transcription factor NF-&#954;B regulates many cellular response pathways, including inflammatory pathways by inducing the expression of ...

Automated Analysis of Intracellular Phenotypes of Salmonella Using ImageJ

Salmonella is an enteric pathogen able to invade the intestinal epithelium and replicate in enterocytes, both inside Salmonella-specific vacuoles and free in the cytosol (cytosolic hyper-replication). These different phenotypes of intracellular replication drive to different pathways of pathogenesis, i.e., cytosolic hyper-replication induces inflammatory cell death and extrusion into the gut lumen, while vacuolar replication leads to trans-epithelium penetration and systemic spread. Significant effort was made to create microscopy tools to study the behavior of Salmonella inside invaded cells, such as the pCHAR-Duo fluorescence reporter plasmid that allows discrimination between vacuolar and cytosolic bacteria by differential expression of mCherry and GFP. However, intracellular phenotypes are often manually scored, a time-consuming procedure that limits analysis to a small number of samples and cells. To overcome these limitations, two complementary and automated image analyses were developed using ImageJ, a freely available image analysis software. In the high-throughput protocol, epithelial cells were infected with Salmonella carrying pCHAR-Duo using 96-well plates. Imaging was performed using an automated fluorescence microscope. Then, two image analysis methods were applied to measure the intracellular behavior of Salmonella at different detail levels. The first method measures the overall intracellular bacterial load and the extent of cytosolic hyper-replication. It is fast and allows the scoring of a high number of cells and samples, making it suitable for high-throughput assays such as screening experiments. The second method performs single-cell analysis to determine the percentage of infected cells, the mean vacuolar load of Salmonella, and the cytosolic hyper-replication rate giving greater details about Salmonella behavior inside epithelial cells. The protocols can be performed by specifically designed ImageJ scripts to automatically run batch analyses of the major steps of Salmonella-enterocyte interaction.

Automated Analysis of Intracellular Phenotypes of Salmonella Using ImageJ

Salmonella invades and replicates inside intestinal epithelial cells both in Salmonella-specific vacuoles and free in the cytosol (hyper-replication). A high-throughput fluorescence microscopy-based protocol is described here to quantify the intracellular phenotypes of Salmonella by two complementary image analyses through ImageJ, reaching single-cell resolution and scoring.

ImageJ Kullanarak Salmonella'nın Hücre İçi Fenotiplerinin Otomatik Analizi

Salmonella is an enteric pathogen able to invade the intestinal epithelium and replicate in enterocytes, both inside Salmonella-specific vacuoles and free ...

An In Vitro Assay to Quantify the Intracellular Growth of Parasite in Macrophages

Source: Sarkar, A., et al. <a href="https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/57486">Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites.</a> J. Vis. Exp. (2018).
This video demonstrates an assay to quantify the intracellular growth of parasites in bone marrow-derived macrophages (BMMs). The macrophage cells are infected with the motile and non-motile invasive stages of Leishmania, metacyclic promastigotes and amastigotes, respectively. The parasites invade the macrophages, getting internalized into a parasitophorous vacuole and multiplying inside. The intracellular parasite growth is quantified using a microscope upon fluorescently staining the macrophage and parasite nuclei.

Makrofajlarda Parazitin Hücre İçi Büyümesini Ölçmek için Bir İn Vitro Test

1. Plating BMMs on Coverslips for Infection 

	Prepare 6-well tissue culture plates by placing four (4) sterile 12 mm glass coverslips (autoclaved and ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

İmmünoloji

İmmünodiyagnostik

Özelleşmiş Analizleri

An Assay to Quantify Cytosolic and Vacuolar Salmonella in Infected Primary Macrophages

Source: Meunier, E., et al. <a href="https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/52960">Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization.</a> J. Vis. Exp. (2015).
This video demonstrates an assay to quantify cytosolic and vacuolar Salmonella typhimurium inside bone marrow-derived macrophages using differential permeabilization. The macrophages are infected with a fluorescent protein-expressing Salmonella, which is internalized inside a specialized vacuolar structure called Salmonella-containing vacuole or SCV. A subset of bacteria escape the SCV and enter the cytosol. The cholesterol-rich plasma membrane of macrophages is permeabilized using digitonin, leaving the SCV intact. Upon labeling the cytosolic bacteria with a fluorescently tagged antibody, the percentage of vacuolar and cytosolic bacteria is quantified using fluorescence-activated cell sorting (FACS).

Fenotipinin yüksek verim Deneyi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

İleri Genetik tanımak makrofajlar kullanılarak Ekranlar

Koful genel Sitosolik kantifikasyonu

Yer Alan Ana Faktörler yüksek verimli tarama mikroskopisi bazlı deneyler