Yazarlar, şırınga ve iğne tekniğine uyum konusunda yardım için sinirsiz hayvanlar üretmek ve sürdürmek için orijinal protokol olan Bayan Rui Wang ile Bayan Danielle Hagstrom ve Dr. Rob Steele&#39;in görüşleri için Dr. Dick Campbell&#39;e (UC Irvine) teşekkür ederler. (UC Irvine) el yazması üzerine yorumlar. Bu çalışma RCSA ve NSF hibe CMMI-1463572 tarafından desteklenmiştir.

1. Çift Kolşisin Tedavisi <ol><li> Hydra medium 3 , 4 , 17&#39;de % 0.4 kolşisin (ağırlık / hacim) solüsyonu yapın. Dikkat: Kolşisin akut toksiktir, yutulduğunda ölümcüldür, genetik kusurlara neden olabilir ve göz hasarına neden olabilir. Tozu bir duman davlumbağında tutun ve eksiksiz Kişisel Koruyucu Donanım (PPE) giyin. </li><li> Karpitte oda sıcaklığında 8 saat süreyle bir Petri kabında kolşisin solüsyonu mL&#39;si başına 5 Hydra oranında% 24&#39;lük kolşisin içinde 24 saat aç bırakılan Hydra vulgaris&#39;i (burada AEP türü kullanıldı) inkübe edin. Not: 5 Hydra / mL kolşisin, Hydra ile çanak kalabalıktan kaçınmak için ne kadar çözüm bulunacağını belirlemek için bir kılavuzdur. Sonraki temizleme ve çözüm değişiklikleri için aynı çözelti hacmini kullanın. </li><li> Kolşisin solüsyonunu çıkarın ve yerine koyun.Kolchicine içermeyen temiz Hydra ortamı ile. Hydra ortamında 50 μg / mL rifampisin&#39;e aktarmadan önce, bir cam Pasteur pipetiyle seri bir transferle temiz Hydra ortamına 5 kez Yıkayın. Hydra&#39;yı 18 ° C inkübatörde saklayın. Not: 1-2 haftalık tedavi için dimetil sülfoksid (DMSO) içinde yeterli 1.000X rifampisin stoğu (50 mg / mL) 4 ° C&#39;de saklanabilir. Kesin miktar, her gün kullanılan toplam çözelti hacmiyle belirlenebilir. Örneğin her biri günde iki kez değiştirilmesi gereken 10 mL solüsyon içeren 2 yemek varsa, günde bir 1000X stoktan 40 μL veya 560 μL&#39;ye tekabül eden toplam 40 mL solüsyon kullanılacaktır Iki haftalık bir süre zarfında. Stok, daha sonra, kullanım üzerine Hydra ortamında 1: 1000 oranında seyreltilir. Dikkat: DMSO yanıcı bir sıvıdır ve cilde kolayca nüfuz eder ve vücuda diğer çözünmüş kimyasallara izin verir. ElSolventi duman kaputunda tutun ve tam KKD giyin. Not, DMSO 4 ° C&#39;de donar </li><li> Rifampisin içeren Hydra maddesini, günde iki kez değiştirin, Hydra , hücreleri ortamdan çıkardığı sürece genellikle tedaviden 1 hafta sonrasına kadar durdurun. Bu noktada, orta günlük olarak değiştirilebilir. Tedaviyi takip eden günlerde Hydra , elindeki dokunduruklarını tamamen kaybedecektir. Birbirlerine kaynaştırabilir ve tuhaf şekilli Hydra ile sonuçlanacak şekilde, Hydra&#39;yı birbiriyle temastan kaçının ( Şekil 2 A ). <ol><li> Temas etmesini önlemek için çanağı dairesel hareketlerle döndürmeyin. Bunun yerine, Hydra ayrılıncaya kadar çanağı dikey ve yatay yönde hafifçe çalkalayın. Hydra&#39;yı 18 ° C inkübatöre yerleştirdikten sonra kabı muayene edin ve gerektiği gibi ayarlayın. Not: Ortamın iki kez değiştirildiği günler için ortamı değiştirinSabah bir kez ve öğleden sonra / akşam tekrar. </li></ol></li><li> Tendak oluşmaya başladıktan sonra, haftada 3-4 kez Hydra&#39;yı zorla besleme ve buruşmaya başlayın (bkz. Bölüm 2 ve 3). Kolşisin tedavisini takiben yaklaşık 8-9 gün içinde Hydra , ellerini geri almaya başlayacak. Not: Tentacle yeniden büyüme bireyler arasında değişir. Bazıları, tentacle büyüme belirtileri göstermeden önce 8 - 9 gün daha uzun sürebilir. Duyularını yeniden canlandırmayan ve garip bir şekilde şekillendirilmiş olan ( Şekil 2 B ) hayvanlar veya beslenemeyecek kadar küçük hayvanlar kaldırılmalıdır. Bu Hydra , muhtemelen ikinci tedaviden sağ kalamayacak. Hydra da tomurcuklanabilir. Bununla birlikte, tomurcuklardan bazılarının hala interstisyel hücreleri olabilir ve kendi başına yiyebilirler. <ol><li> Destek almadan yiyebilecek ve ana hayvandan ayrışabilen tomurcukları çıkartın. Canlı Artemia&#39;yı bu canlılara ekleyerek bu hayvanları tanımlayın.Çanağı beslemek ve hayvanların Artemia&#39;yı kendi başına yakalayıp yemediklerini gözlemlemek. 1 veya 2 Hydra kendi başına yiyebilir. Bunlar da atılmalıdır. Not: Sinirsiz Hidra , karakteristik bir balon benzeri morfolojiye ve normalden daha kısa ve daha incedir (nematosit kaybına bağlı olarak) olan dokunaçlara sahiptir ve bu nedenle kolayca normal görünümlü hayvanlardan ayırt edilebilir ( Şekil 1A, 1B ). </li></ol></li><li> İlk kolşisin tedavisinden üç hafta sonra, kolşisin tedavisini tekrarlayın (adım 1.1 - 1.5). Geride kalan interstisyel hücreleri ve sinir hücrelerini ortadan kaldırmak için ikinci bir kolşisin tedavisi gereklidir 3 . </li></ol> 2. Kuvvet Besleme <ol><li> Artemia kistlerini, daha daralacak dar ve uzun bir cam kaba ekleyin. Kabı Artemia su (6.72 M NaCl) ile doldurun. Exce&#39;den kaçınınDaha yüksek bir kapak verimliliği için 1 L suya 1 g kist oluşturur. <ol><li> Konteynerin üstünü parafilm ile örtün ve parafilm yoluyla kutuya 10 mL&#39;lik bir serolojik pipet yerleştirin. Bir akvaryum hava pompasına boru bağlayarak ve boruyu pipetin etrafına takarak havalandırma sağlayın. Pipet ucunun kabın tabanına ulaştığından ve alt kısmına hiçbir kist yerleşmediğinden emin olun. Artemia 48 saat sonra açılacak. Not: Artemia&#39;yı açmanın , aynı şekilde işe yarayacak birçok farklı yolu vardır. </li></ol></li><li> Bir Artemia ağında Artemia suyundan Artemia suyundan Strain (akvaryum tedarik şirketlerinden temin edilebilir) ve onları Hydra ortamı içeren bir çanağa koymadan önce yaklaşık 20 saniye boyunca DI suda yıkayın. Artemia suyunun tuzluluğu Hydra için çok yüksektir, bu nedenle Artemia kullanılmadan önce yıkanmalıdır. </li><li> Bir diseksiyon mikroskopu altında,Artemia&#39;yı bir çift ince forsepsle hafifçe sıkarak euthanize edin. Bağırsakları atmak için yeterince sert sıkmayın, çünkü bu forseps&#39;e yapışacak ve beslemeyi zorlaştıracaktır. Artemia&#39;yı Hydra&#39;ya vermeden önce hafifçe sıkıştırmak sindirim sürecinde yardımcı olacaktır 14 . Hızlı bir şekilde beslenmeyi kolaylaştırmak için yeni öldürülmüş Artemia&#39;yı çanak içindeki Hydra&#39;nın yakınına yerleştirin. Not: Sonraki tüm basamaklar bir diseksiyon mikroskopu altında yapılır. </li><li> Hydra&#39;yı pedanküle tutmak için bir çift forseps kullanın. Hydra&#39;yı besleme işlemi sırasında pedikül tutmaya devam edin. İkinci bir forseps kullanarak, Hydra sözleşmesini yapmak için vücut sütununu sıkıştırın. </li><li> İkinci forseps ucunu birlikte tutarken hipostomun merkezine dokunun (hayvanın ağız ucundaki kubbeli yapı). Bu bazen ağzın açılmasına neden olur. benF ağza dokunarak açılmıyorsa, forospu hipostomun merkezine ekleyerek ağzı delin ve ardından forsepsin uçlarındaki basıncı hafifçe bırakın. Bu, ponksiyondan yapılan ağız açıklığını uzatmalıdır. Not: Ağız açıldığında Hydra sönebilir ve çökebilir ( Şekil 2 C ). Bu gerçekleşirse, Artemia hala Hydra&#39;ya sokulabilir. Bunu yapmak çok zorsa, bir sonraki Hydra&#39;ya geçin ve bir süre sonra orijinal Hydra&#39;ya dönün ve tekrar deneyin. Hydra, müteakip ağız açıklıklarında o kadar fazla havalandırma eğiliminde değildir. </li><li> Artemia&#39;yı forsepsle çabucak kaldırın ve onları Hydra&#39;nın mide boşluğuna sokun. Mide boşluğu dolana kadar Artemia&#39;yı olabildiğince çok takın ve Artemia Hydra&#39;ya zarar vermeden yerleştirilemez, kazaMüttefiki içerideki herhangi bir Artemi&#39;yi çekip çıkarmak veya ağzın kapanmasını önlemek. Ortalama olarak, bu 5 - 6 Artemia , ancak 12&#39;ye kadar olanı büyük hayvanlara besleniyor. <ol><li> Ağız kapanmaya başlarsa, yukarıda açıklandığı gibi forsepsle tekrar gerin; Bununla birlikte, hayvanın içindeki Artemia ağız yeniden açıldığında çıkmaya başlayabileceği için dikkatli olunmalıdır. </li><li> Hydra bütün bir Artemia için çok küçükse Artemia&#39;yı bir neşter yardımıyla kesip Hydra&#39;yı daha küçük parçalara koyun. Artemia Hydra&#39;nın içinde kalmazsa forsepsleri Artemia&#39;ya karşı basarak ağzı kapatana kadar Hydra&#39;nın içinde tutmak gerekebilir. </li></ol></li><li> Hydra ortamında taze 50 μg / mL rifampisin içeren bir çanağa yanlışlıkla buruşturmayı önlemek için dikkatli bir şekilde cam Pasteur pipetiyle birlikte Hydra&#39;yı gönderin. Bir Artemia kovulduysaTransfer ederken Hydra&#39;yı yeni yemeğe getirirken tekrar takın. Not: Hidra&#39;yı plastikle karşılaştırıldığında camın camdan daha az yapıştığını tespit ettiği için, bir cam pipetle Hydra aktarılır. Pipet uzunluğu önemli değil, ancak 5 inç pipetler kullanmak biraz daha kolay olabilir. </li></ol> 3. Burping <ol><li> Beslenmeden 8 ila 20 saat sonra herhangi bir zamanda sindirilmemiş materyali gidermek için Hydra&#39;yı yırtın. </li><li> İpucu düz olana kadar P320 veya benzeri kum zımpara kağıdıyla 30G&#39;lik bir hipodermik iğne noktasını kumlayın. Not: 27G derialtı iğne de işe yarayabilir, ancak yüksek göstergenin küçük ucu tercih edilir. </li><li> İğneyi tek kullanımlık 1 mL plastik şırınga üzerine takın ve şırıngayı Hydra ortamında taze 50 μg / mL rifampisin ile doldurun. Not: Tek bir Hidra atmak, 0,05 mL ila 0.1 mL çözeltiyi alır. 1 mL syriDaha büyük hacimli bir şırınga ile ortaya çıkan solüsyonun kuvvetini ve hacmini kontrol etmek daha zor olduğundan nge tercih edilir. </li><li> Bir diseksiyon mikroskopu altında, ince noktalı forseps ile Hydra pedankül tutun ve iğne ile hipostom merkezinde dokunun. Ağız açılmazsa, hipospata püskürtücüler sokun ve yukarıda tarif edildiği gibi ağzını besleme için açın. Not: Sonraki tüm basamaklar bir diseksiyon mikroskopu altında yapılır. </li><li> Tüm hayvanın, mide boşluğunun, 50 mikrogram / mL rifampisin solüsyonuyla, tüm artıklar atılıncaya kadar üflenmesini önlemek için, şırıngayı boşaltmak için hafifçe yıkayın. Hidra ölçüsü izin vermiyorsa, iğnenin mutlaka Hydra&#39;ya sokulması gerekmez. İğne, ağız açıklığına yakın tutulabilir ve doğrudan ağza doğru işaret edilebilir. </li><li> Bir cam Pasteur pipet kullanarak, kesilmiş Hydra&#39;yi taze 50&#39;lik bir çanağa aktarın81, g / mL rifampisin, Hydra ortamında. </li></ol> 4. İmmünohistokimya ile Kalite Kontrolü NOT: Aşağıdaki protokol, Shenk, M.A ve arkadaşlarının protokollerinden adapte edilmiştir . 18 ve Böttger, A 19 . Aksi belirtilmediği sürece, tüm basamaklar oda sıcaklığında (RT) yapılır. Kuluçka adımları için bir besleyici kullanılabilir ve boyama kalitesini artırabilir. Bununla birlikte, Hydra birbirine yapışmış olursa, tüm basamaklar olmadan da yapılabilir. <ol><li> Bloke edici çözeltiyi hazırlayın: 1x fosfat tamponlu salin (PBS) içinde% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 DMSO. Kullanana kadar bu solüsyonu 4 ° C&#39;de saklayın (adım 4.6 ve 4.11). Çözüm 1 - 2 gün boyunca saklanabilir. Not: Bu protokolde kullanılan tüm özümler tehlikeli atık olarak doğru bir şekilde toplanmalıdır. </li><li> Hydra&#39;yı 200 μL% 2 üretan içinde Relax Hydra m1.7 mL mikrosantrifüj tüpleri içinde 1 dakika süreyle. Sinirsiz , işlenmemiş, birincil antikor kullanılmadan işlenmiş ve ikincil antikorsuz işlem görmemiş halde, tüp başına 5 Hydra kullanın. Not: 1 dakikanızı aşmayın. Üretkenlikte çok fazla zaman geçtikten sonra hayvanlar kötü şekil alacağından burada zamanlama önemlidir. </li><li> Üretanı çıkarın ve Hydra&#39;yı 200 uL% 4 paraformaldehid (PFA) içinde, Hydra ortamında 15 dakika sabitleyin. </li><li> Numuneleri, her biri için 10 dakika boyunca 3 kez 1x PBS ile yıkayın. Not: PBS ve PBSTx ile yapılan tüm yıkamalar 500 mcL solüsyon ile yapılır. </li><li> PBS içinde 500 μL% 0.5 Triton X-100 ile 15 dakika süreyle geçirgen hale getirin. </li><li> % 0.5 Triton X-100&#39;ü çıkarın ve bloke edici çözeltiden 500 μL ekleyin. Numuneleri en az 1 saat boyunca bloke edin. </li><li> Bloke edici çözeltide anti-tirozin-tübülin antikoru 1: 200 seyreltin. Not: Bu konsantrasyon deDeneysel olarak sona erdirildi. Kontrollerdeki sinyalin çok zayıf olduğu tespit edilirse konsantrasyonun arttırılması gerekebilir. Spesifik olmayan bağlanma varsa, konsantrasyonun azaltılması gerekebilir. Antikorun önceden kuluçkalanması ayrıca, spesifik olmayan bağlanmayı azaltabilir. </li><li> Numunelerdeki bloke edici çözeltiyi çıkarın ve primer antikorun 200 μL&#39;ini sinirsiz Hydra&#39;ya , muamele edilmemiş kontrollere ve ikincil olmadan muamele edilmemiş kontrollere ekleyin. Primer olmayan muamele edilmemiş kontroller için, antikor olmaksızın sadece 200 uL engelleyici çözelti ekleyin. </li><li> Numuneleri gece boyunca (&gt; 12 saat) 4 ° C&#39;de inkübe edin. Not: Alternatif olarak, oda sıcaklığında 5-6 saat inkübe edin. </li><li> Birincil antikoru çıkarın ve numuneleri 1x PBS&#39;de (PBSTx)% 0.3 Triton X-100 ile geniş bir şekilde yıkayın. Not: Birincil antikoru saklayın ve 4 ° C&#39;de saklayın, çünkü en az 2 - 3 kez tekrar kullanılabilir. </li><li> Seyreltik keçi anti-fare hP ikincil antibOdaklama 1: 500 engelleme çözümünde. Sinir içermeyen Hydra&#39;ya , muamele edilmemiş kontrollere ve birincil olmayan muamele edilmemiş kontrollere 200 uL ekleyin. İkincil olmayan muamele edilmemiş kontroller için, sadece antikor olmadan 200 uL engelleyici çözelti ekleyin. Not: Alternatif olarak, flüoresans sekonder antikor kullanılabilir, bunun için 4.13 - 4.17 basamaklarına ihtiyaç yoktur. Bir flüoresan ikincil kullanmak zaman tasarrufu sağlar ve genellikle yeterli ancak hP ikincil artan hassasiyet sağlar. İkincil konsantrasyon deneysel olarak belirlendi. Kontrollerdeki sinyaller çok zayıfsa, konsantrasyonun arttırılması gerekebilir. Spesifik olmayan bağlanma varsa, konsantrasyonun azaltılması gerekebilir. </li><li> Örnekleri gece boyunca 4 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> İkincil antikoru çıkarın ve numuneleri PBSTx ile yoğun bir şekilde yıkayın. </li><li> 1x PBT hazırlayın: 1x PBS içinde% 0,2 sığır serumu albumin (ağırlık / hacim) ve% 0.05 Tween20. Bunları kuluçkalayın30 dakika boyunca 1x PBT&#39;de amples. </li><li> 1x PBT&#39;yi çıkarın ve karanlıkta 15 dakika 1x PBT&#39;de 1: 1000 NHS-floresein ve 1: 10,000 H 2 O 2 içindeki örnekleri inkübe edin. Işıklara maruz kaldıkça flüoresan sinyali düşeceğinden, bu adımdan itibaren örnekleri mümkün olduğunca karanlıkta tutun. Not: NHS-floresein, ayrıntılı bir FISH protokolünü takiben King, RS ve Newmark, PA 20 </li><li> Numuneleri PBSTx ile hızlı bir şekilde 3 kez, daha sonra 30 dakika boyunca 2 kez yıkayın. </li><li> Yıkamaya devam etmek için numuneleri PBSTx&#39;de gece boyunca 4 ° C&#39;de bırakın. </li><li> 1x PBSTx ile birkaç kez daha yıkayın. Hücrenin çekirdeklerini görselleştirmek için, 4 &#39;, 6-diamindino-2-fenilindol, dihidroklorür (DAPI) kullanılarak DNA saykırması için aşağıdaki opsiyonel adımları uygulayın. Aksi halde, numuneler şimdi görüntülenecektir. </li><li> PBSTx&#39;de 5 mg / mL DAPI stokunu 1: 500&#39;lük bir konsantrasyona seyreltin ve her tüpe 200 uL ekleyin. incuÖrnekleri 30 dakika bekletin. Dikkat: DAPI bilinen bir kanserojendir. Tam KKD giyin. </li><li> DAPI kaldırın ve floresan mikroskopi ile görüntüleme önce numuneleri PBSTx ile 2-3 kez yıkayın. </li></ol>

<ol>
	<li>Bode, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interstitial+cell+lineage+of+Hydra:+a+stem+cell+system+that+arose+early+in+evolution.">The interstitial cell lineage of Hydra: a stem cell system that arose early in evolution.</a> J. Cell. Sci. 109, 1155-1164 (1996).</li><li>Hager, G., David, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+of+differentiated+nerve+cells+in+hydra+is+determined+by+precursor+migration.">Pattern of differentiated nerve cells in hydra is determined by precursor migration.</a> Development. 124, 569-576 (1997).</li><li>Campbell, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elimination+of+Hydra+interstitial+and+nerve+cells+by+means+of+colchicine.">Elimination of Hydra interstitial and nerve cells by means of colchicine.</a> J. Cell. Sci. 21, 1-13 (1976).</li><li>Marcum, B. A., Campbell, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+Hydra+lacking+nerve+and+interstitial+cells.">Development of Hydra lacking nerve and interstitial cells.</a> J. Cell. Sci. 29, 17-33 (1978).</li><li>Burns, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3H-colchicine+binding:+Failure+to+detect+any+binding+to+soluble+proteins+from+various+lower+organisms.">3H-colchicine binding: Failure to detect any binding to soluble proteins from various lower organisms.</a> Exp. Cell. Res. 81, 285-292 (1973).</li><li>Lee, H. -. T., Campbell, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+Behavior+of+an+Intergeneric+Chimera+of+Hydra+(Pelmatohydra+oligactis+Interstitial+Cells+Hydra+attenuata+Epithelial+Cells).">Development and Behavior of an Intergeneric Chimera of Hydra (Pelmatohydra oligactis Interstitial Cells Hydra attenuata Epithelial Cells).</a> Biol. Bull. 157 (2), 288-296 (1979).</li><li>Novak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparing+Hydra+viridis+with+Nerve+Cells+and+No+Interstitial+Cells,+or+with+Neither+of+These+Cell+Types.">Preparing Hydra viridis with Nerve Cells and No Interstitial Cells, or with Neither of These Cell Types.</a> Hydra: Research Methods. , 295-297 (1983).</li><li>Wanek, N., Marcum, B. A., Lee, H. -. T., Chow, M., Campbell, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+hydrostatic+pressure+on+morphogenesis+in+nerve-free+Hydra.">Effect of hydrostatic pressure on morphogenesis in nerve-free Hydra.</a> J. Exp. Zool. 211, 275-280 (1980).</li><li>Minobe, S., Koizumi, O., Sugiyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+cell+differentiation+in+nerve-free+tissue+of+epithelial+Hydra+from+precursor+cells+introduced+by+grafting.">Nerve cell differentiation in nerve-free tissue of epithelial Hydra from precursor cells introduced by grafting.</a> Dev. Biol. 172 (1), 170-181 (1995).</li><li>Miljkovic-Licina, M., Chera, S., Ghila, L., Galliot, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Head+regeneration+in+wild-type+hydra+requires+de+novo+neurogenesis.">Head regeneration in wild-type hydra requires de novo neurogenesis.</a> Development. 134 (6), 1191-1201 (2007).</li><li>Wenger, Y., Buzgariu, W., Galliot, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+neurogenesis+in+Hydra+leads+to+compensatory+regulation+of+neurogenic+and+neurotransmission+genes+in+epithelial+cells.">Loss of neurogenesis in Hydra leads to compensatory regulation of neurogenic and neurotransmission genes in epithelial cells.</a> Phil. Trans. R. Soc. B. 371 (20150040), (2015).</li><li>Campbell, R. D., Josephson, R. K., Schwab, W. E., Rushforth, N. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitability+of+nerve-free+Hydra.">Excitability of nerve-free Hydra.</a> Nature. 262, 388-390 (1976).</li><li>Takaku, Y., Hwang, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innexin+gap+junctions+in+nerve+cells+coordinate+spontaneous+contractile+behavior+in+Hydra+polyps.">Innexin gap junctions in nerve cells coordinate spontaneous contractile behavior in Hydra polyps.</a> Sci. Rep. 4 (3573), (2014).</li><li>Marcum, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+Epithelial+Hydra.">Culturing Epithelial Hydra.</a> Hydra: Research Methods. , 287-290 (1983).</li><li>David, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+method+for+maceration+of+Hydra+tissue.">A quantitative method for maceration of Hydra tissue.</a> Wilhelm Roux Arch. Entwickl. Mech. Org. 171, 259-268 (1973).</li><li>Gr&#246;ger, H., Schmid, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Larval+development+in+Cnidaria:+A+connection+to+Bilateria.">Larval development in Cnidaria: A connection to Bilateria.</a> Genesis. 29 (3), 110-114 (2001).</li><li>Lenhoff, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Water,+Culture+Solutions,+and+Buffers.">Water, Culture Solutions, and Buffers.</a> Hydra: Research Methods. , 29-34 (1983).</li><li>Shenk, M. A., Bode, H. R., Steele, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+Cnox-2,+a+HOM/HOX+homeobox+gene+in+hydra,+is+correlated+with+axial+pattern+formation.">Expression of Cnox-2, a HOM/HOX homeobox gene in hydra, is correlated with axial pattern formation.</a> Development. 117, 657-667 (1993).</li><li>B&#246;ttger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Horizontal+Gene+Transfer+Contributed+to+the+Evolution+of+Extracellular+Surface+Structures:+The+Freshwater+Polyp+Hydra+Is+Covered+by+a+Complex+Fibrous+Cuticle+Containing+Glycosaminoglycans+and+Proteins+of+the+PPOD+and+SWT+(Sweet+Tooth)+Families.">Horizontal Gene Transfer Contributed to the Evolution of Extracellular Surface Structures: The Freshwater Polyp Hydra Is Covered by a Complex Fibrous Cuticle Containing Glycosaminoglycans and Proteins of the PPOD and SWT (Sweet Tooth) Families.</a> PLoS One. 7 (12), (2012).</li><li>King, R. S., Newmark, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization+protocol+for+enhanced+detection+of+gene+expression+in+the+planarian+Schmidtea+mediterranea.">In situ hybridization protocol for enhanced detection of gene expression in the planarian Schmidtea mediterranea.</a> BMC Dev. Biol. 13 (8), (2013).</li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Hydra interstisyel hücreler, çift kolşisin tedavisi 3 , 4 ile ortadan kaldırılabilir. İlk tedaviyi izleyen günlerde, Hydra parçalarının deforme olmuş Hydra&#39;ya kaynaşmasını önlemek için bireysel Hydra arasındaki temastan kaçınmak önemlidir. Ayrıca, ilk tedaviyi takiben yiyebilen hayvanlar kaldırılmalıdır çünkü ikinci kolşisin tedavisi bu tür hayvanlardan kalan interstisyel hücreleri ortadan kaldırmak için yeterli olmayabilir. İkinci kolşisin tedavisinden sonra sinirsiz Hydra&#39;nın hayatta kalma oranını en üst düzeye çıkarmak için, hayvanlar, ilk tedaviden sonra mümkün olduğunca çok Artemia ile beslenmelidir; beslenmeler arasında 1-2 gün arasında iyileşme ve büyüme sağlanmalıdır. Her bir kolşisin tedavisi, hücrelerin alınmasıyla birlikte Hydra&#39;nın büyüklüğünü önemli ölçüde azaltır, bu nedenle Hydra&#39;nın her tedaviden önce ne kadar büyük olduğu bHydra&#39;nın beslenebileceği ve muhafaza edilebilecek bir büyüklüğe kavuşması ihtimalini ortadan kaldırın. Her tedaviden sonra Hydra&#39;nın hayatta kalma oranının düşük olması nedeniyle birçok Hydra ile başlamak arzu edilebilir. Bununla birlikte, aynı anda çok fazla Hydra&#39;ya tedavi başlatılması konusunda dikkatli olunmalıdır. Bu, ilk tedaviyi takiben beslenmeyi zorlaştırır ve çok zaman alıcıdır. İlk tedaviden sonra iyi beslenen hayvanlar daha büyük boyutlara ulaşırlar ve bu nedenle ikinci tedaviden sonra daha yüksek sağkalıma sahiptirler. Bu nedenle, daha azıyla başlamak ve daha iyi beslenmeye odaklanmak daha üretken olabilir. Genel olarak, 50 - 100 hayvandan başlayarak 1-2 kişiye kadar yönetilebilir. En iyi Hydra ile başlamak en iyisidir, çünkü bunlar iki tedaviden daha iyi kurtulacaktır. Burada açıklanan sinir hücrelerinin eksik olduğu Hydra&#39;nın zorla beslenmesi ve buruşturulması yöntemi, daha güvenli, basit ve daha fazla zamanGeçmişte açıklanan yöntemlere göre verimli, 3 , 4 , 14 . Piyasada satılan forsepslerin ve şırıngaların kullanılması elle çekilen mikropipet uçlarının gereğini ortadan kaldırır, bu da zaman alıcı ve yapmak zordur. Bu araçların kullanımı da ağız-pipet ihtiyacını ortadan kaldırır. Forseps kullanarak zorla besleme ilk bakışta zor olabilir, ancak yeterli zaman ve uygulama göz önüne alındığında, oldukça kolay ve verimli hale gelir. Önce, aletlerle ne kadar güç kullanılacağı ve Hydra&#39;yı nasıl manipüle edebileceğini hissetmek için, normal yutmayı beslemek ve buruşmak için pratik yapmalıdır. Çeşitli forsepsler ve iğne ebatları, kuvvet besleme ve burping için en uygun aletleri bulmak için test edildi. Burada tarif edildiği gibi antikor boyanın kullanılması hipostomdaki sinir hücrelerinin yokluğunu kontrol etmek için yeterlidir. Tüm interstisyel hücrelerin ortadan kaldırılmasını sağlamak için, hayvanlara maceralı hale getirilebilir veMevcut hücrelerin türleri incelenebilir 15 .

Hydra&#39;nın sinir sistemi, her iki epiteliyal doku katmanı 1 ile ilişkili sinir hücrelerinden oluşan bir sinir ağından oluşur. Sinir ağı hipostom ve pedunkülde yoğunlaşır ve vücut kolonu 2&#39;de daha az yoğun olur. Sinir hücreleri, sekresyon hücreleri, nematositleri, germ hücreleri ve nöronları oluşturan multipotent kök hücreler olan interstisyel kök hücrelerden kaynaklanır 1 . Bölücü hücreleri öldüren bitki kaynaklı bir toksin olan kolşisin 3 , 4 ile tedavi ederek Hydra vulgaris&#39;in interstisyel hücrelerini ortadan kaldırmak mümkündür. Kolşisin, diğer organizmalarda mikrotübül polimerizasyonunu inhibe ettiği tespit edilmesine rağmen, bir önceki çalışmada, tüm tedavi boyunca Hydra&#39;da mikrotübüllerin bulunduğunu ve bu da kolchisinin Hydra 3&#39;de bu şekilde davranmadığını ortaya koymuştur. Başka bir stUdy, Tetrahymena pyriformis, Zea mays, Chlamydomonas ve Schizosaccharomyces pombe gibi bazı organizmalarda kolşisin tübüline etkili bir şekilde bağlanmadığını ve bu farkı açıklayabileceğini önermektedir. Kolşisin tedavisi interstisyel hücrelerin endoderm epitel hücreleri 3 tarafından fagositozunu indükler ve böylece sinir hücreleri, bez hücreleri ve nematositlerden yoksun olan hayvanların yaratılmasına izin verir. İnterstisyel hücrelerin neden özellikle kolşisin tedavisine duyarlı olduğu belirsizdir. Hem post-mitotik interstisyel hücreler hem de interstisyel kök hücre dizisi hasar görmüş ve fagositozlanmış olduğu göz önüne alındığında, Campbell, kolşisin mitotik aktiviteyi doğrudan etkilemediği sonucuna varmıştır3. Özellikle, kolşisin tedavisi Hydra vulgaris&#39;de iyi işliyor ancak Hydra oligactis 6 gibi diğer türlerde de çalışmadığı gösterilmiştir . </Em&gt; Sinirsiz Hydra viridis 7&#39;yi üretmek için kolşisin ve hidroksiüre ile değiştirilmiş bir tedavi kullanılabilir. Sinirsiz Hidra (bazen &quot;epitel Hydra &quot; 8 olarak da ifade edilir) doku homeostazı ve rejenerasyonundaki interstisyel hücre soylarından bu özel hücre tiplerinin rollerini incelemek için yararlı bir araçtır. Hidra , sinir sistemi olmadan yaşayabilen, bilinen tek hayvan örneği olabilir. Sinirsiz Hidra , Hydra rejenerasyonunu, homeostazı ve davranışı düzenleyen sinir ağı rolünü kesmek için özellikle yararlı bir model olarak hizmet eder. Örneğin, interstisyel hücrelerin sinirsiz Hidra&#39;ya greft yoluyla verilmesi, sinir hücrelerinin farklılaşmasının karakterize edilmesi için oldukça bölgeye özel 9 sağlar . Dahası, sinirsiz Hydra yeniden üretebilir, çünküAlternatif, sinir sisteminden bağımsız rejenerasyon yolaklarının araştırılmasını mümkün kılmaktadır. Böyle bir örnek, vahşi tip Hydra&#39;da sinir sisteminde cnox-2 fonksiyonuna bağlı olduğu gösterilmiş olan apikal nevrojenez ve kafa oluşumudur, ancak sinirsiz Hydra&#39;da vazgeçilmez görünmektedir ve alternatif bir kafa rejenerasyon işlemi olabileceğini düşündürmektedir 10 . Sinirsiz Hidra ayrıca nörojenezin 11 kaybı sonrası epitel hücre ekspresyonunu ve nörojenik ve nörotransmisyon genlerinin düzenlenişini incelemek için kullanılmıştır. Sinirsiz Hidra spontan kontraksiyon patlamaları 12 göstermez, bu patlamaların sinir sistemi tarafından düzenlendiğini gösterir. Bununla birlikte, sinirsiz Hydra vücut sütununu forsepsle tutarak yanıt olarak kontrendikçe, mekanik uyarılara yanıt olarak daralmanın bağlanma yoluyla sağlandığını düşündürmektedirGh boşluk kavşakları, spontan kontraktil davranış ise sinir hücrelerindeki boşluk kavşaklarından geçerek sağlanır 13 . Sinirsiz Hidra ağızlarını yiyecek veya azalan glutatyon 3 ile birlikte açtığınızda açmaz; bu, duyusal nöronların gıdaların mevcudiyetini tespit etmek ve ağzın açılması için sinyal vermesi gerektiğini gösterir. Buna ek olarak sinir ağı, ozmotik basıncın algılanmasında bir rol oynuyor gibi görünmektedir, çünkü sinirsiz hayvanlar kendi ağızlarındaki açılma yoluyla iç hidrostatik basıncını özerk bir şekilde kontrol edememektedir, bu da karakteristik balon benzeri görünümünü 3 , 4&#39;e çıkarmaktadır ( Şekil 1B ). Sinirsiz Hidraktaki hidrostatik basıncın sık manuel deflasyonla düzenlenmesi hipostome ve vücut kolonunda bazı anormal morfolojilerin kaybına neden olmuştur. Bununla birlikte, kronik deflasyon büyümeye müdahale etmiştir.Tomurcuklanma ve doku organizasyonu 8 . Her ne kadar sinirsiz Hydra kendi başlarına beslenemez ve üreyemezse de, her hayvanı elle zorla besleyip burping ederek laboratuvarda süresiz olarak korumak mümkündür. Önceki yayınlar, sinirsiz Hydra&#39;nın zorla beslenmesi ve buruşturulması yöntemlerini tarif etmiştir, ancak bu protokoller elle uygun boyuta çekilmesi gereken mikropipet uçlarının yanı sıra pipete 14 boruyla bağlanmış bir ağızlığın kullanılmasıyla ilgilidir. Burada, daha basit, daha güvenli ve daha zamandan tasarruf sağlayan besleme ve burping yöntemi anlatılmıştır. Buna ek olarak, daha önceki çalışmalar, sabit hayvanların bireysel hücrelere ayrılması ve hücre morfolojisinin incelenmesi yoluyla 3 , 4 , 15 nolu sinir hücrelerinin yokluğunun kontrol edilmesini içermektedir. &#39;HHipostomda nöronların tükenmesini kontrol etmek için makulasyon için tamamlayıcı bir yöntem olarak alfa-tübülinin tirozin karboksil terminaline karşı bir monoklonal antikor ile immünohistokimya kullanılmıştır 13,16. Önceki çalışmalar, pedanküldeki nöronların da bu antikor 13 kullanılarak görselleştirilebileceğini göstermiştir, ancak bu nöronların yanı sıra vücut kolonundaki nöronların da bulunması daha zordur. İmmünohistokimya hipostomdaki sinir hücrelerinin yokluğunu teyit etmek için yeterlidir ve hücre tipi morfolojide uzmanlık gerektirmezken, interstisyel kök hücrelerin ve bu hücrelerin diğer türevlerinin yokluğunu kontrol etmek için kullanılamaz. Ayrışma ve hücre morfolojisi çalışmaları daha titizdir ve tedavinin her aşamasından sonra kalan her hücre türünün sayısal bir hesabını verebilir.

<table><tbody><tr><td>Colchicine</td><td>Acros Organics</td><td>227120010</td><td></td></tr><tr><td>1 mL Syringe</td><td>BD</td><td>301025</td><td></td></tr><tr><td>Brine Shrimp Eggs</td><td>Brine Shrimp Direct</td><td>N/A</td><td>Can be purchased locally</td></tr><tr><td>Brine Shrimp Hatchery Dish</td><td>Brine Shrimp Direct</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>60 mm x 15 mm Petri Dish</td><td>Celltreat</td><td>229663</td><td></td></tr><tr><td>30 G x 3/4&quot; Hypodermic Needle</td><td>Covidien</td><td>1188830340</td><td>A 27G needle may also be used</td></tr><tr><td>2 x Fine-tip Tweezers</td><td>Dumont</td><td>0109-5-PO</td><td></td></tr><tr><td>Rifampicin</td><td>EMD Millipore</td><td>557303</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-mouse lgG, Pab (HRP Conjugate)</td><td>Enzo</td><td>ADI-SAB-100-J</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>Fisher</td><td>BP9703-100</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>Fisher</td><td>08-920A</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Gibco</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4&#039;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>PBS Tablets</td><td>MP Bio</td><td>2810305</td><td></td></tr><tr><td>Monoclonal Anti-Tubulin, Tyrosine</td><td>Sigma</td><td>T9028</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogen Peroxide</td><td>Sigma</td><td>216763</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Triton X - 100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Urethane</td><td>Sigma</td><td>U2500</td><td></td></tr><tr><td>Air Pump</td><td>Tetra</td><td>77846-00</td><td></td></tr><tr><td>Glass Pasteur Pipette</td><td>VWR</td><td>53283-916</td><td>Length of the pipet does not matter</td></tr><tr><td>15 mL Tube</td><td>VWR</td><td>89039-670</td><td></td></tr><tr><td>P320 Sandpaper</td><td>3M</td><td>IBGABBV00397</td><td>Can be purchased at local home improvement store</td></tr></tbody></table>

generation and long-term maintenance of nerve-free hydra

Hydra&#39;nın interstisyel hücre dizisi multipotent kök hücreler ve bunların türevlerini içerir: bez hücreleri, nematositleri, germ hücreleri ve sinir hücreleri. İnterstisyel hücreler bölme hücrelerini öldüren bitki kökenli bir toksin olan kolşisinle iki ardışık muamele ile ortadan kaldırılabilir, böylece interstisyel kök hücrelerden türetilen farklılaşmış hücrelerin yenilenme potansiyelini ortadan kaldırır. Bu, sinir hücrelerinden yoksun Hydra üretimini sağlar. Bir sinirsiz polip, ozmotik basıncı beslemek, beslemek veya düzenlemek için ağzını açamaz. Ancak bu tür hayvanlar düzenli olarak zorla beslenir ve buruşurlarsa hayatta kalabilir ve süresiz laboratuvarda kültürlenebilir. Sinir hücrelerinin olmaması sinir sisteminin hayvan davranışını ve yenilenmesini düzenleyen rolünü araştırmaya olanak tanır. Sinirsiz Hidra bakımı için önceden yayınlanmış protokoller, elle çekilen mikropipet ile ağız-pipetleme gibi eski tekniklereHydra&#39;yı beslemek ve temizlemek için ips. Burada, sinirsiz Hydra&#39;nın bakımı için geliştirilmiş bir protokol getirildi. İnce uçlu forseps ağzını açmaya zorlamak ve yeni öldürülen Artemia eklemek için kullanılır. Zorla beslemeyi takiben, hayvanın vücut boşluğu burada &quot;burping&quot; olarak anılacak olan, sindirilmemiş malzemenin çıkarılması için bir şırınga ve hipodermik iğne kullanılarak taze ortam ile yıkanır. Forseps ve şırınga yardımıyla sinirsiz Hydra&#39;yı kuvvetle besleyen ve buruşturan bu yeni yöntem, elle çekilen mikropipet uçları kullanarak ağız-pipetleme ihtiyacını ortadan kaldırır. Böylece işlem daha güvenli ve önemli ölçüde zaman kazandırır. Hipostomdaki sinir hücrelerinin ortadan kaldırılmasını sağlamak için, anti-tirosin-tubulin kullanılarak immünohistokimyasal işlem yapılır.

İlk 8 saatlik kolşisin tedavisinin hemen ardından, tüm Hydra hayatta kalır. Bu Hydra&#39;lardan bazıları sadece benekli tutacaklara sahip olacak ( Şekil 3 A ), diğerleri dokunaçlarını tamamen tükettiler ( Şekil 3 B ). Sonraki 1 veya 2 gün içinde, tüm Hydra&#39;nın elindeki dokunma duyularını kaybedene kadar dokunaçlar küçülmeye devam edecek. Tedaviyi takip eden yaklaşık 1 hafta içinde, Hydra , dokunaçlarını tam olarak yenilemeden önce dokunaçlar gibi küçük saplama ( Şekil 3 C ) ile dokunaçlı yeniden oluşma belirtileri gösterecektir ( Şekil 3 D ). Orijinal Hydra&#39;nın yaklaşık% 50-60&#39;ında sonunda dokunuşları tedaviden 1-2 hafta sonra tekrar oluşuyor. SEcond tedavisinde, hayvanların iyileşmesi ilk tedaviden sonraki iyileşme ile benzerdir. Böylece, her iki tedaviye giren orijinal hayvan sayısının yaklaşık% 10&#39;u toparlar ve deney için uygun bir boyuta gelir ( Şekil 1 B ). Bu Hydra , işlenmemiş hayvanlardan daha ince görülen, daha şeffaf olan dokuları vardır ve ozmotik basıncı hafifletmek için ağızlarını açamama nedeniyle şişmiş görünen dokunma duyularına sahiptir ( Şekil 1 A , 1B). Beslenmeyen tüm hayvanlar birkaç hafta hayatta kalabilirler, ancak beslenemeyen hayvanlar küçülür ve beslenmesi gittikçe zorlaşır. İkinci tedaviyi takiben iyileşen hidra süresiz olarak muhafaza edilebilir. Bu hayvanlar tomurcuklanmakta, böylece nüfusu devam ettirmekte ve büyümektedirler. Ayrıca, nüfus yetiştirilebilirBu hayvanları kesip yeniden canlandırarak 4 . İmmunohistokimya, ikinci kolşisin tedavisinden sonra hipostomdaki nöronların kaybedildiğini doğrulamaktadır. Hipostomdaki yoğun sinir ağı bir anti-tirosin-tubulin antikoru 13 , 16 kullanarak görselleştirilebilir ve ağızdan ve belirgin hücre cisimlerinin dışına yayılan farklı lifleri gösterir ( Şekil 4 A ). Bu lifler, kolşisin ile çift işleme tabi tutularak üretilen sinirsiz Hidra&#39;da yoktur ( Şekil 4 B ). Ayrıca, DAPI ile birlikte boyama, kolşisin tedavilerinin bir sonucu olarak interstisyel hücre soylarının hücrelerinin kaybına bağlı olarak, tedavi edilmemiş kontrollere kıyasla, sinirsiz Hidra&#39;da azalan hücre çekirdeği sayısını ortaya çıkarmaktadır ( Şekil4 A, 4B ). <img alt="Şekil 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56115/56115fig1.jpg" /> Şekil 1 . Sinirsiz ve Tedavi Edilmemiş Hidraların Karşılaştırılması . (A) Tedavi edilmemiş Hydra . (B) İkinci kolşisin tedavisinden 22 gün sonra sinirsiz hidra . Şişmiş vücut kolonunu ve sinirsiz hayvandaki ince dokunaçları not edin. Ölçek çubukları 500 μm&#39;dir. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56115/56115fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56115/56115fig2.jpg" /> Şekil 2 . Şekli Değiştirilmiş Hidra Örneği . (A) İki Hidra </em&gt; İlk tedaviyi takiben kaynaşmış olan&gt;. (B) Tuhaf şekilli bir Hydra . (C) Ağzı açıldıktan sonra sönmüş bir hidra . Ölçek çubukları 400 μm&#39;dir. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56115/56115fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56115/56115fig3.jpg" /> Şekil 3 . İlk 8 saatlik Kolşisin Tedavisini İzleyen Hydra Temsilcisi Görüntüleri. (A) Tedaviden hemen sonra kalın dokunaçlı bir Hydra . (B) Tedaviden hemen sonra eldivenlerini tamamen kaybetmiş bir Hydra . (C) Tedaviden 8 gün sonra onun dokularını yeniden canlandırmaya başlayan bir Hydra . (D)Tedaviden 13 gün sonra onun dokularını tamamen yeniden kıvranan bir Hydra . Ölçek çubukları 400 μm&#39;dir. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56115/56115fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56115/56115fig4.jpg" /> Şekil 4 . Hipostomdaki Sinir Hücrelerinin Kaybı, İmmunohistokimyasal Yöntemle Teyit Edilebilir. (A) (i) anti-tirosin-tübülin antikoru ve (ii) DAPI ile etiketli, ikinci kolşisin tedavisinden yaklaşık 2 hafta sonra, tedavi edilmemiş bir Hidra hipostomu ve (B) sinirsiz bir Hydranın hipostomu. (Iii) yer paylaşımını gösterir. *, Ağzın yerini belirtir. Maksimum z projeksiyonları, e ile alınan dönen disk konfokal floresan z istiflerinden yapıldı.Xposures 500 ms (GFP) ve 15 ms (DAPI). Parlaklık ve kontrast görünürlüğü artırmak için ayarlandı. Ölçek çubukları 20 μm&#39;dir. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56115/56115fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Generation and Long-term Maintenance of Nerve-free Hydra at JoVE.com

Generation and Long-term Maintenance of Nerve-free Hydra

Bölücü hücreleri öldüren bitki kaynaklı bir toksin olan kolşisinle çift tedaviyle sinirsiz Hydra vulgaris üretilebilir. Bu Hydra tek başlarına beslenemez veya yemez. Bu yazıda, sinirsiz Hydra vulgaris&#39;in laboratuarda uzun süreli bakım için geliştirilmiş bir yöntem anlatılmaktadır.

Sinirsiz Kuşak ve Uzun Süreli Bakım<em&gt; Hydra</em

The interstitial cell lineage of Hydra includes multipotent stem cells, and their derivatives: gland cells, nematocytes, germ cells, and nerve cells. The ...

generation-and-long-term-maintenance-of-nerve-free-hydra

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Generation and Long-term Maintenance of Nerve-free Hydra

12.4K Görüntüleme.  UC San Diego.  Bölücü hücreleri öldüren bitki kaynaklı bir toksin olan kolşisinle çift tedaviyle sinirsiz Hydra vulgaris üretilebilir. Bu Hydra tek başlarına beslenemez veya yemez. Bu yazıda, sinirsiz Hydra vulgaris'in laboratuarda uzun süreli bakım için geliştirilmiş bir yöntem anlatılmaktadır. 

Video: Generation and Long-term Maintenance of Nerve-free Hydra

Inducing Complete Polyp Regeneration from the Aboral Physa of the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis

Cnidarians, and specifically Hydra, were the first animals shown to regenerate damaged or severed structures, and indeed such studies arguably launched modern biological inquiry through the work of Trembley more than 250 years ago. Presently the study of regeneration has seen a resurgence using both &#34;classic&#34; regenerative organisms, such as the Hydra, planaria and Urodeles, as well as a widening spectrum of species spanning the range of metazoa, from sponges through mammals. Besides its intrinsic interest as a biological phenomenon, understanding how regeneration works in a variety of species will inform us about whether regenerative processes share common features and/or species or context-specific cellular and molecular mechanisms. The starlet sea anemone, Nematostella vectensis, is an emerging model organism for regeneration. Like Hydra, Nematostella is a member of the ancient phylum, cnidaria, but within the class anthozoa, a sister clade to the hydrozoa that is evolutionarily more basal. Thus aspects of regeneration in Nematostella will be interesting to compare and contrast with those of Hydra and other cnidarians. In this article, we present a method to bisect, observe and classify regeneration of the aboral end of the Nematostella adult, which is called the physa. The physa naturally undergoes fission as a means of asexual reproduction, and either natural fission or manual amputation of the physa triggers re-growth and reformation of complex morphologies. Here we have codified these simple morphological changes in a Nematostella Regeneration Staging System (the NRSS). We use the NRSS to test the effects of chloroquine, an inhibitor of lysosomal function that blocks autophagy. The results show that the regeneration of polyp structures, particularly the mesenteries, is abnormal when autophagy is inhibited.

Inducing Complete Polyp Regeneration from the Aboral Physa of the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis

Here we demonstrate how to induce and monitor regeneration in the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis, a model cnidarian anthozoan. We demonstrate how to amputate and categorize regeneration using a morphological staging system, and we use this system to reveal a requirement for autophagy in regenerating polyp structures.

Starlet Deniz Anemone Aboral physa Tam Polip Regeneration uyaran<em&gt; Nematostella vectensis</em

Cnidarians, and specifically Hydra, were the first animals shown to regenerate damaged or severed structures, and indeed such studies arguably launched ...

Gelişim Biyolojisi

Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability to support axon growth and a hostile environment in the mature CNS1,2. In contrast, mature neurons in the peripheral nervous system (PNS) regenerate readily after injuries3. Adult dorsal root ganglion (DRG) neurons are well known to regenerate robustly after peripheral nerve injuries. Each DRG neuron grows one axon from the cell soma, which branches into two axonal branches: a peripheral branch innervating peripheral targets and a central branch extending into the spinal cord. Injury of the DRG peripheral axons results in substantial axon regeneration, whereas central axons in the spinal cord regenerate poorly after the injury. However, if the peripheral axonal injury occurs prior to the spinal cord injury (a process called the conditioning lesion), regeneration of central axons is greatly improved4. Moreover, the central axons of DRG neurons share the same hostile environment as descending corticospinal axons in the spinal cord. Together, it is hypothesized that the molecular mechanisms controlling axon regeneration of adult DRG neurons can be harnessed to enhance CNS axon regeneration. As a result, adult DRG neurons are now widely used as a model system to study regenerative axon growth5-7.
Here we describe a method of adult DRG neuron culture that can be used for genetic study of axon regeneration in vitro. In this model adult DRG neurons are genetically manipulated via electroporation-mediated gene transfection6,8. By transfecting neurons with DNA plasmid or si/shRNA, this approach enables both gain- and loss-of-function experiments to investigate the role of any gene-of-interest in axon growth from adult DRG neurons. When neurons are transfected with si/shRNA, the targeted endogenous protein is usually depleted after 3-4 days in culture, during which time robust axon growth has already occurred, making the loss-of-function studies less effective. To solve this problem, the method described here includes a re-suspension and re-plating step after transfection, which allows axons to re-grow from neurons in the absence of the targeted protein. Finally, we provide an example of using this in vitro model to study the role of an axon regeneration-associated gene, c-Jun, in mediating axon growth from adult DRG neurons9.

An in vitro model for genetic study of axon regeneration using cultured adult mouse dorsal root ganglion neurons is described. The method includes a re-suspension/re-plating step to allow axon re-growth from neurons undergoing genetic manipulation. This approach is especially useful for loss-of-function studies of axon regeneration using RNAi-based protein knockdown.

Kültür Yetişkin Dorsal Root Ganglion Nöronlar ile Axon Rejenerasyon Genetik Çalışma

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability ...

Nörobilim

Motor Nerve Transection and Time-lapse Imaging of Glial Cell Behaviors in Live Zebrafish

The nervous system is often described as a hard-wired component of the body even though it is a considerably fluid organ system that reacts to external stimuli in a consistent, stereotyped manner, while maintaining incredible flexibility and plasticity. Unlike the central nervous system (CNS), the peripheral nervous system (PNS) is capable of significant repair, but we have only just begun to understand the cellular and molecular mechanisms that govern this phenomenon. Using zebrafish as a model system, we have the unprecedented opportunity to couple regenerative studies with in vivo imaging and genetic manipulation. Peripheral nerves are composed of axons surrounded by layers of glia and connective tissue. Axons are ensheathed by myelinating or non-myelinating Schwann cells, which are in turn wrapped into a fascicle by a cellular sheath called the perineurium. Following an injury, adult peripheral nerves have the remarkable capacity to remove damaged axonal debris and re-innervate targets. To investigate the roles of all peripheral glia in PNS regeneration, we describe here an axon transection assay that uses a commercially available nitrogen-pumped dye laser to axotomize motor nerves in live transgenic zebrafish. We further describe the methods to couple these experiments to time-lapse imaging of injured and control nerves. This experimental paradigm can be used to not only assess the role that glia play in nerve regeneration, but can also be the platform for elucidating the molecular mechanisms that govern nervous system repair.

Although the peripheral nervous system (PNS) is capable of significant repair after injury, little is known about the cellular and molecular mechanisms that govern this phenomenon. Using live, transgenic zebrafish and a reproducible nerve transection assay, we can study dynamic glial cell behaviors during nerve degeneration and regeneration.

Motor Sinir transeksiyonu ve Canlı Zebra balığı Glial Hücre Davranışlarının Time-lapse Görüntüleme

The  nervous system is often described as a hard-wired component of the body even  though it is a considerably fluid organ system that reacts to external ...

Three-dimensional Tissue Engineered Aligned Astrocyte Networks to Recapitulate Developmental Mechanisms and Facilitate Nervous System Regeneration

Neurotrauma and neurodegenerative disease often result in lasting neurological deficits due to the limited capacity of the central nervous system (CNS) to replace lost neurons and regenerate axonal pathways. However, during nervous system development, neuronal migration and axonal extension often occur along pathways formed by other cells, referred to as &#34;living scaffolds&#34;. Seeking to emulate these mechanisms and to design a strategy that circumvents the inhibitory environment of the CNS, this manuscript presents a protocol to fabricate tissue engineered astrocyte-based &#34;living scaffolds&#34;. To create these constructs, we employed a novel biomaterial encasement scheme to induce astrocytes to self-assemble into dense three-dimensional bundles of bipolar longitudinally-aligned somata and processes. First, hollow hydrogel micro-columns were assembled, and the inner lumen was coated with collagen extracellular-matrix. Dissociated cerebral cortical astrocytes were then delivered into the lumen of the cylindrical micro-column and, at a critical inner diameter of &#60;350 &#181;m, spontaneously self-aligned and contracted to produce long fiber-like cables consisting of dense bundles of astrocyte processes and collagen fibrils measuring &#60;150 &#181;m in diameter yet extending several cm in length. These engineered living scaffolds exhibited &#62;97% cell viability and were virtually exclusively comprised of astrocytes expressing a combination of the intermediate filament proteins glial-fibrillary acidic protein (GFAP), vimentin, and nestin. These aligned astrocyte networks were found to provide a permissive substrate for neuronal attachment and aligned neurite extension. Moreover, these constructs maintain integrity and alignment when extracted from the hydrogel encasement, making them suitable for CNS implantation. These preformed constructs structurally emulate key cytoarchitectural elements of naturally occurring glial-based &#34;living scaffolds&#34; in vivo. As such, these engineered living scaffolds may serve as test-beds to study neurodevelopmental mechanisms in vitro or facilitate neuroregeneration by directing neuronal migration and/or axonal pathfinding following CNS degeneration in vivo.

We showcase the development of self-assembled, three-dimensional bundles of longitudinally aligned astrocytic somata and processes within a novel biomaterial encasement. These engineered &#34;living scaffolds&#34;, exhibiting micron-scale diameter yet extending centimeters in length, may serve as test-beds to study neurodevelopmental mechanisms or facilitate neuroregeneration by directing neuronal migration and/or axonal pathfinding.

Astrocyte ağlar gelişimsel mekanizmaları özetlemek ve sinir sistemi yeniden oluşturma işlemi kolaylaştırmak için tasarlanmış üç boyutlu doku uyumlu

Neurotrauma and neurodegenerative disease often result in lasting neurological deficits due to the limited capacity of the central nervous system (CNS) to ...

Biyomühendislik

Fluorescent In Situ Hybridization and 5-Ethynyl-2'-Deoxyuridine Labeling for Stem-Like Cells in the Hydrozoan Jellyfish Cladonema pacificum

Cnidarians, including sea anemones, corals, and jellyfish, exhibit diverse morphology and lifestyles that are manifested in sessile polyps and free-swimming medusae. As exemplified in established models such as Hydra and Nematostella, stem cells and/or proliferative cells contribute to the development and regeneration of cnidarian polyps. However, the underlying cellular mechanisms in most jellyfish, particularly at the medusa stage, are largely unclear, and, thus, developing a robust method for identifying specific cell types is critical. This paper describes a protocol for visualizing stem-like proliferating cells in the hydrozoan jellyfish Cladonema pacificum. Cladonema medusae possess branched tentacles that continuously grow and maintain regenerative capacity throughout their adult stage, providing a unique platform with which to study the cellular mechanisms orchestrated by proliferating and/or stem-like cells. Whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) using a stem cell marker allows for the detection of stem-like cells, while pulse labeling with 5-ethynyl-2&#39;-deoxyuridine (EdU), an S phase marker, enables the identification of proliferating cells. Combining both FISH and EdU labeling, we can detect actively proliferating stem-like cells on fixed animals, and this technique can be broadly applied to other animals, including non-model jellyfish species.

Fluorescent In Situ Hybridization and 5-Ethynyl-2'-Deoxyuridine Labeling for Stem-Like Cells in the Hydrozoan Jellyfish Cladonema pacificum

Here, we describe a protocol for visualizing stem-like proliferating cells in the jellyfish Cladonema. Whole-mount fluorescent in situ hybridization with a stem cell marker allows for the detection of stem-like cells, and 5-ethynyl-2&#39;-deoxyuridine labeling enables the identification of proliferating cells. Together, actively proliferating stem-like cells can be detected.&#160;

Hidrozoan Denizanası Cladonema pacificum'daki Kök Benzeri Hücreler için Floresan In Situ Hibridizasyon ve 5-Etinil-2'-Deoksiüridin Etiketleme

Cnidarians, including sea anemones, corals, and jellyfish, exhibit diverse morphology and lifestyles that are manifested in sessile polyps and ...

Anatomically Inspired Three-dimensional Micro-tissue Engineered Neural Networks for Nervous System Reconstruction, Modulation, and Modeling

Functional recovery rarely occurs&#160;following injury or disease-induced degeneration within the central nervous system (CNS)&#160;due to the inhibitory environment and the limited capacity for neurogenesis. We are developing&#160;a strategy to simultaneously address&#160;neuronal and axonal pathway loss within the damaged CNS. This manuscript presents the fabrication protocol for micro-tissue engineered neural networks (micro-TENNs), implantable constructs consisting of neurons and aligned axonal tracts spanning the extracellular matrix (ECM) lumen of a preformed hydrogel cylinder hundreds of microns in diameter that may extend centimeters in length. Neuronal aggregates are delimited to the extremes of the three-dimensional encasement and are spanned by axonal projections. Micro-TENNs are uniquely poised as a strategy for CNS reconstruction, emulating aspects of brain connectome cytoarchitecture and potentially providing means for network replacement. The neuronal aggregates may synapse with host tissue to form new functional relays to restore and/or modulate missing or damaged circuitry. These constructs may also act as pro-regenerative&#160;&#34;living scaffolds&#34; capable of exploiting developmental mechanisms for cell migration and axonal pathfinding, providing synergistic structural and soluble cues based on the state of regeneration. Micro-TENNs are fabricated by pouring liquid hydrogel into a cylindrical mold containing a longitudinally centered needle. Once the hydrogel has gelled, the needle is removed, leaving a hollow micro-column. An ECM solution is added to the lumen to provide an environment suitable for neuronal adhesion and axonal outgrowth. Dissociated neurons are mechanically aggregated for precise seeding within one or both ends of the micro-column. This methodology reliably produces self-contained miniature constructs with long-projecting axonal tracts that may recapitulate features of brain neuroanatomy. Synaptic immunolabeling and genetically encoded calcium indicators suggest that micro-TENNs possess extensive synaptic distribution and intrinsic electrical activity. Consequently, micro-TENNs represent a promising strategy for targeted neurosurgical reconstruction of brain pathways and may also be applied as biofidelic models to study neurobiological phenomena in vitro.

This manuscript details the fabrication of micro-tissue engineered neural networks: three-dimensional micron-sized constructs comprised of long aligned axonal tracts spanning aggregated neuronal population(s) encased in a tubular hydrogel. These living scaffolds can serve as functional relays to reconstruct or modulate neural circuitry or as biofidelic test-beds mimicking gray-white matter neuroanatomy.

Sinir Sistemi Yeniden Yapılanma, Modülasyon ve Modelleme için Anatomik olarak İlham Almış Üç Boyutlu Mikro-Dokulu Mühendisli Sinir Ağları

Functional recovery rarely occurs&#160;following injury or disease-induced degeneration within the central nervous system (CNS)&#160;due to the inhibitory ...

Rewiring Neuronal Circuits: A New Method for Fast Neurite Extension and Functional Neuronal Connection

Brain and spinal cord injury may lead to permanent disability and death because it is still not possible to regenerate neurons over long distances and accurately reconnect them with an appropriate target. Here a procedure is described to rapidly initiate, elongate, and precisely connect new functional neuronal circuits over long distances. The extension rates achieved reach over 1.2 mm/h, 30-60 times faster than the in vivo rates of the fastest growing axons from the peripheral nervous system (0.02 to 0.04 mm/h)28 and 10 times faster than previously reported for the same neuronal type at an earlier stage of development4. First, isolated populations of rat hippocampal neurons are grown for 2-3 weeks in microfluidic devices to precisely position the cells, enabling easy micromanipulation and experimental reproducibility. Next, beads coated with poly-D-lysine (PDL) are placed on neurites to form adhesive contacts and pipette micromanipulation is used to move the resulting bead-neurite complex. As the bead is moved, it pulls out a new neurite that can be extended over hundreds of micrometers and functionally connected to a target cell in less than 1 h. This process enables experimental reproducibility and ease of manipulation while bypassing slower chemical strategies to induce neurite growth. Preliminary measurements presented here demonstrate a neuronal growth rate far exceeding physiological ones. Combining these innovations allows for the precise establishment of neuronal networks in culture with an unprecedented degree of control. It is a novel method that opens the door to a plethora of information and insights into signal transmission and communication within the neuronal network as well as being a playground in which to explore the limits of neuronal growth. The potential applications and experiments are widespread with direct implications for therapies that aim to reconnect neuronal circuits after trauma or in neurodegenerative diseases.

This procedure describes how to rapidly initiate, extend and connect neurites organized in microfluidic chambers using poly-D-lysine-coated beads fixed to micropipettes that guide neurite elongation.

Yeniden Yönlendiren Sinir Devreleri: Hızlı Neurit Uzatımı ve Fonksiyonel Sinir Bağlantısı İçin Yeni Bir Yöntem

Brain and spinal cord injury may lead to permanent disability and death because it is still not possible to regenerate neurons over long distances and ...

Generation of Neurospheres from Mixed Primary Hippocampal and Cortical Neurons Isolated from E14-E16 Sprague Dawley Rat Embryo

Primary neuron culture is an essential technique in the field of neuroscience. To gain deeper mechanistic insights into the brain, it is essential to have a robust in vitro model that can be exploited for various neurobiology studies. Though primary neuron cultures (i.e., long-term hippocampal cultures) have provided scientists with models, it does not yet represent the complexity of brain network completely. In the wake of these limitations, a new model has emerged using neurospheres, which bears a closer resemblance to the brain tissue. The present protocol describes the plating of high and low densities of mixed cortical and hippocampal neurons isolated from the embryo of embryonic day 14-16 Sprague Dawley rats. This allows for the generation of neurospheres and long-term primary neuron culture as two independent platforms to conduct further studies. This process is extremely simple and cost-effective, as it minimizes several steps and reagents previously deemed essential for neuron culture. This is a robust protocol with minimal requirements that can be performed with achievable results and further used for a diversity of studies related to neuroscience.

Presented here is a protocol for the spontaneous generation of neurospheres enriched in neural progenitor cells from high density plated neurons. During the same experiment, when neurons are plated at a lower density, the protocol also results in prolonged primary rat neuron cultures.

E14-E16 Sprague Dawley Sıçan Embriyosu İzole Karışık Primer Hipokampal ve Kortikal Nöronlardan Nörosfer Lerin Üretimi

Primary neuron culture is an essential technique in the field of neuroscience. To gain deeper mechanistic insights into the brain, it is essential to have ...

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among multicellular animals. Hydra is used as a model for the study of regeneration, pattern formation, and stem cells. However, research efforts have been hampered by lack of a reliable method for gene perturbations to study molecular function. The development of transgenic methods has revitalized the study of Hydra biology1. Transgenic Hydra allow for the tracking of live cells, sorting to yield pure cell populations for biochemical analysis, manipulation of gene function by knockdown and over-expression, and analysis of promoter function. Plasmid DNA injected into early stage embryos randomly integrates into the genome early in development. This results in hatchlings that express transgenes in patches of tissue in one or more of the three lineages (ectodermal epithelial, endodermal epithelial, or interstitial). The success rate of obtaining a hatchling with transgenic tissue is between 10% and 20%. Asexual propagation of the transgenic hatchling is used to establish a uniformly transgenic line in a particular lineage. Generating transgenic Hydra is surprisingly simple and robust, and here we describe a protocol that can be easily implemented at low cost.

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

Stably transgenic Hydra are made by microinjection of plasmid DNA into embryos followed by random genomic integration and asexual propagation to establish a uniform line. Transgenic Hydra are used to track cell movements, overexpress genes, study promoter function, or knock down gene expression using RNAi.

Transgenik Üretimi<em&gt; Hydra</em&gt;: Mikroenjeksiyon yolu ile embriyo

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among ...

Biyoloji

<meta charset="utf8"></head><body>Murin Subventriküler Bölgesinden İzole Edilen NSC'lerin Etkin Nükleofeksiyonu

Isolation, Expansion, and Nucleofection of Neural Stem Cells from Adult Murine Subventricular Zone

Isolation and expansion of neural stem cells (NSCs) from the subventricular zone (SVZ) of the adult mouse brain can be achieved in a medium supplemented with basic fibroblast growth factor (bFGF) and epidermal growth factor (EGF) as mitogens, producing clonal aggregates known as neurospheres. This in vitro system is a valuable tool for studying NSC potential. Transfection of siRNAs or genes carried in plasmids can be used to induce perturbations to gene expression and study NSC biology. However, the exogenous nucleic acid delivery to NSC cultures is challenging due to the low efficiency of central nervous system (CNS) cells transfection. Here, we present an improved nucleofection system that achieves high efficiency of gene delivery in expanded NSCs from adult murine SVZ. We demonstrate that this relatively simple method enhances gene perturbation in adult NSCs, surpassing traditional transfection protocols with survival rates exceeding 80%. Moreover, this method can also be applied in primary isolated NSCs, providing a crucial advancement in gene function studies through gene expression manipulation via knockdown or overexpression in neurosphere cultures.

<meta charset="utf8"></head><body>Yazar Spotlight: Murin Subventriküler Bölgeden Türetilmiş Nöral Kök Hücre Kültürlerinde Yüksek Verimli Gen İletimi için Geliştirilmiş Nükleofeksiyon

Here, we describe a nucleofection system designed to enhance gene delivery efficiency in expanded neural stem cells (NSCs) isolated from the adult murine subventricular zone. The findings demonstrate that this method significantly improves gene perturbation in NSCs, surpassing the effectiveness of traditional transfection protocols and enhancing cell survival rate.

Erişkin Murin Subventriküler Bölgesinden Nöral Kök Hücrelerin İzolasyonu, Genişlemesi ve Nükleofeksiyonu

Isolation and expansion of neural stem cells (NSCs) from the subventricular zone (SVZ) of the adult mouse brain can be achieved in a medium supplemented ...

Sinirsiz Kuşak ve Uzun Süreli Bakım

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Starlet Deniz Anemone Aboral physa Tam Polip Regeneration uyaran