Genom yenilikler ağ (cin) aracılığıyla mali destek genom Kanada ve genom British Columbia işlemleri (204PRO) ve teknoloji geliştirme (214PRO) için teşekkür ederiz. İlaç keşif platformu Araştırma Enstitüsü McGill Üniversitesi Sağlık Merkezi için filme MALDI-TOF enstrüman kullanımı için teşekkür ediyoruz. H.L. desteği Ulusal Bilim ve mühendislik Araştırma Konseyi, Kanada (NSERC) bir doktora sonrası bursu dan minnettardır. C.H.B öncü bağış Fonu (LEEF) üzerinden destek için minnettar olduğunu. C.H.B. desteği (Montreal, Quebec, Kanada) McGill Üniversitesi'nde moleküler Onkoloji Segal McGill sandalyeden minnettardır. M.X.C. ve C.H.B. Yahudi Genel Hastanesi (Montreal, Quebec, Kanada) için Warren Y. Soper hayırsever güven ve Alvin Segal Aile Vakfı çekmek için minnettarız.

aşağıda açıklanan reaktifler miktarda 20 hasta plazma numuneleri ölçüm üzerinde temel alır. İletişim kuralı aşağıdaki Victoria Üniversitesi kuralları sunulan &#39; s insan araştırma Etik Komitesi.
 1. Ang üretimi ben insan plazma <ol><li>çözülme plazma numuneleri (&#8805; 200 µL) bir odada sıcaklık su banyo için 5 min ve örnekleri tamamen çözdürülen kadar buza koy.</li>
	<li>Transfer 200 µL el ile kuyu 1.1 mL derin-şey plaka (örnek plaka), ayrı ve 2 ° C ve 1278 x g. 10 dk santrifüj plaka santrifüj kapasitesi her plazma örneği</li>
	<li>Seri olarak tavuk yumurta akı albümin ile altı Kalibratör çözümleri hazırlamak için bir 500 fmol/µL Ang I NAT standart çözüm sulandırmak için sistem işleme bir otomatik sıvı kullanın (0,1 0,2 0,6, 1.9, 5,7, 17.2 fmol/µL).</li>
	Örnek plaka <li>pipet 200 µL her Kalibratör iyi ve 125 µL nesil için arabelleğe. 
	Not: Fosfat tamponlu tuz (PBS) arabelleği gerektiriyor denemenin gün taze hazırlanacak CEWA.</li>
	<li>Bir otomatik sıvı sistemi işleme kullanarak, yeni bir tabak içinde 125 µL plazma süpernatant karıştırmak ya da PBS CEWA 125 µL Ang 25 µL ile ben 1 M Tris, 0.2 mM ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) ve 1 mM içerir üretimi arabellek phenylmethylsulfonyl florür (PMSF). 
	Not: Ang hazırlamak ben bir 1 M Tris/0.2 mM EDTA sulu tampon karıştırma tarafından üretimi arabellek (pH 5.5 ayarlamak Asetik asit kullanarak) ve PMSF çözüm (metanol içinde 100 mM). 4 ° C. Mix iki çözümleri de 1 ay deneme günü için her iki çözüm de depolanması.</li>
	<li>Otomatik olarak çözümler bir 96-şey plaka, çözüm başına 3 çoğaltır, iyi başına 34 µL içine aktarın. Plaka için 3 h. 37 ° C'de kuluçkaya</li>
</ol> 2. IMMUNO-Ang zenginlik ben kullanarak antikor kaplı boncuk <ol><li>antikor manyetik Protein G boncuklar üzerine konjugasyon Not: Boncuk ile antikor konjugasyon el ile 3 h sırasında Ang gerçekleştirilen ben üretimi dönemi denemenin gün. Diğer analitler için konjuge boncuk %0,015 arkadaşlar (PBSC) 4 ° C'de 3 ay veya daha uzun, özellikleri ve sağlamlık-in antikor bağlı olarak içeren PBS arabellek depolanması mümkün olabilir.
	<ol><li>Transfer 110 µL boncuk Bulamaç (20 örnekleri ölçme ve 6 puntoluk standart eğri yapmak için yeterli), 1,5 mL tüp içine. Boncuk yedi kez % 25 Asetonitril/PBSC 1 mL ile üç kez PBSC 1 mL ile yıkayın. Her yıkama adım arasında boncuk cips için manyetik bir stand kullanın. Sonra son yıkama yıkama arabellek kaldırma 
		Not: 7 kez % 25 ile yıkama Asetonitril/PBSC ara-20 gibi boncuk Bulamaç MS-uyumsuz katkı maddeleri kaldırmak için önemlidir. Seçili boncuk böyle katkısız iseniz, bu geniş çamaşır adım gerekli olmayabilir.</li>
		<li>Boncuk PBSC 110 µL içinde resuspend ve anti-Ang 110 µL ekleyin ben antikor (son antikor konsantrasyon: 100 µg/mL). Boncuk ve çözüm pipetting tarafından mix ve onları 1s 8 rpm'de dönen için oda sıcaklığında kuluçkaya.</li>
		<li>3 kez ile 1 mL PBSC boncuk yıkama ve PBSC 1100 µL içinde resuspend. 
		Not: herhangi bir boncuk çözüm tüp kap kuluçka sırasında aktı, benchtop santrifüj 2680 x g. kullanarak çözüm aşağı spin</li>
		<li>Boncuk çözüm el 96-şey plaka (Boncuk standart plaka) aktarın. Aliquot sisteme aynı 96-şey plaka başına iyi. 120 µL boncuk işleme otomatik sıvı kullanın</li></ol></li> <li>IMMUNO-zenginleştirme boncukları üzerinde <ol><li>3 h Ang ben üretimi dönemi, yerleştirdikten sonra kuluçka plaka buz Ang ı. nesil sonlandırmak 10 dk</li>
		<li>Otomatik olarak 100-fold SIS peptid hisse senedi çözüm (10 pmol/μL) seyreltik PBS ile tampon ve otomatik olarak daha fazla aliquot bir 96-şey PCR plakasına istikrarlı isoptope standart peptid seyreltme. (100 fmol içeren) bir çözümün kararlı izotop standartları (SIS) peptid 1,5 µL kuluçka plaka her kuyunun içine aktarmak ve plazma numuneleri veya PBS arabelleklerindeki CEWA ile karıştırarak.</li>
		<li>Otomatik olarak boncuk çözüm, 10 mL başına iyi kuluçka plaka içeriğini aktarmak, mix.</li>
		<li>4 ° c için 1 h plaka 8 rpm'de dönen kuluçkaya.</li>
		<li>Boncuk üç kez otomatik olarak 5 mM amonyum bikarbonat (AmBic) çözümü, iyi yıkama başına başına 100 µL ile yıkayın. Son yıkama sonra 5 mm AmBic çözüm her şey içinde 7 µL boncuk resuspend. Boncuk son yıkama sonra altına çekmek için bir mıknatıs kullanın</li>
	</ol></li></ol> 3. Transfer bir maldı hedef plaka ve matris çözüm ekleme üzerine boncuk <ol><li>otomatik olarak bir maldı hedef plaka üzerine boncuk Bulamaç Aktarım 7 µL 2.600 spot büyüklüğü µm. Boncuk kurumasına izin. 
	Not: Küçük USB-yeti hayranı boncuk kurutma işlemi hızlandırmak için kullanılabilir.</li>
	<li>Otomatik olarak α-cyano-4-hydroxycinnamic asit (HCCA) 2 µL Ekle-matris çözümden (3 mg/mL HCCA, 1.8 mg/mL amonyum sitrat, % 70 Asetonitril ve % 0.1 trifluoroacetic asit içeren) her örnek hedef plaka üzerinde spot üzerine de matris .</li>
</ol> 4. Sinyal alma bir MALDI-TOF-MS ve veri analizi <ol><li>analiz örnek noktalar olumlu reflektör modunu kullanarak bir MALDI-TOF aleti ile. İç kalibrasyon, veri düzeltme ve temel çıkarma satıcıya özel yazılım ile otomatik olarak gerçekleştirmek. 
	Not: MALDI-TOF ölçüm hedef peptidler veya protein bağlıdır için seçilen modu (pozitif/negatif, doğrusal/reflektör).</li>
	<li>(Nat/SIS yoğunluğu oranı) göreli yanıt oranını hesaplamak ve her örnek konsantrasyonu belirlemek Ang için standart eğri karşılaştırın. Denklem (1), nerede kullanarak PRA hesaplamak Δt Ang ben üretimi Ang ı. oluşturulmasında kullanılan süreyi temsil eder 
	PRA = [Ang ben] / Δt Ang ben üretimi (1)</li></ol>

<ol>
	<li>Aebersold, R., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry-based+proteomics.">Mass spectrometry-based proteomics.</a> Nature. 422 (6928), 198-207 (2003).</li><li>Nicol, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+an+Immunoaffinity-Mass+Spectrometry-based+Approach+for+the+Quantification+of+Protein+Biomarkers+from+Serum+Samples+of+Lung+Cancer+Patients.">Use of an Immunoaffinity-Mass Spectrometry-based Approach for the Quantification of Protein Biomarkers from Serum Samples of Lung Cancer Patients.</a> Mol. &amp; Cell. Proteomics. 7 (10), 1974-1982 (2008).</li><li>Webster, J., Oxley, D., Zanders, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Chemical Genomics and Proteomics: Reviews and Protocols. , 227-240 (2012).</li><li>Yergey, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+sequencing+of+peptides+using+MALDI/TOF-TOF.">De novo sequencing of peptides using MALDI/TOF-TOF.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 13 (7), 784-791 (2002).</li><li>Anderson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Six+decades+searching+for+meaning+in+the+proteome.">Six decades searching for meaning in the proteome.</a> J. Proteomics. 107, 24-30 (2014).</li><li>Landegren, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opportunities+for+Sensitive+Plasma+Proteome+Analysis.">Opportunities for Sensitive Plasma Proteome Analysis.</a> Anal. Chem. 84 (4), 1824-1830 (2012).</li><li>Guo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoaffinity+Enrichment+and+Mass+Spectrometry+Analysis+of+Protein+Methylation.">Immunoaffinity Enrichment and Mass Spectrometry Analysis of Protein Methylation.</a> Mol. &amp; Cell. Proteomics. 13 (1), 372-387 (2014).</li><li>Florentinus-Mefailoski, A., Soosaipillai, A., Dufresne, J., Diamandis, E. P., Marshall, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+enzyme-linked+immuno-mass+spectrometric+assay+with+the+substrate+adenosine+monophosphate.">An enzyme-linked immuno-mass spectrometric assay with the substrate adenosine monophosphate.</a> Anal. Bioanal. Chem. 407 (4), 1119-1130 (2015).</li><li>Fredolini, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunocapture+strategies+in+translational+proteomics.">Immunocapture strategies in translational proteomics.</a> Expert Rev Proteomics. 13 (1), 83-98 (2016).</li><li>Tran, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+Affinity+Capture+and+On-Tip+Digestion+to+Accurately+Quantitate+in+Vivo+Deamidation+of+Therapeutic+Antibodies.">Automated Affinity Capture and On-Tip Digestion to Accurately Quantitate in Vivo Deamidation of Therapeutic Antibodies.</a> Anal. Chem. , (2016).</li><li>Razavi, M., Leigh Anderson, N., Pope, M. E., Yip, R., Pearson, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+precision+quantification+of+human+plasma+proteins+using+the+automated+SISCAPA+Immuno-MS+workflow.">High precision quantification of human plasma proteins using the automated SISCAPA Immuno-MS workflow.</a> N. Biotechnol. 33 (5 Part A), 494-502 (2016).</li><li>Razavi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+SISCAPA+Quantitation+of+Peptides+from+Human+Plasma+Digests+by+Ultrafast,+Liquid+Chromatography-Free+Mass+Spectrometry.">High-Throughput SISCAPA Quantitation of Peptides from Human Plasma Digests by Ultrafast, Liquid Chromatography-Free Mass Spectrometry.</a> J. Proteome Res. 11 (12), 5642-5649 (2012).</li><li>Anderson, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SISCAPA+Peptide+Enrichment+on+Magnetic+Beads+Using+an+In-line+Bead+Trap+Device.">SISCAPA Peptide Enrichment on Magnetic Beads Using an In-line Bead Trap Device.</a> Mol. &amp; Cell. Proteomics. 8 (5), 995-1005 (2009).</li><li>Parker, C. E., Pearson, T. W., Anderson, N. L., Borchers, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass-spectrometry-based+clinical+proteomics+-+a+review+and+prospective.">Mass-spectrometry-based clinical proteomics - a review and prospective.</a> The Analyst. 135 (8), 1830-1838 (2010).</li><li>Reid, J. D., Holmes, D. T., Mason, D. R., Shah, B., Borchers, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+the+Development+of+an+Immuno+MALDI+(iMALDI)+Mass+Spectrometry+Assay+for+the+Diagnosis+of+Hypertension.">Towards the Development of an Immuno MALDI (iMALDI) Mass Spectrometry Assay for the Diagnosis of Hypertension.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 21 (10), 1680-1686 (2010).</li><li>Mason, D. R., Reid, J. D., Camenzind, A. G., Holmes, D. T., Borchers, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Duplexed+iMALDI+for+the+detection+of+angiotensin+I+and+angiotensin+II.">Duplexed iMALDI for the detection of angiotensin I and angiotensin II.</a> Methods. 56 (2), 213-222 (2012).</li><li>Camenzind, A. G., vander Gugten, J. G., Popp, R., Holmes, D. T., Borchers, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+evaluation+of+an+immuno-MALDI+(iMALDI)+assay+for+angiotensin+I+and+the+diagnosis+of+secondary+hypertension.">Development and evaluation of an immuno-MALDI (iMALDI) assay for angiotensin I and the diagnosis of secondary hypertension.</a> Clin. Proteomics. 10 (1), 20 (2013).</li><li>Jiang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+immuno+tandem+mass+spectrometry+(iMALDI)+assay+for+EGFR+diagnosis.">Development of an immuno tandem mass spectrometry (iMALDI) assay for EGFR diagnosis.</a> Proteomics Clin Appl. 1, (2007).</li><li>Jiang, J., Parker, C. E., Fuller, J. R., Kawula, T. H., Borchers, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Immunoaffinity+Tandem+Mass+Spectrometry+(iMALDI)+assay+for+Detection+of+Francisella+tularensis.">An Immunoaffinity Tandem Mass Spectrometry (iMALDI) assay for Detection of Francisella tularensis.</a> Analytica chimica acta. 605 (1), 70-79 (2007).</li><li>Popp, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+assay+for+the+clinical+measurement+of+plasma+renin+activity+by+immuno-MALDI+(iMALDI).">An automated assay for the clinical measurement of plasma renin activity by immuno-MALDI (iMALDI).</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics. 1854 (6), 547-558 (2015).</li><li>Schoenherr, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+screening+of+monoclonal+antibodies+for+SISCAPA+assays+using+a+magnetic+bead+processor+and+liquid+chromatography-selected+reaction+monitoring-mass+spectrometry.">Automated screening of monoclonal antibodies for SISCAPA assays using a magnetic bead processor and liquid chromatography-selected reaction monitoring-mass spectrometry.</a> J Immunol Methods. 353 (1-2), 49-61 (2010).</li><li>Borchers, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+quantitation+and+identification+of+peptides+and+proteins.">Methods of quantitation and identification of peptides and proteins.</a> US patent. , (2010).</li><li>Borchers, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+quantitation+and+identification+of+peptides+and+proteins.">Methods of quantitation and identification of peptides and proteins.</a> Canadian patent CA. , (2011).</li><li>Wei&#223;, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catch+and+measure-mass+spectrometry-based+immunoassays+in+biomarker+research.">Catch and measure-mass spectrometry-based immunoassays in biomarker research.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics. 1844 (5), 927-932 (2014).</li><li>Nelson, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+fragments:+Hope+and+hype.">Antibody fragments: Hope and hype.</a> mAbs. 2 (1), 77-83 (2010).</li><li>Gupta, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evaluation+of+an+aptamer+for+use+as+an+affinity+reagent+with+MS:+PCSK9+as+an+example+protein.">An evaluation of an aptamer for use as an affinity reagent with MS: PCSK9 as an example protein.</a> Bioanalysis. 8 (15), 1557-1564 (2016).</li></ol>

C.H.B patent iMALDI teknoloji üzerinde tutar.

Geleneksel MS tabanlı protein miktar için karşılaştırıldığında, iMALDI analitler zenginleştirmek ve onları karmaşık örnekleri, bu nedenle proteinler veya düşük konsantrasyonlarda peptidler ölçmek mümkün hale gelen arındırmak için antikorlar kullanır. İMALDI Protokolü kritik bir adımda hedef peptidler immün zenginlik olduğunu. Bu amaçla, antikorlar yüksek özgüllük ve ilgi ile seçilmesi gerekir. SISCAPA, 10-9 M veya daha iyi, antikor benzeşim düşük ng/mL21yüksek hassasiyet elde etmek için gerekli rapor edildi. Buna ek olarak, boncuk yüksek antikor Bağlama kapasitesi ile en uygun zenginleştirme için tercih edilir.
Hedef molekülleri en az arka plan düzeyleri ile nispeten "temiz" spectra oluşturmak önemlidir. Yüksek sinyal gürültü oranı geniş boncuk IMMUNO-zenginleştirme adımdan sonra yıkama yoluyla elde edilebilir. Ayrıca, biz bu ekleme ve matris çözüm kurutma ses sinyalleri önemli ölçüde azaltmak ve böylece sinyal-gürültü oranı geliştirmek sonra boncuk noktalar hedef plaka üzerinde yıkama bulduk.
Bu çalışmada gösterilmiştir iMALDI PRA tahlil proteolizis adımları gerektirmez hedef molekül Ang bir peptid olduğunu. Her ne kadar epitope içeren peptidler için sindirimi yakalanan protein22,23tarihinde gerçekleştirilen bir örnek protein molekülleri ölçmek için protein genellikle peptidler IMMUNO-zenginleştirme önce içine sindirilir. Bu durumda, mevcut bir protein sindirimi protokol iMALDI iş akışı içine kolayca eklenebilir.  Sindirim arabellek bağlı olarak desalting bir adım önce boncuklar üzerinde peptidler yakalanması antikor-peptid Bağlama girişimi engellemek için gerekli olabilir.
Benzer şekilde diğer IMMUNO-MS yöntemleri, Anti-peptid antikor üretimini iMALDI deneyleri gelişiminde büyük bir sorun olduğunu. Son zamanlarda, Triple X proteomik teknoloji cilt24başına birden fazla peptidler hedefleyebilirsiniz benzeşme bağlayıcı üretmek için geliştirilmiştir. Bu anti-peptid antikorlar maliyetini azaltabilir ve tek bir kuluçka kullanarak aynı anda çoğaltılmış deneyleri gelişimi kolaylaştırmak. Ayrıca,25 antikor parçaları veya sentetik aptamers26 alternatifler sağlam antikor kullanımı olabilir ve daha kolay üretim avantajı olurdu. Sentetik aptamers alt arka plan düzeyleri benzeşme-zenginleştirme26için kullanıldığında olduğu gibi antikorlar daha gösterilen olarak bildirilmiştir.
iMALDI teknoloji yüksek duyarlılık ve özgüllük ile çok sayıda karmaşık örnekleri, hızlı, yüksek üretilen iş protein/peptid analizde etkinleştirme maldı kütle spektrometresi ile uzun avantajlarını birleştirir. Böylece onların adsorpsiyon plastik nedeniyle peptidler kaybı IMMUNO-yakalama, peptidler tüp eluted değil hedef ama taşıma analitler MS-analiz için maldı hedef tabağa aktarılır boncuk sonra diğer IMMUNO-MS yöntemlerinden farklı olarak, kaçınarak tüpler. Batı leke veya ELISA gibi yaygın olarak kullanılan proteomik araçlarla karşılaştırıldığında, tek bir antikor iMALDI içinde önemli ölçüde tahlil geliştirme zaman ve maliyeti azaltmak gerekir. PRA tahlil almış algılama alt sınırı için geleneksel ELISA ve fizyolojik aralığı içinde iyi karşılaştırılabilir. Antikor ve kitle ücret oranı yüksek özgüllük testin sağlar Çift Kişilik seçim bir süreç sağlar. İMALDI uygulamalar PRA deneyleri için sınırlı değildir, ancak herhangi bir protein ifade Nefelometri ve protein değişiklik karmaşık örneklerinde bile miktar için uygulanabilir. Özellikle, otomatik yüksek üretilen iş iMALDI keşif ve protein biyolojik hastalıklar, şu anda kliniklerde bakteriyel için kullanılan benchtop maldı aletleri varlığı nedeniyle çeşitli doğrulama için güçlü bir klinik araç olabilir kimliği.

Kütle spektrometresi nicel proteomik içinde vazgeçilmez bir araç haline gelmiştir. Kütle spektrometresi hedef proteinler veya peptidler kitlelerin belirlemek için bu nedenle elde edilen analit sinyalleri uzun için karşılaştırıldığında çok özel olabilir. İki iyonlaşma yöntemleri, electrospray ve maldı, en çok1,2,3,4proteinler ve peptidler algılamak için kullanılır. Düşük-bereket proteinler yüksek-bereket proteinler huzurunda ng/mL veya pg/mL konsantrasyonlarda karmaşık örneklerinde tespiti MS tabanlı protein miktar içinde büyük bir sorun yatıyor ve insan plazmada bulunan birçok aday protein biyolojik vardır Bu aralığı5içinde. Bu sorun büyük ölçüde doğal olarak geniş dinamik alan ve insan Proteom6karmaşıklığı tarafından nedeniyle oluşur.
Bu algılama zorlukları aşmak için IMMUNO-MS yöntemleri hedef proteinler veya katı bir yüzeye örnek çözümlerinden peptidler zenginleştirmek için geliştirilmiştir analitler ve MS ölçüm7,8 elüsyon tarafından takip , 9 , 10. IMMUNO-zenginleştirme karmaşık örnekleri analitler saflaştırılmış ve bu nedenle diğer molekülleri iyon-bastırma etkilerinden en aza indirilir. Sahip oldukları yüksek antikor Bağlama kapasitesi avantajları ve kullanım kolaylığı gibi çeşitli katı destekler arasında manyetik boncuklar şu anda en yaygın olarak kullanılmaktadır. Farklı functionalizations ve boyutları ile manyetik boncuklar geliştirilen ve immunoprecipitation deneyler için ticari. Bugüne kadar IMMUNO-zenginleştirme boncuk üzerinde electrospray iyonlaşma (ESI) ve maldı-MS ile protein ve peptid ölçüm için sızdı. Kararlı izotop standartları ve yakalama tarafından Anti-peptid antikorlar (SISCAPA) teknolojisi, kuluçka antikor kaplı boncuk IMMUNO-zenginleştirme ile takip örnekleri proteinleri sindirmek. "Klasik" SISCAPA içinde ele geçirilen proteotypic peptidler boncuk eluted ve tarafından sıvı Kromatografi-ESI-MS (LC-MS) veya doğrudan infüzyon ESI-çoklu tepki izleme-MS (ESI-MRM-MS)11,12tarafından ölçülür. IMMUNO-zenginleştirme MRM tahlil duyarlılığı düşük ng/mL Aralık13ulaşan 3-4 büyüklük, geliştirilmiş.
Electrospray-MS için karşılaştırıldığında, maldı-MS daha hızlı ve böylece hiçbir ertelenmiş ve kirlenme sorunları, temizlik ve LC sütunların yeniden denge yüksek üretilen iş çalışmaları14için daha uygun hale anlamına gelmez. IMMUNO-maldı teknoloji bizim laboratuvar IMMUNO-zenginleştirme maldı-MS ile hassas ve belirli miktar peptidler ve proteinler (proteotypic peptidler Nefelometri üzerinde dayalı) için birleştirmek için geliştirilen15,16 ,17. IMMUNO-zenginleştirme sonra boncuk maldı hedef tabağa yatırılır, matris çözüm için boncuk eklenir ve plaka kuruduktan sonra bir MALDI-TOF-Bayan göre analiz için hazırdır. Boncuk üzerinden peptidler elüsyon ayrı bir adım olarak gerçekleştirilir, ancak böylece numune hazırlama basitleştirilmesi ve örnek kaybını en aza boncuk noktalarına eklendiğinde benzeşme bağlı analitler maldı matris çözüm tarafından eluted. İMALDI teknoloji uygulamaları18,19, çeşitli uygulanan ve son zamanlarda edilmiş otomatik ve anjiyotensin ölçmek için kullanılan ben (Ang ben) plazma renin aktivitesi (PRA)20belirlemek için. Bu iletişim kuralı bir otomatik iMALDI tahlil gerçekleştirmek için kullanılan yordam gösterecektir. Örnek olarak, daha az % 10 arası gün CVs PRA tahlil alarak sağlanmıştır edildi 744 örnek gün20/ ölçme yeteneği ile otomasyon yoluyla.
Bu el yazması gösterdi iMALDI PRA tahlil hedef molekül olarak protein sindirimi gerektirmez (Ang ben) bir peptid 1295.7 Da Moleküler ağırlığı olduğunu. Diğer deneyleri içinde nerede protein sindirimi gereklidir ve bir peptid için olduğu gibi protein vekil olarak kullanılır, eşsiz ve bunun c kolayca ayırt edilebilir böylece 800 Da üzerinde bir kitle ile hedef protein iMALDI için seçili peptid olmalıdır Hemical gürültü maldı matris çözümden. Anti-peptid antikorlar peptidler IMMUNO-zenginleştirme için gereklidir. İletişim kuralı PRA ölçme bir iMALDI tahlil için dört adımlardan oluşur: 1) Ang nesil ben insan plazma; 2) IMMUNO-zenginleştirme Ang I istimal boncuk antikor kaplı; 3) boncuk bir maldı hedef plaka ve transfer ekleyerek matris çözüm; ve 4) sinyal Alım bir MALDI-TOF-MS ve veri analizi20tarafından.

<table><tbody><tr><td>Healthy control human plasma</td><td>Bioreclamation</td><td>HMPLEDTA2</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium bicarbonate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>09830</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium citrate dibasic</td><td>Sigma Aldrich</td><td>09833</td><td></td></tr><tr><td>CHAPS (&gt;=98%)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C9426</td><td></td></tr><tr><td>Albumin from chicken egg white (&gt;98%)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5503</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>EDS</td><td></td></tr><tr><td>Alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>70990</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Phenylmethanesulfonyl fluoride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>78830</td><td></td></tr><tr><td>Trifluoroacetic acid</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>85172</td><td>LC-MS grade</td></tr><tr><td>acetonitrile</td><td>Fluka</td><td>34967</td><td>LC-MS grade</td></tr><tr><td>water</td><td>Fluka</td><td>39253</td><td>LC-MS grade</td></tr><tr><td>acetic acid</td><td>Fluka</td><td>320099</td><td>LC-MS grade</td></tr><tr><td>Tris(hydroxymethyl)aminomethane</td><td>Roche Diagnostics</td><td>3118169001</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Protein G magnetic beads</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10003D</td><td>2.8 &lt;span class=&quot;font5&quot;&gt;&amp;mu;m, 30 mg/mL&lt;/span&gt;</td></tr><tr><td>anti-Ang I goat polyclonal antibody</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-7419</td><td></td></tr><tr><td>Nat and SIS Ang I</td><td>synthesized at the University of Victoria-Genome BC Proteomics Centre</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Automated liquid handling system</td><td>Agilent</td><td>16050-102</td><td>Agilent Bravo robotic workstation</td></tr><tr><td>Magnet</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12321D</td><td>Invitrogen DynaMag-2 magnet</td></tr><tr><td>Tube rotator</td><td>Theromo Scientific</td><td>400110Q</td><td>Labquake Tube Rotator</td></tr><tr><td>Magnet</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12027</td><td>DynaMag-96 side skirted magnet</td></tr><tr><td>Magnet</td><td>VP Scientific</td><td>771RM-1</td><td>used to pull the beads to the bottom of the well</td></tr><tr><td>MALDI-TOF</td><td>Bruker</td><td></td><td>Bruker Microflex LRF instrument</td></tr></tbody></table>

peptide and protein quantification using automated immuno-maldi (imaldi)

Kütle spektrometresi (MS) her hedef molekül kütlesi ücret oranı doğrudan tespiti sonucunda mükemmel tahlil özgüllük ile karmaşık örnekleri, protein miktarının için en sık kullanılan teknolojileri biridir. Ancak, çoğu diğer analitik teknikler gibi MS tabanlı proteomik yüksek-bereket analitler ölçme doğru bir önyargı var, elde etmek zor bu yüzden düşük ng/mL algılama sınırlar veya pg/mL karmaşık örnekleri ve bu konsantrasyon aralığın çoğu için biofluids insan plazma gibi hastalık ilgili proteinleri verdik. Düşük-bereket analitler algılama içinde yardımcı olmak için IMMUNO-zenginleştirme konsantre ve MS ölçüm, önemli ölçüde tahlil duyarlılık geliştirmek önce analit arındırmak için tahlil içine entegre edilmiştir. Bu çalışmada, IMMUNO - Matrix-Assisted lazer desorpsiyon/iyonlaşma (iMALDI) teknoloji proteinlerin ve peptidler biofluids içinde miktar için sunulan, IMMUNO-zenginleştirme boncuk üzerinde temel alan, maldı-MS ölçüm öncesinde elüsyon olmadan izledi. Anti-peptid antikorlar manyetik boncuklar functionalized ve örnekleri ile inkübe. Sonra yıkama, boncuk doğrudan bir maldı hedef tabağa aktarılır ve matris çözüm için boncuk uygulandıktan sonra sinyalleri tarafından uçuş (MALDI-TOF) enstrümanın bir maldı-zaman ölçülür. Diğer IMMUNO-MS deneyleri için karşılaştırıldığında örnek hazırlama prosedürü Basitleştirilmiş ve maldı ölçüm hızlıdır. Bütün numune hazırlama sistemi, geliştirilmiş tahlil tekrarlanabilirlik ve yüksek işlem hacmi ile işleme bir sıvı ile otomatik olarak gerçekleşir. Bu makalede, iMALDI tahlil peptid anjiyotensin belirlemek için kullanılır ben (Ang ben) konsantrasyon plazma, plazma renin aktivitesi okuma birincil aldosteronism (PA) tarama için klinik olarak kullanılır.

Ang ölçmek için bir otomatik iMALDI yordam ben şekil 1' de gösterilen. Hedef peptidler (endojen peptidler veya peptidler sindirilir proteinler üzerinden) Anti-peptid manyetik boncuklar zenginleştirilmiş ve sonra boncuk maldı ölçüm için bir hedef tabak aktarılır. Tüm prosedürü ek peptid elüsyon adım gerektiren diğer IMMUNO-MS teknolojileri ile karşılaştırıldığında basitleştirilmiştir. Otomasyon iMALDI tahlil örnekleri, çok sayıda varyasyon (CV) altında % 10 20arası gün katsayısı ile yüksek üretilen iş analizi sağlar. Temsilcisi spectra ang ölçerek elde insan plazma numuneleri ı Şekil 2' de gösterilmektedir. SIS peptidler peptid Nefelometri için dahili bir standart olarak işlev. Korelasyon ile otomatik iMALDI tahlil bir klinik LC-MS/MS yordamı17 kullanarak elde edilen PRA değerler ile elde edilen 188 hasta numuneleri PRA değerleri şekil 3' te gösterilmiştir. İki yöntem var 0,98 korelasyon katsayısı; yamaçları arasındaki farkı iki yöntemleri farklı iç standartlarının kullanımı veya iMALDI yordam20farklı antikor kullanımı neden olabilir. Tahlil ve tahlil hassas doğrusal dizi şekil 4 ve şekil 5gösterilir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55933/55933fig1.jpg"> 
Şekil 1: Süreç akış şeması bir otomatik iMALDI PRA testin. Başvuru20, izniyle uyarlanmıştır. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55933/55933fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55933/55933fig2.jpg"> 
Resim 2: Temsilcisi spectra NAT ve SIS Ang ben peptidler ölçülen bir insan plazma örneği.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55933/55933fig3.jpg"> 
Şekil 3: PRA korelasyon değerleri ölçülen iMALDI ve LC-MS/MS tarafından 188 hasta örnekleri. Başvuru20, izniyle uyarlanmıştır.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55933/55933fig4.jpg"> 
Şekil 4: Doğrusal aralıkları iMALDI PRA testin reflektör(a)ve (B) doğrusal modu. Başvuru20,. izniyle uyarlanmıştır <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55933/55933fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55933/55933fig5.jpg"> 
Şekil 5: Gün içi duyarlık(a)ve interday hassas (B) iMALDI PRA deneyleri düşük, orta ve Yüksek PRA değerlere sahip havuzları plazma üzerinde. Başvuru20, izniyle uyarlanmıştır. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55933/55933fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Peptide and Protein Quantification Using Automated Immuno-MALDI iMALDI at JoVE.com

Peptide and Protein Quantification Using Automated Immuno-MALDI iMALDI

Otomatik IMMUNO-maldı (iMALDI) teknolojisini kullanarak karmaşık biyolojik sıvı protein miktar için bir protokol sunulmuştur.

Peptid ve Protein miktar kullanarak otomatik IMMUNO-maldı (iMALDI)

Mass spectrometry (MS) is one of the most commonly used technologies for quantifying proteins in complex samples, with excellent assay specificity as a ...

peptide-and-protein-quantification-using-automated-immuno-maldi-imaldi

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Chemistry

Peptide and Protein Quantification Using Automated Immuno-MALDI (iMALDI)

7.9K Görüntüleme.  University of Victoria-Genome BC Proteomics Centre. Otomatik IMMUNO-maldı (iMALDI) teknolojisini kullanarak karmaşık biyolojik sıvı protein miktar için bir protokol sunulmuştur.

Video: Peptide and Protein Quantification Using Automated Immuno-MALDI iMALDI

Quantitative Proteomics Using Reductive Dimethylation for Stable Isotope Labeling

Stable isotope labeling of peptides by reductive dimethylation (ReDi labeling) is a method to accurately quantify protein expression differences between samples using mass spectrometry. ReDi labeling is performed using either regular (light) or deuterated (heavy) forms of formaldehyde and sodium cyanoborohydride to add two methyl groups to each free amine. Here we demonstrate a robust protocol for ReDi labeling and quantitative comparison of complex protein mixtures. Protein samples for comparison are digested into peptides, labeled to carry either light or heavy methyl tags, mixed, and co-analyzed by LC-MS/MS. Relative protein abundances are quantified by comparing the ion chromatogram peak areas of heavy and light labeled versions of the constituent peptide extracted from the full MS spectra. The method described here includes sample preparation by reversed-phase solid phase extraction, on-column ReDi labeling of peptides, peptide fractionation by basic pH reversed-phase (BPRP) chromatography, and StageTip peptide purification. We discuss advantages and limitations of ReDi labeling with respect to other methods for stable isotope incorporation. We highlight novel applications using ReDi labeling as a fast, inexpensive, and accurate method to compare protein abundances in nearly any type of sample.

Stable isotope labeling of peptides by reductive dimethylation (ReDi labeling) is a rapid, inexpensive strategy for accurate mass spectrometry-based quantitative proteomics. Here we demonstrate a robust method for preparation and analysis of protein mixtures using the ReDi approach that can be applied to nearly any sample type.

Kararlı İzotop Etiketleme için indirgeyici dimetilasyonu kullanma Sayısal Proteomiks

Stable isotope labeling of peptides by reductive dimethylation (ReDi labeling) is a method to accurately quantify protein expression differences between ...

Kimya

Low Molecular Weight Protein Enrichment on Mesoporous Silica Thin Films for Biomarker Discovery

The identification of circulating biomarkers holds great potential for non invasive approaches in early diagnosis and prognosis, as well as for the monitoring of therapeutic efficiency.1-3 The circulating low molecular weight proteome (LMWP) composed of small proteins shed from tissues and cells or peptide fragments derived from the proteolytic degradation of larger proteins, has been associated with the pathological condition in patients and likely reflects the state of disease.4,5 Despite these potential clinical applications, the use of Mass Spectrometry (MS) to profile the LMWP from biological fluids has proven to be very challenging due to the large dynamic range of protein and peptide concentrations in serum.6 Without sample pre-treatment, some of the more highly abundant proteins obscure the detection of low-abundance species in serum/plasma. Current proteomic-based approaches, such as two-dimensional polyacrylamide gel-electrophoresis (2D-PAGE) and shotgun proteomics methods are labor-intensive, low throughput and offer limited suitability for clinical applications.7-9 Therefore, a more effective strategy is needed to isolate LMWP from blood and allow the high throughput screening of clinical samples. 
Here, we present a fast, efficient and reliable multi-fractionation system based on mesoporous silica chips to specifically target and enrich LMWP.10,11 Mesoporous silica (MPS) thin films with tunable features at the nanoscale were fabricated using the triblock copolymer template pathway. Using different polymer templates and polymer concentrations in the precursor solution, various pore size distributions, pore structures, connectivity and surface properties were determined and applied for selective recovery of low mass proteins. The selective parsing of the enriched peptides into different subclasses according to their physicochemical properties will enhance the efficiency of recovery and detection of low abundance species. In combination with mass spectrometry and statistic analysis, we demonstrated the correlation between the nanophase characteristics of the mesoporous silica thin films and the specificity and efficacy of low mass proteome harvesting. The results presented herein reveal the potential of the nanotechnology-based technology to provide a powerful alternative to conventional methods for LMWP harvesting from complex biological fluids. Because of the ability to tune the material properties, the capability for low-cost production, the simplicity and rapidity of sample collection, and the greatly reduced sample requirements for analysis, this novel nanotechnology will substantially impact the field of proteomic biomarker research and clinical proteomic assessment.

We developed a technology based on mesoporous silica thin film for the selective recovery of low molecular weight proteins and peptides from human serum. The physico-chemical properties of our mesoporous chips were finely tuned to provide substantial control in peptide enrichment and consequently profile the serum proteome for diagnostic purposes.

Biyomarker Discovery için Mezogözenekli Silika İnce Filmler üzerine düşük molekül ağırlıklı Protein Zenginleştirme

The identification of circulating biomarkers holds great potential for non invasive approaches in early diagnosis and prognosis, as well as for the ...

Biyomühendislik

MALDI Imaging Mass Spectrometry of Neuropeptides in Parkinson's Disease

MALDI imaging mass spectrometry (IMS) is a powerful approach that facilitates the spatial analysis of molecular species in biological tissue samples2 (Fig.1). A 12 &mu;m thin tissue section is covered with a MALDI matrix, which facilitates desorption and ionization of intact peptides and proteins that can be detected with a mass analyzer, typically using a MALDI TOF/TOF mass spectrometer. Generally hundreds of peaks can be assessed in a single rat brain tissue section. In contrast to commonly used imaging techniques, this approach does not require prior knowledge of the molecules of interest and allows for unsupervised and comprehensive analysis of multiple molecular species while maintaining high molecular specificity and sensitivity2. Here we describe a MALDI IMS based approach for elucidating region-specific distribution profiles of neuropeptides in the rat brain of an animal model Parkinson's disease (PD). 
PD is a common neurodegenerative disease with a prevalence of 1% for people over 65 of age3,4. The most common symptomatic treatment is based on dopamine replacement using L-DOPA5. However this is accompanied by severe side effects including involuntary abnormal movements, termed L-DOPA-induced dyskinesias (LID)1,3,6. One of the most prominent molecular change in LID is an upregulation of the opioid precursor prodynorphin mRNA7. The dynorphin peptides modulate neurotransmission in brain areas that are essentially involved in movement control7,8. However, to date the exact opioid peptides that originate from processing of the neuropeptide precursor have not been characterized. Therefore, we utilized MALDI IMS in an animal model of experimental Parkinson's disease and L-DOPA induced dyskinesia. 
MALDI imaging mass spectrometry proved to be particularly advantageous with respect to neuropeptide characterization, since commonly used antibody based approaches targets known peptide sequences and previously observed post-translational modifications. By contrast MALDI IMS can unravel novel peptide processing products and thus reveal new molecular mechanisms of neuropeptide modulation of neuronal transmission. While the absolute amount of neuropeptides cannot be determined by MALDI IMS, the relative abundance of peptide ions can be delineated from the mass spectra, giving insights about changing levels in health and disease. In the examples presented here, the peak intensities of dynorphin B, alpha-neoendorphin and substance P were found to be significantly increased in the dorsolateral, but not the dorsomedial, striatum of animals with severe dyskinesia involving facial, trunk and orolingual muscles (Fig. 5). Furthermore, MALDI IMS revealed a correlation between dyskinesia severity and levels of des-tyrosine alpha-neoendorphin, representing a previously unknown mechanism of functional inactivation of dynorphins in the striatum as the removal of N-terminal tyrosine reduces the dynorphin's opioid-receptor binding capacity9. This is the first study on neuropeptide characterization in LID using MALDI IMS and the results highlight the potential of the technique for application in all fields of biomedical research.

Dopamine replacement pharmacotherapy using L-DOPA is the most commonly used symptomatic treatment of Parkinson&#x2019;s disease, but is accompanied by side effects including involuntary abnormal movements, termed dyskinesia 1. Here, a protocol for MALDI imaging mass spectrometry is presented that detects changes in rat brain neuropeptide levels related to dyskinesia.

Parkinson Hastalığında nöropeptitler MALDI Görüntüleme Kütle Spektrometresi

MALDI imaging mass spectrometry (IMS) is a powerful approach that facilitates the spatial analysis of molecular species in biological tissue samples2 ...

Tıp

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ubiquitinated proteins, peptides with a diglycine remnant conjugated to the epsilon amino group of lysine (&#39;K-&#949;-diglycine&#39; or simply &#39;diGly&#39;) can be used to track back the original modification site. Efficient immunopurification of diGly peptides combined with sensitive detection by mass spectrometry has resulted in a huge increase in the number of ubiquitination sites identified up to date. We have made several improvements to this workflow, including offline high pH reverse-phase fractionation of peptides prior to the enrichment procedure, and the inclusion of more advanced peptide fragmentation settings in the ion routing multipole. Also, more efficient cleanup of the sample using a filter-based plug in order to retain the antibody beads results in a greater specificity for diGly peptides. These improvements result in the routine detection of more than 23,000 diGly peptides from human cervical cancer cells (HeLa) cell lysates upon proteasome inhibition in the cell. We show the efficacy of this strategy for in-depth analysis of the ubiquitinome profiles of several different cell types and of in vivo samples, such as brain tissue. This study presents an original addition to the toolbox for protein ubiquitination analysis to uncover the deep cellular ubiquitinome.

We present a method for the purification, detection, and identification of diGly peptides that originate from ubiquitinated proteins from complex biological samples. The presented method is reproducible, robust, and outperforms published methods with respect to the level of depth of the ubiquitinome analysis.

Peptit Zenginleştirme ve Kütle Spektrometresi ile Protein Ubiquitinasyon Sitelerinin Saptanması

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Biyokimya

Peptide-based Identification of Functional Motifs and their Binding Partners

Specific short peptides derived from motifs found in full-length proteins, in our case HIV-1 Nef, not only retain their biological function, but can also competitively inhibit the function of the full-length protein. A set of 20 Nef scanning peptides, 20 amino acids in length with each overlapping 10 amino acids of its neighbor, were used to identify motifs in Nef responsible for its induction of apoptosis. Peptides containing these apoptotic motifs induced apoptosis at levels comparable to the full-length Nef protein. A second peptide, derived from the Secretion Modification Region (SMR) of Nef, retained the ability to interact with cellular proteins involved in Nef's secretion in exosomes (exNef). This SMRwt peptide was used as the "bait" protein in co-immunoprecipitation experiments to isolate cellular proteins that bind specifically to Nef's SMR motif. Protein transfection and antibody inhibition was used to physically disrupt the interaction between Nef and mortalin, one of the isolated SMR-binding proteins, and the effect was measured with a fluorescent-based exNef secretion assay. The SMRwt peptide's ability to outcompete full-length Nef for cellular proteins that bind the SMR motif, make it the first inhibitor of exNef secretion. Thus, by employing the techniques described here, which utilize the unique properties of specific short peptides derived from motifs found in full-length proteins, one may accelerate the identification of functional motifs in proteins and the development of peptide-based inhibitors of pathogenic functions.

Techniques to dissect the mechanisms underlying the secretion of HIV-1 Nef in exosomes are described. Specific short peptides derived from Nef and protein transfection were exploited to determine the structure, function, and binding partners of Nef&#x2019;s Secretion Modification Region. These procedures have general relevance in many mechanistic studies.

Fonksiyonel Motifler ve Bağlama Ortaklar peptid bazlı Kimlik

Specific short  peptides derived from motifs found in full-length proteins, in our case HIV-1  Nef, not only retain their biological function, but can ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Automated Sample Multiplexing by using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging (cPILOT)

We have introduced a high throughput quantitative proteomics workflow, combined precursor isotopic labeling and isobaric tagging (cPILOT) capable of multiplexing up to 22 or 24 samples with tandem mass tags or isobaric N,N-dimethyl leucine isobaric tags, respectively, in a single experiment. This enhanced sample multiplexing considerably reduces mass spectrometry acquisition times and increases the utility of the expensive commercial isobaric reagents. However, the manual process of sample handling and pipetting steps in the strategy can be labor intensive, time consuming, and introduce sample loss and quantitative error. These limitations can be overcome through the incorporation of automation. Here we transferred the manual cPILOT protocol to an automated liquid handling device that can prepare large sample numbers (i.e., 96 samples) in parallel. Overall, automation increases feasibility and reproducibility of cPILOT and allows for broad usage by other researchers with comparable automation devices.

Automated Sample Multiplexing by using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging cPILOT

Combined precursor isotopic labeling and isobaric tagging (cPILOT) is an enhanced sample multiplexing strategy that is capable of increasing the number of samples that can be analyzed simultaneously with available isobaric tags. Incorporation of a robotic platform has greatly increased experimental throughput, reproducibility, and quantitative accuracy.

Kombine Öncül İzotopik Etiketleme ve İzobarik Etiketleme (cPILOT) kullanılarak Otomatik Numune Çoklama

We have introduced a high throughput quantitative proteomics workflow, combined precursor isotopic labeling and isobaric tagging (cPILOT) capable of ...

Immunopeptidomics: Isolation of Mouse and Human MHC Class I- and II-Associated Peptides for Mass Spectrometry Analysis

Immunopeptidomics is an emerging field that fuels and guides the development of vaccines and immunotherapies. More specifically, it refers to the science of investigating the composition of peptides presented by major histocompatibility complex (MHC) class I and class II molecules using mass spectrometry (MS) technology platforms. Among all the steps in an MS-based immunopeptidomics workflow, sample preparation is critically important for capturing high-quality data of therapeutic relevance. Here, step-by-step instructions are described to isolate MHC class I and II-associated peptides by immunoaffinity purification from quality control samples, from mouse (EL4 and A20), and human (JY) cell lines more specifically. The various reagents and specific antibodies are thoroughly described to isolate MHC-associated peptides from these cell lines, including the steps to verify the beads-binding efficiency of the antibody and the elution efficiency of the MHC-peptide complexes from the beads. The protocol can be used to establish and standardize an immunopeptidomics workflow, as well as to benchmark new protocols. Moreover, the protocol represents a great starting point for any non-experts in addition to foster the intra- and inter-laboratory reproducibility of the sample preparation procedure in immunopeptidomics.

Here, we present a protocol for the purification of MHC class I and class II peptide complexes from mouse and human cell lines providing high-quality immunopeptidomics data. The protocol focuses on sample preparation using commercially available antibodies.

İmmünopeptidomik: Kütle Spektrometresi Analizi için Fare ve İnsan MHC Sınıfı I ve II İlişkili Peptitlerin İzolasyonu

Immunopeptidomics is an emerging field that fuels and guides the development of vaccines and immunotherapies. More specifically, it refers to the science ...

"Cell Surface Capture" Workflow for Label-Free Quantification of the Cell Surface Proteome

Over the past decade, mass spectrometry-based proteomics has enabled an in-depth characterization of biological systems across a broad array of applications. The cell surface proteome ("surfaceome") in human disease is of significant interest, as plasma membrane proteins are the primary target of most clinically approved therapeutics, as well as a key feature by which to diagnostically distinguish diseased cells from healthy tissues. However, focused characterization of membrane and surface proteins of the cell has remained challenging, primarily due to the complexity of cellular lysates, which mask proteins of interest by other high-abundance proteins. To overcome this technical barrier and accurately define the cell surface proteome of various cell types using mass spectrometry proteomics, it is necessary to enrich the cell lysate for cell surface proteins prior to analysis on the mass spectrometer. This paper presents a detailed workflow for labeling cell surface proteins from cancer cells, enriching these proteins out of the cell lysate, and subsequent sample preparation for mass spectrometry analysis.

Here, we describe a proteomics workflow for characterization of the cell surface proteome of various cell types. This workflow includes cell surface protein enrichment, subsequent sample preparation, analysis using an LC-MS/MS platform, and data processing with specialized software.

Over the past decade, mass spectrometry-based proteomics has enabled an in-depth characterization of biological systems across a broad array of ...

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in quantitation, are associated with a high cost, long lead time, and are fraught with drawbacks (e.g. heterophilic antibodies, autoantibody interference, 'hook-effect').1 An alternative technique is affinity enrichment of peptides coupled with quantitative mass spectrometry, commonly referred to as SISCAPA (Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies).2 In this technique, affinity enrichment of peptides with stable isotope dilution and detection by selected/multiple reaction monitoring mass spectrometry (SRM/MRM-MS) provides quantitative measurement of peptides as surrogates for their respective proteins. SRM/MRM-MS is well established for accurate quantitation of small molecules 3, 4 and more recently has been adapted to measure the concentrations of proteins in plasma and cell lysates.5-7 To achieve quantitation of proteins, these larger molecules are digested to component peptides using an enzyme such as trypsin. One or more selected peptides whose sequence is unique to the target protein in that species (i.e. "proteotypic" peptides) are then enriched from the sample using anti-peptide antibodies and measured as quantitative stoichiometric surrogates for protein concentration in the sample. Hence, coupled to stable isotope dilution (SID) methods (i.e. a spiked-in stable isotope labeled peptide standard), SRM/MRM can be used to measure concentrations of proteotypic peptides as surrogates for quantification of proteins in complex biological matrices. The assays have several advantages compared to traditional immunoassays. The reagents are relatively less expensive to generate, the specificity for the analyte is excellent, the assays can be highly multiplexed, enrichment can be performed from neat plasma (no depletion required), and the technique is amenable to a wide array of proteins or modifications of interest.8-13 In this video we demonstrate the basic protocol as adapted to a magnetic bead platform.

Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies (SISCAPA) couples affinity enrichment of peptides with stable isotope dilution mass spectrometry (MRM-MS) to provide quantitative measurement of peptides as surrogates for their respective proteins. Here we describe the protocol using magnetic particles in a partially automated format.

Proteinler Peptid immunoaffiniti Zenginleştirme kullanarak Niceleme Kütle Spektrometresi ile birleştiğinde

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in ...

Biyoloji

Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometry for Absolute Protein Quantification

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This protocol provides step-by-step instructions for the development and application of quantitative assays using selected reaction monitoring (SRM) mass spectrometry (MS). First, likely quantotypic target peptides are identified based on numerous criteria. This includes identifying proteotypic peptides, avoiding sites of posttranslational modification, and analyzing the uniqueness of the target peptide to the target protein. Next, crude external peptide standards are synthesized and used to develop SRM assays, and the resulting assays are used to perform qualitative analyses of the biological samples. Finally, purified, quantified, heavy isotope labeled internal peptide standards are prepared and used to perform isotope dilution series SRM assays. Analysis of all of the resulting MS data is presented. This protocol was used to accurately assay the absolute abundance of proteins of the chemotaxis signaling pathway within RAW 264.7 cells (a mouse monocyte/macrophage cell line). The quantification of Gi2 (a heterotrimeric G-protein &#945;-subunit) is described in detail.

This protocol describes how to perform absolute quantification assays of target proteins within complex biological samples using selected reaction monitoring. It was used to accurately quantify proteins of the mouse macrophage chemotaxis signaling pathway. Target peptide selection, assay development, and qualitative and quantitative assays are described in detail.

Mutlak Protein Niceleme Kütle Spektrometresi İzleme Seçilen Tepki

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This ...