ゲノム技術革新ネットワーク (ジン) をゲノム カナダ、操作 (204PRO) および技術開発 (214PRO) のゲノム ブリティッシュ コロンビア州からの資金援助に感謝いたします。撮影用飛行時間測定器の使用のマギル大学健康センター研究所薬剤発見プラットフォームをありがちましょう。H.L. 国立科学工学研究協議会のカナダ (レベル) からポスドク研究員プログラムからサポートに感謝です。C.H.B は最先端基金基金 (葉っぱ) からのサポートに感謝しています。えざるはマギル大学 (モントリオール, ケベック州, カナダ) 分子腫瘍学のシーガル マギル椅子からのサポートに感謝します。M.X.C. とえざるがユダヤ人の総合病院 (モントリオール, ケベック州, カナダ) にウォーレン Y. ソーパー慈善信託とアルヴィン シーガル家族財団から支援に感謝。

下記試薬の量は 20 の患者血漿検体の測定に基づいています。プロトコルはビクトリア大学のガイドライン以下提示 &#39; s 人間研究倫理委員会.
 1 アン世代ひと血漿中私 <ol><li>血漿検体を解凍 (&#8805; 200 μ l) の部屋で温度水は 5 分のお風呂と、完全に解凍するまで氷の上にサンプルを置く。</li>。
	<li>1.1 mL ディープウェル プレート (サンプル プレート) の井戸を分離し、遠心分離機の 2 ° C および 1278 x g で 10 分間遠心でプレートに手動で各血漿サンプルの転送 200 μ l</li>
	<li>リキッドハンド リング システムを使用して、連続希薄と鶏卵白アルブミン 6 校正ソリューションを準備する 500 fmol/μ L Ang I NAT の標準溶液 (0.1、0.2、0.6、1.9 5.7, 17.2 fmol/μ L).</li>
	サンプル プレートに <li>世代のも、125 μ L を各キャリブレータのピペット 200 μ L バッファーします 。
	注: CEWA のリン酸バッファー生理食塩水 (PBS) バッファーは実験の日に新たに作成される必要があります</li>。
	<li>リキッドハンド リング システムを使用して、新しいプレートのミックス プラズマの培養上清中の 125 μ L または 125 μ L の PBS の CEWA のアンの 25 μ L で私世代バッファー 1 M トリス、0.2 mM エチレンジアミン四酢酸 (EDTA)、1 mM を含む特異フッ化物 (PMSF). 
	注: 準備、Ang 私 1 M トリス/0.2 mM EDTA 水系バッファーをミキシングによって生成バッファー (pH 5.5 に調整酢酸を使用して) そして PMSF ソリューション (メタノール 100 mM)。両方のソリューションで、実験の日に 4 ° c. のミックス 2 つのソリューションで 1 ヶ月格納できます</li>。
	<li>は、96 ウェル プレート、1 ソリューションにつき 3 複製、34 μ L/ウェルにソリューションを自動的に転送します。3 h の 37 ° C でプレートを孵化させなさい</li>
</ol> 2。アンの免疫強化私を使用して抗体をコートしたビーズ <ol><li>蛋白質 G 磁気ビーズに抗体の共役 注: ビーズを抗体の共役が 3 h アンの中に手動で実行される私の発生期、実験の日。その他の検体の共役ビーズ プロパティおよび抗体の安定性に応じて 3 ヵ月以上、4 ° C で 0.015% チャップス (きて) を含む PBS バッファーに格納することができるかもしれない。
	<ol><li>(20 のサンプルを測定し、6 点の標準曲線を作る十分な) ビーズ スラリーの転送 110 μ L 1.5 mL チューブに。ビーズ 7 回 1 mL 25% アセトニ トリル/きてときて 1 mL で 3 回洗います。各洗浄工程間ビーズをペレットにマグネット スタンドを使用します。最後のワシントン州後に洗浄バッファーを削除 
		注意: 洗浄 7 回 25% アセトニ トリル/きてはビーズ スラリー、Tween 20 MS 互換性のない添加物を除去するため重要です。選択したビーズではこのような添加剤は、この広範な洗浄工程必要がありますできません</li>。
		<li>きて、110 μ のビードを再停止しなさい、反中央の 110 μ L を追加私抗体 (最終的な抗体濃度: 100 μ g/mL)。ミックス ビーズとソリューションをピペッティングと、それらを 8 rpm で回転、1 時間室温でインキュベートします</li>。
		<li>3 回きて、1 mL でビーズを洗ってきて 1100 μ で再懸濁します 。
		注: 場合はビード ソリューションは、インキュベーション中にチューブのキャップに流れ込んできた、スピンダウン 2680 x g にベンチトップ遠心分離機を使用して、ソリューション</li>
		<li>は、96 ウェル プレート (ビーズ標準プレート) にビーズ ソリューションを手動で転送します。リキッドハンド リングの因数にシステム 120 μ L/ウェル同じ 96 ウェル プレートにビーズを使用して、</li></ol></li> <li>ビーズの免疫強化 <ol><li>後 3 h アン発生期培養プレートに。アン I. の生成を終了する 10 分の氷</li>
		<li>は自動的に SIS ペプチド原液 (10 pmol/μ L) を 100 倍希釈 PBS で、バッファーに格納し、自動的に更に因数 96 ウェル PCR プレートに安定した isoptope 標準的なペプチド希釈。培養プレートの各ウェルに 1.5 μ L (100 fmol 含む) 安定同位体標準 (SIS) ペプチド溶液を転送し、血漿検体または PBS バッファーで CEWA ミックスします</li>。
		<li>ビーズのソリューションは、ウェルあたり 10 mL に培養プレートの内容を転送、ミックスを自動的にします</li>。
		<li>1 h 4 ° C でプレートを 8 回転で回転させながらインキュベートします</li>。
		<li>ビーズにて 3 回洗浄自動的に 5 mM 重炭酸アンモニウム (アンビック) ソリューションでは、100 μ L/ウェル洗浄あたり。最後の洗浄後 5 mM 各ウェルに碧のソリューションの 7 μ L でビーズを再懸濁します。最後のワシントン州の後下部にビーズをプルする磁石を使用</li>
	</ol></li></ol> 3。MALDI ターゲット プレートと追加するマトリックス ソリューションにビーズの転送 <li>2,600 のスポット サイズと MALDI ターゲット プレートの上に自動的にビーズ スラリーの転送 7 μ <ol>μ m。ビーズが乾くみましょう 。
	注: 小型 USB 電源ファンはビーズ乾燥過程を加速するため使用できます</li>。
	<li>は自動的に α-シアノ-4-ヒドロキシケイ皮酸 (HCCA) の 2 μ L を追加-各サンプル ターゲット プレート上のスポットにはうまく行列から行列ソリューション (3 mg/mL HCCA、クエン酸アンモニウム 1.8 mg/mL、70% アセトニ トリル、0.1% トリフルオロ酢酸を含む).</li>
</ol> 4。MALDI TOF MS とデータ解析による買収を信号 正反射モードを使用して MALDI-TOF 楽器 <ol><li>分析サンプル スポット。内部校正、データの平滑化、およびベンダー固有のソフトウェアで自動的に基線の減算を実行します 。
	注: (正/負、線形/リフレクター) 選択したモード MALDI-TOF 測定対象のペプチッドまたは蛋白質によって異なります</li>。
	<li>相対応答比 (Nat/SIS 強度比) を計算して、アンの私を決定する標準的なカーブに各サンプルの濃度を比較すること。計算式 (1) を使用して、プラ Δt アン私世代 Ang i. の生成に使用される時刻を表す 
	プラ = [アン私]/Δt アン私世代 (1)</li></ol>

<ol>
	<li>Aebersold, R., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry-based+proteomics.">Mass spectrometry-based proteomics.</a> Nature. 422 (6928), 198-207 (2003).</li><li>Nicol, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+an+Immunoaffinity-Mass+Spectrometry-based+Approach+for+the+Quantification+of+Protein+Biomarkers+from+Serum+Samples+of+Lung+Cancer+Patients.">Use of an Immunoaffinity-Mass Spectrometry-based Approach for the Quantification of Protein Biomarkers from Serum Samples of Lung Cancer Patients.</a> Mol. &amp; Cell. Proteomics. 7 (10), 1974-1982 (2008).</li><li>Webster, J., Oxley, D., Zanders, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Chemical Genomics and Proteomics: Reviews and Protocols. , 227-240 (2012).</li><li>Yergey, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+sequencing+of+peptides+using+MALDI/TOF-TOF.">De novo sequencing of peptides using MALDI/TOF-TOF.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 13 (7), 784-791 (2002).</li><li>Anderson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Six+decades+searching+for+meaning+in+the+proteome.">Six decades searching for meaning in the proteome.</a> J. Proteomics. 107, 24-30 (2014).</li><li>Landegren, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opportunities+for+Sensitive+Plasma+Proteome+Analysis.">Opportunities for Sensitive Plasma Proteome Analysis.</a> Anal. Chem. 84 (4), 1824-1830 (2012).</li><li>Guo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoaffinity+Enrichment+and+Mass+Spectrometry+Analysis+of+Protein+Methylation.">Immunoaffinity Enrichment and Mass Spectrometry Analysis of Protein Methylation.</a> Mol. &amp; Cell. Proteomics. 13 (1), 372-387 (2014).</li><li>Florentinus-Mefailoski, A., Soosaipillai, A., Dufresne, J., Diamandis, E. P., Marshall, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+enzyme-linked+immuno-mass+spectrometric+assay+with+the+substrate+adenosine+monophosphate.">An enzyme-linked immuno-mass spectrometric assay with the substrate adenosine monophosphate.</a> Anal. Bioanal. Chem. 407 (4), 1119-1130 (2015).</li><li>Fredolini, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunocapture+strategies+in+translational+proteomics.">Immunocapture strategies in translational proteomics.</a> Expert Rev Proteomics. 13 (1), 83-98 (2016).</li><li>Tran, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+Affinity+Capture+and+On-Tip+Digestion+to+Accurately+Quantitate+in+Vivo+Deamidation+of+Therapeutic+Antibodies.">Automated Affinity Capture and On-Tip Digestion to Accurately Quantitate in Vivo Deamidation of Therapeutic Antibodies.</a> Anal. Chem. , (2016).</li><li>Razavi, M., Leigh Anderson, N., Pope, M. E., Yip, R., Pearson, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+precision+quantification+of+human+plasma+proteins+using+the+automated+SISCAPA+Immuno-MS+workflow.">High precision quantification of human plasma proteins using the automated SISCAPA Immuno-MS workflow.</a> N. Biotechnol. 33 (5 Part A), 494-502 (2016).</li><li>Razavi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+SISCAPA+Quantitation+of+Peptides+from+Human+Plasma+Digests+by+Ultrafast,+Liquid+Chromatography-Free+Mass+Spectrometry.">High-Throughput SISCAPA Quantitation of Peptides from Human Plasma Digests by Ultrafast, Liquid Chromatography-Free Mass Spectrometry.</a> J. Proteome Res. 11 (12), 5642-5649 (2012).</li><li>Anderson, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SISCAPA+Peptide+Enrichment+on+Magnetic+Beads+Using+an+In-line+Bead+Trap+Device.">SISCAPA Peptide Enrichment on Magnetic Beads Using an In-line Bead Trap Device.</a> Mol. &amp; Cell. Proteomics. 8 (5), 995-1005 (2009).</li><li>Parker, C. E., Pearson, T. W., Anderson, N. L., Borchers, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass-spectrometry-based+clinical+proteomics+-+a+review+and+prospective.">Mass-spectrometry-based clinical proteomics - a review and prospective.</a> The Analyst. 135 (8), 1830-1838 (2010).</li><li>Reid, J. D., Holmes, D. T., Mason, D. R., Shah, B., Borchers, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+the+Development+of+an+Immuno+MALDI+(iMALDI)+Mass+Spectrometry+Assay+for+the+Diagnosis+of+Hypertension.">Towards the Development of an Immuno MALDI (iMALDI) Mass Spectrometry Assay for the Diagnosis of Hypertension.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 21 (10), 1680-1686 (2010).</li><li>Mason, D. R., Reid, J. D., Camenzind, A. G., Holmes, D. T., Borchers, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Duplexed+iMALDI+for+the+detection+of+angiotensin+I+and+angiotensin+II.">Duplexed iMALDI for the detection of angiotensin I and angiotensin II.</a> Methods. 56 (2), 213-222 (2012).</li><li>Camenzind, A. G., vander Gugten, J. G., Popp, R., Holmes, D. T., Borchers, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+evaluation+of+an+immuno-MALDI+(iMALDI)+assay+for+angiotensin+I+and+the+diagnosis+of+secondary+hypertension.">Development and evaluation of an immuno-MALDI (iMALDI) assay for angiotensin I and the diagnosis of secondary hypertension.</a> Clin. Proteomics. 10 (1), 20 (2013).</li><li>Jiang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+immuno+tandem+mass+spectrometry+(iMALDI)+assay+for+EGFR+diagnosis.">Development of an immuno tandem mass spectrometry (iMALDI) assay for EGFR diagnosis.</a> Proteomics Clin Appl. 1, (2007).</li><li>Jiang, J., Parker, C. E., Fuller, J. R., Kawula, T. H., Borchers, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Immunoaffinity+Tandem+Mass+Spectrometry+(iMALDI)+assay+for+Detection+of+Francisella+tularensis.">An Immunoaffinity Tandem Mass Spectrometry (iMALDI) assay for Detection of Francisella tularensis.</a> Analytica chimica acta. 605 (1), 70-79 (2007).</li><li>Popp, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+assay+for+the+clinical+measurement+of+plasma+renin+activity+by+immuno-MALDI+(iMALDI).">An automated assay for the clinical measurement of plasma renin activity by immuno-MALDI (iMALDI).</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics. 1854 (6), 547-558 (2015).</li><li>Schoenherr, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+screening+of+monoclonal+antibodies+for+SISCAPA+assays+using+a+magnetic+bead+processor+and+liquid+chromatography-selected+reaction+monitoring-mass+spectrometry.">Automated screening of monoclonal antibodies for SISCAPA assays using a magnetic bead processor and liquid chromatography-selected reaction monitoring-mass spectrometry.</a> J Immunol Methods. 353 (1-2), 49-61 (2010).</li><li>Borchers, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+quantitation+and+identification+of+peptides+and+proteins.">Methods of quantitation and identification of peptides and proteins.</a> US patent. , (2010).</li><li>Borchers, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+quantitation+and+identification+of+peptides+and+proteins.">Methods of quantitation and identification of peptides and proteins.</a> Canadian patent CA. , (2011).</li><li>Wei&#223;, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catch+and+measure-mass+spectrometry-based+immunoassays+in+biomarker+research.">Catch and measure-mass spectrometry-based immunoassays in biomarker research.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics. 1844 (5), 927-932 (2014).</li><li>Nelson, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+fragments:+Hope+and+hype.">Antibody fragments: Hope and hype.</a> mAbs. 2 (1), 77-83 (2010).</li><li>Gupta, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evaluation+of+an+aptamer+for+use+as+an+affinity+reagent+with+MS:+PCSK9+as+an+example+protein.">An evaluation of an aptamer for use as an affinity reagent with MS: PCSK9 as an example protein.</a> Bioanalysis. 8 (15), 1557-1564 (2016).</li></ol>

C.H.B は、iMALDI 技術の特許を保持しています。

従来の MS を用いたタンパク質定量と比較して、iMALDI は、分析検体を豊かにし、したがって、それはタンパク質またはペプチド低濃度を定量化することが可能、複雑なサンプルからそれらを浄化する抗体を使用します。IMALDI プロトコルの重要なステップは、ターゲット ペプチドの免疫強化です。このため、高い特異性と親和性の抗体を選択してください。SISCAPA、内 10-9 M 以上で抗体の親和性が低い ng/mL21で高感度を達成するために必要になることが報告されています。さらに、高い抗体結合能とビーズは最適な濃縮に適しています。
また、比較的「クリーン」最小限のバック グラウンド レベルと標的分子スペクトルを生成することが重要です。高い信号対雑音比は、豊富なビーズ免疫濃縮のステップの後の洗浄で実現できます。また、我々 はその後追加しマトリックス ソリューションを乾燥することができますノイズ信号を大幅に削減し、信号対雑音比を向上させるターゲット板にビード スポットを洗浄を発見しました。
本作で披露 iMALDI プラ試金蛋白質分解手順は必要ありませんターゲット分子アンとして私はペプチド。サンプル中のタンパク質分子を定量化するには、エピトープを含むペプチドは、消化は、キャプチャされたタンパク質22,23でも実行できますが、蛋白質は通常免疫濃縮前にペプチドに消化されます。この場合、既存の蛋白質の消化力のプロトコルは、iMALDI のワークフローに簡単に挿入できます。 消化バッファーによって抗体ペプチド結合との干渉を避けるために、ビーズにペプチドのキャプチャ前に脱塩ステップを必要可能性があります。
その他免疫 MS メソッドと同様に、抗ペプチド抗体の生産は iMALDI の試金の開発の主要な課題です。最近、バインダー24あたり複数のペプチドを対象とする親和性バインダーを生成するトリプル X プロテオミクス技術を開発されています。これは抗ペプチド抗体のコストを減らすことができる、単一の孵化を使用して同時多重アッセイの開発を容易にするでしょう。また、抗体フラグメントの25または合成アプタマー26そのまま抗体の使用に代わる方法ができるし、簡単な生産の利点を持っているでしょう。合成アプタマーは、そのまま抗体親和性濃縮26を使用する場合よりも低いのバック グラウンド レベルを示すと報告されています。
iMALDI 技術は、MALDI 質量分析法は、高い感度と特異性を持つ複雑なサンプルの数が多いに急速に、高スループットのタンパク質/ペプチド分析を有効にするとイムノアッセイの利点を兼ね備えています。その他免疫 MS メソッドとは異なり免疫キャプチャ、ペプチドがチューブに溶出しないターゲットが運ぶ検体は, 質量分析の MALDI ターゲット プレートに転送されますビーズ後回避プラスチックへの吸着によるペプチドの損失チューブ。ウェスタンブロッティングや ELISA などの広く使用されているプロテオーム ツールと比較して、iMALDI、アッセイ開発時間とコストを大幅に削減でのみ 1 つの抗体が必要です。プラのアッセイで得た検出下限値は従来の ELISA と生理学的範囲内に匹敵します。抗体と質量電荷比は、アッセイの高い特異性を保証する二重選択プロセスを提供します。IMALDI のアプリケーションはプラの試金に限定されていないが、任意のタンパク質発現の定量及び複雑な試料中のタンパク質の修飾も定量化の適用することができます。特に、自動化されたハイスループット iMALDI 強力な臨床ツール発見とベンチトップ MALDI 細菌のための診療所で現在使用の存在のための病気の様々 な蛋白質バイオ マーカーの検証ができます。身分証明書。

質量分析法による定量的プロテオミクスにおける必要不可欠なツールとなっています。質量分析法は、ターゲット蛋白質またはペプチッドの固まりを判断できます、したがって得られた試料信号することができます非常に具体的イムノアッセイと比較しています。エレクトロ スプレーと MALDI は、2 つのイオン化方法は、タンパク質・ ペプチド1,2,3、4を検出するためによく使用されます。MS を用いたタンパク質定量における大きな課題は、高豊富な蛋白質の存在下で ng/mL または pg/mL の濃度で複雑な試料中の低豊富なタンパク質の検出、ひと血漿中発見多く候補蛋白質バイオ マーカーこれの範囲の5を実行します。この問題は、本質的に広いダイナミック レンジおよび人間の proteome6の複雑さが主原因です。
ターゲット蛋白質または固体表面上にサンプル ソリューションからペプチドを豊かにする方法が免疫 MS 検出課題を克服するために開発されて、検体と MS 測定7,8の溶出順,9,10します。 複雑なサンプルから濃縮、免疫を介して、検体を精製し、他の分子からイオン抑制効果を最小化するため。固体の様々 なサポートの中では、扱いやすさと高い抗体結合能力の利点を有するので磁気ビーズは最も広く使用現在。別の functionalizations とサイズの磁気ビーズを開発し、免疫沈降実験のため商品化します。日には、ビーズに免疫強化をエレクトロ スプレー イオン化 (ESI) と MALDI MS タンパク質およびペプチドの測定のためインターフェースされてが。安定同位体標準および抗ペプチド抗体 (SISCAPA) 技術による捕獲は、免疫強化のための抗体をコートしたビーズと孵化によって続いて、試料中のタンパク質は消化されます。「古典的な」SISCAPA でキャプチャ proteotypic ペプチドが、ビーズから溶出し、測定による液体クロマトグラフィー-MS (LC-MS)、または直接注入 ESI 複数反応モニタリング MS (ESI MRM MS)11,12。免疫強化は、ng/mL の低範囲13に達する 3-4 桁 MRM アッセイ感度を向上します。
エレクトロ スプレー MS と比較して、MALDI MS の高速、かつを含まない洗浄と LC カラムの再平衡持ち越しと汚染の問題がないのでより高スループット研究14に適しています。ペプチッドおよび蛋白質 (proteotypic ペプチドの定量に基づく) の特異的かつ高感度定量 MALDI MS と免疫強化を結合する当研究室で開発した免疫 MALDI 技術15,16 ,17。免疫濃縮後 MALDI ターゲット プレートにビーズを堆積、マトリックス ソリューション ビーズに追加されます、乾燥後プレートは MALDI TOF MS による分析の準備ができて。ビーズからペプチドの溶出は別のステップとして実行されませんが、アフィニティ バインド analytes は MALDI のマトリックス ソリューションによって溶離されるビード スポット、サンプル準備を簡素化し、サンプルの損失を最小限に抑えることに追加するとき。IMALDI 技術適用されているさまざまなアプリケーション18,19で、最近自動化されアンジオテンシンを測定するために使用私 (Ang 私) 血漿レニン活性 (PRA)20を決定します。このプロトコルは、自動 iMALDI 分析を実行するための手順を説明します。例については、10% 未満の間日 CVs としてプラ アッセイを取って日20あたり 744 のサンプルを測定する機能を備えた、自動化によって達成されています。
本稿で示した iMALDI プラ アッセイはターゲット分子としてのタンパク質消化を必要としない (アン私) 1295.7 Da の分子量のペプチドです。C とそれを簡単に区別できるように 800 Da 以上の質量を持つ、ターゲット蛋白質に固有にする必要があります iMALDI の選択したペプチドその他試金蛋白質消化が必要あり、ペプチドはそのまま蛋白質の代理として使用される、MALDI のマトリックス ソリューションから 2・3 のノイズ。抗ペプチド抗体、ペプチドの免疫強化に必要です。PRA を測定 iMALDI 試金のためのプロトコルは 4 つのステップで構成されています: 1) アンの世代人間プラズマで2) 免疫-豊かなアンの私は抗体をコートしたビーズ; を使用して3) ビーズの MALDI ターゲット プレートと追加するマトリックス ソリューションへの転送・ 4) 信号集録 MALDI TOF MS とデータ解析20。

<table width="892">
	<tbody>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl63" height="21" style="width:204pt;height:15.75pt" width="272">Healthy control human plasma</td>
			<td class="xl63" style="width:134pt" width="178">Bioreclamation</td>
			<td class="xl68" style="width:89pt" width="119">HMPLEDTA2</td>
			<td class="xl66" style="width:242pt" width="323"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl63" height="21" style="width:204pt;height:15.75pt" width="272">Ammonium bicarbonate</td>
			<td class="xl63" style="width:134pt" width="178">Sigma Aldrich</td>
			<td class="xl69">09830</td>
			<td class="xl66"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl63" height="21" style="width:204pt;height:15.75pt" width="272">Ammonium citrate dibasic</td>
			<td class="xl63" style="width:134pt" width="178">Sigma Aldrich</td>
			<td class="xl68" style="width:89pt" width="119">09833</td>
			<td class="xl66"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl63" height="21" style="width:204pt;height:15.75pt" width="272">CHAPS (&#62;=98%)</td>
			<td class="xl63" style="width:134pt" width="178">Sigma Aldrich</td>
			<td class="xl68" style="width:89pt" width="119">C9426</td>
			<td class="xl66"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl63" height="21" style="width:204pt;height:15.75pt" width="272">Albumin from chicken egg white (&#62;98%)</td>
			<td class="xl63" style="width:134pt" width="178">Sigma Aldrich</td>
			<td class="xl68" style="width:89pt" width="119">A5503</td>
			<td class="xl66"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl63" height="21" style="width:204pt;height:15.75pt" width="272">Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td class="xl63" style="width:134pt" width="178">Sigma Aldrich</td>
			<td class="xl68" style="width:89pt" width="119">EDS</td>
			<td class="xl66"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl63" height="21" style="width:204pt;height:15.75pt" width="272">Alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid</td>
			<td class="xl63" style="width:134pt" width="178">Sigma Aldrich</td>
			<td class="xl68" style="width:89pt" width="119">70990</td>
			<td class="xl66"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl63" height="21" style="width:204pt;height:15.75pt" width="272">Phosphate buffered saline</td>
			<td class="xl63" style="width:134pt" width="178">Sigma Aldrich</td>
			<td class="xl68" style="width:89pt" width="119">P4417</td>
			<td class="xl66"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl63" height="21" style="width:204pt;height:15.75pt" width="272">Phenylmethanesulfonyl fluoride</td>
			<td class="xl63" style="width:134pt" width="178">Sigma Aldrich</td>
			<td class="xl68" style="width:89pt" width="119">78830</td>
			<td class="xl66"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl63" height="21" style="width:204pt;height:15.75pt" width="272">Trifluoroacetic acid</td>
			<td class="xl63" style="width:134pt" width="178">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td class="xl68" style="width:89pt" width="119">85172</td>
			<td class="xl66">LC-MS grade</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl63" height="21" style="width:204pt;height:15.75pt" width="272">acetonitrile</td>
			<td class="xl63" style="width:134pt" width="178">Fluka</td>
			<td class="xl68" style="width:89pt" width="119">34967</td>
			<td class="xl66">LC-MS grade</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl63" height="21" style="width:204pt;height:15.75pt" width="272">water</td>
			<td class="xl63" style="width:134pt" width="178">Fluka</td>
			<td class="xl68" style="width:89pt" width="119">39253</td>
			<td class="xl66">LC-MS grade</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl63" height="21" style="width:204pt;height:15.75pt" width="272">acetic acid</td>
			<td class="xl63" style="width:134pt" width="178">Fluka</td>
			<td class="xl68" style="width:89pt" width="119">320099</td>
			<td class="xl66">LC-MS grade</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl63" height="21" style="width:204pt;height:15.75pt" width="272">Tris(hydroxymethyl)aminomethane</td>
			<td class="xl63" style="width:134pt" width="178">Roche Diagnostics</td>
			<td class="xl71">3118169001</td>
			<td class="xl66"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl63" height="21" style="width:204pt;height:15.75pt" width="272">Dynabeads Protein G magnetic beads</td>
			<td class="xl63" style="width:134pt" width="178">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td class="xl68" style="width:89pt" width="119">10003D</td>
			<td class="xl66">2.8 &#956;m, 30 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl63" height="21" style="width:204pt;height:15.75pt" width="272">anti-Ang I goat polyclonal antibody</td>
			<td class="xl63" style="width:134pt" width="178">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td class="xl68" style="width:89pt" width="119">sc-7419</td>
			<td class="xl66"></td>
		</tr>
		<tr height="84" style="height:63.0pt">
			<td class="xl63" height="84" style="width:204pt;height:63.0pt" width="272">Nat and SIS Ang I</td>
			<td class="xl63" style="width:134pt" width="178">synthesized at the University of Victoria-Genome BC Proteomics Centre</td>
			<td class="xl68" style="width:89pt" width="119"></td>
			<td class="xl66"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl63" height="21" style="width:204pt;height:15.75pt" width="272">Automated liquid handling system</td>
			<td class="xl63" style="width:134pt" width="178">Agilent</td>
			<td class="xl68" style="width:89pt" width="119">16050-102</td>
			<td class="xl66">Agilent Bravo robotic workstation</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl63" height="21" style="width:204pt;height:15.75pt" width="272">Magnet</td>
			<td class="xl63" style="width:134pt" width="178">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td class="xl68" style="width:89pt" width="119">12321D</td>
			<td class="xl66">Invitrogen DynaMag-2 magnet</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl63" height="21" style="width:204pt;height:15.75pt" width="272">Tube rotator</td>
			<td class="xl63" style="width:134pt" width="178">Theromo Scientific</td>
			<td class="xl68" style="width:89pt" width="119">400110Q</td>
			<td class="xl66">Labquake Tube Rotator</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl63" height="21" style="width:204pt;height:15.75pt" width="272">Magnet</td>
			<td class="xl63" style="width:134pt" width="178">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td class="xl68" style="width:89pt" width="119">12027</td>
			<td class="xl66">DynaMag-96 side skirted magnet</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl63" height="21" style="width:204pt;height:15.75pt" width="272">Magnet</td>
			<td class="xl63" style="width:134pt" width="178">VP Scientific</td>
			<td class="xl68" style="width:89pt" width="119">771RM-1</td>
			<td class="xl66">used to pull the beads to the bottom of the well</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl63" height="21" style="width:204pt;height:15.75pt" width="272">MALDI-TOF</td>
			<td class="xl63" style="width:134pt" width="178">Bruker</td>
			<td class="xl68" style="width:89pt" width="119"></td>
			<td class="xl66">Bruker Microflex LRF instrument</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

peptide and protein quantification using automated immuno-maldi (imaldi)

質量分析 (MS) は、各ターゲット分子の質量電荷比の直接検出の結果として優秀なアッセイの特異性と複雑な試料中のタンパク質を定量化するための最も一般的に使用される技術の一つです。しかし、他のほとんどの分析技術のような MS ベースのプロテオミクスは高豊富な検体を測定への偏り、検出限界は低い ng/mL のまたは pg/mL で複雑なサンプル、およびこれは多くの濃度範囲を達成するために困難ですのでひと血漿など生体の疾患関連蛋白質。低豊富な検体の検出を支援するには、免疫強化を集中し、MS の測定、アッセイの感度が大幅に向上する前に検体を浄化するアッセイに統合されています。この作品で、免疫-マトリックス レーザー脱離イオン化 (iMALDI) 技術がタンパク質及びペプチドの生体の定量化のために提示はビーズに免疫強化に基づく、事前の溶出なし MALDI MS 測定が続きます。抗ペプチド抗体は磁気ビーズの官能基化、サンプルと孵化させます。洗浄後、ビーズは MALDI ターゲット プレート上に直接転送し、マトリックス ソリューションがビーズに適用された後、飛行 (MALDI-TOF) 計器の MALDI 時間は信号を測定します。その他免疫 MS の試金に比較サンプルの準備の手順を簡略化し、MALDI の測定は高速。改善された分析の再現性と高スループット処理システム、液体全体サンプル準備が自動化されます。この記事で iMALDI 試金はペプチド アンジオテンシンを決定するため使用される私 (Ang 私) 原発性アルドステロン症 (PA) のスクリーニングのため血漿レニン活性の読み出しとして臨床的に使用されている血漿中濃度。

アンを測定するための自動 iMALDI 手順は図 1にされます。ターゲット ペプチド (内因性ペプチドまたは消化タンパク質由来のペプチド)、抗ペプチド磁気ビーズの濃縮し、MALDI 測定用ターゲット プレートにビーズを転送するし。追加ペプチド溶出のステップを必要とする他の免疫 MS 技術と比較して、全体の手順を簡略化します。IMALDI アッセイの自動化は、間日係数の変化 (CV) 10 20%以下のサンプルの多数の高いスループット分析のためことができます。アンを測定することによって得られる代表的なスペクトルひと血漿サンプルでは図 2のとおりです。SIS ペプチド ペプチド定量用内部標準物質として機能します。臨床 LC ・ MS/MS 手順17を使用して取得された PRA 値で自動 iMALDI 試金で得られた 188 患者サンプルから PRA 値の相関は図 3に示します。2 つの方法がある相関係数 0.98;内部規格の異なる 2 つの方法で使用すること iMALDI 手順20の異なった抗体の使用によって、斜面の違いが考えられます。アッセイと分析精度の線形範囲は図 4および図 5に示します。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55933/55933fig1.jpg"> 
図 1:自動 iMALDI プラ アッセイのプロセス フロー概略図。参照20許可を得てから適応。<a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55933/55933fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55933/55933fig2.jpg"> 
図 2:NAT と SIS アンの代表スペクトル私ひと血漿サンプルからペプチド測定します。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55933/55933fig3.jpg"> 
図 3:プラ相関値 188 患者サンプルから iMALDI、クロマトグラフィー-タンデム質量を測定した。参照20許可を得てから適応。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55933/55933fig4.jpg"> 
図 4:IMALDI プラの線形範囲の反射器 (A) と (B) 線形モードの両方で試金します。参照20、.の許可を得てから適応<a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55933/55933fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55933/55933fig5.jpg"> 
図 5:日中精度 (A) と iMALDI の interday 精度 (B) 低、中、および高の PRA 値プラズマ プールにプラの試金します。参照20許可を得てから適応。<a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55933/55933fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

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Peptide and Protein Quantification Using Automated Immuno-MALDI iMALDI

自動免疫 MALDI (iMALDI) 技術を使用して複雑な体液でプロテインの定量のためのプロトコルが表示されます。

ペプチドおよびタンパク質定量を使用して自動免疫-MALDI (iMALDI)

Mass spectrometry (MS) is one of the most commonly used technologies for quantifying proteins in complex samples, with excellent assay specificity as a ...

peptide-and-protein-quantification-using-automated-immuno-maldi-imaldi

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Chemistry

Peptide and Protein Quantification Using Automated Immuno-MALDI (iMALDI)

7.9K ビュー.  University of Victoria-Genome BC Proteomics Centre. 自動免疫 MALDI (iMALDI) 技術を使用して複雑な体液でプロテインの定量のためのプロトコルが表示されます。

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Production of Disulfide-stabilized Transmembrane Peptide Complexes for Structural Studies

Physical interactions among the lipid-embedded alpha-helical domains of membrane proteins play a crucial role in folding and assembly of membrane protein complexes and in dynamic processes such as transmembrane (TM) signaling and regulation of cell-surface protein levels. Understanding the structural features driving the association of particular sequences requires sophisticated biophysical and biochemical analyses of TM peptide complexes. However, the extreme hydrophobicity of TM domains makes them very difficult to manipulate using standard peptide chemistry techniques, and production of suitable study material often proves prohibitively challenging. Identifying conditions under which peptides can adopt stable helical conformations and form complexes spontaneously adds a further level of difficulty. Here we present a procedure for the production of homo- or hetero-dimeric TM peptide complexes from materials that are expressed in E. coli, thus allowing incorporation of stable isotope labels for nuclear magnetic resonance (NMR) or non-natural amino acids for other applications relatively inexpensively. The key innovation in this method is that TM complexes are produced and purified as covalently associated (disulfide-crosslinked) assemblies that can form stable, stoichiometric and homogeneous structures when reconstituted into detergent, lipid or other membrane-mimetic materials. We also present carefully optimized procedures for expression and purification that are equally applicable whether producing single TM domains or crosslinked complexes and provide advice for adapting these methods to new TM sequences.

Biophysical and biochemical studies of interactions among membrane-embedded protein domains face many technical challenges, the first of which is obtaining appropriate study material. This article describes a protocol for producing and purifying disulfide-stabilized transmembrane peptide complexes that are suitable for structural analysis by solution nuclear magnetic resonance (NMR) and other analytical applications.

構造研究のためのジスルフィド安定化膜貫通ペプチド複合体の生産

Physical  interactions among the lipid-embedded alpha-helical domains of membrane  proteins play a crucial role in folding and assembly of membrane ...

化学

Multiplexed Fluorescent Microarray for Human Salivary Protein Analysis Using Polymer Microspheres and Fiber-optic Bundles

Herein, we describe a protocol for simultaneously measuring six proteins in saliva using a fiber-optic microsphere-based antibody array. The immuno-array technology employed combines the advantages of microsphere-based suspension array fabrication with the use of fluorescence microscopy. As described in the video protocol, commercially available 4.5 &#956;m polymer microspheres were encoded into seven different types, differentiated by the concentration of two fluorescent dyes physically trapped inside the microspheres. The encoded microspheres containing surface carboxyl groups were modified with monoclonal capture antibodies through EDC/NHS coupling chemistry. To assemble the protein microarray, the different types of encoded and functionalized microspheres were mixed and randomly deposited in 4.5 &#956;m microwells, which were chemically etched at the proximal end of a fiber-optic bundle. The fiber-optic bundle was used as both a carrier and for imaging the microspheres. Once assembled, the microarray was used to capture proteins in the saliva supernatant collected from the clinic. The detection was based on a sandwich immunoassay using a mixture of biotinylated detection antibodies for different analytes with a streptavidin-conjugated fluorescent probe, R-phycoerythrin. The microarray was imaged by fluorescence microscopy in three different channels, two for microsphere registration and one for the assay signal. The fluorescence micrographs were then decoded and analyzed using a homemade algorithm in MATLAB.

We describe a procedure for profiling salivary proteins using multiplexed microsphere-based antibody arrays. Monoclonal antibodies were covalently linked to fluorescent dye-encoded 4.5 &#x03BC;m polymer microspheres using carbodiimide chemistry. The modified microspheres were deposited in fiber-optic microwells to measure protein levels in saliva using fluorescence sandwich immunoassays.

ポリマー微小球および光ファイババンドルを使用したヒト唾液タンパク質分析のための多重化された蛍光マイクロアレイ

Herein, we describe a protocol for simultaneously measuring six proteins in saliva using a fiber-optic microsphere-based antibody array. The immuno-array ...

Structure and Coordination Determination of Peptide-metal Complexes Using 1D and 2D 1H NMR

Copper (I) binding by metallochaperone transport proteins prevents copper oxidation and release of the toxic ions that may participate in harmful redox reactions. The Cu (I) complex of the peptide model of a Cu (I) binding metallochaperone protein, which includes the sequence MTCSGCSRPG (underlined is conserved), was determined in solution under inert conditions by NMR spectroscopy.
NMR is a widely accepted technique for the determination of solution structures of proteins and peptides. Due to difficulty in crystallization to provide single crystals suitable for X-ray crystallography, the NMR technique is extremely valuable, especially as it provides information on the solution state rather than the solid state. Herein we describe all steps that are required for full three-dimensional structure determinations by NMR. The protocol includes sample preparation in an NMR tube, 1D and 2D data collection and processing, peak assignment and integration, molecular mechanics calculations, and structure analysis. Importantly, the analysis was first conducted without any preset metal-ligand bonds, to assure a reliable structure determination in an unbiased manner.

Structure and Coordination Determination of Peptide-metal Complexes Using 1D and 2D 1H NMR

The NMR-solution structure of a metallochaperone model peptide with Cu (I) was determined, and a detailed protocol from sample preparation and 1D and 2D data collection to a three-dimensional structure is described.

Copper (I) binding by metallochaperone transport proteins prevents copper oxidation and release of the toxic ions that may participate in harmful redox ...

Analyzing Protein Dynamics Using Hydrogen Exchange Mass Spectrometry

All cellular processes depend on the functionality of proteins. Although the functionality of a given protein is the direct consequence of its unique amino acid sequence, it is only realized by the folding of the polypeptide chain into a single defined three-dimensional arrangement or more commonly into an ensemble of interconverting conformations. Investigating the connection between protein conformation and its function is therefore essential for a complete understanding of how proteins are able to fulfill their great variety of tasks. One possibility to study conformational changes a protein undergoes while progressing through its functional cycle is hydrogen-1H/2H-exchange in combination with high-resolution mass spectrometry (HX-MS). HX-MS is a versatile and robust method that adds a new dimension to structural information obtained by e.g. crystallography. It is used to study protein folding and unfolding, binding of small molecule ligands, protein-protein interactions, conformational changes linked to enzyme catalysis, and allostery. In addition, HX-MS is often used when the amount of protein is very limited or crystallization of the protein is not feasible. Here we provide a general protocol for studying protein dynamics with HX-MS and describe as an example how to reveal the interaction interface of two proteins in a complex. &#160;&#160;

Protein conformation and dynamics are key to understanding the relationship between protein structure and function. Hydrogen exchange coupled with high-resolution mass spectrometry is a versatile method to study the conformational dynamics of proteins as well as characterizing protein-ligand and protein-protein interactions, including contact interfaces and allosteric effects.

水素交換質量分析法を用いてタンパク質のダイナミクスを分析する

All cellular processes depend on the functionality of proteins. Although the functionality of a given protein is the direct consequence of its unique ...

Split-and-pool Synthesis and Characterization of Peptide Tertiary Amide Library

Peptidomimetics are great sources of protein ligands. The oligomeric nature of these compounds enables us to access large synthetic libraries on solid phase by using combinatorial chemistry. One of the most well studied classes of peptidomimetics is peptoids. Peptoids are easy to synthesize and have been shown to be proteolysis-resistant and cell-permeable. Over the past decade, many useful protein ligands have been identified through screening of peptoid libraries. However, most of the ligands identified from peptoid libraries do not display high affinity, with rare exceptions. This may be due, in part, to the lack of chiral centers and conformational constraints in peptoid molecules. Recently, we described a new synthetic route to access peptide tertiary amides (PTAs). PTAs are a superfamily of peptidomimetics that include but are not limited to peptides, peptoids and N-methylated peptides. With side chains on both &#945;-carbon and main chain nitrogen atoms, the conformation of these molecules are greatly constrained by sterical hindrance and allylic 1,3 strain. (Figure 1) Our study suggests that these PTA molecules are highly structured in solution and can be used to identify protein ligands. We believe that these molecules can be a future source of high-affinity protein ligands. Here we describe the synthetic method combining the power of both split-and-pool and sub-monomer strategies to synthesize a sample one-bead one-compound (OBOC) library of PTAs.

Peptide tertiary amides (PTAs) are a superfamily of peptidomimetics that include but are not limited to peptides, peptoids and N-methylated peptides. Here we describe a synthetic method which combines&#160;both split-and-pool and sub-monomer strategies to synthesize a one-bead one-compound library of PTAs.

ペプチド第三級アミドライブラリのスプリット·アンド·プールの合成とキャラクタリゼーション

Peptidomimetics are great sources of protein ligands. The oligomeric nature of these compounds enables us to access large synthetic libraries on solid ...

Development of a Backbone Cyclic Peptide Library as Potential Antiparasitic Therapeutics Using Microwave Irradiation

Protein-protein interactions (PPIs) are intimately involved in almost all biological processes and are linked to many human diseases. Therefore, there is a major effort to target PPIs in basic research and in the pharmaceutical industry. Protein-protein interfaces are usually large, flat, and often lack pockets, complicating the discovery of small molecules that target such sites. Alternative targeting approaches using antibodies have limitations due to poor oral bioavailability, low cell-permeability, and production inefficiency.
Using peptides to target PPI interfaces has several advantages. Peptides have higher conformational flexibility, increased selectivity, and are generally inexpensive. However, peptides have their own limitations including poor stability and inefficiency crossing cell membranes. To overcome such limitations, peptide cyclization can be performed. Cyclization has been demonstrated to improve peptide selectivity, metabolic stability, and bioavailability. However, predicting the bioactive conformation of a cyclic peptide is not trivial. To overcome this challenge, one attractive approach it to screen a focused library to screen in which all backbone cyclic peptides have the same primary sequence, but differ in parameters that influence their conformation, such as ring size and position.
We describe a detailed protocol for synthesizing a library of backbone cyclic peptides targeting specific parasite PPIs. Using a rational design approach, we developed peptides derived from the scaffold protein Leishmania receptor for activated C-kinase (LACK). We hypothesized that sequences in LACK that are conserved in parasites, but not in the mammalian host homolog, may represent interaction sites for proteins that are critical for the parasites&#39; viability. The cyclic peptides were synthesized using microwave irradiation to reduce reaction times and increase efficiency. Developing a library of backbone cyclic peptides with different ring sizes facilitates a systematic screen for the most biological active conformation. This method provides a general, fast, and facile way to synthesize cyclic peptides.

A simple and general method for the synthesis of cyclic peptides using microwave irradiation is outlined. This procedure enables the synthesis of backbone cyclic peptides with a collection of different conformations while retaining the side chains and the pharmacophoric moieties., and therefore, allows to screen for the bioactive conformation.

マイクロ波照射を用いて潜在的な抗寄生虫治療薬としてのバックボーン環状ペプチドライブラリの開発

Protein-protein interactions (PPIs) are intimately involved in almost all biological processes and are linked to many human diseases. Therefore, there is ...

CN-GELFrEE - Clear Native Gel-eluted Liquid Fraction Entrapment Electrophoresis

Protein complexes perform an array of crucial cellular functions. Elucidating their non-covalent interactions and dynamics is paramount for understanding the role of complexes in biological systems. While the direct characterization of biomolecular assemblies has become increasingly important in recent years, native fractionation techniques that are compatible with downstream analysis techniques, including mass spectrometry, are necessary to further expand these studies. Nevertheless, the field lacks a high-throughput, wide-range, high-recovery separation method for native protein assemblies. Here, we present clear native gel-eluted liquid fraction entrapment electrophoresis (CN-GELFrEE), which is a novel separation modality for non-covalent protein assemblies. CN-GELFrEE separation performance was demonstrated by fractionating complexes extracted from mouse heart. Fractions were collected over 2 hr and displayed discrete bands ranging from ~30 to 500 kDa. A consistent pattern of increasing molecular weight bandwidths was observed, each ranging ~100 kDa. Further, subsequent reanalysis of native fractions via SDS-PAGE showed molecular-weight shifts consistent with the denaturation of protein complexes. Therefore, CN-GELFrEE was proved to offer the ability to perform high-resolution and high-recovery native separations on protein complexes from a large molecular weight range, providing fractions that are compatible with downstream protein analyses.

This protocol describes how to prepare and perform clear native gel-eluted liquid fraction entrapment electrophoresis (CN-GELFrEE), a native separation technique for non-covalent biomolecular assemblies and proteins from heterogeneous samples that is compatible with various downstream protein analysis techniques.

CN-GELFrEE  - クリア天然ゲル溶出液フラクションエントラップメント電気泳動

Protein complexes perform an array of crucial cellular functions. Elucidating their non-covalent interactions and dynamics is paramount for understanding ...

Characterization, Quantification and Compound-specific Isotopic Analysis of Pyrogenic Carbon Using Benzene Polycarboxylic Acids (BPCA)

Fire-derived, pyrogenic carbon (PyC), sometimes called black carbon (BC), is the carbonaceous solid residue of biomass and fossil fuel combustion, such as char and soot. PyC is ubiquitous in the environment due to its long persistence, and its abundance might even increase with the projected increase in global wildfire activity and the continued burning of fossil fuel. PyC is also increasingly produced from the industrial pyrolysis of organic wastes, which yields charred soil amendments (biochar). Moreover, the emergence of nanotechnology may also result in the release of PyC-like compounds to the environment. It is thus a high priority to reliably detect, characterize and quantify these charred materials in order to investigate their environmental properties and to understand their role in the carbon cycle.
Here, we present the benzene polycarboxylic acid (BPCA) method, which allows the simultaneous assessment of PyC&#39;s characteristics, quantity and isotopic composition (13C and 14C) on a molecular level. The method is applicable to a very wide range of environmental sample materials and detects PyC over a broad range of the combustion continuum, i.e., it is sensitive to slightly charred biomass as well as high temperature chars and soot. The BPCA protocol presented here is simple to employ, highly reproducible, as well as easily extendable and modifiable to specific requirements. It thus provides a versatile tool for the investigation of PyC in various disciplines, ranging from archeology and environmental forensics to biochar and carbon cycling research.

Characterization, Quantification and Compound-specific Isotopic Analysis of Pyrogenic Carbon Using Benzene Polycarboxylic Acids BPCA

We present the benzene polycarboxylic acid (BPCA) method for assessing pyrogenic carbon (PyC) in the environment. The compound-specific approach uniquely provides simultaneous information about the characteristics, quantity and isotopic composition (13C and 14C) of PyC.

特徴づけ、定量化およびベンゼンポリカルボン酸を使用した熱分解炭素の化合物固有の同位体分析（BPCA）

Fire-derived, pyrogenic carbon (PyC), sometimes called black carbon (BC), is the carbonaceous solid residue of biomass and fossil fuel combustion, such as ...

Capillary Electrophoresis to Monitor Peptide Grafting onto Chitosan Films in Real Time

Free-solution capillary electrophoresis (CE) separates analytes, generally charged compounds in solution through the application of an electric field. Compared to other analytical separation techniques, such as chromatography, CE is cheap, robust and effectively requires no sample preparation (for a number of complex natural matrices or polymeric samples). CE is fast and can be used to follow the evolution of mixtures in real time (e.g., chemical reaction kinetics), as the signals observed for the separated compounds are directly proportional to their quantity in solution.
Here, the efficiency of CE is demonstrated for monitoring the covalent grafting of peptides onto chitosan films for subsequent biomedical applications. Chitosan&#39;s antimicrobial and biocompatible properties make it an attractive material for biomedical applications such as cell growth substrates. Covalently grafting the peptide RGDS (arginine - glycine - aspartic acid - serine) onto the surface of chitosan films aims at improving cell attachment. Historically, chromatography and amino acid analysis have been used to provide a direct measurement of the amount of grafted peptide. However, the fast separation and absence of sample preparation provided by CE enables equally accurate yet real-time monitoring of the peptide grafting process. CE is able to separate and quantify the different components of the reaction mixture: the (non-grafted) peptide and the chemical coupling agents. In this way the use of CE results in improved films for downstream applications.
The chitosan films were characterized through solid-state NMR (nuclear magnetic resonance) spectroscopy. This technique is more time-consuming and cannot be applied in real time, but yields a direct measurement of the peptide and thus validates the CE technique.

Free solution capillary electrophoresis is a fast, cheap and robust analytical method that enables the quantitative monitoring of chemical reactions in real time. Its utility for rapid, convenient and precise analysis is demonstrated here through analysis of covalent peptide grafting onto chitosan films for improved cell adhesion.

リアルタイムでのキトサンフィルム上にペプチドグラフトを監視するためのキャピラリー電気泳動

Free-solution capillary electrophoresis (CE) separates analytes, generally charged compounds in solution through the application of an electric field. ...

In Situ Detection and Single Cell Quantification of Metal Oxide Nanoparticles Using Nuclear Microprobe Analysis

Micro-analytical techniques based on chemical element imaging enable the localization and quantification of chemical composition at the cellular level. They offer new possibilities for the characterization of living systems and are particularly appropriate for detecting, localizing and quantifying the presence of metal oxide nanoparticles both in biological specimens and the environment. Indeed, these techniques all meet relevant requirements in terms of (i) sensitivity (from 1 up to 10 &#181;g.g-1 of dry mass), (ii) micrometer range spatial resolution, and (iii) multi-element detection. Given these characteristics, microbeam chemical element imaging can powerfully complement routine imaging techniques such as optical and fluorescence microscopy. This protocol describes how to perform a nuclear microprobe analysis on cultured cells (U2OS) exposed to titanium dioxide nanoparticles. Cells must grow on and be exposed directly in a specially designed sample holder used on the optical microscope and in the nuclear microprobe analysis stages. Plunge-freeze cryogenic fixation of the samples preserves both the cellular organization and the chemical element distribution. Simultaneous nuclear microprobe analysis (scanning transmission ion microscopy, Rutherford backscattering spectrometry and particle induced X-ray emission) performed on the sample provides information about the cellular density, the local distribution of the chemical elements, as well as the cellular content of nanoparticles. There is a growing need for such analytical tools within biology, especially in the emerging context of Nanotoxicology and Nanomedicine for which our comprehension of the interactions between nanoparticles and biological samples must be deepened. In particular, as nuclear microprobe analysis does not require nanoparticles to be labelled, nanoparticle abundances are quantifiable down to the individual cell level in a cell population, independently of their surface state.

In Situ Detection and Single Cell Quantification of Metal Oxide Nanoparticles Using Nuclear Microprobe Analysis

We describe a procedure for the detection of chemical elements present in situ in human cells as well as their in vitro quantification. The method is well-suited to any cell type and is particularly useful for quantitative chemical analyses in single cells following in vitro metal oxide nanoparticles exposure.

その場で検出および核マイクロ プローブ分析法を用いた金属酸化物ナノ粒子の単一細胞定量

Micro-analytical techniques based on chemical element imaging enable the localization and quantification of chemical composition at the cellular level. ...