Name: in vitro phagocytosis of myelin debris by bone marrow-derived macrophages
Uploaded: 2017-12-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Phagocytosis of Myelin Debris by Bone Marrow-Derived Macrophages at JoVE.com

Yazarlar Glenn Sanger-Hodgson, medya uzmanı FSU Üniversite Tıp video prodüksiyon, düzenleme ve ses çalışmaları için teşekkür etmek istiyorum.
Bu eser Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından (R01GM100474 ve R01GM072611) destek verdi.

Yöntemleri burada açıklanan ve Bölüm 2'de Florida Eyalet Üniversitesi Kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmış olan ve ileri Kılavuzu bakım ve kullanım laboratuvar hayvanlarının, 8th edition için belirlenen kuralları izler . Bunda bu protokol için kullanılan tüm özel laboratuvar hayvan tesisi evde kadar kullanmak hayvanlardır. Vivo deneyler gerçekleştirilen öncesinde kurban oldu. Hayvan sayıları ortalama hücre ve miyelin koleksiyonları kullanımını en aza indirmek için bir kılavuz olarak kullanarak deneysel ihtiyacına göre.
Not: Bu iletişim kuralı kemik iliği türevi makrofajlar (BMDMs) (Bölüm 1), fluorescently etiketli beyin kaynaklı miyelin enkaz (Bölüm 2), miyelin enkaz fagositoz (Bölüm 3), analiz genel yordamı hazırlanması nesil açıklar ve Genel yordam miyelin enkaz lipid birikimi (Bölüm 4) çözümlenmesi için. Reaktif hazırlık, hücre hasat ve işleme, miyelin koleksiyonu ve etiketleme ve tahlil performans Laminer hava akımı Biyogüvenlik kabini tamamlanmalıdır.
1. birincil kemik iliği türevi makrofajlar nesil
<ol>
	<li>Hazırlık tam makrofaj kültür ortamının (CMCM) Not: kemik iliği nesilden makrofaj makrofaj koloni uyarıcı faktör (M-CSF) kullanımını gerektirir. Bu hazırlık L929 fare fibroblast şartına medya M-CSF kaynağı olarak kullanır.<ol>
		<li>L929 fare fibroblast şartına medya kodlamayla hücreleri tarafından 145 mm yemekleri ile 50 mL, yüksek glikoz (4500 mg/L L-glikoz) Dulbecco'nın modifiye kartal orta (% 5 yeni doğan buzağı serum (NCS) ve penisilin/streptomisin ile 7 gün boyunca takıma DMEM) oluşturun.</li>
		<li>Medya 3500 x g, 4 ° c'de 30 dakika 50 mL konik santrifüj tüpleri ve santrifüj kültürler toplamak</li>
		<li>Supernatants yeni bir 50 mL konik santrifüj tüpüne 0.2 µm şırınga filtre ile filtre. Klimalı ortam-80 ° C'de 6 aya kadar muhafaza edilebilir.</li>
		<li>DMEM yüksek glikoz için % 5 vol/vol NCS ekleyin, DMEM ve %1 %15 vol/vol L929 fare fibroblast şartına penisilin/streptomisin. Medya 4 ° C'de 2-3 ay boyunca saklanır. Kullanmadan önce 37 ° c sıcak.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Birincil kemik iliği hücreleri ve makrofaj indüksiyon koleksiyonu 
	Not: Bu iletişim kuralı bir fare kullanarak yaklaşık 20 milyon kemik iliği türevi makrofajlar (BMDMs) oluşturur.<ol>
		<li>8-10 hafta standart CO2 boğulma yönergeleri kullanarak eski fareler tarafından servikal yerinden çıkması takip için istediğiniz sayıyı ötenazi.</li>
		<li>% 70 (vol/vol) etanol: H2O kullanarak, kürk doyurarak hayvan sterilize.</li>
		<li>Karın küçük bir açılış kesmek ve dikkatli bir şekilde geri çekin temel doku ortaya çıkarmak için cilt. Periton boşluğuna delik değil için dikkat ediniz.</li>
		<li>Kalçada başlayıp ayak bileği her iki arka ayakları kaldırın. Yer 5-10 mL steril fosfat içeren 100 mm Petri kabına toplanan dokusuna arabelleğe alınmış serum (PBS) % 1'ile desteklenmiş penisilin/streptomisin. 
		Not: Otelde çeşitli hayvanlar işleme yemekleri doku bozulması sınırlamak için buz üzerinde tutmak emin olun.</li>
		<li>Kas ve bağ dokusu bir neşter kullanarak kemiğinden kaldırın. Sadece femur ve tibia kullanılan hücre koleksiyonu için fibula atılır.</li>
		<li>Toplanan kemik iliği boşluğuna her iki ucu bir neşter ile küçük bir bölümünden çıkararak maruz.</li>
		<li>25 g iğne kullanarak, CMCM ile kemik iliği boşluklar içine 50 mL konik santrifüj tüpü sifonu çek. Bir kez onlar yeterince temizlenen kemikleri beyaz görünür.</li>
		<li>Koleksiyon tamamlandığında, örnekleri oluşturulan bir tek hücre süspansiyon 30-90 s için bir 18 g iğne ile tahrik. 
		Not: Bir isteğe bağlı kırmızı kan hücresi (RBC) lizis adım bu noktada gerçekleştirilebilir. Son zamanlarda hücre içi demir içeriği miyelin enkaz makrofaj polarizasyon16üzerine etkilerini etkileyebilir sürülmüştür. RBC lizis adım olmasıyla ilgili bilgi için Trouplin ve arkbakın. 17.</li>
		<li>Süspansiyon 70 µm steril hücre süzgeç aracılığıyla yeni bir 50 mL konik santrifüj tüpüne filtre.</li>
		<li>Tohum hücrelerini eşit olarak 15-20 mL CMCM içeren 145 mm hücre kültür yemekleri toplanan. Yaklaşık üç kültür yemekleri feda fare başına kullanın. Kültürler 37 ° c, % 5 CO2kuluçkaya.</li>
		<li>72 saat yapışık olmayan hücreleri kaldırmak için bir kez steril PBS ile plakalar yıkadıktan sonra 15-20 mL ekleyin taze CMCM. Kültürler için 37 ° c, % 5 CO2ek bir 4 gün kuluçkaya. Toplam kültürünün 7 gün sonra başlangıçta izole kemik iliği hematopoetik hücreler olgun BMDMs (şekil 1) olacaktır.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. nesil Fluorescently etiketli beyin kaynaklı miyelin enkaz
Not: Tüm reaktifler 4 ° C'de 1 ay boyunca saklanır.
<ol>
	<li>Miyelin enkaz toplama reaktifler hazırlanması
	<ol>
		<li>Tris· hazırlamak CL arabellek çözüm.<ol>
			<li>800 mL distile deiyonize H2O (ddiH2O) eklemek 1 M Tris· 20 mL CL, pH 7,45 (20 mM son konsantrasyonu) ve 20 mL 100 mm Na2EDTA (2 mM son konsantrasyonu).</li>
			<li>PH 7,45 için ayarlayın. DdiH2O. filtre solution'ı 0.2 µm filtrasyon ünitesi ile 1000 ml ses düzeyini ayarlayın.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>1 M Sükroz çözüm hazırlamak.<ol>
			<li>Tris· 100 mL için CL arabellek çözüm, 68.46 g Sükroz ekleyin. Tris· ile 200 mL için ses düzeyini ayarlama CL arabellek çözüm. 0.2 µm filtrasyon ünitesi ile çözüme filtre.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Tris· 1 M Çözümle sulandrarak 200 mL 0.32 M Sükroz çözeltisi hazırlamak CL arabellek çözüm 0.83:0.16 (vol/vol).</li>
		<li>Tris· 1 M Çözümle sulandrarak 150 mL 0,83 M Sükroz çözeltisi hazırlamak CL arabellek çözüm 0.83:0.16 (vol/vol).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Beyin elde edilen ham miyelin enkaz topluluğu 
	Not: Burada açıklanan koleksiyonu ham miyelin enkaz yalıtım için yöntemidir.<ol>
		<li>10-12 fareler 8-10 hafta-in yaş servikal çıkığı tarafından izlenen standart CO2 boğulma yönergeleri uygulayarak ötenazi.</li>
		<li>Beyni incelemek ve 10 mL 0.32 M Sükroz çözeltisi içeren bir 100 mm tabak koyun.</li></ol></li></ol>Buz üzerinde çanak tutmak.
		<li>Beyin içine kesilmiş steril Cerrahi makas kullanarak boyutu yaklaşık3 5 mm parçaları.</li>
		<li>50 mL konik santrifüj tüpü doku transferi ve yaklaşık 30 mL 0.32 M Sükroz çözeltisi ekleyin.</li>
		<li>Düzgün bir çözüm elde kadar steril bir el döner homogenizer ile homojenize.</li>
		<li>Homojenize beyin son hacmiyle 0.32 M Sükroz çözüm ile 90 mL seyreltik.</li>
		<li>Altı 38,5-mL ince duvarlı polipropilen ultracentrifuge tüpler için 20 mL 0,83 M Sükroz çözeltisi ekleyin.</li>
		<li>Yavaşça homojenize beyin çözüm iki kat karıştırmak için değil dikkat çekici 0,83 M Sükroz çözüm en üstüne ekleyin.</li>
		<li>Her tüpün 0.32 M Sükroz çözüm ile denge.</li>
		<li>Uygun bir kullanarak 4° C'de 45 dk için 100.000 x g, santrifüj ultracentrifuge rotor ön soğutmalı. Rotor hızlanma ve yavaşlama miyelin enkaz kaybını azaltmak için en düşük değerlerine geri ayarlayın.</li>
		<li>Miyelin enkaz iki Sükroz yoğunlukları arabiriminden toplamak. 
		Not: enkaz tüp merkezine doğru beyaz bir grup olarak görünmelidir.</li>
		<li>Ham miyelin enkaz bir 50 mL konik santrifüj tüpüne birleştirmek ve yaklaşık 35 ml Tris· kullanarak ses seviyesini CL arabellek çözüm.</li>
		<li>30-60 s için steril bir el döner homogenizer ile ham miyelin enkaz lunaparkçı.</li>
		<li>Süspansiyon 6 temiz ultracentrifuge tüpleri ve Tris· uygun bir hacmi ile denge arasında eşit olarak bölmek CL arabellek çözüm.</li>
		<li>Uygun bir kullanarak 4° C'de 45 dk için 100.000 x g, santrifüj ultracentrifuge rotor ön soğutmalı. Rotor hızlanma ve yavaşlama maksimum değerlerine döndürecek.</li>
		<li>Katı beyaz granül şimdi görünür olacak gibi süpernatant atmak ve granül 10-15 mL Tris· yeniden askıya alma CL arabellek çözüm.</li>
		<li>Süspansiyon 2 temiz ultracentrifuge tüpler ve Tris· uygun bir hacmi ile denge arasında eşit olarak bölmek CL arabellek çözüm.</li>
		<li>Santrifüj tekrar 100.000 x g için uygun bir kullanarak 4 ° C'de 45 dk de ultracentrifuge rotor ön soğutmalı. Rotor hızlanma ve yavaşlama maksimum değerlerine döndürecek.</li>
		<li>Süpernatant atın ve 5-6 mL steril PBS granül resuspend ve süspansiyon önceden ağırlığını 1.5 mL mikro-santrifüj tüpleri uygun sayıda arasında bölün.</li>
		<li>4 ° C'de 10 dakika için 22.000 x g, santrifüj</li>
		<li>Süpernatant atın ve miyelin enkaz parçaları ağırlığını belirlemek.</li>
		<li>Granül, yeniden 100 mg/mL nihai bir konsantrasyon için PBS içinde askıya alma. 
		Not: on kadar twelve beyin da 10-15 mL 100 mg/mL miyelin enkaz üretmek için yeterlidir. Miyelin enkaz-80 ° C'de deposu için 6 ay olabilir.</li>
	
	
	<li>Miyelin enkaz floresan etiketleme
	<ol>
		<li>50 µM carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) çözüm kullanımdan hemen önce hazırlayın.<ol>
			<li>Steril PBS kullanarak, 5 mM stok çözeltisi % 100 Dimetil sülfoksit (DMSO) 50 µM son çalışma konsantrasyon için hazırlanan CFSE oranında seyreltin.</li>
			<li>Çözüm 0.2 µm şırınga filtre ile filtre.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>100 mg/mL miyelin enkaz istenilen miktarda çözülme ve steril 29 g iğne ile yeniden askıya alma. 
		Not: miyelin enkaz buz gibi o çözüm resuspension kullanmadan önce gerektiren kadar neden olur.</li>
		<li>Miyelin enkaz önceden ağırlığını 1.5 mL mikro-santrifüj tüpü aktarın.</li>
		<li>4° C'de 10 dakika 14,800 x g, santrifüj Süpernatant atmak.</li>
		<li>CFSE çözüm pelleted 100 µL miyelin enkaz başına 200 µL miyelin enkaz resuspend.</li>
		<li>Oda sıcaklığında ışıktan korunan (RT) 30 dk için kuluçkaya.</li>
		<li>4 ° C'de 10 dakika 14,800 x g, santrifüj Süpernatant atmak.</li>
		<li>Pelet yıkama arabellek 600-800 µL içinde resuspend (0.2 µm filtre sterilize PBS 100 mM glisin).</li>
		<li>4 ° C'de 10 dakika 14,800 x g, santrifüj Süpernatant atmak.</li>
		<li>Adımları 2.3.8-2.3.9 iki kez daha tekrarlayın.</li>
		<li>Son yıkama sonra miyelin enkaz Pelet ağırlığını belirlemek ve 100 mg/mL steril PBS ile yeniden askıya alabiliriz. Not: Etiketli miyelin enkaz 6 aya kadar-80 ° C'de deposu olabilir.</li>
	</ol>
	</li>

3. miyelin enkaz fagositoz tahlil
Not: Fagositoz fluorescently etiketli miyelin enkaz gözlemlemek için temel yöntem aşağıdadır. Diğer tedaviler ve deneysel koşullar ek araştırmacı tarafından optimize edilmiş olması gerekir.
<ol>
	<li>Tedavi plakaları hazırlanması
	<ol>
		<li>Her 145 mm plaka için olgun BMDMs Dulbecco'nın fosfat tamponlu tuz (dPBS) (pH 7,4) 5-6 mL 10 mM ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) kullanarak bir 15 mL konik santrifüj tüpüne toplamak. 
		Not: Hücreleri18etkinleştirme durumunu değiştirebilir tripsin kullanmayın.</li>
		<li>Önceden ısıtılmış CMCM eşit bir hacmi kendine hakim hücre her tüp için ekleyin.</li>
		<li>8 dk. 20 ° C'de için 180 x g, santrifüj Süpernatant atmak.</li>
		<li>Hücreleri CMCM ve sayısı alanındaki yeniden askıya alma.</li>
		<li>24-şey hücre kültür plaka her şey için CMCM 1 mL 1 x 105 hücreleri ekleyin.</li>
		<li>37 ° c, % 5 CO2 24 h için kuluçkaya.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Miyelin enkaz tedavi ve analiz
	<ol>
		<li>Miyelin enkaz için her şey (son konsantrasyonu 1 mg/mL) olarak 100 mg/mL CFSE 10 µL etiketli ekleyin.</li>
		<li>1-3 saat 37 ° c, % 5 CO2kuluçkaya.</li>
		<li>Plaka sigara yuttu miyelin enkaz kaldırmak için 3 kez steril PBS ile yıkayın.</li>
		<li>400 µL % 4 paraformaldehyde, her şey için ekleyin. 30 dk RT. az için kuluçkaya</li>
		<li>Plaka 2 kez steril PBS ile yıkayın.</li>
		<li>Höchst 33258 çözüm 400 µL her şey için ekleyin. Işıktan korunan RT, 5 min için kuluçkaya.</li>
		<li>Tabak 2 kez steril PBS ile yıkayın.</li>
		<li>Fluoro-jel 200 µL Tris arabelleği ile photobleaching azaltmak için her şey için ekleyin.</li>
		<li>Görüntü hücre ters bir epi-floresan yetenekli mikroskop kullanarak. 
		Not: CFSE uyarma ve emisyon dalga boylarında 494 vardır nm ve 521 nm, anılan sıraya göre.</li>
		<li>CFSE pozitif hücre sayısı çekirdeği göreli miyelin enkaz alımını belirlemek için sayıya bölme.</li>
		<li>Görüntüleme önce plakaları ışıktan korunan 4 ° C'de 7 güne kadar korumak.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. yağ kırmızı-O boyama ile hücre içi lipidler miktar
Not: Hücre içi miyelin enkaz türetilmiş lipidler gözlemlemek için temel yöntem aşağıdadır.Miyelin enkaz etiketli CFSE kullanımı nedeniyle spektral örtüşme boyama ORO floresan miktar için tavsiye edilmez. Diğer tedaviler ve deneysel koşullar ek araştırmacı tarafından optimize edilmiş olması gerekir.
<ol>
	<li>Hazırlık çözümler boyama
	<ol>
		<li>% 0,5 yağ kırmızı-O (ORO) Boyama çözüm hazırlamak.<ol>
			<li>Yavaş yavaş ORO (1-([4-(Xylylazo)xylyl]azo)-2-naphthol) karıştırma süre. 0,5 g % 100 propilen glikol (1,2-Propanediol) 100 mL eklemek</li>
			<li>Çözüm 95 ° C'de 15 dakika veya tüm büyük parçacıklar çözünene kadar ısı. 
			Not: üzerinde 100 ° c ısı değil</li>
			<li>Solution'ı filtre kağıt hala sıcak iken yeni bir konteyner içine filtre.</li>
			<li>Serin gecede RT. çözüm çözüm-ebilmek var olmak stok RT. ilâ 1 yıl için izin</li>
		</ol>
		</li>
		<li>%85 propilen glikol çözeltisi hazırlamak.<ol>
			<li>% 100 propilen glikol 85 mL ddiH2O. kadar karışık heyecan için 15 mL ekleyin. Çözüm-ebilmek var olmak stok ilâ 1 yıl RT.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Tedavi plakaları hazırlanması
	<ol>
		<li>Tabi belgili tanımlık yöntem Bölüm 3'te özetlenen bir 24-şey tabak hazırlamak.</li>
		<li>37 ° c, % 5 CO2 24 h için kuluçkaya.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Miyelin enkaz tedavi
	<ol>
		<li>100 mg/mL miyelin enkaz 10 µL her şey (son konsantrasyonu 1 mg/mL) ekleyin.</li>
		<li>1-3 h 37 ° c, % 5 CO2için kuluçkaya.</li>
		<li>Plaka sigara sindirilmiş miyelin enkaz kaldırmak için 3 kez steril PBS ile yıkayın. Not: Bu noktada, tabaklar da hemen fiksasyon uygulayabilir veya taze CMCM eklenebilir ve hücreleri kuluçka için ek zaman Puan girildi.</li>
		<li>400 µL % 4 paraformaldehyde, her şey için ekleyin. 30 dk RT. az için kuluçkaya</li>
		<li>2 kez ile steril PBS sonra procced boyama için plaka yıkayın.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>ORO boyama ve analiz
	<ol>
		<li>Sabit plaka ddiH2O. ile 3 kez yıkamak</li>
		<li>Her şey % 100 propilen glikol 400 µL ekleyin ve RT., 5 min için kuluçkaya 
		Not: Bu ertelenmiş ddiH2O. azaltır</li>
		<li>Propilen glikol Aspire edin ve her şey için 400 µL ORO çözüm ekleyin.</li>
		<li>8 dk. 60 ° C'de için kuluçkaya</li>
		<li>ORO çözüm Aspire edin. Daha sonra her şey için % 85 propilen glikol 400 µL ekleyin ve RT., 5 minumintes için kuluçkaya</li>
		<li>Plaka ddiH2O. ile 3 kez yıkamak</li>
		<li>Höchst 33258 çözüm 400 µL her şey için ekleyin. RT, ışıktan korunan, 5 min için kuluçkaya.</li>
		<li>Tabak 2 kez steril PBS ile yıkayın.</li>
		<li>Fluoro-jel 200 µL Tris arabelleği ile her şey için ekleyin.</li>
		<li>Görüntü hücre ters bir epi-floresan yetenekli mikroskop kullanarak. ORO standart bir Texas kırmızı veya DsRed filtre seti kullanarak yansıma.</li>
		<li>ORO olumlu alanını her resim alanı belirleme ve çekirdeği sayısına bölen tarafından göreli lipid saklama ölçmek.</li>
		<li>İçin 7 gün 4 ° c seramik plakalar ışıktan korunan korumak.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+biology+in+development,+homeostasis+and+disease.">Macrophage biology in development, homeostasis and disease.</a> Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).</li><li>Unanue, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen-presenting+function+of+the+macrophage.">Antigen-presenting function of the macrophage.</a> Annu Rev Immunol. 2, 395-428 (1984).</li><li>Cavaillon, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokines+and+macrophages.">Cytokines and macrophages.</a> Biomed Pharmacother. 48 (10), 445-453 (1994).</li><li>Ren, Y., Savill, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis:+the+importance+of+being+eaten.">Apoptosis: the importance of being eaten.</a> Cell Death Differ. 5 (7), 563-568 (1998).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+in+spinal+cord+injury:+phenotypic+and+functional+change+from+exposure+to+myelin+debris.">Macrophages in spinal cord injury: phenotypic and functional change from exposure to myelin debris.</a> Glia. 63 (4), 635-651 (2015).</li><li>Goodrum, J. F., Earnhardt, T., Goines, N., Bouldin, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+of+myelin+lipids+during+degeneration+and+regeneration+of+peripheral+nerve:+an+autoradiographic+study.">Fate of myelin lipids during degeneration and regeneration of peripheral nerve: an autoradiographic study.</a> J Neurosci. 14 (1), 357-367 (1994).</li><li>Greenhalgh, A. D., David, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+the+Phagocytic+Response+of+Microglia+and+Peripheral+Macrophages+after+Spinal+Cord+Injury+and+Its+Effects+on+Cell+Death.">Differences in the Phagocytic Response of Microglia and Peripheral Macrophages after Spinal Cord Injury and Its Effects on Cell Death.</a> J Neurosci. 34 (18), 6316 (2014).</li><li>Sun, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelin+activates+FAK/Akt/NF-kappaB+pathways+and+provokes+CR3-dependent+inflammatory+response+in+murine+system.">Myelin activates FAK/Akt/NF-kappaB pathways and provokes CR3-dependent inflammatory response in murine system.</a> PLoS One. 5 (2), e9380 (2010).</li><li>Gensel, J. C., Zhang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+activation+and+its+role+in+repair+and+pathology+after+spinal+cord+injury.">Macrophage activation and its role in repair and pathology after spinal cord injury.</a> Brain Res. , 1-11 (2015).</li><li>Bourre, J. M., Pollet, S., Daudu, O., Le Saux, F., Baumann, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelin+consists+of+a+continuum+of+particles+of+different+density+with+varying+lipid+composition:+major+differences+are+found+between+normal+mice+and+quaking+mutants.">Myelin consists of a continuum of particles of different density with varying lipid composition: major differences are found between normal mice and quaking mutants.</a> Biochimie. 59 (10), 819-824 (1977).</li><li>Larocca, J. N., Norton, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Current Protocols in Cell Biology. , (2001).</li><li>Norton, W. T., Poduslo, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelination+in+rat+brain:+method+of+myelin+isolation.">Myelination in rat brain: method of myelin isolation.</a> J Neurochem. 21 (4), 749-757 (1973).</li><li>Wang, X. Q., Duan, X. M., Liu, L. H., Fang, Y. Q., Tan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carboxyfluorescein+diacetate+succinimidyl+ester+fluorescent+dye+for+cell+labeling.">Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester fluorescent dye for cell labeling.</a> Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 37 (6), 379-385 (2005).</li><li>Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+dyes+for+lymphocyte+migration+and+proliferation+studies.">Fluorescent dyes for lymphocyte migration and proliferation studies.</a> Immunol Cell Biol. 77 (6), 499-508 (1999).</li><li>Deutsch, M. J., Schriever, S. C., Roscher, A. A., Ensenauer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+image+analysis+approach+for+lipid+droplet+size+quantitation+of+Oil+Red+O-stained+cultured+cells.">Digital image analysis approach for lipid droplet size quantitation of Oil Red O-stained cultured cells.</a> Anal Biochem. 445, 87-89 (2014).</li><li>Kroner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TNF+and+increased+intracellular+iron+alter+macrophage+polarization+to+a+detrimental+M1+phenotype+in+the+injured+spinal+cord.">TNF and increased intracellular iron alter macrophage polarization to a detrimental M1 phenotype in the injured spinal cord.</a> Neuron. 83 (5), 1098-1116 (2014).</li><li>Trouplin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marrow-derived+Macrophage+Production.">Marrow-derived Macrophage Production.</a> J Vis Exp. (81), e50966 (2013).</li><li>Chen, S., So, E. C., Strome, S. E., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Detachment+Methods+on+M2+Macrophage+Phenotype+and+Function.">Impact of Detachment Methods on M2 Macrophage Phenotype and Function.</a> J Immunol Methods. 426, 56-61 (2015).</li><li>Guo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rescuing+macrophage+normal+function+in+spinal+cord+injury+with+embryonic+stem+cell+conditioned+media.">Rescuing macrophage normal function in spinal cord injury with embryonic stem cell conditioned media.</a> Mol Brain. 9 (1), 48 (2016).</li><li>Bosco, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+synthetic+matrix+metalloproteinase+inhibitor+reduces+human+mesenchymal+stem+cell+adipogenesis.">A new synthetic matrix metalloproteinase inhibitor reduces human mesenchymal stem cell adipogenesis.</a> PLOS ONE. 12 (2), e0172925 (2017).</li><li>Ram&#237;rez-Zacar&#237;as, J. L., Castro-Mu&#241;ozledo, F., Kuri-Harcuch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+adipose+conversion+and+triglycerides+by+staining+intracytoplasmic+lipids+with+oil+red+O.">Quantitation of adipose conversion and triglycerides by staining intracytoplasmic lipids with oil red O.</a> Histochem. 97 (6), 493-497 (1992).</li><li>Koopman, R., Schaart, G., Hesselink, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimisation+of+oil+red+staining+permits+combination+with+immunofluorescence+and+automated+quantification+of+lipids.">Optimisation of oil red staining permits combination with immunofluorescence and automated quantification of lipids.</a> Histochem Cell Biol. 116 (1), 63-68 (2001).</li><li>Fang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipopolysaccharide-Induced+Macrophage+Inflammatory+Response+Is+Regulated+by+SHIP.">Lipopolysaccharide-Induced Macrophage Inflammatory Response Is Regulated by SHIP.</a> J Immunol. 173 (1), (2004).</li><li>Martinez, F. O., Sica, A., Mantovani, A., Locati, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+activation+and+polarization.">Macrophage activation and polarization.</a> Front Biosci. 13, (2008).</li><li>Mosser, D. M., Edwards, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+full+spectrum+of+macrophage+activation.">Exploring the full spectrum of macrophage activation.</a> Nat Rev Immunol. 8 (12), 958-969 (2008).</li></ol>

Yazarlar hiçbir açıklamalar var.

Burada açıklanan yordamları taze izole kaba CNS miyelin enkaz ve birincil kemik iliği türevi makrofajlar kullanmaktadır. Hayvan harcamaları azaltmak için her iki beyin önerilir ve kemik iliği hücreleri kurban anda her fare--dan hasat. Birlikte çalışan iki araştırmacı aynı anda her iki malzeme hazırlayabilirsiniz. Alternatif olarak, beyin-80 ° c miyelin enkaz yalıtım önce antibiyotik ile takıma PBS içinde saklanır. Hiç beyin bizim deneyim ilâ 1 ay miyelin enkaz üretme potansiyeli sezilebilir kaybı için bu koşullarda muhafaza edilebilir.
CFSE miyelin enkaz, kullanım kolaylığı ve floresan yoğunluğu nedeniyle etiketlemek için kullanılır. Hücresel esterazlar asetat grubu molekül14tarihinde ayırmak kadar boya yüzeyi kalır. Bırakılmış succinimidyl ester grubu sonra hücresel proteinler14kovalent bağlanma sonuçlanan birincil amidler ile tepki verebilir. CFSE standart yeşil flüoresan kanallarını kullanarak heyecanlı olmakla birlikte, var çeşitli türevleri farklı spektral özellikleri ile ticari olarak elde edilebilir. Böylece, birden çok floresan boyalar kullanarak benzer bir fagositoz tahlil tasarlamak mümkündür. Ayrıca boya kolayca plazma membran geçer çünkü bu etiket apoptotik hücreler için benzer bir şekilde miyelin enkaz19kullanılabileceğini belirtmek gerekir. Kullanıcı optimizasyon ile standart görüntü analizi üzerine bizim yöntem dayanır Ayrıca, miktar Akış Sitometresi veya görüntüleme sistemi yüksek işlem hacmi plaka kullanılarak gerçekleştirilemez.
Yağ kırmızı o. (Solvent Kırmızı 27 veya Sudan kırmızı 5B olarak da bilinir) yoğun histolojik örneklerinde nötr lipitler leke için kullanılan yağda çözünen bir boya olduğunu. Koyu kırmızı onun pigmentasyon parlak alan ve floresan mikroskopi5,20ile hücre içi lipidler görselleştirme sağlar. Floresan mikroskopisi kullanılarak tek kanal görüntüleme ve sağlam miktar, lipid damlacıkları lekeli ORO için sağlar. Boyama yöntemi basit ve son derece tekrarlanabilir olmakla birlikte, numune hazırlama sırasında özen göstermelidir. Hücre içi lipidler, yoğunluk boyama içinde belirgin bir şekilde azaltılmasına yol çözünebilmektedir gibi alkol veya asit tabanlı Fiksajlar kullanılmaması, önemlidir. Ayrıca, herhangi bir sayısal görüntü analizi ile standart görüntü yakalama ayarlarını ve yeterli yansız örnekleme önemini gösterişsiz değil. Denetimleri boyama kullanımı herhangi bir örnek otomatik Floresans için hesap için önerilir. Boyama gibi denetimleri aynı şekilde tedavi edilmelidir, ama sol arka plan otomatik Floresans düzeyini ölçmek için ORO ile günahı. Öyle olsa bile, bizim görüntü analiz yöntemi diğer lipid miktar teknikleri, daha az optimizasyonu gerektirir gibi standart eğri hazırlık gerektiren ORO ayıklama yöntemi21için deneysel değişkenliği daha yatkın ve gerektirir örnek imha. Temel görüntü analizi kullanımı birkaç vardır o geleneksel ORO çıkarma yöntemleri üzerinde tahribatsız bu avantajları ve immunostaining21,22 ile uyumludur.
Açıklanan yordamları nispeten düz ileri olmakla birlikte, son olarak, bu makrofajlar patojen endotoksin gibi moleküler desenleri (PAMPS) ilişkili tanımak birden çok reseptörleri hızlı beri uygun aseptik tekniği, kullanılması önemlidir lipopolysaccharide (LPS)23. Bakteriyel ile etkileşim kirlenmektedir neden makrofaj harekete geçirmek içinde ve onların işlevi24,25dramatik değişiklik yapabilirsiniz. Toplanan miyelin enkaz gelince kirlenme için test tavsiye edilir. Endotoksin algılama yöntemleri limulus amebocyte lysate (LAL) tahlil gibi yüksek hassasiyet var ve daha önce bu uygulama5,19için kullanılmıştır.
Makrofajlar sağlık ve hastalığında önemli bir rol oynamaktadır, henüz BMDMs rol CNS yaralanma bağlamında şu anda soruşturma önemli bir konudur. Burada açıklanan yöntemleri kullanarak, araştırmacılar tarafından BMDMs miyelin enkaz fagositoz mekanizmasının daha iyi anlamaya başlayabilirsiniz.

Makrofajlar (BMDMs) kemik iliği türevi doğuştan gelen ve edinilmiş bağışıklık sistemleri arasında önemli bir bağlantı vardır. Antijen sunan hücreler (ZPT), olarak her iki antijen sunumu ile lenfositler ile iletişim kurabilir ve sitokin yayın1,2,3. Ancak, profesyonel fagositler onların birincil işlevi patojenler, yaşlı hücreler ve hücresel enkaz1,4temizlemektir. Bir omurilik yaralanması (SCI), miyelin enkaz önemli miktarda hücre tipi CNS axon myelination5için sorumlu ölmek üzere olan oligodendrocytes oluşturulur. Biz ve diğerleri miyelin enkaz temizleme BMDMs5,6,7infiltre öncelikle sorumluluğu olduğunu göstermiştir. Ancak, Medulla Spinalis Yaralanmalarında içinde siteleri engulfment miyelin enkaz bir pro-inflamatuar durumu5,8,9karşı bu normalde anti-inflamatuar hücreleri kaydırmaya sürülmüştür. Anahtar arabulucu nöro-inflamasyon yaralı spinal kord BMDMs önemli klinik hedefleridir.
BMDMs etkisi yaralı spinal kord araştırmak yardımcı olmak için nasıl BMDMs miyelin enkaz için yanıt doğrudan çalışmaya bir vitro modeli geliştirdik. Biyolojik alaka artırmak için birincil fare BMDMs ve taze izole miyelin enkaz bu araştırmalarda kullanılır. Bu nedenle, burada sunulan yöntemleri de detay yalıtım ve birincil fare BMDMs kültürünü ve fare CNS ayırmak için kullanılan bir değiştirilmiş Sükroz degrade teknik miyelin enkaz10,11,12türetilmiş. Miyelin enkaz kolayca floresan bir boya carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE), sitotoksik sigara çünkü onun içselleştirilmesi BMDMs. CFSE tarafından de bu uygulama için uygun izlemek ve kendi dar floresan spektrum izni ile Etiketlenmiş diğer floresan ile çoğullama13,14sondalar. Fagositoz, miyelin enkaz lipidler organellerin taşınır ve nötr lipitler gibi hücre içi lipid damlacıkları5paketlenmiş. Bu hücre içi lipid birikimi ölçmek için boyama yöntemi kantitatif görüntü analizi için en iyi duruma getirilmiş bir yağ kırmızı O (ORO) mevcut. Bu basit boyama yöntemi sağlam tekrarlanabilir sonuçlar ve miktar15üretir. Bu yöntemlerden miyelin enkaz fagositoz ve lipid saklama sınırlı özel ekipman ile çalışma kolaylaştırmak.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30243.01</td><td>High glucose with L-glutamine, sodium pyruvate</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin Solution</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td>100X Solution</td></tr><tr><td>New Born Calf Serum (NCS)</td><td>Rocky Mountain Biologics</td><td>NBS-BBT-5XM</td><td>United States Origin</td></tr><tr><td>NCTC clone 929 [L cell, L-929, derivative of Strain L]&amp;nbsp;</td><td>ATCC</td><td>CCL-1</td><td>L929 Cell Line of Conditioned Media Preparation</td></tr><tr><td>24-well Cell Culture Plates</td><td>VWR</td><td>10062-896&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Cell Culture Dish</td><td>Greiner Bio-One</td><td>639960</td><td>Polystyrine, 145/20mm</td></tr><tr><td>CFSE Cell Proliferation Kit</td><td>Thermo Fisher</td><td>C34570</td><td>DMSO for Reconsitution Provided</td></tr><tr><td>Fluoro-gel with Tris Buffer&amp;nbsp;</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>17985-11</td><td></td></tr><tr><td>Oil Red O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>O0625</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Materials&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Ultracentrifuge Tubes</td><td>Beckman Coulter</td><td>326823</td><td>Thinwall, Polypropylene, 38.5 mL, 25 x 89 mm</td></tr><tr><td>SW 32 Ti Ultracentrifuge Rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>369650</td><td>SW 32 Ti Rotor, Swinging Bucket, Titanium</td></tr><tr><td>Hand Held Rotary Homogenizer</td><td>Fisher Science</td><td>08-451-71</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro phagocytosis of myelin debris by bone marrow-derived macrophages

Makrofajlar (BMDMs) kemik iliği elde edilen profesyonel fagositler olarak kritik bir fizyolojik rolü parçacıklar çeşitli Temizleme yeteneğine hizmet olgun lökosit vardır. Normalde, BMDMs merkezi sinir sistemi (MSS) sınırlı ama bir yaralanma, onlar kolayca sızmak olabilir. Bir kez yaralı CNS doku içinde BMDMs lipid zengin miyelin enkaz büyük miktarlarda dahil olmak üzere yaralanma kaynaklı hücresel enkaz için izni sorumlu birincil hücre türü vardır. BMDM infiltrasyon ve miyelin enkaz fagositoz MSS içinde neuropathological yansımaları karmaşık ve iyi anlaşılan. Burada, açıklanan protokollere izin ver BMDMs doğrudan vitro çalışma bağlamında, CNS yaralanma için. Biz fare BMDM yalıtım ve kültür, miyelin enkaz hazırlama ve deneyleri BMDM miyelin enkaz fagositoz değerlendirmek için kapağı. Bu teknikler önemli özel ekipman veya malzemeler için gerek kalmadan sağlam ölçülebilir sonuçlar üretmek henüz araştırmacılar ihtiyaçlarını karşılamak üzere kolayca özelleştirilebilir.

Miyelin enkaz etiketli CFSE ile BMDMs tedavisinde açık içselleştirilmesi (Şekil 2) verim. 3 saatlik etkileşim vakit BMDMs sağlam aşağı akım algılama için yeterli eklenen miyelin enkaz phagocytose için yeterli olsa da, hücre içi birikimi ile etkileşim 1 saat kadar görülebilir. Ancak, bazı miyelin enkaz hala yıkandıktan sonra hücre yüzeyinde mevcut olabilir. Bu yetersiz yıkama veya tam değil içselleştirilmiş fagositoz erken evrelerinde parçacıkları nedeniyle olabilir.
BMDMs hızla miyelin enkaz içselleştirmesi iken, lizozomal işleme önce ORO stainable lipid damlacıkları formu gereklidir. Göstermek için BMDMs miyelin enkaz ile 90 dakika boyunca inkübe, yıkanmış ve ek fiksasyon ve (şekil 3) boyama önce zaman miktarda için kültürlü. Şekil 4 tedavi başlatma ve tarafsız lipid görünümü arasında bir gecikme olduğunu gösterir. Ayrıca lipid saklama sırasında kültür istikrarlı değil dikkat edilmelidir. BMDMs yakında damlacık oluşumu sonra birikmiş yağlar metabolize etmeye başlayacaktır. Bu nedenle, bekleyen çamaşır uzak olmayan yuttu miyelin enkaz ve fiksasyon arasında 24 saat daha uzun öneririz.
Miktar alan lekeli ORO miyelin lipid metabolizması BMDMs (şekil 5) oranını gösterir. 90 dakika etkileşim süre sonrasında, hücreleri taze CMCM kuluçka için iade edildi. Taze ortamda erken chase döneminde BMDMs fagosite miyelin enkaz lipid bileşen tarafsız ORO stainable lipidler metabolize. ORO pozitif alan sürekli bir artış etkileşim aşağıdaki saat içinde normaldir. 24 saat sonra ancak, BMDMs effluxed ya da hücre içi lipidler önemli bir kısmını metabolize edilir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56322/56322fig1.jpg"> 
Resim 1 : Temsilcisi BMDM kültürler. Kaç yapışık hücreleri başlangıçta tespit edilecektir. 3 günde yapışık olmayan hücreler kaldırılır. Gün 7 tarafından olgun kemik iliği türevi makrofajlar gözlenir. Ölçek = 50 µm. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56322/56322fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56322/56322fig2.jpg"> 
Resim 2 : BMDM miyelin enkaz fagositoz görüntülerini temsilcisi tahlil. Hücreleri 1mg/mL 1 saat önce çamaşır ve % 4 ile fiksasyon miyelin enkaz etiketli CFSE ile tedavi PFA. İçselleştirilmiş miyelin enkaz bir epi-floresan yetenekli mikroskobunun standart GFP filtre kümesi kullanma görüntülenmeyecektir. Ölçek = 50 µm. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56322/56322fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56322/56322fig3.jpg"> 
Şekil 3 : Yağ kırmızı O (ORO) deneysel tasarım diyagramı. BMDM tedavi edilir 1 mg/mL miyelin enkaz (1: 100 seyreltme) ile 90 dakika boyunca ardından yıkama ve kültür fiksasyon önce taze ortamda. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56322/56322fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56322/56322fig4.jpg"> 
Şekil 4 : ORO miyelin enkaz fagositoz takip BMDM boyama. Aşağıdaki fiksasyon ile belirtilen zaman puan, BMDMs, PFA lekeli ORO ve Höchst 33258 ile % 4. Her zaman-nokta için temsil edici görüntüleri gösterilir. Ölçek = 100 µm. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56322/56322fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56322/56322fig5.jpg"> 
Şekil 5 : Sayısal görüntü analizi ORO boyama. Boyama ORO miktar için 3 Kuyu başına iyi 5 resim ile 20 X görüntüsü. Tüm görüntü alma ayarlarını aynıydı. Hata çubukları SEM = (n = 3). <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56322/56322fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Phagocytosis of Myelin Debris by Bone Marrow-Derived Macrophages at JoVE.com

In Vitro Phagocytosis of Myelin Debris by Bone Marrow-Derived Macrophages

Biz birincil fare kemik iliği türevi makrofajlar fluorescently etiketli miyelin enkaz ve hücre içi lipid damlacık boyama kullanarak fagositik kapasitesini değerlendirmek için yöntemler mevcut.

Vitro Fagositoz miyelin enkaz kemik iliği türevi makrofajlar tarafından

Bone marrow-derived macrophages (BMDMs) are mature leukocytes that serve a critical physiological role as professional phagocytes capable of clearing a ...

in-vitro-phagocytosis-myelin-debris-bone-marrow-derived

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In Vitro Phagocytosis of Myelin Debris by Bone Marrow-Derived Macrophages

12.6K Görüntüleme.  Florida State University. Biz birincil fare kemik iliği türevi makrofajlar fluorescently etiketli miyelin enkaz ve hücre içi lipid damlacık boyama kullanarak fagositik kapasitesini değerlendirmek için yöntemler mevcut.

Video: In Vitro Phagocytosis of Myelin Debris by Bone Marrow-Derived Macrophages

Depletion and Reconstitution of Macrophages in Mice

Macrophages are critical players in the innate immune response to infectious challenge or injury, initiating the innate immune response and directing the acquired immune response. Macrophage dysfunction can lead to an inability to mount an appropriate immune response and as such, has been implicated in many disease processes, including inflammatory bowel diseases. Macrophages display polarized phenotypes that are broadly divided into two categories. Classically activated macrophages, activated by stimulation with IFN&gamma; or LPS, play an essential role in response to bacterial challenge whereas alternatively activated macrophages, activated by IL-4 or IL-13, participate in debris scavenging and tissue remodeling and have been implicated in the resolution phase of inflammation. During an inflammatory response in vivo, macrophages are found amid a complex mixture of infiltrating immune cells and may participate by exacerbating or resolving inflammation. To define the role of macrophages in situ in a whole animal model, it is necessary to examine the effect of depleting macrophages from the complex environment. To ask questions about the role of macrophage phenotype in situ, phenotypically defined polarized macrophages can be derived ex vivo, from bone marrow aspirates and added back to mice, with or without prior depletion of macrophages. In the protocol presented here clodronate-containing liposomes, versus PBS injected controls, were used to deplete colonic macrophages during dextran sodium sulfate (DSS)-induced colitis in mice. In addition, polarized macrophages were derived ex vivo and transferred to mice by intravenous injection. A caveat to this approach is that clodronate-containing liposomes deplete all professional phagocytes, including both dendritic cells and macrophages so to ensure the effect observed by depletion is macrophage-specific, reconstitution of phenotype by adoptive transfer of macrophages is necessary. Systemic macrophage depletion in mice can also be achieved by backcrossing mice onto a CD11b-DTR background, which is an excellent complementary approach. The advantage of clodronate-containing liposome-mediated depletion is that it does not require the time and expense involved in backcrossing mice and it can be used in mice regardless of the background of the mice (C57BL/6, BALB/c, or mixed background).

Macrophages play a central role in homeostasis and pathology in many tissues. The protocol presented here describes methods for depleting macrophages in vivo, deriving polarized macrophages from bone marrow aspirates, and adoptively transferring macrophages into mice. These techniques allow determination of the role that polarized macrophages play in health and disease.

Farelerde Makrofajlar tükenmesi ve Sulandırma

Macrophages are critical players in the innate  immune response to infectious challenge or injury, initiating the innate immune  response and directing ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bone Marrow-derived Macrophage Production

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because of their powerful microbicidal activities. Macrophages are widely distributed throughout the body and are present in the lymphoid organs, liver, lungs, gastrointestinal tract, central nervous system, bone, and skin. Because of their repartition, they participate in a wide range of physiological and pathological processes. Macrophages are highly versatile cells that are able to recognize microenvironmental alterations and to maintain tissue homeostasis. Numerous pathogens have evolved mechanisms to use macrophages as Trojan horses to survive, replicate in, and infect both humans and animals and to propagate throughout the body. The recent explosion of interest in evolutionary, genetic, and biochemical aspects of host-pathogen interactions has renewed scientific attention regarding macrophages. Here, we describe a procedure to isolate and cultivate macrophages from murine bone marrow that will provide large numbers of macrophages for studying host-pathogen interactions as well as other processes.

Macrophages have long been recognized as a critical component of the innate and adaptive immune responses. The recent explosion of knowledge pertaining to evolutionary, genetic, and biochemical aspects of the interaction between macrophages and microbes has renewed scientific attention to macrophages. This article describes a method to differentiate macrophages from mouse bone marrow.

Kemik İliği Makrofaj üretim kaynaklı

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because ...

Study of Phagolysosome Biogenesis in Live Macrophages

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome maturation is the complex and tightly regulated process during which a nascent phagosome undergoes drastic transformation through well-orchestrated interactions with various cellular organelles and compartments in the cytoplasm. This process, which is essential for the physiological function of phagocytic cells by endowing phagosomes with their lytic and bactericidal properties, culminates in fusion of phagosomes with lysosomes and biogenesis of phagolysosomes which is considered to be the last and critical stage of maturation for phagosomes. In this report, we describe a live cell imaging based method for qualitative and quantitative analysis of the dynamic process of lysosome to phagosome content delivery, which is a hallmark of phagolysosome biogenesis. This approach uses IgG-coated microbeads as a model for phagocytosis and fluorophore-conjugated dextran molecules as a luminal lysosomal cargo probe, in order to follow the dynamic delivery of lysosmal content to the phagosomes in real time in live macrophages using time-lapse imaging and confocal laser scanning microscopy. Here we describe in detail the background, the preparation steps and the step-by-step experimental setup to enable easy and precise deployment of this method in other labs. Our described method is simple, robust, and most importantly, can be easily adapted to study phagosomal interactions and maturation in different systems and under various experimental settings such as use of various phagocytic cells types, loss-of-function experiments, different probes, and phagocytic particles.

Canlı Makrofagların içinde Phagolysosome Biogenesis&#39;den Çalışması

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome ...

An Engulfment Assay: A Protocol to Assess Interactions Between CNS Phagocytes and Neurons

Phagocytosis is a process in which a cell engulfs material (entire cell, parts of a cell, debris, etc.) in its surrounding extracellular environment and subsequently digests this material, commonly through lysosomal degradation. Microglia are the resident immune cells of the central nervous system (CNS) whose phagocytic function has been described in a broad range of conditions from neurodegenerative disease (e.g., beta-amyloid clearance in Alzheimer&#8217;s disease) to development of the healthy brain (e.g., synaptic pruning)1-6. The following protocol is an engulfment assay developed to visualize and quantify microglia-mediated engulfment of presynaptic inputs in the developing mouse retinogeniculate system7. While this assay was used to assess microglia function in this particular context, a similar approach may be used to assess other phagocytes throughout the brain (e.g., astrocytes) and the rest of the body (e.g., peripheral macrophages) as well as other contexts in which synaptic remodeling occurs (e.g. ,brain injury/disease).

Microglia are the resident immune cells of the central nervous system (CNS) with a high capacity to phagocytose or engulf material in their extracellular environment. Here, a broadly applicable, reliable, and highly quantitative assay for visualizing and measuring microglia-mediated engulfment of synaptic components is described.

Bir yutulma Deneyi: CNS Fagositler ve nöronlar arasındaki etkileşimi değerlendirmek için bir protokol

Phagocytosis is a process in which a cell engulfs material (entire cell, parts of a cell, debris, etc.) in its surrounding extracellular environment and ...

Nörobilim

Metabolic Characterization of Polarized M1 and M2 Bone Marrow-derived Macrophages Using Real-time Extracellular Flux Analysis

Specific metabolic pathways are increasingly being recognized as critical hallmarks of macrophage subsets. While LPS-induced classically activated M1 or M(LPS) macrophages are pro-inflammatory, IL-4 induces alternative macrophage activation and these so-called M2 or M(IL-4) support resolution of inflammation and wound healing. Recent evidence shows the crucial role of metabolic reprogramming in the regulation of M1 and M2 macrophage polarization. 
In this manuscript, an extracellular flux analyzer is applied to assess the metabolic characteristics of naive, M1 and M2 polarized mouse bone marrow-derived macrophages. This instrument uses pH and oxygen sensors to measure the extracellular acidification rate (ECAR) and oxygen consumption rate (OCR), which can be related to glycolytic and mitochondrial oxidative metabolism. As such, both glycolysis and mitochondrial oxidative metabolism can be measured in real-time in one single assay.
Using this technique, we demonstrate here that inflammatory M1 macrophages display enhanced glycolytic metabolism and reduced mitochondrial activity. Conversely, anti-inflammatory M2 macrophages show high mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) and are characterized by an enhanced spare respiratory capacity (SRC). 
The presented functional assay serves as a framework to investigate how particular cytokines, pharmacological compounds, gene knock outs or other interventions affect the macrophage&#8217;s metabolic phenotype and inflammatory status.

Metabolic reprogramming is a characteristic and prerequisite for M1 and M2 macrophage polarization. This manuscript describes an assay for the measurement of fundamental parameters of glycolysis and mitochondrial function in mouse bone marrow-derived macrophages. This tool can be applied to investigate how particular factors affect the macrophage&#8217;s metabolism and phenotype.

Gerçek zamanlı Ekstrasellüler Flux Analizi Polarize M1 ve M2 Kemik İliği-türevli Makrofagların Metabolik Karakterizasyonu

Specific metabolic pathways are increasingly being recognized as critical hallmarks of macrophage subsets. While LPS-induced classically activated M1 or ...

Mesenchymal Stem Cell Regulation of Macrophage Phagocytosis; Quantitation and Imaging

Mesenchymal stem cells (MSC) have traditionally been studied for their regenerative properties, but more recently, their immunoregulatory characteristics have been at the forefront. They interact with and regulate immune cell activity. The focus of this study is the MSC regulation of macrophage phagocytic activity. Macrophage (M&#934;) phagocytosis is an important part of the innate immune system response to infection, and the mechanisms through which MSC modulate this response are under active investigation. Presented here is a method to study M&#934; phagocytosis of non-opsonized zymosan particles conjugated to a pH-sensitive fluorescent molecule while in co-culture with MSC. As phagocytic activity increases and the labeled zymosan particles are enclosed within the acidic environment of the phagolysosome, the fluorescence intensity of the pH-sensitive molecule increases. With the appropriate excitation and emission wavelengths, phagocytic activity is measured using a fluorescent spectrophotometer and kinetic data is presented as changes in relative fluorescent units over a 70 min period. To support this quantitative data, the change in the phagocytic activity is visualized using dynamic imaging. Results using this method demonstrate that when in co-culture, MSC enhance M&#934; phagocytosis of non-opsonized zymosan of both naive and IFN-&#947; treated M&#934;. These data add to the current knowledge of MSC regulation of the innate immune system. This method can be applied in future investigations to fully delineate the underlying cellular and molecular mechanisms.

Presented here is a protocol to quantify and produce dynamic images of mesenchymal stem cell (MSC) mediated regulation of macrophage (M&#934;) phagocytosis of non-opsonized yeast (zymosan) particles that are conjugated to a pH-sensitive fluorescent molecule.

Makrofaj Fagositozun Mezenkimal Kök Hücre Regülasyonu; Nicellik ve Görüntüleme

Mesenchymal stem cells (MSC) have traditionally been studied for their regenerative properties, but more recently, their immunoregulatory characteristics ...

Flow Cytometry Approach to Characterize Phagocytic Properties of Acutely-Isolated Adult Microglia and Brain Macrophages In Vitro

Microglia and central nervous system (CNS)-infiltrating macrophages, collectively called CNS mononuclear phagocytes (CNS-MPs), play central roles in neurological diseases including neurodegeneration and stroke. CNS-MPs are involved in phagocytic clearance of pathological proteins, debris and neuronal synapses, each with distinct underlying molecular pathways. Characterizing these phagocytic properties can provide a functional readout that compliments molecular profiling of microglia using traditional flow cytometry, transcriptomics and proteomics approaches. Phagocytic profiling of microglia has relied on microscopic visualization and in vitro cultures of mouse neonatal microglia. The former approach suffers from limited sampling while the latter approach is inherently poorly reflective of the true in vivo state of adult CNS-MPs. This paper describes optimized protocols to phenotype phagocytic properties of acutely-isolated mouse CNS-MPs by flow cytometry. CNS-MPs are acutely isolated from adult mouse brain using mechanical dissociation followed by density gradient centrifugation, incubated with fluorescent microspheres or fluorescent A&#946; fibrils, washed, and then labeled with panels of antibodies against surface markers (CD11b, CD45). Using this approach, it is possible to compare phagocytic properties of brain-resident microglia with CNS-infiltrating macrophages and then assess the effect of aging and disease pathology on these phagocytic phenotypes. This rapid method also holds potential to functionally phenotype acutely-isolated human CNS-MPs from post-mortem or surgical brain specimens. Additionally, specific mechanisms of phagocytosis by CNS-MP subsets can be investigated by inhibiting select phagocytic pathways.

Assessment of phagocytic properties of microglia and brain macrophages can provide a valuable functional dimension to molecular profiling studies. We describe a validated protocol that uses flow cytometry to rapidly and reliably quantify phagocytosis of fluorescent microspheres and amyloid beta fibrils by acutely-isolated microglia and brain macrophages from mouse models.

Microglia and central nervous system (CNS)-infiltrating macrophages, collectively called CNS mononuclear phagocytes (CNS-MPs), play central roles in ...

Isolation and Culture of Bone Marrow-Derived Macrophages from Mice

Macrophages have important effector functions in homeostasis and inflammation. These cells are present in every tissue in the body and have the important ability to change their profile according to the stimuli present in the microenvironment. Cytokines can profoundly affect macrophage physiology, especially IFN-&#947; and interleukin 4, generating M1 and M2 types respectively. Because of the versatility of these cells, the production of a population of bone marrow-derived macrophages can be a basic step in many experimental models of cell biology. The aim of this protocol is to help researchers in the isolation and culture of macrophages derived from bone marrow progenitors. Bone marrow progenitors from pathogen-free C57BL/6 mice are transformed into macrophages upon exposure to macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) that, in this protocol, is obtained from the supernatant of the murine fibroblast lineage L-929. After incubation, mature macrophages are available for use from the 7th to the 10th day. A single animal can be the source of approximately 2 x 107 macrophages. Therefore, it is an ideal protocol for obtaining large amounts of primary macrophages using basic methods of cell culture.

The present protocol describes the isolation and culture of bone marrow-derived macrophages from mice.

Farelerden Kemik İliği Kaynaklı Makrofajların İzolasyonu ve Kültürü

Macrophages have important effector functions in homeostasis and inflammation. These cells are present in every tissue in the body and have the important ...

In vitro Quantitative Imaging Assay for Phagocytosis of Dead Neuroblastoma Cells by iPSC-Macrophages

Microglia orchestrate neuroimmune responses in several neurodegenerative diseases, including Parkinson&#39;s disease and Alzheimer&#39;s disease. Microglia clear up dead and dying neurons through the process of efferocytosis, a specialized form of phagocytosis. The phagocytosis function can be disrupted by environmental or genetic risk factors that affect microglia. This paper presents a rapid and simple in vitro&#160;microscopy protocol for studying microglial efferocytosis in an induced pluripotent stem cell (iPSC) model of microglia, using a human neuroblastoma cell line (SH-SY5Y) labeled with a pH-sensitive dye for the phagocytic cargo. The procedure results in a high yield of dead neuroblastoma cells, which display surface phosphatidylserine, recognized as an &#34;eat-me&#34; signal by phagocytes. The 96-well plate assay is suitable for live-cell time-lapse imaging, or the plate can be successfully fixed prior to further processing and quantified by high-content microscopy. Fixed-cell high-content microscopy enables the assay to be scaled up for screening of small molecule inhibitors or assessing the phagocytic function of genetic variant iPSC lines. While this assay was developed to study phagocytosis of whole dead neuroblastoma cells by iPSC-macrophages, the assay can be easily adapted for other cargoes relevant to neurodegenerative diseases, such as synaptosomes and myelin, and other phagocytic cell types.

Neurodegenerative diseases are associated with dysregulated microglia functions. This article outlines an in vitro assay of phagocytosis of neuroblastoma cells by iPSC-macrophages. Quantitative microscopy readouts are described for both live-cell time-lapse imaging and fixed-cell high-content imaging.

İPSC-Makrofajlar tarafından Ölü Nöroblastom Hücrelerinin Fagositozu için İn vitro Nicel Görüntüleme Tahlili

Microglia orchestrate neuroimmune responses in several neurodegenerative diseases, including Parkinson&#39;s disease and Alzheimer&#39;s disease. ...

Neonatal Kemik İliği Kaynaklı Makrofajların Fagositik Test ile Değerlendirilmesi 

Neonatal Mouse Bone Marrow Isolation and Preparation of Bone Marrow-Derived Macrophages

Various techniques for isolating bone marrow from adult mice have been well established. However, isolating bone marrow from neonatal mice is challenging and time-consuming, yet for some models, it is translationally relevant and necessary. This protocol describes an efficient and straightforward method for preparing bone marrow cells from 7-9-day-old pups. These cells can then be further isolated or differentiated into specific cell types of interest. Macrophages are crucial immune cells that play a major role in inflammation and infection. During development, neonatal macrophages contribute significantly to tissue remodeling. Moreover, the phenotype and functions of neonatal macrophages differ from those of their adult counterparts. This protocol also outlines the differentiation of neonatal macrophages from the isolated bone marrow cells in the presence of L929-conditioned medium. Surface markers for differentiated neonatal macrophages were assessed using flow cytometric analysis. To demonstrate functionality, the phagocytic efficiency was also tested using pH-sensitive dye-conjugated Escherichia coli.

Yazar Spotlight: Erken Yaşam Bağışıklık Tepkilerini İlerletmek için Yenidoğan Farelerinden Kemik İliği Kaynaklı Makrofajları İzole Etmek İçin Tekrarlanabilir Bir Yöntem Geliştirme

This protocol describes a non-enzymatic and straightforward method for isolating 7-9-day-old neonatal mouse bone marrow cells and generating differentiated macrophages using a supernatant of L929 cells as a source of granulocyte colony-stimulating factor (M-CSF). The bone marrow-derived macrophages were further analyzed for surface antigens F4/80, CD206, CD11b, and functional competency.

Yenidoğan Fare Kemik İliği İzolasyonu ve Kemik İliği Kaynaklı Makrofajların Hazırlanması

Various techniques for isolating bone marrow from adult mice have been well established. However, isolating bone marrow from neonatal mice is challenging ...