ونحن نشكر لوكاس Jonatan له المساعدة التقنية مع تغذية الخلية والثقافة، سيرفي استابولاري de la اتحاد المصارف العربية لرعاية الحيوان ومارتن دومينيك لتسجيل الفيديو. حظي بدعم هذا العمل من الوزارة دي ايكونوميا y AGL2014 كومبيتيتيفيداد-52408-R ودي محافظة كاتالونيا SGR 2014-524. بعثة التحقق المشتركة مستفيدة زمالة PIF-اتحاد المصارف العربية.

استخدام الحيوانات في المقاطع أدناه قد تم وافقت عليها "لجنة الأخلاقيات" في الحيوان والإنسان البحث جامعة برشلونة المستقلة ود خلية &#39; الصيد الزراعة، راماديريا، وأنا Alimentació من محافظة كاتالونيا (بروتوكول #8741).
 1-تغذية الخلية المنظمة والتخزين ملاحظة: القلفة البشرية الليفية (الأكايمية-1) كانت مجمدة في السابق في 1 مل من محلول التجميد التي تتكون من 90% مصل بقرى الجنين (FBS) و 10% ثنائي ميثيل سلفوكسيد ( [دمس]) وتخزينها في النتروجين السائل حتى استخدام.
<ol><li>ذوبان الجليد قنينة مبردة من الأكايمية-1 (1 مل) من غمر القنينة في حمام مائي 37 درجة مئوية.</li>
	<li>إضافة محتويات القنينة المبردة المذابة إلى دولبيكو المعالجون مسبقاً &#39; s النسر التعديل &#39; s المتوسطة (دميم) وتستكمل مع 10% FBS لجعل 01:10 إضعاف.</li>
	<li>بذور الخلايا المخفف (10 مل) في قارورة T75 والثقافة لهم في 37 درجة مئوية و 5% CO 2-</li>
	تغيير <li>في اليوم التالي، على المديين المتوسط والقضاء على البقايا [دمس]. إزالة المتوسطة وإضافة 10 مل دميم دافئة قبل استكمالها مع 10% FBS.</li>
	الثقافة في هفس <li>وتغيير المتوسطة كل 48 ساعة حتى يصل إلى الثقافة مرحلة المتلاقية. قد يستغرق هذا الأمر حوالي 7 إلى 10 أيام.</li>
	<li>لإعداد حل المنظمة، وتمييع mitomycin C في دميم وتستكمل مع 10% FBS بتركيز نهائي 10 ميكروغرام/مل. احتضان الخلايا مع حل المنظمة ح 3 في 37 درجة مئوية و 5% CO 2-</li>
	<li>إزالة حل المنظمة وشطف الخلايا ثلاث مرات مع 2 مل من هانكس متوازن الملح الحل (حبس) للقضاء على فلول ميتوميسين ج.</li>
	<li>لفصل الخلايا المعطل، إضافة 1 مل من قبل حرارة يدتا التربسين الحل واحتضان لمدة 5 دقائق في 37 درجة مئوية و 5% CO 2-</li>
	<li>مراقبة الخلايا تحت مجهر مقلوب التأكد من أنها منفصلة (الهدف العاشر 10 مع 0.3 الفتحة العددية أو NA). إذا لم تكن كذلك، احتضان منهم لبضع دقائق إضافية في 37 درجة مئوية و 5% CO 2. فحص الخلايا مرة أخرى تحت المجهر المقلوب.</li>
	<li>"الماصة؛" الحل مع ماصة باستور كي ننأى بكتل الخلية.</li>
	<li>تحييد الحل الانزيمية بإضافة 4 مل دميم وتستكمل مع 10% FBS وريسوسبيند-</li>
	تأخذ قاسمة لتعليق خلية <li>وجعل إضعاف 1: 100 في حبس. لتحديد عدد الخلايا، تحميل 10 ميليلتر لتمييع في نويباور &#39; s الدائرة. عد الخلايا الموجودة في إحدى الساحات الكبيرة الدائرة بموجب مجهر مقلوب (الهدف x 20 مع نا 0.45).
	<ol><li>تكرار العد في مجموعة من أربعة مربعات كبيرة. حساب إجمالي عدد الخلايا (ن) كنون = متوسط عدد الخلايا معدود x الحجم الإجمالي x تمييع x 10 4-</li>
	</ol></li> <li>الطرد المركزي بقية العينة لمدة 5 دقائق في 200 x غ. تجاهل المادة طافية وبيليه مع تجميد الحل بتركيز 10 6 خلايا كل مل ريسوسبيند.</li>
	<li>قاسمة التعليق في قنينات المبردة مع 10 6 خلايا (1 مل) كل. ضع قارورة المبردة في حاوية تجميد وتجميد في-80 درجة مئوية.</li>
	<li>في اليوم التالي، تخزين القنينات المبردة في النتروجين السائل-</li>
</ol> 2. وحدة تغذية "الخلية والثقافة" <ol><li>واحد إلى أربعة أيام قبل البدء في عملية الاشتقاق، إبطال ذوبان قنينة مبردة التي تتضمن 1 × 10 6 خلايا الأكايمية-1 في حمام مائي في 37 درجة مئوية.</li>
	<li>جعل إضعاف 1:6 1-الأكايمية المذابة في تسخينها قبل دميم وتستكمل مع 10% FBS والحفاظ على درجة حرارة 37 درجة مئوية.</li>
	<li>ملء كل بئر من صفيحة 4-جيدا مع 500 ميليلتر من قبل حرارة 0.2 ٪ الجيلاتين من جلد الخنزير والاحتفاظ باللوحة في 37 درجة مئوية للحد الأدنى 10</li>
	إزالة 500 ميليلتر من الجيلاتين من الآبار <li>وإضافة 500 ميليلتر لتمييع هفس. روك بلطف لوحة لضمان توزيع هفس في الجزء السفلي من الآبار بصورة موحدة. تجنب حركات دائرية، خلاف ذلك سوف تركز الخلايا في مركز البئر.</li>
	<li>احتضان لوحة مالا يقل عن 24 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5% CO 2 للحصول على المونولاير هفس المعطل في كل بئر-</li>
	مراقبة الخلايا تحت مجهر مقلوب (الهدف العاشر 10 مع نا 0.3) <li>في اليوم التالي، والتحقق من أنها تعلق والبلوتينيوم الموزعة. تغيير وسيلة للقضاء على فلول [دمس]. إزالة المتوسطة وإضافة 500 ميليلتر من دميم دافئة قبل استكمالها مع 10% FBS.</li>
</ol> 3. جمع الجنين والثقافة <ol><li>أربعة أيام قبل جمع الأجنة، وإدارة 5 وحدات دولية من الفرس الحامل &#39; s المصل تروج عن طريق الحقن داخل للفئران الإناث 6-12 أسبوع القديمة. 
	ملاحظة: لقد استخدمنا الإناث من 129S2 أو من سلالات B6CFAF1، على الرغم من أن يمكن استخدام الإناث من سلالات الماوس الأخرى. ومع ذلك، عند العمل مع الإناث من سلالات غير المتساهلة (مثلاً CBA)، المتوسطة ينبغي أن تستكمل مع 2 طاء كما هو مذكور في الخطوة 4، 2-</li>
	<li>بعد 48 ساعة، إدارة 5 وحدات دولية من الإنسان المشيمية تروج عن طريق الحقن داخل، وتتزاوج الإناث مع الذكور، على الأقل 8 أسابيع من العمر، بنسبة 1:1. فصل الإناث عن الذكور في اليوم التالي-</li>
	إعداد ثقافة خلية 35 ملم طبق بيتري مع عدة قطرات ميليلتر 40 كسوماج المتوسطة وتستكمل مع 4 مغ/مل ألبومين المصل البقري (BSA) <li>اليوم قبل جمع الأجنة، وملء اللوحة مع الزيوت المعدنية تغطية كامل القطرات. احتضان الطبق على 37 درجة مئوية و 5% CO 2 حجته المتوسطة-</li>
	<li>لإعداد الماصات التلاعب بالأجنة، حرارة الجزء أرق من الزجاج طويلة ذات الرؤوس ماصة باستور استخدام موقد بنسن. بمجرد لينة، وسحبها من اللهب وسحب طرفي عن بعضها البعض. كسرها إلى الطول المطلوب. يجب أن يكون القطر الداخلي في تلميح 100-150 ميكرومتر.</li>
	<li>Euthanize الفئران الإناث بخلع عنق الرحم ح 45-48 وظيفة-كويتوم (p.c.).</li>
	<li>تشريح الفئران لفضح تجويف البطن بقطع الجلد مع منحنى سلس مقص حاد والصفاق مع مقص حاد مستقيم. انتزاع الرحم واحد مع الملقط وقطع قناة استخدام مقص حاد مستقيم، ووضعه في كزب مخزنة حبيس المتوسطة (هكزب) 13 في 37 درجة جيم تكرار العملية لإزالة في قناة أخرى.</li>
	<li>دافق أوفيدوكتس مع حقنه 1 مل محملة هكزب الذي عقد في مكان بالملقط الساعاتي لجمع الأجنة 2-خلية- 
	ملاحظة: إعداد تأخذ إبرة التنظيف إبرة حقن 30 غ، قطع النهاية، والبرية إلى تلميح صراحة على حجر جلخ.</li>
	<li>باستخدام أجهزة ماصة الفم، التقاط الأجنة وغسلها في هكزب والثقافة لهم في الطبق الثقافة الجنين المجهز سابقا على 37 درجة مئوية و 5% CO 2 حتى مرحلة الكيسة. ما يصل إلى 50 الأجنة يمكن أن يكون مثقف في كل قطره 40 ميليلتر. رصد التنمية الجنين كل 24 ساعة تحت ستيريوميكروسكوبي. 
	ملاحظة: بدلاً من ذلك، الأجنة يمكن جمعها في مرحلة الكيسة لتقصير الثقافة الجنين في المختبر. وفي هذه الحالة، euthanize الإناث في يوم p.c. 3.5-4.5، تشريح الرحم. وتدفق عليه مع هكزب-</li>
</ol> 4. اشتقاق الخلايا الجذعية <ol><li><ol><li>من إعداد لوحات الاشتقاق في اليوم من زرع الجنين، إعداد المتوسطة الاشتقاق بتكميل المتوسطة دميم مع 100 ميكرومتر 2-β ميركابتوثانول، 1 x "الأحماض الأمينية" الأساسية عدم ، 20% لاستبدال المصل، و 10 3 U/mL ليف.</li>
		<li>إذا رغبت في ذلك، أيضا إضافة 1 ميكرومتر من مجاهدي خلق مثبطات PD0325901 و 3 ميكرومتر مثبطات GSK3 CHIR99021 للحصول على متوسط 2 طاء-</li>
		<li>تأخذ لوحة 4-جيدا مع أحادي الطبقة هفس المعطل (الخطوة 2، 6) من حاضنة. إزالة المتوسطة وإضافة 800 ميليلتر من الاشتقاق قبل حرارة متوسطة لكل بئر. العودة اللوحة للحاضنة.</li>
	</ol></li> <li>إزالة Zona pellucida والجنين البذر <ol><li>إعداد ثقافة خلية 35 ملم طبق بيتري مع قطرات ثلاث 30 ميليلتر من تيرودي الحمضية &#39; s الحل 14 وقطرات ثلاث 30 ميليلتر من المتوسطة الاشتقاق. تغطية القطرات مع الزيوت المعدنية وإبقاء الطبق على 37 درجة مئوية.</li>
		<li>أخذ الطبق الثقافة الجنين من الحاضنة. واحداً تلو الآخر، نقل بلاستوسيستس من قطرات الثقافة إلى تيرودي حمضية &#39; s حل انخفاض استخدام ماصة تلاعب الأجنة. إذا كان ذلك ممكناً، حدد فقط blastocysts الموسعة لبدء عملية الاشتقاق.</li>
		<li>مراقبة الهضم zona pellucida تحت ستيريوميكروسكوبي. حالما يختفي بيلوسيدا زونا، نقل الكيسة إلى انخفاض متوسط اشتقاق من أجل تغسل تيرودي الحمضية &#39; حل s-</li>
		<li>تأخذ لوحة الاشتقاق 4-جيدا من حاضنة والبذور واحدة خالية من زونا الكيسة على وحدة التغذية خلايا في كل بئر-</li>
		<li>عودة لوحة الاشتقاق 4-جيدا للحاضنة والثقافة في 37 درجة مئوية و 5% CO 2-</li>
	</ol></li> <li>تغير نمو الخلايا الجذعية الرصد والمتوسطة <ol><li>رصد ثقافات كل 24 ساعة تحت مجهر مقلوب (الهدف X 20 مع نا 0.45). من المهم ملاحظة ما إذا كانت هناك علامات على تمايز الخلايا الجذعية، مثل تورم الخلايا الانكسار المحيطة بثمرة أو حتى دفع التغذية الخلايا جانبا.</li>
		<li>كل يوم، تغيير وسيلة للثقافة. تأخذ اللوحة 4-جيدا من الحاضنة وإزالة المتوسطة من كل بئر وإضافة 800 ميليلتر من المتوسطة اشتقاق المعالجون قبل استكمالها مع ليف و 2 طاء، إذا ما استخدمت. الحفاظ على الثقافة حتى هي لاحظت أووتجرووثس (6-8 أيام)-</li>
	</ol></li></ol> 5. زراعة الخلايا الجذعية وصيانة <ol><li>تحضير يشار تشبه مقابض والماصات التلاعب بالخلايا الجذعية. اتبع الخطوة 3.4 بإعداد الماصات التلاعب بالخلايا الجذعية مع قطر داخلي في غيض من 250-300 ميكرون. استخدم الجزء الآخر من ماصة باستور سحبت لإعداد المؤشر مثل يشار. الحرارة والشكل حتى الحصول على هوك-</li>
	<li>لوحة الثقافة 4-جيدا خارج الحاضنة وتحديد موقع ثمرة تحت ستيريوميكروسكوبي. استخدم المقبض لدفع بعيداً الخلايا المتمايزة ومغذيات التي تحيط ثمرة. 
	ملاحظة: لتجنب التفريق في نهاية المطاف من ثمرة، من المهم لإزالة جميع الخلايا المتمايزة من الحافة من ثمرة.</li>
	<li>نضح ثمرة مع ماصة تلاعب خلايا الجذعية، ووضعه في طبق جديد في قطره 50 ميليلتر التربسين-يدتا.</li>
	<li>استخدام مشرط لقطع ثمرة في عدة أجزاء من أجل تفصيل ذلك ميكانيكيا وانزيماتيكالي على السواء-</li>
	<li>على الفور، نقل أجزاء ثمرة إلى قطره جديدة من الاشتقاق المتوسطة لتحييد عمل التربسين.</li>
	<li>نقل أجزاء ثمرة لصفيحة 4 آبار جديدة مع أحادي الطبقة مغذيات. نقل الأجزاء يصل إلى 10 في كل بئر والثقافة لهم مع اشتقاق المتوسطة في 37 درجة مئوية و 5% CO 2-</li>
	<li>الحفاظ على الثقافات الشبيهة بالخلايا الجذعية لمدة ستة أسابيع على الأقل قبل النظر في السطر مسك المنشأة. تغيير المتوسط كل يوم وثقافة فرعية أخرى منها مرة واحدة في أسبوع-</li>
</ol>

<ol>
	<li>Biswas, A., Hutchins, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cells.">Embryonic stem cells.</a> Stem Cell Dev. 16 (2), 213-221 (2007).</li><li>Weinberger, L., Ayyash, M., Novershtern, N., Hanna, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+stem+cell+states:+naive+to+primed+pluripotency+in+rodents+and+humans.">Dynamic stem cell states: naive to primed pluripotency in rodents and humans.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (3), 155-169 (2016).</li><li>Evans, M. J., Kaufman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+in+culture+of+pluripotential+cells+from+mouse+embryos.">Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos.</a> Nature. 292, 154-156 (1981).</li><li>Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+pluripotent+cell+line+from+early+mouse+embryos+cultured+in+medium+conditioned+by+teratocarcinoma+stem+cells.">Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells.</a> Proc Nat Acad Sci U S A. 78 (12), 7634-7638 (1981).</li><li>Martin, G. R., Evans, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+clonal+lines+of+teratocarcinoma+cells:+formation+of+embryoid+bodies+in+vitro.">Differentiation of clonal lines of teratocarcinoma cells: formation of embryoid bodies in vitro.</a> PNAS. 72 (4), 1441-1445 (1976).</li><li>Czechanski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+and+characterization+of+mouse+embryonic+stem+cells+from+permissive+and+nonpermissive+strains.">Derivation and characterization of mouse embryonic stem cells from permissive and nonpermissive strains.</a> Nat Prot. 9 (3), 559-574 (2014).</li><li>Smith, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+pluripotential+embryonic+stem+cell+differentiation+by+purified+polypeptides.">Inhibition of pluripotential embryonic stem cell differentiation by purified polypeptides.</a> Nature. 336 (6200), 688-690 (1988).</li><li>Williams, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloid+leukaemia+inhibitory+factor+maintains+the+developmental+potential+of+embryonic+stem+cells.">Myeloid leukaemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells.</a> Nature. 336 (6200), 684-687 (1988).</li><li>Brook, F. A., Gardner, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+and+efficient+derivation+of+embryonic+stem+cells+in+the+mouse.">The origin and efficient derivation of embryonic stem cells in the mouse.</a> Proc Nat Acad Sci U S A. 94 (11), 5709-5712 (1997).</li><li>Ward, C. M., Stern, P., Willington, M. A., Flenniken, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+germline+transmission+of+mouse+embryonic+stem+cells+grown+in+synthetic+serum+in+the+absence+of+a+fibroblast+feeder+layer.">Efficient germline transmission of mouse embryonic stem cells grown in synthetic serum in the absence of a fibroblast feeder layer.</a> Lab Invest. 82 (12), 1765-1767 (2002).</li><li>Ying, Q. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ground+state+of+embryonic+stem+cell+self-renewal.">The ground state of embryonic stem cell self-renewal.</a> Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).</li><li>Wakayama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+establishment+of+mouse+embryonic+stem+cell+lines+from+single+blastomeres+and+polar+bodies.">Efficient establishment of mouse embryonic stem cell lines from single blastomeres and polar bodies.</a> Stem cells (Dayton, Ohio). 25 (4), 986-993 (2007).</li><li>Chatot, C. L., Ziomek, C. A., Bavister, B. D., Lewis, J. L., Torres, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+culture+medium+support+development+of+random-bred+1-cell+mouse+embryos+in+vitro.">An improved culture medium support development of random-bred 1-cell mouse embryos in vitro.</a> J Reprod Fertil. 86, 679-688 (1989).</li><li>Nagy, A., Vintersten, K., Behringer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. , (2003).</li><li>Lee, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditions+and+techniques+for+mouse+embryonic+stem+cell+derivation+and+culture.">Conditions and techniques for mouse embryonic stem cell derivation and culture.</a> Pluripotent Stem Cells. , 85-115 (2013).</li><li>Ma, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+foreskin+fibroblast+produces+interleukin-6+to+support+derivation+and+self-renewal+of+mouse+embryonic+stem+cells.">Human foreskin fibroblast produces interleukin-6 to support derivation and self-renewal of mouse embryonic stem cells.</a> Stem Cell Res Ther. 3 (29), (2012).</li><li>Cheng, J., Dutra, A., Takesono, A., Garrett-Beal, L., Schwartzberg, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+generation+of+C57BL/6J+mouse+embryonic+stem+cells+in+a+defined+serum-free+media.">Improved generation of C57BL/6J mouse embryonic stem cells in a defined serum-free media.</a> Genesis. 39 (2), 100-104 (2004).</li><li>Chaudhry, M. A., Vitalis, T. Z., Bowen, B. D., Piret, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basal+medium+composition+and+serum+or+serum+replacement+concentration+influences+on+the+maintenance+of+murine+embryonic+stem+cells.">Basal medium composition and serum or serum replacement concentration influences on the maintenance of murine embryonic stem cells.</a> Cytotechnology. 58 (3), 173-179 (2008).</li><li>Kawase, E., Suemori, H., Takahashi, N., Okazaki, K., Hashimoto, K., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strain+difference+in+establishment+of+mouse+embryonic+stem+(ES)+cell+lines.">Strain difference in establishment of mouse embryonic stem (ES) cell lines.</a> Int. J. Dev. Biol. 38 (2), 385-390 (1994).</li><li>Gonzalez, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+culture+conditions+support+distinct+states+associated+with+different+developmental+stages+and+potency.">Embryonic stem cell culture conditions support distinct states associated with different developmental stages and potency.</a> Stem Cell Rep. 7 (2), 177-191 (2016).</li></ol>

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

على الرغم من أن مسك خط الاشتقاق إجراء معروفة تستخدم بشكل روتيني في العديد من المختبرات، كفاءتها ليس دائماً مرتفعا كما هو متوقع بسبب العوامل المتعددة التي يمكن أن تخل بصيانة بلوريبوتينسي. في هذه المادة ونحن إظهار، خطوة بخطوة، كيفية إنشاء خطوط مسك بكفاءة عالية باستخدام بروتوكول بسيط ويمكن الاعتماد عليها. هذه الفعالية مماثلة لتلك التي ذكرت في الأدبيات.
لضمان أقصى قدر من الكفاءة، من المهم مراقبة الخلايا يوميا أو مرة كل يومين، منذ الساعة النقاط التي أشارت إلى توضيحية فقط. من الضروري تجنب فرط المستعمرات، أن هذا يعزز موت الخلايا وتمايزها. من المهم أيضا لتقليل قدر الإمكان التعرض للمستعمرات إلى التربسين-يدتا أثناء على ثقافة فرعية، لأن هذا يمكن أن تقلل أيضا بقاء الخلية.
عامل أساسي آخر هو مصدر تغذية الخلايا وثقافتهم. أظهرت العديد من الدراسات أن الليفية ستو الأكايمية والليفية الجنينية الماوس (MEF) والماوس أيضا قادرة على دعم اشتقاق المفتاح ESC والثقافة15. بيد أن الأكايمية حتى دائم أكثر من مرتين من MEF وستو في16من الثقافة، مما يتيح المزيد من الوقت ©جميع أن تنمو. وهكذا يتجنب استخدام الأكايمية تهاونا مسك إضافية.
إذا اشتقاق الكفاءة التي تم الحصول عليها أقل من النتائج المبلغ بها، فمن المهم فحص دقيق لجميع مكونات المتوسطة الاشتقاق، خصوصا المصل الاستبدال. دفعات مختلفة لاستبدال المصل يمكن أن تؤدي الاختلافات الكبيرة في اشتقاق الكفاءات17،18. ولذلك، يجب اختبار كل دفعة جديدة قبل استخدامه.
من المهم أن نشير إلى أن الخلفية الوراثية للأجنة المستخدمة كمصدر لاشتقاق ©جميع أيضا بدرجة كبيرة يمكن أن تؤثر على كفاءة الاشتقاق. وفي الواقع، قد صنفت سلالات الماوس إلى سلالات المتساهلة (مثل 129S2 و C57BL6) وسلالات غير المتساهلة (مثل المصرف المركزي وإيماءة وففب) وفقا لقدرتها تسفر عن مسك خطوط تحت الظروف القياسية9،19. البروتوكول ذكرت هنا يمكن يمكن تطبيقها بنجاح على الأجنة من كلا النوعين من سلالات طالما يتم تضمين 2 طاء كوكتيل في الأجلين المتوسط والاشتقاق عند العمل مع الأجنة من سلالات غير متساهلة. متوسطة 2 طاء غير قادرة على تعديل نمط خطوط ©جميع للحفاظ على بلوريبوتينسي، بغض النظر عن الخلفية الوراثية6إرسال الإشارات. القيد الرئيسي أنه، نظراً لنمط الإشارات القوية المكتسبة خلال20من الثقافة، مسك خطوط المستزرعة في 2 طاء تصبح مقاومة للتمايز. للتغلب على هذا التحديد، ينبغي أن مثقف مسك خطوط دون 2 طاء لمرور واحد على الأقل قبل تنظيم دورات تعريفية للتمايز إلى إضعاف مما يشير إلى اكتساب.
عموما، يمكن أن يخفف هذا العمل ممارسة الاشتقاق مسك بإظهار الخطوات قدر الإمكان ببساطة، والتأشير على أهم الصعوبات وكيفية التغلب عليها.

الخلايا الجذعية الجنينية (ESC) هي pluripotent الخلايا المشتقة من الأجنة بريمبلانتيشن، التي تحتفظ بالقدرة على تجديد ذاتية أو التفريق تحت ظروف محددة1. وبناء على هذه الخصائص، أصبحت ESC أداة مفيدة للطب التجديدي، والنمذجة المرض، والأنسجة الدراسات الهندسية2.
استمدت ESC للمرة الأولى من الأجنة الماوس preimplantation، تنشأ خطوط ESC (مسك) الماوس مع النجاح منخفضة3،4. لسنوات، ظلت كفاءة اشتقاق منخفضة نظراً لصعوبة الحفاظ على بلوريبوتينسي في المختبر. وإلى جانب ذلك وجود تغذية الخلايا5، مما يحسن كفاءة الاشتقاق، وتعزيز مرفق مستعمرة والاستقرار كاريوتيبيك6، عدة تعديلات للبروتوكول يؤدي إلى حدوث تحسن في الصيانة بلوريبوتينسي. كانت أهم الإضافة من اللوكيميا المثبطة عامل (LIF) إلى مسك الثقافة المتوسطة7،8، استخدام الأجنة من الخلفية الدلالية 129S29 وثقافة مسك مع المتوسطة وتستكمل مع تعريف المصل، خالية من عوامل التمايز المحتمل10. في الآونة الأخيرة، وقد أظهرت الأدلة الدامغة أن إضافة خليط من اثنين المغيرون جزيء صغير من مسارات الإشارات إلى مسك الثقافة المتوسطة (المعروفة باسم 2i) أفضل وسيلة للحفاظ على بلوريبوتينسي. 2 طاء كوكتيل يتكون من مجموعة المانع مجاهدي خلق PD0325901، مما يقلل من إشارات التمايز عن طريق تثبيط بروتين mitogen تنشيط المسار كيناز (MAPK)، ومثبطات GSK3β CHIR99021، مما يعزز بقاء الخلية في منخفض الكثافة بتنشيط مسار Wnt11.
في هذه المادة، يمكننا وصف بروتوكول بسيط لكفاءة استخلاص خطوط ©جميع من blastocysts الماوس. ونحن اتباع الإجراءات القياسية، استزراع الأجنة من سلالات متساهلة في تغذية الخلايا في اشتقاق المتوسطة وتستكمل مع ليف و استبدال مصل12. يمكن اشتقاق عقب هذا البروتوكول، ومسك خطوط مع الكفاءات المماثلة لتلك التي تم الحصول عليها في المتوسط 2 طاء. وعلى الرغم من ذلك، يمكن إضافة 2 طاء لتجنب المشاكل المحتملة مع الحفاظ على بلوريبوتينسي أو عند العمل مع سلالات غير متساهلة.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1125">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">1 mL sryringe</td>
			<td style="width:199px;">BD&#160;</td>
			<td style="width:141px;">309628</td>
			<td style="width:524px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">2-&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>31350-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">4-well plate</td>
			<td>Thermo Scientific Nunc</td>
			<td style="width:141px;">176740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:263px;">Acidic Tyrode&#39;s solution&#160;</td>
			<td style="width:199px;">Home-made</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td style="width:524px;">See recipe in Nagy et al, 2003. For short-term storage (up to 1 month) keep it at 4&#186;C. Alternatively, for long-term storage keep it at -20&#186;C. If the efficiency of the solution diminishes, it should be acidified by the adition of a small drop of HCl 1M.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:141px;">A3311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:22px;width:263px;">Chicken anti-Mouse IgG, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Molecular Probes - Invitrogen</td>
			<td style="width:141px;">A-21200</td>
			<td>1:500 dilution. Secondary antibody for Oct4, Tuj1, &#945;SMA and AFP mouse antibodies.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:263px;">CHIR990212</td>
			<td style="width:199px;">Axon Medchem&#160;</td>
			<td style="width:141px;">1386</td>
			<td style="width:524px;">Reconstitute with 2.15 ml DMSO for each mg of powder, to obtain a 1 mM stock solution. Aliquot at desired volume and store at -20&#186;C. Avoid freeze and thaw cycles.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">CryoTube</td>
			<td>Thermo Scientific Nunc</td>
			<td style="width:141px;">3754518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">DMSO</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:141px;">41640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">DMEM</td>
			<td style="width:199px;">BioWest</td>
			<td>L0107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">FBS</td>
			<td style="width:199px;">BioWest</td>
			<td>S1810</td>
			<td>Inactivate it prior to use by heating for 30 mins at 56&#186;C. Aliquot and store at -20&#186;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Flushing needle</td>
			<td style="width:199px;">BD&#160;</td>
			<td>304000</td>
			<td>Cut the end of the needle and ground to a blunt tip on an abrasive stone</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Gelatin from porcine skin</td>
			<td style="width:199px;">Fluka</td>
			<td>48724</td>
			<td>Dilute at 0,2% in destilled water and autoclave it. Each dilution can be used for a month.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 594</td>
			<td>Molecular Probes - Invitrogen</td>
			<td style="width:141px;">A-11037</td>
			<td>1:500 dilution. Secondary antibody for Sox2 rabbit antibody.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">HBSS</td>
			<td style="width:199px;">BioWest</td>
			<td style="width:141px;">L0611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Hepes-buffered CZB&#160;</td>
			<td style="width:199px;">Home-made</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td>See composition in Chatot et al, 1989</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:263px;">Human chorionic gonadotropin</td>
			<td style="width:199px;">Divasa-Farmavic</td>
			<td style="width:141px;">Veterin-Corion 3000 UI</td>
			<td style="width:524px;">Dilute in NaCl 0.9% at 50 IU/ml. Aliquot it in 1 ml and store at -20&#186;C for up to two months. Once thawed do not freeze again.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Human foreskin fibroblasts</td>
			<td style="width:199px;">ATCC</td>
			<td style="width:141px;">ATCCSCRC-1041</td>
			<td>For long term storage it is recommended to store them in liquid nitrogen.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:263px;">KnockOut Serum Replacement</td>
			<td style="width:199px;">Life Technologies</td>
			<td>&#160;10828-028</td>
			<td style="width:524px;">Photosensitive. It is recommended to aliquot it in small volumes such as 10 ml and store it at -20&#186;C (check the expiration date). Avoid freeze and thaw cycles.&#160;&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:263px;">KSOMaag Evolve</td>
			<td style="width:199px;">Zenith Biotech</td>
			<td style="width:141px;">ZEKS-050</td>
			<td style="width:524px;">Supplement with 4 mg/ml BSA. Equilibrate at 37&#186;C and 5% CO2 a day prior to use.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Leukemia Inhibitory Factor</td>
			<td style="width:199px;">Merk Millipore</td>
			<td>ESG1106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:263px;">Mice&#160;</td>
			<td style="width:199px;">Charles River/Harlan</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td style="width:524px;">It is recommended to use mice from a permissive strain in terms of mESC derivation (such as 129S2 or C57BL). However, inbreed strains are less efficient producing embryos. Therefore, it is recomended to use a hybrid strain, such as 129S2 x C57BL or B6CBAF1 to take advantage of the hybrid vigor.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Mineral oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8410</td>
			<td>Embryo tested. Photosensitive.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:263px;">Mitomycin C</td>
			<td style="width:199px;">Serva</td>
			<td>2980501</td>
			<td style="width:524px;">Reconstitute the powder with MilliQ water at 0.5 mg/ml. Store at 4&#186;C protected from light. Attention, it is harmful and suspected of causing cancer.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Mouse anti-tubulin &#946; III (Tuj1)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td style="width:141px;">MMS-435P</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Mouse monoclonal anti-&#945;SMA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:141px;">A5228</td>
			<td>1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Mouse monoclonal anti-AFP</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:141px;">MAB1368</td>
			<td>1:50 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Mouse monoclonal anti Oct3/4&#160;</td>
			<td>Santa cruz</td>
			<td style="width:141px;">Sc-5279</td>
			<td>1:50 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Non-Essential Amino Acids</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11140-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:263px;">PD0325901</td>
			<td style="width:199px;">Axon Medchem&#160;</td>
			<td style="width:141px;">1408</td>
			<td style="width:524px;">Reconstitute with 2.08 ml DMSO for each mg of powder, to obtain a 1 mM stock solution. Aliquot at desired volume and store at -20&#186;C. Avoid freeze and thaw cycles.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Petri dish (35mm)</td>
			<td>Thermo Scientific Nunc</td>
			<td style="width:141px;">153066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Petri dish (60mm)</td>
			<td>Thermo Scientific Nunc</td>
			<td>150288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:263px;">Pregnant mare&#39;s serum gonadotropin</td>
			<td style="width:199px;">Foligon</td>
			<td>Foligon-1000 UI</td>
			<td style="width:524px;">Dilute in NaCl 0.9% at 50 IU/ml. Aliquot it in 1 ml and store at -20&#186;C for up to two months. Once thawed do not freeze again.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Rabbit policlonal anti-Sox2</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td style="width:141px;">AB5603</td>
			<td>1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">T75 falcon</td>
			<td style="width:199px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:141px;">130190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Trypsin-EDTA 10x</td>
			<td style="width:199px;">BioWest</td>
			<td style="width:141px;">X0930</td>
			<td>Dilute 1:10 in HBSS to obtain a 1x solution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

derivation of stem cell lines from mouse preimplantation embryos

اشتقاق الخلايا الجذعية الجنينية (مسك) الماوس هو العملية التي pluripotent هي أنشأت خطوط الخلايا من الأجنة preimplantation. هذه الخطوط الاحتفاظ بالقدرة على تجديد ذاتية أو التفريق تحت شروط معينة. بسبب هذه الخصائص، يتم مسك أداة مفيدة في الطب التجديدي، والنمذجة المرض، ودراسات هندسة الأنسجة. توضح هذه المقالة بروتوكول بسيط للحصول على خطوط مسك مع اشتقاق عالية الكفاءة (60-80 في المائة) باستزراع blastocysts من سلالات الماوس متساهلة في تغذية الخلايا في المعرفة المتوسطة وتستكمل مع العوامل المثبطة اللوكيميا. يمكن أيضا تطبيق البروتوكول كفاءة استخلاص خطوط ©جميع من سلالات الماوس غير متساهلة، بإضافة بسيطة من خليط من اثنين مثبطات جزيء صغير إلى متوسط الاشتقاق (متوسط 2 طاء). وترد الإجراءات المفصلة في إعداد والثقافة لتغذية الخلايا، جمع وثقافة الأجنة الماوس، واشتقاق والثقافة من خطوط ©جميع. هذا البروتوكول لا يتطلب معدات متخصصة ويمكن أن تنفذ في أي مختبر خبرة الثقافة الأساسية خلايا الثدييات.

في أعقاب هذا البروتوكول، ما يزيد على 95% تكوين ثمرة يجب أن يتحقق بعد الأسبوع الأول من الثقافة (الشكل 1A). إنشاء خطوط ©جميع بعد ستة ممرات متغيراً بين replicates التجريبي، مع نجاح متوسط من 60-80%. إضافة 2 طاء لا يحسن إلى حد كبير النتائج عند العمل مع سلالات الماوس المتساهلة، مثل تلك التي مع خلفية 129S2، ولكن من الضروري عند العمل مع سلالات غير متساهلة.
المستعمرات ESC الماوس ينبغي أن يقدم مورفولوجيا عادية بشكل مسطح وتحديد الحواف عند مثقف دون علاج (الشكل 1B-ج) أو مثقف مع 2 طاء (الشكل 1). تجاهل المستعمرات يجب أن يكون عرض علامات التمايز الطرفية (الشكل 1E-F). إذا كانت الكفاءة اشتقاق الحصول على أقل من القيم المتوقعة، السيطرة على نمو المستعمرات مسك وثقافة فرعية أكثر منهم كثيرا تجنب فرط، وهذا يمكن أن يسبب موت الخلايا ويعزز التمايز (الشكل 1-ح).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56171/56171fig1.jpg"> 
الشكل 1 : صور الممثلة مسك المستعمرات في الثقافة- (أ) ثمرة المستمدة من الكيسة بعد الأسبوع الأول من الثقافة (ب، ج) مسك عدة مستعمرات في مرور 10 حواف محددة بعرض وشكل مسطح. (د) المستعمرات من خطوط ©جميع تعامل مع 2 طاء. (ه، و) أمثلة لمستعمرات مسك متمايزة شبه عرض علامات التمايز الطرفية (أبرزت مع الحذف متقطع). (ز، ح) أمثلة لمستعمرات مسك متضخمة عرض علامات سيئة مورفولوجيا والتمايز. تغيير حجم أشرطة = 100 ميكرومتر. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56171/56171fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
للتحقق من ستيمنيس للخطوط ©جميع المفترضة التي تم الحصول عليها بعد ستة أسابيع ثقافة، ينبغي تقييم وجود علامات بلوريبوتينسي والتمايز. يجب أن تكون الأسطر ©جميع إيجابية بالنسبة لعلامات بلوريبوتينسي مثل Oct4 و Sox2 (الشكل 2 أ-ب). وعلاوة على ذلك، بعد تحريض تمايز العفوية باستزراع الخلايا لمدة 10 أيام دون تغذية الخلايا في دميم وتستكمل مع 10% FBS، خطوط ©جميع يتوقع أن تكون إيجابية بالنسبة للفئة β-tubulin ماركر الأديم الظاهر الثالث (Tuj1) (الشكل 2)، ميسوديرم ماركر α-السلس العضلات أكتين (αSMA) (الشكل 2D) وعلامة الأنسجة الفافيتوبروتين (وكالة فرانس برس) (الشكل 2E). ينبغي أن تعتبر خطوط ©جميع الحقيقية الإيجابية لخمس علامات تقييم الخطوط فقط وهكذا المستخدمة لحساب كفاءة الاشتقاق. عادة، وهذا يتوافق مع تقريبا جميع خطوط ©جميع التي تم إنشاؤها باستخدام هذا البروتوكول.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56171/56171fig2.jpg"> 
الشكل 2 : الممثل الفلورة ضد علامات بلوريبوتينسي والتمايز. ©جميع المستعمرات معربا عن Oct4 (A) (أخضر) (ب) و Sox2 (أحمر). التمييز بين المستعمرات مسك الإعراب (ج) Tuj1 (الأخضر)، (د) αSMA (الأخضر) ووكالة فرانس برس (E) (أخضر). هو كونتيرستينيد بالمواد النووية في جميع الصور مع هويشست (أزرق). تغيير حجم أشرطة = 100 ميكرومتر. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56171/56171fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>

Watch this Scientific Journal Video about Derivation of Stem Cell Lines from Mouse Preimplantation Embryos at JoVE.com

Derivation of Stem Cell Lines from Mouse Preimplantation Embryos

اشتقاق خطوط الخلايا الجذعية من الأجنة الجيني الماوس

توضح هذه المقالة بروتوكول لاشتقاق بكفاءة وثقافة pluripotent خطوط الخلايا الجذعية من الأجنة الماوس في مرحلة الكيسة.

Mouse embryonic stem cell (mESC) derivation is the process by which pluripotent cell lines are established from preimplantation embryos. These lines ...

derivation-of-stem-cell-lines-from-mouse-preimplantation-embryos

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.3K Views.  Universitat Autònoma de Barcelona. توضح هذه المقالة بروتوكول لاشتقاق بكفاءة وثقافة pluripotent خطوط الخلايا الجذعية من الأجنة الماوس في مرحلة الكيسة.

Video: Derivation of Stem Cell Lines from Mouse Preimplantation Embryos

Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells

Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great promise in cell therapy against heart disease. Among various methods to isolate CPCs, differentiation of embryonic stem cell (ESC) into CPCs attracts great attention in the field since ESCs can provide unlimited cell source. As a result, numerous strategies have been developed to derive CPCs from ESCs. In this protocol, differentiation and purification of embryonic CPCs from both mouse and human ESCs is described. Due to the difficulty of using cell surface markers to isolate embryonic CPCs, ESCs are engineered with fluorescent reporters activated by CPC-specific cre recombinase expression. Thus, CPCs can be enriched by fluorescence-activated cell sorting (FACS). This protocol illustrates procedures to form embryoid bodies (EBs) from ESCs for CPC specification and enrichment. The isolated CPCs can be subsequently cultured for cardiac lineage differentiation and other biological assays. This protocol is optimized for robust and efficient derivation of CPCs from both mouse and human ESCs.

In this protocol, derivation of cardiac progenitor cells from both mouse and human embryonic stem cells will be illustrated. A major strategy in this protocol is to enrich cardiac progenitor cells with flow cytometry using fluorescent reporters engineered into the embryonic stem cell lines.

اشتقاق خلايا القلب السلف من الخلايا الجذعية الجنينية

Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great ...

Efficient Derivation of Retinal Pigment Epithelium Cells from Stem Cells

No cure has been discovered for age-related macular degeneration (AMD), the leading cause of vision loss in people over the age of 55. AMD is complex multifactorial disease with an unknown etiology, although it is largely thought to occur due to death or dysfunction of the retinal pigment epithelium (RPE), a monolayer of cells that underlies the retina and provides critical support for photoreceptors. RPE cell replacement strategies may hold great promise for providing therapeutic relief for a large subset of AMD patients, and RPE cells that strongly resemble primary human cells (hRPE) have been generated in multiple independent labs, including our own. In addition, the uses for iPS-RPE are not limited to cell-based therapies, but also have been used to model RPE diseases. These types of studies may not only elucidate the molecular bases of the diseases, but also serve as invaluable tools for developing and testing novel drugs. We present here an optimized protocol for directed differentiation of RPE from stem cells. Adding nicotinamide and either Activin A or IDE-1, a small molecule that mimics its effects, at specific time points, greatly enhances the yield of RPE cells. Using this technique we can derive large numbers of low passage RPE in as early as three months.

Stem cell-derived retinal pigment epithelium (RPE) cells may be used for multiple applications including cell-based therapies for retinal degeneration, disease modeling, and drug studies. Here we present a simple protocol for reproducibly deriving RPE from stem cells.

اشتقاق كفاءة خلايا الظهارة الصبغية الشبكية من الخلايا الجذعية

No cure has been discovered for age-related macular degeneration  (AMD), the leading cause of vision loss in people over the age of 55. AMD is complex ...

Derivation of Highly Purified Cardiomyocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Small Molecule-modulated Differentiation and Subsequent Glucose Starvation

Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) have become an important cell source to address the lack of primary cardiomyocytes available for basic research and translational applications. To differentiate hiPSCs into cardiomyocytes, various protocols including embryoid body (EB)-based differentiation and growth factor induction have been developed. However, these protocols are inefficient and highly variable in their ability to generate purified cardiomyocytes. Recently, a small molecule-based protocol utilizing modulation of Wnt/&#946;-Catenin signaling was shown to promote cardiac differentiation with high efficiency. With this protocol, greater than 50%-60% of differentiated cells were cardiac troponin-positive cardiomyocytes were consistently observed. To further increase cardiomyocyte purity, the differentiated cells were subjected to glucose starvation to specifically eliminate non-cardiomyocytes based on the metabolic differences between cardiomyocytes and non-cardiomyocytes. Using this selection strategy, we consistently obtained a greater than 30% increase in the ratio of cardiomyocytes to non-cardiomyocytes in a population of differentiated cells. These highly purified cardiomyocytes should enhance the reliability of results from human iPSC-based in vitro disease modeling studies and drug screening assays.

Here, we describe a robust protocol for human cardiomyocyte derivation that combines small molecule-modulated cardiac differentiation and glucose deprivation-mediated cardiomyocyte purification, enabling production of purified cardiomyocytes for the purposes of cardiovascular disease modeling and drug screening.

اشتقاق العضلية العالية النقاء من صنع الإنسان المحفزة الخلايا الجذعية عن طريق صغير التمايز التضمين جزيء واللاحقة الجلوكوز المجاعة

Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) have become an important cell source to address the lack of primary cardiomyocytes ...

Establishment of Genome-edited Human Pluripotent Stem Cell Lines: From Targeting to Isolation

Genome-editing of human pluripotent stem cells (hPSCs) provides a genetically controlled and clinically relevant platform from which to understand human development and investigate the pathophysiology of disease. By employing site-specific nucleases (SSNs) for genome editing, the rapid derivation of new hPSC lines harboring specific genetic alterations in an otherwise isogenic setting becomes possible. Zinc finger nucleases (ZFNs), transcription activator-like effector nucleases (TALENs) and clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 are the most commonly used SSNs. All of these nucleases function by introducing a double stranded DNA break at a specified site, thereby promoting precise gene editing at a genomic locus. SSN-meditated genome editing exploits two of the cell&#39;s endogenous DNA repair mechanisms, non-homologous end joining (NHEJ) and homology directed repair (HDR), to either introduce insertion/deletion mutations or alter the genome using a homologous repair template at the site of the double stranded break. Electroporation of hPSCs is an efficient means of transfecting SSNs and repair templates that incorporate transgenes such as fluorescent reporters and antibiotic resistance cassettes. After electroporation, it is possible to isolate only those hPSCs that incorporated the repair construct by selecting for antibiotic resistance. Mechanically separating hPSC colonies and confirming proper integration at the target site through genotyping allows for the isolation of correctly targeted and genetically homogeneous cell lines. The validity of this protocol is demonstrated here by using all three SSN platforms to incorporate EGFP and a puromycin resistance construct into the AAVS1 safe harbor locus in human pluripotent&#160;stem cells.

Genome editing of human pluripotent stem cells (hPSCs) can be done quickly and efficiently. Presented here is a robust experimental procedure to genetically engineer hPSCs as exemplified by editing the AAVS1 safe harbor locus to express EGFP and introduce antibiotic resistance.

إنشاء الجينوم تحريره المحفزة الإنسان خطوط الخلايا الجذعية: من استهداف لعزل

Genome-editing of human pluripotent stem cells (hPSCs) provides a genetically controlled and clinically relevant platform from which to understand human ...

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse preimplantation embryos. The procedures necessary for embryo collection, immunofluorescence, imaging on a confocal microscope, and image segmentation and analysis are described. This method allows quantitation of the expression of multiple nuclear markers and the spatial (XYZ) coordinates of all cells in the embryo. It takes advantage of MINS, an image segmentation software tool specifically developed for the analysis of confocal images of preimplantation embryos and embryonic stem cell (ESC) colonies. MINS carries out unsupervised nuclear segmentation across the X, Y and Z dimensions, and produces information on cell position in three-dimensional space, as well as nuclear fluorescence levels for all channels with minimal user input. While this protocol has been optimized for the analysis of images of preimplantation stage mouse embryos, it can easily be adapted to the analysis of any other samples exhibiting a good signal-to-noise ratio and where high nuclear density poses a hurdle to image segmentation (e.g., expression analysis of embryonic stem cell (ESC) colonies, differentiating cells in culture, embryos of other species or stages, etc.).

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analysis of protein expression to study lineage specification in mouse preimplantation embryos. The procedures necessary for collection of blastocysts, whole-mount immunofluorescent detection of proteins, imaging of samples on a confocal microscope, and nuclear segmentation and image analysis are described.

تحليل كمي للتعبير البروتين لدراسة النسب مواصفات في ماوس سابق للانغراس الأجنة

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

Loss- and Gain-of-function Approach to Investigate Early Cell Fate Determinants in Preimplantation Mouse Embryos

Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene modification in preimplantation embryos provides a means to study the underlying mechanisms of genes implicated in, for instance, cellular differentiation into the trophectoderm (TE) and the inner cell mass (ICM). Here, we describe a protocol that examines the role of neogenin as an authentic receptor for initial cell fate determination in preimplantation mouse embryos. First, we discuss the experimental manipulations that were used to produce gain and loss of neogenin function by microinjecting neogenin cDNA and shRNA; the effectiveness of this approach was confirmed by a strong correlation between the pair-wise expression levels of either red fluorescent protein (RFP) or green fluorescent protein (GFP) and the immunocytochemical quantification of neogenin expression. Secondly, overexpression of neogenin in preimplantation mouse embryos leads to normal ICM development while neogenin knockdown causes the ICM to develop abnormally, implying that neogenin could be a receptor that relays extracellular cues to drive blastomeres to early cell fates. Given the success of this detailed protocol in investigating the function of a novel embryonic developmental stage-specific receptor, we propose that it has the potential to aid in exploration and identification of other stage-specific genes during embryogenesis.

The goal of this protocol is to describe a loss- and gain-of function method that is applicable to identify neogenin as a stage-specific receptor that leads to trophectoderm and inner cell mass differentiation in preimplantation mouse embryos.

Loss- ونهج كسب من وظيفة إلى التحقيق في خلية المبكر مصير محددات في سابق للانغراس أجنة الفئران

 Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene ...

Feeder-free Derivation of Melanocytes from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can direct the differentiation of hPSCs into the cell type of interest by manipulating the culture conditions to recapitulate signals seen during development. One such cell type is the melanocyte, a pigment-producing cell of neural crest (NC) origin responsible for protecting the skin against UV irradiation. This protocol presents an extension of a currently available in vitro Neural Crest differentiation protocol from hPSCs to further differentiate NC into fully pigmented melanocytes. Melanocyte precursors can be enriched from the Neural Crest protocol via a timed exposure to activators of WNT, BMP, and EDN3 signaling under dual-SMAD-inhibition conditions. The resultant melanocyte precursors are then purified and matured into fully pigmented melanocytes by culture in a selective medium. The resultant melanocytes are fully pigmented and stain appropriately for proteins characteristic of mature melanocytes.

This work describes an in vitro differentiation protocol to produce pigmented, mature melanocytes from human pluripotent stem cells via a neural crest and melanoblast intermediate stage using a feeder-free, 25 day protocol.

اشتقاق خالية المغذية من الخلايا الصباغية من الخلايا الجذعية متعددة القدرات البشرية

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can ...

Affinity Labeling Detection of Endogenous Receptors from Zebrafish Embryos

By combining the powers of Affinity Labeling and Immunoprecipitation (AFLIP), a technique for the detection of low abundance receptors in zebrafish embryos has been implemented. This technique takes advantage of the selectivity and sensitivity conferred by affinity labeling of a given receptor by its ligand with the specificity of the immunoprecipitation. We have used AFLIP to detect the type III TGF-&#946; receptor (TGFBR3), also know as betaglycan, during early zebrafish development. AFLIP was instrumental in validating the efficacy of a TGFBR3 morphant zebrafish phenotype. In the first step, embryo protein extracts are prepared and used to generate 125I-TGF-&#946;2-TGFBR3 complexes that are purified by immunoprecipitation. Later, these complexes are covalently cross-linked and revealed using SDS-PAGE separation and autoradiography detection. This technique requires the availability of a labeled ligand for, and a specific antibody against, the receptor to be detected, and shall be easily adapted to identify any growth factor or cytokine receptor that meets these requirements.

A novel technique for the detection of low abundance endogenous receptors present in zebrafish embryos is described. We have named it AFLIP because it consists of affinity labeling of the receptor by its ligand linked to immunoprecipitation.

تقارب كشف وسمها الذاتية المستقبلات من الزرد الأجنة

By combining the powers of Affinity Labeling and Immunoprecipitation (AFLIP), a technique for the detection of low abundance receptors in zebrafish ...

The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using different methods. Here, we produced iPS cells from mouse amniotic fluid cells, using a non-viral-based transposon system. All obtained iPS cell lines exhibited characteristics of pluripotent cells, including the ability to differentiate toward derivatives of all three germ layers in vitro and in vivo. This strategy opens up the possibility of using cells from diseased fetuses to develop new therapies for birth defects.

In this study, we generate induced pluripotent stem cells from mouse amniotic fluid cells, using a non-viral-based transposon system.

إنتاج الخلايا الجذعية المحفزة من الفأر الأمنيوسي الخلايا السوائل عن طريق نظام ينقول

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

Integration Free Derivation of Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Laminin 521 Matrix

Xeno-free and fully defined conditions are key parameters for robust and reproducible generation of homogenous human induced pluripotent stem (hiPS) cells. Maintenance of hiPS cells on feeder cells or undefined matrices are susceptible to batch variances, pathogenic contamination and risk of immunogenicity. Utilizing the defined recombinant human laminin 521 (LN-521) matrix in combination with xeno-free and defined media formulations reduces variability and allows for the consistent generation of hiPS cells. The Sendai virus (SeV) vector is a non-integrating RNA-based system, thus circumventing concerns associated with the potential disruptive effect on genome integrity integrating vectors can have. Furthermore, these vectors have demonstrated relatively high efficiency in the reprogramming of dermal fibroblasts. In addition, enzymatic single cell passaging of cells facilitates homogeneous maintenance of hiPS cells without substantial prior experience of stem cell culture. Here we describe a protocol that has been extensively tested and developed with a focus on reproducibility and ease of use, providing a robust and practical way to generate defined and xeno-free human hiPS cells from fibroblasts.

Robust derivation of human induced pluripotent stem (hiPS) cells was achieved by using non-integrating Sendai virus (SeV) vector mediated reprogramming of dermal fibroblasts. hiPS cell maintenance and clonal expansion was performed using xeno-free and chemically defined culture conditions with recombinant human laminin 521 (LN-521) matrix and Essential E8 (E8) Medium.

التكامل الانشطار الحرة من الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان المستحث باستخدام مصفوفة لامينين 521

Xeno-free and fully defined conditions are key parameters for robust and reproducible generation of homogenous human induced pluripotent stem (hiPS) ...