저자는 우수한 기술 지원 마리 트 Warrer를 감사합니다. 이 작품은 독립적인 연구에 대 한 덴마크 위원회에 의해 지원 되었다 | 자연 과학 [1323-00343B] 고 덴마크 연구 재단 [DNRF120].

1. 세균성 문화의 준비.
최대 1/6의 문화/플라스 크 볼륨 비율 삼각 플라스 크에 <ol><li>성장 모든 문화. 전형적인 실험 설정에서 성장 37.0 ° C에서 문화 및 morpholinepropanesulfonic 산 (MOPS) 최소한의 중간 18 선호 탄소 소스, 예를 들어 0.2% 포도 당, 적어도 10와 보완에 160 rpm에 떨고 RNA 수확을 하기 전에 연속 세대.</li>
	<li>RNA 수확 전에 하루 희석 MOPS 다음 날 원하는 시간에 원하는 OD 436 도달할 것 같은 방법으로 최소한의 매체에서 원하는 스트레인의 능가 해 문화. 계산 수식으로 접종에 사용할 능가 해 문화의 볼륨: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56212/56212eq1.jpg" /> 참고: 여기, OD 새로운 나타냅니다 원하는 OD 436 부 화, 후 V 새로운 상징 희석된 문화의 볼륨, OD 오래 된 능가 해 문화에서 희석의 OD 436 나타냅니다, G 세대 문화, 성장 수를 나타냅니다에서 희석 (t 1)로 산출 될 수 있다 (t 2) 후 일 필요는 시간이 하의 시간: 시간 t 1과 t 2 세대 시간 (분)으로 나눈 값 (분)에서 차이. 샘플링 시간에 정상 성장을 보장 하기 위해, G는 이어야 한다 &#8805; 10; V 오래 된 신선한 매체에 전송 해야-자란 문화의 볼륨을 나타냅니다. 이 방정식은 어떤 래그 단계; 고려 하지 않습니다는 근사 종종 신선한 미디어에서 밖으로 성장된 문화의 희석 후 관찰 하는 현상.
	<ol><li>성장 조건, 실험의 목적에 따라 달라 집니다 하지만 제한 셀 변형 tRNA 수준 (권장) 결과의 재현성을 증가 하 고 성장 샘플링 이전 상태를 꾸준히 문화 19.</li></ol></li></ol> 2. 스파이크 셀의 준비 참고: 대장균 스트레인 MAS1074, tRNA selC는 이소프로필 β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)의 통제를 인코딩 selC 유전자 표현- 유도할 수 있는 발기인 스파이크에 긴장으로 사용 됩니다.
<ol><li>Dilute 능가 해 문화 MAS1074의 OD 436 MOPS에 0.05를 최소한의 미디어 100 µ g/mL 암 피 실린과 0.2% 포도 당으로 보충. 160 rpm에서 떨고 37 ° C에서 문화 성장. 
	: 참고는 대체 참조 긴장의 사용에 대 한 토론.</li>
	<li>에서 OD 436 ~ 0.1, tRNA selC의 표현을 유도를 1mm의 최종 농도에 IPTG을 추가 합니다. OD 436 ~0.5 문화 성장 (3-4 h 성장의) 문화 플라스 크를 얼음 목욕을 이동. RNA의 정화에 대 한 모든 샘플 수확 되었습니다 때까지 얼음에 스파이크에서 세포 배양을 유지.</li>
</ol> 3. 실험 샘플의 수확.
<ol><li>사전 따뜻한 (37 ℃) 한 출장 100 mL 삼각 플라스 크 (또는 유사한) 4 mL 10% (w/v) trichloroacetic 산 (TCA)를 포함 하는 온수 물 욕조에 그것을 배치 하 여 각 샘플. 
	참고: 주의 TCA 분해, 난방 시 염화 수소 및 클로 프롬을 포함 한 독성 및 부식성 가스를 생산 합니다. 물에서이 솔루션은 강한 산 성; 그것은 기지와 심하게 반응 하 고 많은 금속에 부식성 이다. 이 액체를 사용 하는 경우 적절 한 주의가지고 야 한다.</li>
	<li>셀 수확 직전 측정 하 고 기록 문화의 OD 436.</li>
	<li>셀 수확, TCA를 포함 하는 미리 데워 진된 플라스 크를 문화의 4 mL 전송.</li>
	<li>혼합 샘플 5 미 혼합 TCA와 즉시 모든 효소 활동을 억제 하 고 따라서는 tRNAs의 충전 레벨을 유지 플라스 크를 손으로 소용돌이. 
	참고: 여러 샘플 수집 될 경우, 계속 수확된 샘플 얼음에 TCA에서 모든 샘플이 수집 될 때까지.</li>
</ol> 4. 스파이크 셀의 추가 참고: 스파이크 셀의 준비 단계 2에서 설명.
<ol><li>때 모든 RNA 준비에 대 한 샘플 수집 되어, 각 샘플에 5% 스파이크 셀 (외경 기준) 추가. 
	참고: 필요한 스파이크에 세포 배양의 수식으로 계산 됩니다: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56212/56212eq2.jpg" /> V 스파이크 스파이크에 세포 배양 필요의 볼륨을 나타냅니다 어디 V exp 볼륨을 나타냅니다 (TCA) 없이 수확된 실험적인 세포 배양의 OD 특급 TCA에 수확의 시간에서 실험 세포 배양의 OD 436을 나타냅니다. OD 스파이크 스파이크에 세포 배양의 OD 436 나타냅니다. 여러 샘플에서 다른 ODs 수확 하는 경우 스파이크 셀 추가 볼륨 각 샘플에 대 한 위의 공식에 따라 조정 되어야 합니다.</li>
	<li>관심, RNA 종 스파이크 셀에서 기여를 계량만 4 mL TCA와 스파이크 셀 4 mL를 혼합 하 여 스파이크 셀을 포함 하는 샘플을 준비 합니다. 이 샘플에서 준비 하는 경우와 동일한 방식으로 다른 샘플에서 RNA.</li>
	<li>필요에 따라 다른 플라스 크 셀, 스파이크 없이 실험은 샘플만 포함 하 고 척도 tRNA에 실험 샘플의 기여를 포함 selC 수준, 에 tRNA selC의 내 생 수준 대장균 K-12는 사소 하 게 낮은.</li>
</ol> 5. RNA의 준비 참고: 여기에 설명 된이 RNA 준비 프로토콜은 기본적으로 Varshney 그 외 여러분에 의해 설명 1; 동안을 피하기 위해 deacylation aminoacylated tRNAs의 정화 그것은 산 성 pH에서 고 정화의 과정을 통해 0 ° C에서 샘플을 유지 하는 것이 중요. 깨끗 한 무 균 튜브/플라스 크를 사용 하 여 샘플 및 솔루션, 그리고 물을 초순 (18.2 ㏁ 저항력)와 모든 솔루션을 준비.
<li>부 어 8 mL 얼음 냉장 원심 분리기 튜브에 각 샘플의 <ol>. 샘플 4 ° C. 완전히 제거 상쾌한에 9500 x g에서 10 분 원심 및 0.3 mL 차가운 0.3 M 아세트산 나트륨, pH 4.5, 10 mM EDTA에에서 resuspend.</li>
	<li>감기 1.5 mL microcentrifuge 관을 각 샘플을 전송 하 고 동일한 버퍼 equilibrated 0.3 mL 페 놀을 추가. 
	참고: 주의 페 놀 유독 가스를 생성 하 고 피부에 매우 부식성입니다.</li>
	<li>소용돌이 각 샘플 10 x 15에 대 한 최소 1 분 각 소용돌이 사이 s. Vortexing 사이 0에서 샘플을 계속 ° C. 샘플 감기 유지 되도록 자주 일시 중지를 사용 하 여.</li>
	<li>20000 x g 4에에 15 분 동안 원심 분리기 샘플 ° C. 전송 새로운 1.5 mL microcentrifuge 하 물 단계 (상위 단계) 튜브합니다. 이전과 0.3 mL 찬 페 놀 및 소용돌이 4 x 15 s 추가.</li>
	<li>20000 x g 4에서 10 분 원심 분리기 ° 2.5 배 96% 에탄올 (~ 750 µ L)의 볼륨을 포함 C. 전송 새, 차가운 1.5 mL microcentrifuge 하 물 단계 튜브 합니다. 1 시간 또는 밤새-80-20 ° C에서에 대 한 튜브를 배양 하 여 RNA를 침전 ° c.</li>
	<li>20000 x g 4에에 30 분 동안 원심 분리기 샘플 ° c.는 상쾌한 삭제 하 고 신중 하 게 RNA 펠 렛을 방해 하지 않고 1 mL 찬 70% 에탄올을 추가 합니다. 부드럽게 에탄올 튜브의 내부를 세척 한 번 반전. 
	참고: 펠 릿이이 단계에서 볼 힘들 수 있습니다.</li>
	<li>20000 x g 4에서 10 분 원심 분리기 ° C. 완전히는 상쾌한을 제거 하 고 아무 에탄올 왼쪽 때까지 펠 릿을 건조. 20 µ L 찬 10 나트륨 아세테이트 pH 4.5에서 1 mM EDTA에에서 적극적으로 vortexing에 의해 펠 릿 resuspend. 
	참고:-건조 하지 마십시오 펠 릿 resuspend 어렵다 될 것 이다.</li>
	<li>260에서 흡 광도 측정 하 여 필요에 따라 RNA의 농도 평가 nm.</li>
	<li>필요에 따라 agarose 젤 전기 이동 법 20 순화 된 RNA의 품질 평가.</li>
	<li>저장소 샘플-80에서 ° c. 
	참고: 프로토콜 일시 중지할 수 있습니다 여기.</li>
</ol> 6. 화학적으로 deacylated 컨트롤 샘플의 준비 참고: aminoacylated의 밴드를 구별 하는 북에 deacylated 대응에서 tRNA 오 점, 한 화학적 deacylated aliquot는 알칼리 처리에 의해 준비. 대부분의 목적에 대 한 각 북부 오 점에 대 한 deacylate 단일 샘플에 충분 하다.
얼음에 <ol><li>thaw RNA 샘플입니다. 새로운 튜브에 RNA 샘플의 4 µ L 약 수를 전송 합니다. 46 µ L Tris HCl pH 9.0을 추가 합니다. 2 h 37 ° c.에 대 한 품 어</li>
	<li>PH 4.5에서 0.3 M 나트륨 아세테이트의 15 µ L을 추가 하 고 그 후 96% 에탄올의 125 µ L을 추가. 1 헤에-20 ° C에서 RNA 침전</li>
	<li>20000 x g 4에에 30 분 동안 원심 분리기 ° C. 완전히 상쾌한을 제거 하 고 4 µ L 찬 10 m m 나트륨 아세테이트 pH 4.5 및 1 mM EDTA에 resuspend. 
	참고: 프로토콜 일시 중지할 수 있습니다 여기, 샘플-80에 저장 된 경우 ° c.</li>
</ol> 7. 젤 전기 이동 법 그리고 북부 blotting <ol><li>믹스 4 µ L 샘플 (치료 또는 화학적 deacylated) 6 µ L 로드 버퍼 (0.1 M 나트륨 아세테이트 (pH 5.0), 8 M 요소, 0.05 %bromophenol 파랑 및 0.05% 자일 렌 cyanol). 
	참고: 기억 스파이크에 셀만,를 포함 하는 샘플을 포함 하는 화학적 deacylated 샘플 (및 스파이크에 셀을 하나 준비 하는 경우 없이 샘플).</li>
	<li>에 0.4 m m 두께 6.5 %polyacrylamide 젤 (19:1 acrylam-ide:bisacrylamide) 8 M 0.1 M 나트륨 아세테이트 버퍼 (pH 5.0)에서 요소를 포함 하는 샘플을 로드 합니다. TRNA의 적절 한 분리를 위한 60 cm 긴 젤 사용.</li>
	<li>에서 4 ° C에서 10 V/cm 젤 전기 이동 법으로 분리 되는 RNA 블루 bromophenol까지 젤 (~ 20 h)의 하단에 도달.</li>
	<li>자일 렌 cyanol 염료에서 지역 bromophenol 파랑 쪽으로 내려 20 cm 염료 blotting 사용 됩니다 (두 염료 사이의 거리는 25-30 cm 이어야 한다). 젤은 그들 중 하나에 남아 있다 그래야 신중 하 게 두 개의 유리 접시를 구분 합니다. 필터 종이의 얇은 조각 잘라 원하는 더 럽 히 면의 크기 이며 젤 blotting에 사용 될 부분 위에 배치. 필터 종이 적용 되지 않는 젤 부분의 차단 및 삭제. 필터 종이 사용 하 여 유리 접시에서 젤 조각을 조심 스럽게 들어올립니다. 
	참고: 큰 젤은 매우 깨지기 쉬운 그래서 관심을가지고 취급.</li>
	<li>충전 된 나일론 막 (예: Hybond N + 막) 젤 위에 놓이고 그것은 20 V 전송 버퍼 2 mM EDTA 40mm 트리 아세테이트 (pH 8.1)을 사용 하 여 90 분 electroblotted.</li>
	자외선을 사용 하 여 막에 <li>Crosslink RNA (0.12 J/c m 2). 
	참고: 막 실내 온도에 저장 될 수 있습니다 및 프로토콜 여기 일시 중지 될 수 있습니다.</li>
</ol> 8. 설계 및 검증의 프로브 참고: 설계 및 북부 오 점 프로브의 검증은 신뢰할 수 있는 결과 가져오고 다른 RNA 종족과 원치 않는 간 교 잡 방지 하는 중요 한 주의.
<ol><li>사용 조사로 짧은 합성 oligonucleotides. 그것은 관심의 tRNA의 시퀀스의 가장 독특한 부분에 보완-이것은 종종 anticodon 루프 방식에서 프로브 시퀀스 디자인. 
	참고: 다양 한 유기 체에서 예측된 tRNA 시퀀스 목록에서에서 찾을 수 있습니다 게놈 tRNA 데이터베이스 (GtRNAdb) 21.</li>
	<li>조정 한 예측를 시퀀스의 길이 55-65 ° c.의 온도 용융</li>
	<li>폭발 (기본적인 현지 줄 맞춤 검색 도구) 선택한 순서 22에 설명 된 대로 선택한 tRNA에는 확인 하는 실험에 사용 하는 세균성 긴장의 게놈 순서에 대 한 시퀀스. 
	주: 표 1 대장균 K12의 여러 다른 tRNAs에 대 한 제안된 프로브 시퀀스를 나열합니다. 프로브는 특정 관심의 tRNA에 대 한, 두 밴드는 북부 오 점 (충전 및 충전 tRNA)에 표시 하 고 단 하나의 밴드 deacylated 샘플 (충전된 tRNA)와 차선에 표시 됩니다. 두 개 이상의 밴드를 사용할 수 있는지 또는 경우 추가 유효성 검사 프로브 특이성의 토론을 참조 하십시오.</li>
</ol> 9. 북부 오 점 교 잡 참고: 다음 단계에서 막은 순차적으로 때 교배 프로브 프로브 특정 참조를 포함 하 여 원하는 특정 tRNAs에 무료 tRNA selC.
<ol><li>막 교 잡 튜브에 놓고 6 mL 교 잡 솔루션 추가 (0.9 M NaCl, 0.05 M NaH 2 포 4 (pH 7.7), 5 mM EDTA, 0.5% (w/v) SDS, 100 mg/mL의 전단 및 청 어 정자 DNA와 5를 변성 x Denhardt &#39; s 솔루션 (100 x Denhardt &#39; s 솔루션 2% 소 혈 청 알 부 민, 2% polyvinylpyrrolidone 40, 및 2% = Ficoll)).</li>
	<li>미리 1 h 42 ° C. 추가 30 pmol 방사성 올리고 DNA 프로브 5 회전에 대 한 버퍼에 막 교배 &#39;-엔드-32 P (Sambrook 그 외 여러분에 의해 설명 된 대로 준비와 함께 표시 23) 참고: 주의 32 P에서에서 고 에너지 베타 방출 상당한 피부와 눈 복용량 위험을 제시할 수 있습니다. 32 P. 방사성 폐기물을 사용 하 여 폐기 해야 합니다의 적절 한 제도적 안전 프로토콜에 따라 때 적절 한 주의가지고 야 한다.</li>
	<li>42에서 막 하룻밤 회전 프로브를 품 어 ° C. 제거 일회용 10 mL 피 펫을 사용 하 여 프로브. 
	참고: 냉동 실에 저장 하는 경우 프로브 다시 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>교 잡 튜브에 씻어 0.3 M NaCl, 30mm 나트륨 시트르산, 실 온에서 0.1% (w/v) SDS의 50 mL에 곧 막. 
	참고:이 첫 번째 워시 훨씬 언바운드 프로브를 포함 하 고 높은 방사성으로 처리 되어야 합니다.</li>
	<li>반복 9.4 번 단계 다음 평평한 플라스틱 컨테이너 또는 트레이 뚜껑을 포함 한 막 이동. 세척 솔루션 (0.3 M NaCl, 30mm 나트륨 시트르산, 0.1% (w/v) SDS) 막 고 실 온에서 30 분 동안 품 어.</li>
	<li>세척 솔루션을 변경 하 고 만족 신호 대 잡음 비 (자주 세척 솔루션의 3-4 변경) 얻은 되었습니다 때까지 세척을 계속. 가 거-뮐러 관을 사용 하 여 막의 빈 영역에서 방사선을 측정 하 여 잡음 신호 비율을 변경 하는 방법을 감지 하 여 프로브는 tRNA를 특히 때 교배는 어디 지역에 그것을 비교.</li>
	<li>노출, 후 막에서 프로브를 수 있을 것 (중요 한) 막 건조 하지 않습니다 밖으로 스트립 절차 전에 확인 합니다. 막 얇은 비닐 또는 플라스틱을 사용 하 여 단단히 포장 하 고 봉인 테이프 또는 용접으로 밀폐 되도록 포장에 놓습니다. Phosphorimaging 화면에 봉인된 막 장소. 
	참고: phosphorimaging 화면에 필요한 노출 시간에 따라 결정 됩니다 프로브, 특정 활동 RNA의 양을 조사 for, 그리고 프로브, 그리고 수의 교 잡 효율 크게; 다 몇 일 분. 경험으로,가 거-뮐러 관 막에 방사선의 강도 필요한 노출 시간에 대 한 좋은 표시를 제공 합니다. 신뢰할 수 있는 정량화, 화면 설쳐 하지 것이 중요 하다.</li>
	<li>레이저 스캐너를 사용 하 여 phosphorimaging 화면을 스캔 하 고 파일에 저장 &#34;.gel &#34; 형식. 
	참고: 높은 신호 대 잡음 비는 신뢰할 수 있는 정량화 필요 합니다. 두 밴드; 초래 한다는 tRNA에 대 한 한 포함 aminoacylated tRNA (느린 마이그레이션)와 1 개의 포함 deacylated tRNA (빠른 마이그레이션). 그림 2를 참조 하십시오.</li>
</ol> 10. 멤브레인 스트립 참고: 이전 프로브 막 벗 겨 서 먼저 제거 해야 합니다 전에 막 다른 tRNA에 대 한 탐색할 수 있습니다,.
<ol><li>열 충분히 스트립 버퍼 (15 m m NaCl, 1.5 m m 나트륨 구 연산 염, 0.1% (w/v) SDS) 커버 하는 막 고 막 위에 부 어. 실 온에서 15 분 동안 품 어.</li>
	<li>반복 단계 10.1 아무 방사선까지가 거-뮐러 관으로 검출 될 수 있다; 막 다시 교배 섹션 9에 설명 된 단계를 따라 될 수 있습니다.</li>
</ol> 11. TRNA를 측정 하 고 충전 레벨 <ol><li>부하는 영상으로.gel 파일 소프트웨어 (재료의 표 참조). 신호 수 있는 하지도, 그림 3A에서와 같이 같은 방법으로 그것은 레인의 너비의 대부분에 걸쳐 있지만 밴드의 가장자리는 제외 됩니다 샘플 레인의 각에 따라 수직 라인을 그릴.</li>
	<li>시각화를 클릭 하 여 각 차선에서 계산 &#34; 분석 &#34;-&#62; &#34; 그래프 만들기 &#34;. 그림 3B와 같이 각 차선에서는 충전 및 충전된 tRNA를 나타내는 두 개의 봉우리를 수동으로 정의.</li>
	<li>클릭 하 여 각 피크에서 카운트를 얻을 &#34; 분석 &#34;-&#62; &#34; 지역 보고서 &#34;, 두 봉우리의 각 영역을 기록.</li>
	<li>오 점 tRNA selC와 관심의 하나 이상의 tRNA 조사 되었습니다 때 tRNA selC 관심의 tRNA의 수준을 정상화.
	<ol><li>각 레인에 스파이크 셀에서 발생 하는 tRNA의 비율을 계산 하 고 방정식을 사용 하 여 그 차선에 총 신호에서 뺍니다: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56212/56212eq3.jpg" /> 참고: 여기에서, TRNA 샘플 = 원하는 tRNA;에 대 한 조사는 막의 단일 차선에서 얻은 신호 샘플 selC = tRNA selC;에 대 한 조사 같은 막의 동일한 차선에서 얻은 신호 Ref tRNA 원하는 tRNA;에 대 한 조사 같은 막의 스파이크에만 셀 RNA를 포함 하는 차선에서 얻은 신호를 = Ref selC tRNA selC에 대 한 조사 같은 막의 스파이크에만 셀 RNA를 포함 하는 차선에서 얻은 신호를 =.</li>
		<li>정상화, 동일한 차선에서 tRNA selC 신호에 나누어 각 차선에서 교정된 tRNA 값. 
		참고: 샘플된 셀에서 tRNA selC 신호에 기여는 무시할 수 (참조 하십시오 그림 2 차선 표시 &#34;-selC &#34;).</li>
	</ol></li> <li>계산 하는 tRNA의 두 봉우리에서 신호의 합으로 청구 tRNA를 나타내는 피크 신호를 분할 하 여 각 레인에 대 한 레벨을 충전 (충전 + 충전).</li></ol>

<ol>
	<li>Varshney, U., Lee, C. -. P., RajBhandary, U. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+analysis+of+aminoacylation+levels+of+tRNAs+in+vivo.+Application+to+studying+recognition+of+Escherichia+coli+initiator+tRNA+mutants+by+glutaminyl-tRNA+synthetase.">Direct analysis of aminoacylation levels of tRNAs in vivo. Application to studying recognition of Escherichia coli initiator tRNA mutants by glutaminyl-tRNA synthetase.</a> J Biol Chem. 266 (36), 24712-24718 (1991).</li><li>Sorensen, M. 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Implications for protein synthesis and translational fidelity during amino acid starvation in Escherichia coli.</a> J Mol Biol. 236 (2), 441-454 (1994).</li><li>Tian, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Curtailing+of+the+Stringent+Response+by+Toxin-Antitoxin+Module-Encoded+mRNases.">Rapid Curtailing of the Stringent Response by Toxin-Antitoxin Module-Encoded mRNases.</a> J Bacteriol. 198 (14), 1918-1926 (2016).</li></ol>

저자는 공개 없다.

이 프로토콜 특정 대장균 의 충전 레벨을 동시에 측정 하는 방법에 설명 합니다 tRNAs 다른 샘플에 tRNAs의 상대적 수준을 비교 하 고. 1) 2)는 다른 샘플에서 상대 tRNA 수준을 안정적으로 비교 될 수 있다, 같은 방식으로 tRNA 수량을 정상화 하 고 3) sp 셀룰러 tRNA 충전 레벨 유지 되는 방식으로 샘플을 처리 하는 프로토콜의 중요 한 포인트는 관심의 tRNAs에 대 한 선택 된 프로브 ecificity. 이러한 포인트는 아래 별도로 해결 됩니다.
tRNA 정화
tRNAs는 그들의 휴대 전화 충전 레벨을 유지 하기 위해 최적화 된 부드러운 방식으로 대장균 에서 정화. 그것은 우리의 경험이이 프로토콜 주로 150 보다 짧은 RNAs를 추출 하는 nt, 따라서 tRNA 구성 순화 된 RNA의 큰 분수. 이러한 이유로, 그것은 대장균에서 총 RNA 정화이 프로토콜을 사용 하 여 권장 하지 않습니다. 여기에 제시 된 프로토콜 탐지 및 어떤 추가 적응 없이 작은 RNA (요 스르나.) 같은 다른 RNAs의 정량화에 적합 해야 합니다. 짧은 RNA 시퀀스에 대 한 풍요롭게 하는 RNA 추출 프로토콜 때문에 그것은 또한 찾아야한다 사용을 조사 요 스르나. 낮은 표현 하는 경우에.
스파이크에 셀에 의해 정규화
그것은 RNA 샘플 샘플 변화를 해결 하기 위해서는 모든 샘플에서 세포 당 동일한 평균 수에 존재 하는 대 본의 수준에 tRNA 수준을 정상화 하는 데 필요한 다른 샘플에서는 tRNA의 레벨을 비교 하 복구 및 젤 로드 합니다. 이 목적을 위해 우리는 RNA 정화 전에 드문 tRNAselC overexpress 참조 셀의 5%와 샘플 스파이크. 스파이크에 방법이 바람직합니다 참조로 생 RNA를 사용 하 여 조건 어디 아무 생 RNAs 동일한 세포 농도에 확실 하 게 알려져 있습니다에 걸쳐 tRNA 레벨의 비교를 허용 하기 때문에. 스파이크도 대장균 세포를 사용 하 여 단점은 그 5% 있다 여분의 대장균 RNA 모든 실험 샘플에 추가 됩니다 그것은 관심의 RNA의 신호에 기여. 이 바이어스만 스파이크에 셀 모든 북부 오 점를 포함 하 고 단계 11.4.1에에서 설명 된 대로 RNA 값을 수정 하는 샘플을 포함 하 여 여 차지입니다. SelC 야생 타입 셀에서은 tRNA의 식은 그것이 다른 tRNAs ( 그림 2참조)에 비해 낮은 정량화에 상당한 차이 확인 하지 않습니다 하 고 따라서 무시 될 수 있습니다. 그러나, 어디 selC 높은 사본 플라스 미드에는 T7 발기인에 의해 표현 된다, 참조 스트레인 MAS1074, 우리 추정 적어도 빌드하기 더 tRNAselC 1mm IPTG의 생산은 wildtype e.에 의해 생산 보다 대장균 K-12 어떤 조건 하에서. MAS1074 전체 IPTG 유도의 2 세대 이후 성장 중단. 그 시점에서, tRNAselC 의 유도 문화-문화 차이 작은, 그리고 스파이크 셀 단일 실험에 대 한 모든 aliquots로이 프로토콜에 대 한 관심사 아닙니다 MAS1074의 동일한 유도 문화에서 가져옵니다. MAS1074 하는 대신, 그 RNA의 교 잡 프로브 cross-react 하지 것 이다 유기 체에서 세포 스파이크 셀으로 사용할 수 있습니다. Sulfolobus solfataricus 셀 성공적으로 대장균 tRNA4실험으로 스파이크에 사용 되었습니다. 그러나, 대장균 스파이크 셀 높습니다 실험 세포의 세포 세포의 용 해의 정도 보다 정확 하 게 반영 여부 S. solfataricus 로 동일한 효율성으로 lyses 불확실은 대장균. 또한, 성장 하는 S. solfataricus ~ 16 h의 세대 시간 85 ° C에서 그들이 성장 더 지루한입니다.
선택한 tRNAs의 특이성을 보장
TRNA를 성공적으로 되었습니다 aminoacylated와 deacylated 정화 두 밴드 북부 막에 감지 한다. 두 밴드 사이의 거리 조사, 특정 tRNA에 따라 다를 것 이며 크기, 극 지 속성 및 특정 아미노산 특정 tRNA5 바인딩할 때 발생 하는 구조에 있는 다름의 결합 된 결과 . 예를 들어는 aminoacylated에서 deacylated 사이의 거리 tRNA 큽니다 tRNAargVYZQ 에 대 한 보다 tRNAgltTUVW, 그림 2에서 볼 수 있듯이. 여기 RNA를 분리 하는 데 사용 하는 젤의 큰 크기 때문에 해상도 높은 만큼 서로 다른 tRNAs 길이, 순서에 그들의 차이 대부분을 구별 하는 것 뿐만 아니라 충전에서 충전된 tRNA를 구별 하 구성, 고 수정 패턴입니다. 심지어 isoaccepting tRNAs tRNAs2수락 하는 신에 대 한 같이 구분할 수 있습니다. 그러나, 참고는이 연구에서 불가능 했다 순서에 차이 tRNAleuT에서 tRNAleuPQV 를 구별 하는 것만 한 G T 대체를 이다.
두 개 이상의 밴드 북부 막에 나타나는 경우 다른 RNAs 가진 조사 cross-reaction의 결과 수 있습니다. 온도 증가 시켜 세척 단계 (단계 9.5)의 엄중을 증가 일반적으로 이것을 해결할 수 있다. 55 ° C에서 30 분을 세척 하는 것은 일반적으로 충분 합니다. 워시 엄중을 증가 간 교 잡 제거 하지 않습니다, 경우 솔루션은 tRNA 시퀀스의 다른 (수시로 부분적으로 겹치는) 부분을 보완 하는 새로운 프로브 디자인 될 수 있습니다. 추가 밴드 막의 부족 한 스트립 결과로 이전 조사에서 수행 될 수 있습니다. 이 방지 하려면 다시 검색 하기 전에 막 노출 스트립 컨트롤 할. 밴드 제어 스캔에 표시 하는 경우는 막 추가 제거 할 수 있습니다. 일반적으로 다시 조사를 막 8-10 배 이상 가능 하지만 여러 프로브 후 완전히 제거 하기 어려운 될 수 있습니다. 이 경우 막 32P 부패 한다 빨리로 다시 검색 하기 전에 몇 달 동안 저장할 수 있습니다.
프로브 특이성의 더 확인 한 북부를 수행 하 여 얻을 수 있습니다 오 셀 조건 집합에서 수확 어디 관심의 사본을 예측 가능한 방식으로 영향을 받을 것으로 예상 된다. 예를 들어 유도할 수 있는 식 플라스 미드, 또는 동족 아미노산에 대 한 아미노산 기아에서 tRNA의 한다 결과 향상 된 상대 식 수준 또는 더 낮은 충전 수준에 각각, 관심의 tRNA의.

다음, 우리는 특정 tRNAs 측정에 대 한 방법을 제시 하 고 북부 blotting에 의해 레벨을 측정 하 고 그들의 충전. 방법은 먼저 Varshney 그 외 여러분 에 의해 개발 된 기술에 기반 1. trichloroacetic 산 (TCA)으로 세포를 수확 하 고 RNA 정화에 걸쳐 0 ° C에서 샘플을 유지는 tRNA는 아미노산 사이의 에스테 르 결합은 보존된2,,34. Aminoacylated tRNAs 구별 될 수 있다 그들의 nonacylated에서 젤 전기 이동 법 그리고 북부 blotting에 의해 때문에 aminoacylated의 감소 이동성에 기인한 covalently 바인딩된 아미노산5젤에 tRNA. 또한, 우리는 스파이크 셀 거의 사용된 tRNAselC 4overexpressing의 추가 의해 tRNA 수량 정상화에 대 한 프로토콜을 제시.
tRNAs 세균성 세포 및 번역 기계에의 한 절대적으로 중요 한 부분에 있는 가장 풍부한 분자의 일부입니다. tRNAs는 아미노산 바인딩 그리고 번역 리보솜에 그들을 전송. (Aminoacylation 또는 충전) tRNAs에 아미노산의 바인딩 aminoacyl tRNA synthetases에 의해 촉진 된다. Underrepresentation는 동계어의 청구 주어진된 메신저 RNA (mRNA) 코 돈에 tRNA 근처 동계어 tRNA는 가능성을 증가 하기 때문에 다른 충전된 tRNAs의 관계 되는 풍부는 단백질 합성의 품질 보장을 위한 중요 한 잘못 리보솜6에 성장 polypeptide 사슬의 아미노산을 제공 합니다. TRNA 위탁된의 중요성;는 tRNA의 충전 레벨에 심각한 드롭 대장균 세포의 광범위 한 응답에 반영 됩니다. 엄격한 응답입니다. 엄격한 응답 동안 tRNAs 리보솜 RNAs, 대부분 mRNAs의 합성은 아미노산 생 합성 및 스트레스 생존와 관련 된 특정 mRNAs의 녹음 방송에 찬성 하 여 하향 조정 하 고 세포의 성장 율은 극적으로 낮 췄 다7 . 또한, 우리와 다른 사람에 의해 최근 작품 대장균 적극적으로 대부분 tRNA 레벨의 조정 될 수 있습니다 제안 번역4,8을 제한 하는 스트레스에 대 한 응답에서의 tRNA의 저하를 보이고 있다 이러한 스트레스와 대처에 대 한 중요 한. 따라서, tRNA 나타났는데 및 충전 레벨의 신뢰할 수 있는 측정 세균성 긴장 응답을 완전히 이해 하기 위한 중요 한 도구가 됩니다.
대장균 은 일반적으로 재조합 단백질을 표현 하는 데 사용 됩니다 그리고 차이 codon 사용법에서 종 사이, 차선 식 자주 직면 하는 문제9. 이 재조합 mRNA10번역 하는 데 필요한 추가 tRNAs의 표현에 의해 피할 수 있다. 이러한 긴장에 레벨 충전 하는 tRNA의 측정 문제 해결 노력을 안내 하 고 단백질 식이 최적화 하는 데 도움이 수 있습니다.
이 메서드는 또한 "mischarging";의 검색을 수 있습니다. 비 동계어 아미노산 tRNA 분자 aminoacylated 다른 아미노산에 의해 Aminoacylation polyacrylamide 젤1,11을 통해 약간 다른 속도으로 마이그레이션할 tRNA를 발생할 수 있습니다. 경우에 따라 방법 또한 달리 동일한 tRNAs3에 다른 수정 패턴을 구별 하 사용할 수 있습니다.
다른 레벨을 충전 하는 tRNA의 조사는 산화를 periodate에 대 한 생 화 확 적인 절차를 설립. 메서드는 tRNA에서 보호 하는 aminoacylated periodate 산화 및 충전된 tRNA는 관찰에 의존 합니다. 후에 수확된 하는 RNA의 충전 수준을 추정 하는 데 사용은 tRNA의 재충전 산화 치료 periodate. 그러나, 여러 tRNAs 충전 표시 되었습니다 일부 부정확12제공 하는 치료에 의해 영향을 받을 것. 방법 제시 여기 측정값 순화 된 RNA에서 직접 충전, 따라서 화학 또는 효소 반응에서 어떤 편견을 제외. 이 방법의 한 가지 한계는 그 하나만 tRNA 종 그것은 어렵고 다소 많은 tRNAs에 데이터를 수집 하는 힘이 드는 비록 동일한 북부 오 점 제거 하 고 여러 tRNAs에 대 한 reprobed 될 수 있으므로 한 번에 검색.
서로 게 샘플을 정상화의 신뢰할 수 있는 방법은 목표 다른 샘플에서 분자의 상대적 수준을 비교 하는 연구에 생명 이다. 여기 우리는 RNA 어디 드문 tRNAselC overexpressing 대장균 세포의 작은 약 수는으로 추가 스파이크에 RNA 정화 전에 모든 실험 샘플에 대 한 표준화 절차를 소개 합니다. 이 방법은 tRNAs 검사 하는 경우에 뿐만 아니라 그러나 RNA의 어떤 종의 상대 정량화에 대 한 모든 샘플에서 동일한 세포 농도에 현재 아무 생 RNA 수 신뢰할 수 있는 그런 실험적인 체제 때 유용 하다. 예를 들어 다른 사이 다른 RNA의 상대적 양을 비교 하는 내 생 참조 샘플13로 "가사" RNA 같은 리보솜 RNA의 수준 자주 사용. 그러나 이것은 거의 사용 경우 참조 RNA의 세포 농도 샘플, 사이 차이 수 ribosomal RNA의 경우 샘플링 스트레스 응답15,,1617 또는 도중 발생 하는 경우 고정 단계17로 항목입니다. 스파이크 셀 이전에 RNA 정화 실험 샘플의 추가 샘플링 설치의 독립적인 정규화의 견고 하 고 정확한 방법을 제공합니다. 표준화의 또 다른 방법은 RNA 정화 후 하나 이상의 스파이크에 RNAs 실험 샘플의 추가 이다. 그러나,이 방법은 견본 사이의 RNA 복구에 차이 대 한 고려 하지 않습니다.
대장균 세포를 사용 하 여 참조 RNA 스파이크 셀 ( 그림 1참조)으로 대장균 에 대 한 실험 결과 단점이 그 overexpress 또한 외 인 대장균 의 작은 금액의 총 RNA에는 샘플입니다. 우리는이 추가 대 한 실험 샘플 (참조 그림 2, 차선 "selC" 라는 오 점 북)와 병렬로 스파이크에만 셀을 포함 하는 샘플을 분석 하 여 수정 합니다. 제시 하는 프로토콜은 대장균 K-12 위해 개발 하지만 대부분 세균성 종에 적용 될 것입니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Merck</td>
			<td>57-13-6</td>
			<td>Purity &#62;99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyacrylamide</td>
			<td>Serva</td>
			<td>79-06-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis (N,N&#39;-Methylene-bis-acrylamide)</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>161-0201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloroacetic acid (TCA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>76-03-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>108-95-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Citrate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Herring Sperm DNA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>100403-24-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polivinylpyrrolidone</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P32 &#947;ATP</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA oligos (probes)</td>
			<td>TAG Copenhagen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybond N+ membrane</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>RPN203B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crosslinker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroblotter</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Typhoon FLA 7000 Scanner</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28955809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydridization oven</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geiger-M&#252;ller tube</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphor imager screen</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization tube</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture Flasks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml microcentrifuge tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 ml centrifuge tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageQuant</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of the abundance and charging levels of transfer rnas in escherichia coli

이동 RNA (tRNA) 변환 기계 어떤 유기 체에서의 필수적인 부분입니다. tRNAs 바인딩할 하 고 번역 리보솜에 아미노산을 전송. 다른 tRNAs의 상대 수준 및 aminoacylated의 비율 충전 수준으로 알려진 총 tRNA에 tRNA는 정확성과 번역의 속도 결정에 중요 한 요소. 따라서, 풍요로 움과 tRNAs의 충전 레벨 측정 단백질 합성, 다양 한 스트레스 조건 예를 공부 하는 때에 중요 한 변수가 있다. 여기, 우리가 수확 하는 tRNA와 직접 상대 풍요로 움과 대장균에 특정 tRNA의 절대 충전 레벨을 측정 하는 방법을 설명 합니다. tRNA는 tRNA의 아미노산 사이 정한 채권 유지 되는 그런 방법으로 수확 이다. RNA는 다음 젤 전기 이동 법 그리고 북부 더럽혀, 충전 및 충전 tRNAs의 분리에는 결과를 받게 됩니다. 다른 샘플에서 특정 tRNAs 수준의 스파이크 셀 정규화의 추가 때문에 비교할 수 있습니다. RNA 정화, 전에 우리는 각 샘플에 드문 tRNAselC 당신과 대장균 세포의 5%를 추가 합니다. TRNA 종의 샘플에 관심의 금액은 다음 tRNAselC 동일한 샘플의 양을 정규화 됩니다. 스파이크에 RNA 정화 이전 셀의 추가 또한 샘플 사이 세포 세포의 용 해 효율 차이 차지 하는 순화 된 스파이크에 RNAs의 추가 이점이 있다.

절차를 사용 하 여 풍부 하 고 전과 아미노산 기아 중 레벨 3 tRNAs의 대장균 K-12에 측정 되었다 충전 여기, 설명 합니다.
아르기닌 주별 NF9154 스트레인 (세 레이 그의 아 티 mtl supE44) MOPS 최소한의 매체와 0.4% 글리세롤, 50 µ g/mL 트레오닌, 신, 아르기닌, 37 ° C에서 흔들어에서 5 µ g/mL 히스티딘 보충에 10 세대 이상 성장 했다 160 rpm을. 아르기닌 기아 문화와 신선한 MOPS 매체 아르기닌 하지 않고 위의 물의 resuspension의 여과 의해 도입 되었다. 아르기닌 기아 중 단백질 합성은 강하게 감소 하지만 아르기닌 기존 단백질의 회전율에 의해 발표를 사용 하 여 낮은 수준에서 계속 됩니다. 샘플은 시간에 수확 했다 그림 4에 표시 된 포인트. TRNAselC, overexpressing 셀 스파이크에 MAS1074의 5%에서 볼 수 있듯이 각 샘플에 추가 되었습니다 후 모든 샘플 TCA에 수확 했다, 그림 1. RNA 샘플에서 정화, 전기 이동 법으로 분리 되었고 프로토콜에 설명 된 대로 막에 얼룩이. 그림 2에서 보듯이 막 tRNAargVYZQ, tRNAgltTUVW, tRNAhisR, 및 tRNAselC, 조사 했다. 각 차선에서 방사선 신호는 각 그림 3, 그림 및 교정 섹션 11에 설명 된 대로 정규화 된 4 개의 프로브에 대 한 정량 했다. 결과 그림 4에 표시 됩니다. 그림 4A 모든 테스트 tRNA 종의 수준 아미노산 기아, 최근 보고 된4중 급속 하 게 감소 보여줍니다. 그림 4B 을 예상 대로 수준 작동을 충전 하는 tRNA를 보여줍니다: 아르기닌-수락 tRNA의 청구 일부 상품 빠르게 성장 매체에서 아르기닌의 제거에 따라 다른 tRNAs의 충전 레벨에 따라 약간 증가 하는 반면 기아 tRNAs 축적 그들의 속도 리보솜에서 decharging의 단백질 합성4기판의 부족 때 충전 때문에. 또한 기아 기간으로 충전된 tRNA 분수 감소 tRNA 풀 (그림 4A)에서 나머지 tRNAs의 decharging의 큰 비율에 있는 결과의 대다수의 저하로 인해 약 사전 기아 수준 리보솜입니다. TRNAargVYZQ 의 충전된 분수; 적어도 두 가지 이유로 증가 하는 반면, 1) 엄격한 응답 활성화 의미 mRNA, tRNAarg, 청구 하지 번역에 대 한 제한 요인이 된다 2)arg 는 tRNA의 총 수영장 감소 (그림 4A) 그래서 총 tRNA의 큰 분수 arg 아르기닌의 동일한 작은 금액으로 충전 하실 수 있습니다. 이 실험에서는 tRNA 풍요로 움과 tRNA 충전 레벨의 동시 측정 셀 내부의 단백질 합성에 대 한 조건에 대 한 높은 품질 정보를 제공 하는 방법을 보여 줍니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56212/56212fig1.jpg"> 
그림 1입니다. 스파이크 셀 샘플의 추가. 이 예제에서는 전과 아미노산 기아 중 대장균 NF915의 단일 문화에서 샘플 시계열에 수확. NF915의 성장 곡선의 회로도, 파란색 점 샘플 수확의 포인트를 나타냅니다 표시 됩니다. y 축의 로그 눈금은. 섹션 3에 설명 된 대로 샘플 실험 문화의 수확. 스파이크-스트레인 MAS1074의 성장 곡선의 회로도 샘플 수확 파란색 점으로 표시 된 지점으로도 표시 됩니다. 그림의 요점은 ( 대장균 이 예제에서 NF915)의 모든 실험 샘플 같은 기준 문화권에서 스파이크 셀의 약 수를 수신 설명 하기. 각 샘플 스파이크 셀의 5% 계산 실험 셀에 추가 된다 세포 배양 (섹션 4 참조)의 세에 따라. 그 후, RNA에서 모든 샘플 정화 및 북부 오 점에 대 한 사용. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56212/56212fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56212/56212fig2.jpg"> 
그림 2입니다. 북부 오 점의 형광체 영상 스캔 표시 tRNAs에 대 한 조사. 막 E. 콜라이 긴장 NF915 아르기닌 기아 (분)의 유도 전후 표시 시간 지점에서 수확에서 RNA를 포함 합니다. 또한, 막 스파이크 셀 생략 된 샘플의 2 개의 차선을 포함 (-selC 다와-selC), 및 스파이크에서 RNA를 포함 하는 레인 셀만 (selC). -SelC 다 샘플 포함 화학적 deacylated tRNA. 충전 및 충전 tRNA 종 대표 하는 두 밴드 명확 하 게 구분 됩니다. 참고 차선에서 tRNAselC 에서 무시할 수 신호 없이 스파이크 셀 추가. 같은 막 연속적으로 박탈 되었고 tRNAs는 왼쪽에 표시 된에 대 한 reprobed. 위 오 점에 박스형된 지역 후속 tRNA probings에 대 한 표시 되는 오의 일부를 나타냅니다. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56212/56212fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56212/56212fig3v2.jpg"> 
그림 3입니다. 북부 오 점의 정량화. tRNA 풍부한 소프트웨어를 사용 하 여 측정 됩니다. (A) A 북부 오 점 그림 2 tRNAargVYZQ에 대 한 조사에서 하나의 레인. 상하 화살표 표시는 aminoacylated tRNA와는 deacylated tRNA, 각각. 차선으로 병렬 실행 빨간 줄 추가 하 고 정량화에 대 한 영역을 정의 하는 데 사용 됩니다. 신호 라인 내에서 두 개의 깨진 레드 (A)에서의 부 량 (B) 수평 축 나타냅니다 (픽셀)에 (a) 라인의 상단에서 거리와 수직 축에서는 신호 강도 (개수)를 그래프로 묘사. 두 개의 포함 된 신호 발생 봉우리는 aminoacylated에서 tRNA는 deacylated tRNA, 각각 있으며 수동으로 정의. 추가 분석을 위해 내보낸 데이터는 두 봉우리의 각 영역에 해당 하는 값입니다. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56212/56212fig3v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56212/56212fig4.jpg"> 
그림 4입니다. 대표 결과: tRNA 나타났는데 정량화 한d 아르기닌 기아 중 레벨을 충전 합니다. 그림 2에 표시 된 북부 오 점에 밴드 부 량이 고 TRNAgltTUVW (적색), tRNAargVYZQ (파란색) 및 tRNAhisR (녹색)의 (A) 상대 풍부. 0 분 (샘플 기아 발병 직전 수확)에 레벨 1로 설정 됩니다. (B) (A)에서 동일한 3 개의 tRNAs의 레벨을 충전. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56212/56212fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>프로브 특이성</td>
			<td>조사 순서</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNAargVYZQ</td>
			<td>5'-TCCGACCGCTCGGTTCGTAGC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNAgluTUVW</td>
			<td>5'-CCTGTTACCGCCGTGAAAGGG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNAhisR</td>
			<td>5'-CACGACAACTGGAATCACAATCC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNAleuPQVT</td>
			<td>5'-GTAAGGACACTAACACCTGAAGC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNAleuU</td>
			<td>5'-TATTGGGCACTACCACCTCAAGG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNAleuW</td>
			<td>5'-CTTGCGGCGCCAGAACCTAAATC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNAleuX</td>
			<td>5'-TATTTCTACGGTTGATTTTGAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNAleuZ</td>
			<td>5'-AAAATCCCTCGGCGTTCGCGCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNAlysQTVWYZ</td>
			<td>5'-TGCGACCAATTGATTAAAAGTCAAC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNAthrV</td>
			<td>5'-TGGGGACCTCACCCTTACCAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNAtyrTV</td>
			<td>5'-TCGAACCTTCGAAGTCGATGA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNAselC</td>
			<td>5'-ATTTGAAGTCCAGCCGCC</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
표 1입니다. 선택한 tRNAs 대장균 K-12. 에 대 한 제안된 프로브 시퀀스의 테이블

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Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

풍부 하 고 대장균 에서 전송 RNAs의 레벨 충전의 정량화

여기에 우리가 직접 스파이크에 추가에 따라 다른 샘플에서 이동 RNA의 상대적 수준 또는 다른 짧은 RNA를 비교 하는 방법 뿐만 아니라 순화 된 대장균 RNA에서 레벨을 충전 하는 전송 RNA를 측정 하는 방법 제시 셀 참조 유전자 표현입니다.

Transfer RNA (tRNA) is an essential part of the translational machinery in any organism. tRNAs bind and transfer amino acids to the translating ribosome. ...

quantification-abundance-charging-levels-transfer-rnas-escherichia

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

9.2K 조회수.  University of Copenhagen. 여기에 우리가 직접 스파이크에 추가에 따라 다른 샘플에서 이동 RNA의 상대적 수준 또는 다른 짧은 RNA를 비교 하는 방법 뿐만 아니라 순화 된 대장균 RNA에서 레벨을 충전 하는 전송 RNA를 측정 하는 방법 제시 셀 참조 유전자 표현입니다.

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Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique applications for OMV where traditional nanoparticles are proving too difficult to synthesize. To date, all Gram-negative bacteria have been shown to produce OMV demonstrating packaging of a variety of cargo that includes small molecules, peptides, proteins and genetic material. Based on their diverse cargo, OMV are implicated in many biological processes ranging from cell-cell communication to gene transfer and delivery of virulence factors depending upon which bacteria are producing the OMV. Only recently have bacterial OMV become accessible for use across a wide range of applications through the development of techniques to control and direct packaging of recombinant proteins into OMV. This protocol describes a method for the production, purification, and use of enzyme packaged OMV providing for improved overall production of recombinant enzyme, increased vesiculation, and enhanced enzyme stability. Successful utilization of this protocol will result in the creation of a bacterial strain that simultaneously produces a recombinant protein and directs it for OMV encapsulation through creating a synthetic linkage between the recombinant protein and an outer membrane anchor protein. This protocol also details methods for isolating OMV from bacterial cultures as well as proper handling techniques and things to consider when adapting this protocol for use for other unique applications such as: pharmaceutical drug delivery, medical diagnostics, and environmental remediation.

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

A protocol for the production, purification, and use of enzyme packaged outer membrane vesicles (OMV) providing for enhanced enzyme stability for implementation across diverse applications is presented.

에서 외부 막 소포 내에서 감독 단백질 포장<em&gt; 대장균</em&gt; : 디자인, 생산 및 정제

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique ...

연구

생화학

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many of these conditions cause protein unfolding in the cell and have detrimental impact on the survival of the organism. A group of unrelated, stress-specific molecular chaperones have been shown to play essential roles in the survival of these stress conditions. While fully folded and chaperone-inactive before stress, these proteins rapidly unfold and become chaperone-active under specific stress conditions. Once activated, these conditionally disordered chaperones bind to a large number of different aggregation-prone proteins, prevent their aggregation and either directly or indirectly facilitate protein refolding upon return to non-stress conditions. The primary approach for gaining a more detailed understanding about the mechanism of their activation and client recognition involves the purification and subsequent characterization of these proteins using in vitro chaperone assays. Follow-up in vivo stress assays are absolutely essential to independently confirm the obtained in vitro results.
This protocol describes in vitro and in vivo methods to characterize the chaperone activity of E. coli HdeB, an acid-activated chaperone. Light scattering measurements were used as a convenient read-out for HdeB&#39;s capacity to prevent acid-induced aggregation of an established model client protein, MDH, in vitro. Analytical ultracentrifugation experiments were applied to reveal complex formation between HdeB and its client protein LDH, to shed light into the fate of client proteins upon their return to non-stress conditions. Enzymatic activity assays of the client proteins were conducted to monitor the effects of HdeB on pH-induced client inactivation and reactivation. Finally, survival studies were used to monitor the influence of HdeB&#39;s chaperone function in vivo.

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

This study describes biophysical, biochemical and molecular techniques to characterize the chaperone activity of Escherichia coli HdeB under acidic pH conditions. These methods have been successfully applied for other acid-protective chaperones such as HdeA and can be modified to work for other chaperones and stress conditions.

의 pH에 ​​의존 활동의 검출<em&gt; 대장균</em&gt; 보호자 HdeB<em&gt; 체외</em&gt; 및<em&gt; 생체</em

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many ...

Quantification of Hypopigmentation Activity In Vitro

This study presents laboratory methods for the quantification of hypopigmentation activity in vitro. Melanin, the major pigment in melanocytes, is synthesized in response to multiple cellular and environmental factors. Melanin protects skin cells from ultraviolet damage, but also has biophysical and biochemical functions. Excessive production or accumulation of melanin in melanocytes can cause dermatological problems, such as freckles, dark spots, melasma, and moles. Therefore, the control of melanogenesis with hypopigmentation agents is important in individuals with clinical or cosmetic needs. Melanin is primarily synthesized in the melanosomes of melanocytes in a complex biochemical process called melanogenesis, which is influenced by extrinsic and intrinsic factors, such as hormones, inflammation, age, and ultraviolet light exposure. We describe three methods to determine the hypopigmentation activity of chemicals or natural substances in melanocytes: measurement of the 1) cellular tyrosinase activity and 2) melanin content, and 3) staining and quantifying cellular melanin with image analysis.
In melanogenesis, tyrosinase catalyzes the rate-limiting step that converts L-tyrosine into 3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA) and then into dopaquinone. Therefore, the inhibition of tyrosinase is a primary hypopigmentation mechanism. In cultured melanocytes, tyrosinase activity can be quantified by adding L-DOPA as a substrate and measuring dopaquinone production by spectrophotometry. Melanogenesis can also be measured by quantifying the melanin content. The melanin-containing cellular fraction is extracted with NaOH and melanin is quantified spectrophotometrically. Finally, the melanin content can be quantified by image analysis following Fontana-Masson staining of melanin. Although the results of these in vitro assays may not always be reproduced in human skin, these methods are widely used in melanogenesis research, especially as the initial step to identify potential hypopigmentation activity. These methods can also be used to assess melanocyte activity, growth, and differentiation. Consistent results with the three different methods ensure the validity of the effects.

We describe three experimental methods for evaluating the hypopigmentation activity of chemicals in vitro: quantification of 1) cellular tyrosinase activity and 2) melanin content, and 3) measurement of melanin by cellular melanin staining and image analysis.

생체 외에서 Hypopigmentation 활동의 정량화

This study presents laboratory methods for the quantification of hypopigmentation activity in vitro. Melanin, the major pigment in melanocytes, is ...

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

With increasing interest in RNA biology and the use of RNA molecules in sophisticated biotechnological applications, the methods to produce large amounts of recombinant RNAs are limited. Here, we describe a protocol to produce large amounts of recombinant RNA in Escherichia coli based on co-expression of a chimeric molecule that contains the RNA of interest in a viroid scaffold and a plant tRNA ligase. Viroids are relatively small, non-coding, highly base-paired circular RNAs that are infectious to higher plants. The host plant tRNA ligase is an enzyme recruited by viroids that belong to the family Avsunviroidae, such as Eggplant latent viroid (ELVd), to mediate RNA circularization during viroid replication. Although ELVd does not replicate in E. coli, an ELVd precursor is efficiently transcribed by the E. coli RNA polymerase and processed by the embedded hammerhead ribozymes in bacterial cells, and the resulting monomers are circularized by the co-expressed tRNA ligase reaching a remarkable concentration. The insertion of an RNA of interest into the ELVd scaffold enables the production of tens of milligrams of the recombinant RNA per liter of bacterial culture in regular laboratory conditions. A main fraction of the RNA product is circular, a feature that facilitates the purification of the recombinant RNA to virtual homogeneity. In this protocol, a complementary DNA (cDNA) corresponding to the RNA of interest is inserted in a particular position of the ELVd cDNA in an expression plasmid that is used, along the plasmid to co-express eggplant tRNA ligase, to transform E. coli. Co-expression of both molecules under the control of strong constitutive promoters leads to production of large amounts of the recombinant RNA. The recombinant RNA can be extracted from the bacterial cells and separated from the bulk of bacterial RNAs taking advantage of its circularity.

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

Here, we present a protocol to produce large amounts of recombinant RNA in Escherichia coli by co-expressing a chimeric RNA that contains the RNA of interest in a viroid scaffold and a plant tRNA ligase. The main product is a circular molecule that facilitates purification to homogeneity.

대장균 에서 바이로이드 파생 시스템을 사용 하 여 원형 발판에 재조합 RNAs의 대규모 생산

With increasing interest in RNA biology and the use of RNA molecules in sophisticated biotechnological applications, the methods to produce large amounts ...

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in DNA to investigate the interaction between small non-coding ribonucleic acid (sRNA) molecules and target messenger RNAs (mRNAs). In addition, site-directed mutagenesis is used to map specific protein binding sites to RNA. A 2-step and 3-step PCR based introduction of mutations is described. The approach is relevant to all protein-RNA and RNA-RNA interaction studies. In short, the technique relies on designing primers with the desired mutation(s), and through 2 or 3 steps of PCR synthesizing a PCR product with the mutation. The PCR product is then used for cloning. Here, we describe how to perform site-directed mutagenesis with both the 2- and 3-step approach to introduce mutations to the sRNA, McaS, and the mRNA, csgD, to investigate RNA-RNA and RNA-protein interactions. We apply this technique to investigate RNA interactions; however, the technique is applicable to all mutagenesis studies (e.g., DNA-protein interactions, amino-acid substitution/deletion/addition). It is possible to introduce any kind of mutation except for non-natural bases but the technique is only applicable if a PCR product can be used for downstream application (e.g., cloning and template for further PCR).

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in deoxyribonucleic acid (DNA). This protocol describes how to do site-directed mutagenesis with a 2-step and 3-step polymerase chain reaction (PCR) based approach, which is applicable to any DNA fragment of interest.

사이트 감독 Mutagenesis에 대 한 생체 외에서 그리고 Vivo 실험 대장균 RNA 상호 Exemplified에서

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in DNA to investigate the interaction between small non-coding ribonucleic ...

Use of Alu Element Containing Minigenes to Analyze Circular RNAs

In addition to linear mRNAs, many eukaryotic genes generate circular RNAs. Most circular RNAs are generated by joining a 5&#39; splice site with an upstream 3&#39; splice site within a pre-mRNA, a process called back-splicing. This circularization is likely aided by secondary structures in the pre-mRNA that bring the splice sites into close proximity. In human genes, Alu elements are thought to promote these secondary RNA structures, as Alu elements are abundant and exhibit base complementarities with each other when present in opposite directions in the pre-mRNA. Here, we describe the generation and analysis of large, Alu element containing reporter genes that form circular RNAs. Through optimization of cloning protocols, reporter genes with up to 20 kb insert length can be generated. Their analysis in co-transfection experiments allows the identification of regulatory factors. Thus, this method can identify RNA sequences and cellular components involved in circular RNA formation.

Use of Alu Element Containing Minigenes to Analyze Circular RNAs

We clone and analyze reporter genes generating circular RNAs. These reporter genes are larger than constructs to analyze linear splicing and contain Alu elements. To investigate the circular RNAs, the constructs are transfected into cells and resulting RNA is analyzed using RT-PCR after removal of linear RNA.

원형 RNA를 분석하기 위해 미니유전자를 포함하는 Alu 요소 사용

In addition to linear mRNAs, many eukaryotic genes generate circular RNAs. Most circular RNAs are generated by joining a 5&#39; splice site with an ...

Synthesis of a Deuterated Standard for the Quantification of 2-Arachidonoylglycerol in Caenorhabditis elegans

This work presents a method to prepare an analytical standard to analyze 2-arachidonoyl glycerol (2-AG) qualitatively and quantitatively by liquid chromatography-electrospray Ionization-tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS). Endocannabinoids are conserved lipid mediators that regulate multiple biological processes in a variety of organisms. In C. elegans, 2-AG has been found to possess different roles, including modulation of dauer formation and cholesterol metabolism. This report describes a method to overcome the difficulties associated with the costs and stability of deuterated standards required for 2-AG quantification. The procedure for the synthesis of the standard is simple and can be performed in any laboratory, without the need for organic synthesis expertise or special equipment. In addition, a modification of Folch&#39;s method to extract the deuterated standard from C. elegans culture is described. Finally, a quantitative and analytic method to detect 2-AG using the stable isotopically labeled analog 1-AG-d5 is described, which provides reliable results in a fast-chromatographic run. The procedure is useful for studying the multiple roles of 2-AG in C. elegans while also being applicable to other studies of metabolites in different organisms.

Synthesis of a Deuterated Standard for the Quantification of 2-Arachidonoylglycerol in Caenorhabditis elegans

This work describes a robust and straightforward method to detect and quantify the endocannabinoid 2-arachidonoylglycerol (2-AG) in C. elegans. An analytical deuterated standard us prepared and used for the quantification of 2-AG by isotopic dilution and liquid chromatography-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS).

케노하브디티스 예쁜꼬마선충에서 2-아라키도노일글리세롤의 정량화를 위한 신분화 표준의 합성

This work presents a method to prepare an analytical standard to analyze 2-arachidonoyl glycerol (2-AG) qualitatively and quantitatively by liquid ...

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

Several methods have been developed to functionally characterize novel membrane transporters. Polyamines are ubiquitous in all organisms, but polyamine exchangers in plants have not been identified. Here, we outline a method to characterize polyamine antiporters using membrane vesicles generated from the lysis of Escherichia coli cells heterologously expressing a plant antiporter. First, we heterologously expressed AtBAT1 in an E. coli strain deficient in polyamine and arginine exchange transporters. Vesicles were produced using a French press, purified by ultracentrifugation and utilized in a membrane filtration assay of labeled substrates to demonstrate the substrate specificity of the transporter. These assays demonstrated that AtBAT1 is a proton-mediated transporter of arginine, &#947;-aminobutyric acid (GABA), putrescine and spermidine. The mutant strain that was developed for the assay of AtBAT1 may be useful for the functional analysis of other families of plant and animal polyamine exchangers. We also hypothesize that this approach can be used to characterize many other types of antiporters, as long as these proteins can be expressed in the bacterial cell membrane. E. coli is a good system for the characterization of novel transporters, since there are multiple methods that can be employed to mutagenize native transporters.

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

We describe a method for the characterization of proton-driven membrane transporters in membrane vesicle preparations produced by heterologous expression in E. coli and lysis of cells using a French press.

대장균의 이종 식에 의한 멤브레인 수송기의 특성화 및 멤브레인 소포 생산

Several methods have been developed to functionally characterize novel membrane transporters. Polyamines are ubiquitous in all organisms, but polyamine ...

Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic interactions among multiple proteins in a protein interaction network is technically difficult. Here, we present a protocol for Quantitative Multiplex Immunoprecipitation (QMI), which allows quantitative assessment of fold changes in protein interactions based on relative fluorescence measurements of Proteins in Shared Complexes detected by Exposed Surface epitopes (PiSCES). In QMI, protein complexes from cell lysates are immunoprecipitated onto microspheres, and then probed with a labeled antibody for a different protein in order to quantify the abundance of PiSCES. Immunoprecipitation antibodies are conjugated to different MagBead spectral regions, which allows a flow cytometer to differentiate multiple parallel immunoprecipitations and simultaneously quantify the amount of probe antibody associated with each. QMI does not require genetic tagging and can be performed using minimal biomaterial compared to other immunoprecipitation methods. QMI can be adapted for any defined group of interacting proteins, and has thus far been used to characterize signaling networks in T cells and neuronal glutamate synapses. Results have led to new hypothesis generation with potential diagnostic and therapeutic applications. This protocol includes instructions to perform QMI, from the initial antibody panel selection through to running assays and analyzing data. The initial assembly of a QMI assay involves screening antibodies to generate a panel, and empirically determining an appropriate lysis buffer. The subsequent reagent preparation includes covalently coupling immunoprecipitation antibodies to MagBeads, and biotinylating probe antibodies so they can be labeled by a streptavidin-conjugated fluorophore. To run the assay, lysate is mixed with MagBeads overnight, and then beads are divided and incubated with different probe antibodies, and then a fluorophore label, and read by flow cytometry. Two statistical tests are performed to identify PiSCES that differ significantly between experimental conditions, and results are visualized using heatmaps or node-edge diagrams.

Quantitative Multiplex Immunoprecipitation (QMI) uses flow cytometry for sensitive detection of differences in the abundance of targeted protein-protein interactions between two samples. QMI can be performed using a small amount of biomaterial, does not require genetically engineered tags, and can be adapted for any previously defined protein interaction network.

멀티플렉스 동시 면역 침전을 이용한 단백질 상호 작용 네트워크 역학의 정량화

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic ...

Quantification of Coenzyme A in Cells and Tissues

Emerging research has revealed that the cellular coenzyme A (CoA) supply can become limiting with a detrimental impact on growth, metabolism and survival. Measurement of cellular CoA is a challenge due to its relatively low abundance and the dynamic conversion of free CoA to CoA thioesters that, in turn, participate in numerous metabolic reactions. A method is described that navigates through potential pitfalls during sample preparation to yield an assay with a broad linear range of detection that is suitable for use in many biomedical laboratories.

This method describes sample preparation from cultured cells and animal tissues, extraction and derivatization of coenzyme A in the samples, followed by high pressure liquid chromatography for purification and quantification of the derivatized coenzyme A by absorbance or fluorescence detection.

세포와 조직에서 코엔자임 A의 정량화

Emerging research has revealed that the cellular coenzyme A (CoA) supply can become limiting with a detrimental impact on growth, metabolism and survival. ...