Dr. pençe-Min-tein-Oo, Dr. Han-Thiri-Zin ve Bayan H. Tsurutani kendi teknik yardım için teşekkür etmek istiyorum. Bu proje için genç bilim adamları (avcı ve YS), bilimsel araştırma B (DM), bilimsel araştırma C (DM) ve bilimsel araştırma içinde yenilikçi alanları (DM), Milli Eğitim Bakanlığı, kültür, spor, bilim, Grants-in-Aid tarafından desteklendi ve Japonya'nın teknoloji.

tüm hayvan konut ve cerrahi işlemler hayvan deney, Yamaguchi Üniversitesi Tıp Fakültesi için kurallar uyarınca vardı ve kurumsal hayvan bakım ve kullanım Yamaguchi Komitesi tarafından kabul edildi Üniversite.
 1. hayvanlar <ol><li>4 - için 5-hafta-yaşlı erkek Sprague-Dawley Rat (yaş doğum sonrası 28-31 gün) kullanın.</li>
	<li>(23 ° C ± 1 ° C) sabit bir sıcaklıkta muhafaza fareler içinde bireysel plastik kafes (40 cm × 25 cm × 25 cm) bir 12-h ışık/karanlık döngü altında ev. Fareler su ve yiyecek için ad libitum erişim vermek.</li>
</ol> 2. Rotor çubuk testi <ol>motor beceri öğrenme, her fare konu rotor çubuk testi için araştırmak için <li>(çubuk çapı 7 cm; lane genişliği 8.9 cm; düşme yüksekliği 26.7 cm) 1 veya 2 gün üst üste için ( şekil 1A, Kida vd., 2016 7). Bir sessiz, ısı kontrollü Oda (23 ± 1 ° C) görevi. Rahatsız veya işlemek önce test fareler değil</li>
	<li>Rotor çubuk hangi 4 rotasyonlar/dak 40 rotasyonlar/dk (8 π/dk. 80 π/dk) 5 dak üzerinden doğrusal olarak artar ivme moduna ayarla</li>
	<li>Dinlenme dönen çubuk üzerinde fare koymak. Bütün uzuvları çubuk üzerinde olduğundan emin olun.</li>
	<li>Motor performansını değerlendirmek için dönen rod düşmeye gecikme süresi ölçü birimi.</li>
	<li>10 girişimleri (deneme) 30-s aralıklarla her fare izin.</li>
	<li>Fareyi dönen rod düşerse, bir daha sonra bir 10-20 s aralığı çubuk üzerinde ayarla.</li>
	<li>Fentobarbital (400 mg/kg) aşırı dozda fareyle 30 dk sonra final deneme kurban. Anestezi ev onların kafes içinde aynı doz ile eğitimsiz kontrol fareler enjekte.</li>
</ol> 3. İnhibitör kaçınma test bir inhibitör kaçınma (IA) testi ( şekil 1 d, Mitsushima vd., 2011, 2013 10 , için konu sıçanlar bağlamsal öğrenme, araştırmak için <ol><li> 11) kaçının denemenin gibi gün herhangi bir epizodik deneyimlerini başkaları ile kafes değişiklikleri veya temizlik başvurun. Bir sessiz, ısı kontrollü Oda (23 ± 1 ° C) görevi. 
	Not: IA eğitim cihazları bir iki odalı akrilik kutusudur (uzunluğu 33 cm; genişlik 58 cm; yüksekliği 33 cm). Işıklı bir kenarda ve bir tuzak kapı ( şekil 1 d) tarafından ayrılmış bir karanlık şok tarafı vardır.</li>
	<li>Fareyi ışıklı kutusu (ışıklı) güvenli tarafına yerleştirin. Fareyi yavaşça stres olmadan ele.</li>
	<li>Kısa bir süre bekleyin (10 ile 20 s) fareyi çevreye alışmana için.</li>
	<li>Fareyi diledikleri koyu kutu girmek izin vermek için kayar kapı açın.</li>
	Fare kutusunun roman karanlık tarafında girmeden önce <li>(s) gecikme süresi ölçü birimi. İlk deneme gecikme sıçan temsil eder &#39; s performans başlamadan önce eğitim.</li>
	<li>Karanlık yüzü girmesinden sonra kapıyı kapat ve bir şifreli elektrik ayak şok uygulayın (2 s, 1.6 mA) yolu ile elektrik çelik çubuklar kutu zemine ayarla. Gözden geçirme fareler eğitim cihazları olmadan 1dk şok için keşfetmek izin. Ev unpaired fareler bir ışıklı şok kafes için birkaç gün ve aniden epizodik deneyimleri olmadan şok ver. Yavaşça herhangi bir grupta stres olmadan ele.</li>
	<li>Koyu kutu 10 için her fare tutmak için ev kafes dönmeden önce s.</li>
	<li>, 30 dk ayak şok sonra tekrar kutusunun tarafından ışıklı fare yerleştirin. Karanlık tarafa girmek için gecikme süresi ölçü birimi.</li>
	<li>Sıçan eve kafes dönmek.</li>
	<li>, 60 dakika sonra şok, kurban Fentobarbital (400 mg/kg) aşırı dozda fareyle. Fareyi yavaşça işlemek ve anestezi intraperitoneally enjekte. Eğitimsiz kontrol fareler, yukarıda açıklanan deneyimi olmayan onların ev kafeslerde anestezi enjekte.</li>
</ol> 4. Diseksiyon arabellek <ol><li>erimesi kristalleri 0.195 g NaH 2 PO 4-2 H 2 O, 0,188 g KCl 0,074 g CaCl 2 1.423 g MgCl 2-6 H 2 O ve 12.579 g Kolin klorür ultrasaf su (950 ml 900 mL) . Bkz. Tablo 1.</li>
	<li>Erimesi kristalleri 2.340 g askorbik asit, 0.342 g Pirüvik asit sodyum tuzu, 2,100 g NaHCO 3 ve 4.500 g glikoz.</li>
	<li>Ekle 1000 mL su. Aralığında ise osmolalite aralığını 290 mOsm/L ve 300 mOsm/l ayarlama osmolalite ultrasaf su ekleyerek olacak.</li>
	<li>% 5 CO 2 Çözümle kabarcık / %95 O 2 gaz karışımı kullanmadan önce 5 min için buz gibi soğuk sıcaklıklarda.</li>
</ol> 5. Yapay beyin omurilik sıvısı (aCSF) <ol><li>erime kristalleri 0,186 g KCl, 6.700 g NaCl ve 0,156 g NaH 2 PO 4-2 H 2 O ultrasaf su (950 ml 900 mL). Bkz. Tablo 2.</li>
	<li>Kabarcık gaz karışımı 5 dakika süreyle ile</li>
	<li>Erimesi kristalleri 1.800 g glikoz ve 2.184 g NaHCO 3 ve 4 mL MgCl 2 ve 4 mL CaCl 2 den 1 M stok çözümleri ekleyin.</li>
	<li>Ekle 1000 mL su. Aralığında ise osmolalite aralığını 290 mOsm/L ve 295 mOsm/l ayarlama osmolalite ultrasaf su ekleyerek olacak.</li>
	<li>Kullanmadan önce gaz karışımı ile kabarcık.</li>
</ol> 6. Hücre içi çözümler <ol><li>0.0746 g KCl akım tipi kelepçe kayıtları (Tablo 3), dağıtılması için 6.089 g K-glukonat, 0.476 g HEPES, 0.0456 g EGTA ve 500 µL MgCl 2 1 M den 180 mL ultrasaf su çözümde stok (pH 7.2 KOH ile için ayarlayın).
	<ol><li>0.4408 g Na 2 - ATP, 0.0418 g Na 3 - GTP ve 0.510 g Na-phosphocreatine ekleyin. 200 mL su ekleyip 7,35 KOH ile pH ayarlama.</li>
		<li>İçin yaklaşık 290 mOsm/L osmolalite ultrasaf su ekleyerek ayarlayın.</li>
		<li>Deposu olarak 1 mL aliquots dondurucu (-30 ° C).</li>
	</ol></li> <li>Gerilim tipi kelepçe kayıtları (Tablo 4), dağıtılması için 5.244 g CsMeSO 3, 0.672 g CsCl, HEPES 0.476 g, 0.0456 g EGTA ve 500 µL MgCl 2 1 M den 180 mL ultrasaf su çözümlerinde stok. PH 7.2 ile CsOH için ayarlayın. MEPSP ve mIPSP kayıtları değiştirilmiş yoğunlukta 5.814 g CsMeSO 3 ve 0,252 g CsCl GABA A reseptör yanıt 11 ters potansiyelini ayarlamak için kullanın.
	<ol><li>0.4408 g Na 2 - ATP, 0.0418 g Na 3 - GTP ve 0.510 g Na-phosphocreatine ekleyin. 200 mL su ekleyip 7,35 CsOH ile pH ayarlama.</li>
		<li>İçin yaklaşık 290 mOsm/L osmolalite ultrasaf su ekleyerek ayarlayın.</li>
		<li>Deposu olarak 1 mL aliquots dondurucu (-30 ° C).</li>
	</ol></li></ol> 7. Dilim hazırlık feda, ezilmiş buz ( şekil 2A) tüm diseksiyon araçları Soğuma <li>önceden <ol>. Yaklaşık 500 mL soğuk su temas yüzey alanı artırmak için ezilmiş buz kap içine ekleyin. Bu yordamı tanımlanmıştır daha önce 10 , 11 , 12. 
	Not: Kullanılan araçlardır burada: büyük makas, Iris makas, bir spatula, bir mikro spatula, forseps, cımbız, paslanmaz çelik 200 mL kabı, kırpma, diseksiyon arabellek gaz karışımı ile tedavi ile dolu bir 120 mL kardiyak perfüzyon şırınga beyin için bir bıçak bir Silikon tüp (20 cm) bağlı bir paslanmaz beyin diseksiyon sahne bir düzleştirilmiş 18'lik iğne (kalınlığı 3 mm, ϕ = = 12 cm) ve vibratome için bir montaj sahne (ϕ = 5 cm).</li>
	<li>Fentobarbital (400 mg/kg vücut ağırlığı) aşırı dozda anesthetizing tarafından davranış paradigma tamamladıktan sonra 30 dk sıçan kurban. Hızla dilimleri olanaklı 10 , 11 , 12 olarak sağlıklı olduğundan emin olmak için dilim hazırlık gerçekleştirin. Beyin NGEylem iletişim kuralı için Üniversitemiz tüm hayvan hastalıklarıyla ilgili standartları karşıladığından.</li>
	<li>Buz gibi diseksiyon arabellek (tablo 1) 120 mL şırınga bubbled ile % 5 CO 2 dolgu / %95 O 2 gaz karışımı. Herhangi bir hava kabarcıkları perfüzyon önce kaldırmak.</li>
	<li>Kalp açığa sonra iğne sol ventrikül arka kısmına takın.</li>
	<li>Gerçekleştirme transcardial perfüzyon şırınga kullanarak el ile beyin. Büyük sıçanlar perfüzyon için daha fazla diseksiyon arabellek gerektirir. 5 dk. kabarcık arabellek için buz gibi diseksiyon arabellek ile beyin sürekli olarak Dalma sırasında daldırın.</li>
	<li>Bir açı paralel olarak bir bıçak kullanarak hedef kortikal bölgenin dendritik yönünü, beyin arka tarafında kırpın. Beyin ayakta beri kesme son alt diseksiyon sahnede, başlangıç açı tüm sonraki beyin dilimler açısını belirler. Bu adım kritik düzeyde önemli ( şekil 2B) olduğunu. Yanlış bir açı ile hedef piramidal nöronların kesebilir. 
	Not: Kullanılan araçlardır burada: beyin düzeltme için bir bıçak, bir filtre kağıdı (ϕ = 10 cm), bir paslanmaz beyin diseksiyon sahne (kalınlığı 3 mm, ϕ = = 12 cm), bir spatula, bir yapıştırıcı, bir damlalık ve vibratome için bir montaj sahne (ϕ = 5 cm).</li>
	<li>350 µm bir vibratome kullanarak kalın koronal beyin dilimler kesin. Buz gibi soğuk arabellek ile diseksiyon odası bubbled ile % 5 CO 2 dolgu / %95 O 2 gaz karışımı ( şekil 2C). Sürekli olarak beyin dilim sırasında arabellek kabarcık.</li>
	<li>Iris makas kullanarak hedef alan çevre trim.</li>
	<li>Oda sıcaklığında aCSF hafifçe kesilmiş dilimleri bubbled %95 / % 5 CO 2 yıkama O 2 (Tablo 2).</li>
	<li>Koru kesilmiş dilimleri kayıt olana bir arayüz odasında ( şekil 2B ve E) uygulandı. Kuluçka odasında 1 h için hücreleri durumunu artırır, ancak dilimleri için daha--dan 10 saat inkübe fenotipleri değiştirin. Gazlar aldığınızdan odası kapağını kapatın ve küçük sıvı aCSF damla.</li>
</ol> 8. Bütün hücre yama kelepçe Not: Bütün hücreli kayıtları bir amplifikatör ve 5 kHz bir kesme frekansına ayarla bir alçak geçiren Filtre gerektirir. Sinyalleri dijital ve bir PC'de depolanan. Saklı veri analiz çevrimdışı ( şekil 3A).
<ol><li>Bir yatay çektirmenin kullanarak oluştur cam elektrotlar. Uygun bir çözüm (Tablo 3 ve 4) elektrotlar doldurmak normal polietilen 1 mL şırınga kullanarak bağlı bir ince cam tüp ve 0,22-µm filtrenin.</li>
	<li>Hücre ile ilgili kişi önce pozitif basınç korumak ve pipet sıfır olarak geçerli ayarlayın.</li>
	<li>Bir gigaohm mühür şekillendirme sonra hücre zarının ( şekil 3F yapılandırmada bütün hücreli) rüptürü için negatif basınç uygulayın.</li>
</ol> 9. Geçerli-kelepçe analiz hücre zarı <ol><li><ol><li>özelliklerini Pipetler için geçerli-kelepçe kayıtları (Tablo 3) hücre içi çözüm ile kayıt yama doldurun. 4 MΩ ve aCSF 7 MΩ pipet dayanıklılığını arasındadır.</li>
		Membran yırtığı sonra <li>tutun membran gerilim -60 mV V-kelepçe modunda. Daha sonra geçiş &#34; banyo &#34; moduna &#34; hücre &#34; membran kapasitans, direnç ve zaman sabit gibi iç hücre özelliklerini ölçmek için yazılımı kullanma membran test modunda.</li>
	</ol></li> <li>Enjeksiyon çalışmada <ol><li>iç hücre özelliklerini kaydettikten sonra V-kelepçe modundan izlenecek geçer (Ben = 0) geçerli enjeksiyon için /I-CLAMP NORMAL. Sıvı kavşak potansiyel düzeltilmiş 10 olmaması gerektiğini unutmayın.</li>
		<li>Enjekte için 300 Bayan hücreye geçerli değiştirmek--dan kademeli akım yoğunluğu &#8722; 100 pA +550 PA ile 50-pA artar. Geçerli enjeksiyonları tarafından elde edildi sivri (Aksiyon potansiyelleri) saymak.</li>
		<li>Bir aksiyon potansiyeli (bu eşik gerilimi) ikna etmek için gerekli minimum gerilim ölçmek.</li>
		<li>Afterhyperpolarization genlik spike başlatma, gerilim ve afterhyperpolarization 7 sırasında elde en düşük fiyat voltajı arasındaki fark olarak hesaplar.</li>
	</ol></li></ol> 10. Gerilim Tipi Kelepçe analizi <ol><li>AMPA/NMDA oranı Not: AMPA/NMDA oranı glutamatergic eksitatör sinapslarda 7 , 8 postsinaptik plastisite değerlendirmek için geleneksel bir yoludur , 9 , 10 , 11. ancak, her iki bileşenin eşlik eden artış oranı 13 değil değişebilir.
	<ol><li>Perfuse kayıt odası fizyolojik solüsyonu ile gaz karışımı bubbled ve sıcaklığı 22 ° c ile 25 ° C. Ekle 0,1 mM picrotoxin - yanıt aracılı ve 4 µM 2 eklemek - GABA A engellemek için belgili tanımlık eriyik için korumak uyarılmış nöral yanıt 14 dengelemeye chloroadenosine.</li>
		<li>Doldurmak Pipetler Gerilim Tipi Kelepçe için hücre içi çözüm ile kayıt düzeltme kayıtları (Tablo 4). ACSF kayıt pipet direnç kontrol edin. 4 MΩ ve 7 MΩ arasında dirençtir.</li>
		<li>Kayıt için Katman II/III piramidal nöronların M1, manik depresif bir tungsten elektrot 200 µm 300 µm lateral hücrelere forelimb temsil bölgesinde pial yüzeyden kaydedilmesi için uyarıcı yerleştirin (2 mm yükseklik orta hat) 15 , 16 , 17.</li>
		<li>CA1 piramit nöron kayıt için 300 µm lateral (Schaffer teminat fiber) için uyarıcı elektrot 200 µm yerleştirin veya medial (temporoammonic yolu)-ecek var olmak hücreleri için kaydedilen ( şekil 3B).</li>
		<li>Sinaptik yanıt kadar uyarıcı yoğunluk artmak &#62; 10 baba.</li>
		<li>Hesaplamak AMPA/NMDA oranı maksimum akım oranı, ölçülen &#8722; 60 mV geçerli ölçülen + 40 mV 150 MSN uyarıcı başlangıçlı sonra. 50-100 izlemeler oranını hesaplamak için ortalama unutmayın.</li>
	</ol></li> <li>Minyatür postsinaptik geçerli kayıtları Not: minyatür eksitatör postsinaptik akımları (mEPSCs) Glutamat tek bir vezikül presynaptic yayın tarafından elde edildi yanıt karşılık düşünülmektedir 18 . Buna ek olarak, minyatür inhibitör postsinaptik akımları (mIPSCs) tek bir vezikül GABA 18 presynaptic yayın tarafından elde edildi yanıt karşılık düşünülmektedir. MEPSCs ve mIPSCs genlikleri artışlar yansıtır frekans yansıtmak halinde fonksiyonel sinapslarda veya presynaptic yayın olasılık sayısını artışlar postsinaptik iletim, güçlendirilmesi artar 11 .
	<ol><li>Yama kayıt pipet ile değiştirilmiş hücre içi çözüm (Tablo 4) GABA A reseptör aracılı CARI ters potansiyelini ayarlamak için -60 doldurmak mV.</li>
		<li>Ekle 0,5 µM Tetradotoksin spontan aksiyon potansiyelleri engellemek için Bath'a.</li>
		<li>Tutun -60, gerilim mV rSlayt 5 dakika süreyle mEPSC olaylar</li>
		5 min için kayıt mIPSC olaylara <li>değişim 0 olarak potansiyel holding mV. Çünkü M1 nöronlar biraz daha yüksek ters AMPA reseptör aracılı akımlar için potansiyel göstermek, mIPSCs M1 nöronların + 15 kaydedilir 0,1 mM APV ile mV.</li>
		<li>Akım stabilize etmek için birkaç dakika bekleyin.</li>
		<li>5 dakika süreyle mIPSC olayları kaydetmek</li>
		<li>Yazılım kullanarak minyatür olayları algılamak ve olaylar 10 pA üzerinde çözümleme için kullanın. MEPSCs veya mIPSCs olay sıklığını belirlemek 5 min için sayma. Ortalama ortalama genlik elde etmek için olaylar genlikleri.</li>
		<li>Banyo tedavisi ile 10 µM CNQX veya 10 µM bicuculline methiodide ile mEPSCs ve mIPSCs olaylar sırasıyla engeller olup olmadığını onaylamak.</li>
	</ol></li> <li>Çiftli-pulse analizi Not: Presynaptic plastisite analiz eşleştirilmiş-pulse analizi kullanarak. GABA sürümünden olasılık 7 , 10 , 11 veya eşleştirilmiş-darbe oranı artış presynaptic Glutamat bir düşüş göstermektedir.
	<ol><li>Eksitatör sinapslarda analiz, 0,1 mM picrotoxin eklemek ve -60, yanıtı kaydettikten mV. Banyoya 4 µM 2-chloroadenosine eklediğimiz rağmen biz ilaç presynaptic yayın olasılık 14 etkiler göz önünde bulundurun gerekir.</li>
		İnhibitör sinapslarda, analiz etmek için <li>0,1 mM APV ve 4 µM 2-chloroadenosine banyoya ekleyin ve 0, yanıtı kaydettikten mV. M1 nöronlarda + 15, yanıtı kaydettikten mV.</li>
		<li>100 ms veya 200 Bayan arası uyarıcı aralığı ile eşleştirilmiş darbeleri uygulamak</li>
		<li>50-100 sıralı izleri her potansiyel tutarak, kaydetmek ve değerlerin ortalamasını.</li>
		<li>İlk tepeye kadar postsinaptik geçerli ikinci en yüksek oranı olarak eşleştirilmiş nabız oranını hesaplamak.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Neher, E., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-channel+currents+recorded+from+membrane+of+denervated+frog+muscle+fibres.">Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres.</a> Nature. 260 (5554), 799-802 (1976).</li><li>Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+patch-clamp+techniques+for+high-resolution+current+recording+from+cells+and+cell-free+membrane+patches.">Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches.</a> Pflugers Arch. 391 (2), 85-100 (1981).</li><li>Edwards, F. A., Konnerth, A., Sakmann, B., Takahashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+thin+slice+preparation+for+patch+clamp+recordings+from+neurones+of+the+mammalian+central+nervous+system.">A thin slice preparation for patch clamp recordings from neurones of the mammalian central nervous system.</a> Pflugers Arch. 414 (5), 600-612 (1989).</li><li>Rioult-Pedotti, M. S., Friedman, D., Donoghue, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Learning-induced LTP in neocortex. Science. 290 (5491), 533-536 (2000).</li><li>Yang, G., Pan, F., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stably+maintained+dendritic+spines+are+associated+with+lifelong+memories.">Stably maintained dendritic spines are associated with lifelong memories.</a> Nature. 462 (7275), 920-924 (2009).</li><li>Xu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+formation+and+selective+stabilization+of+synapses+for+enduring+motor+memories.">Rapid formation and selective stabilization of synapses for enduring motor memories.</a> Nature. 462 (7275), 915-919 (2009).</li><li>Kida, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+Training+Promotes+Both+Synaptic+and+Intrinsic+Plasticity+of+Layer+II/III.">Motor Training Promotes Both Synaptic and Intrinsic Plasticity of Layer II/III.</a> Pyramidal Neurons in the Primary Motor Cortex. Cereb Cortex. 26 (8), 3494-3507 (2016).</li><li>Takahashi, T., Svoboda, K., Malinow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experience+strengthening+transmission+by+driving+AMPA+receptors+into+synapses.">Experience strengthening transmission by driving AMPA receptors into synapses.</a> Science. 299 (5612), 1585-1588 (2003).</li><li>Rumpel, S., LeDoux, J., Zador, A., Malinow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postsynaptic+receptor+trafficking+underlying+a+form+of+associative+learning.">Postsynaptic receptor trafficking underlying a form of associative learning.</a> Science. 308 (5718), 83-88 (2005).</li><li>Mitsushima, D., Ishihara, K., Sano, A., Kessels, H. W., Takahashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contextual+learning+requires+synaptic+AMPA+receptor+delivery+in+the+hippocampus.">Contextual learning requires synaptic AMPA receptor delivery in the hippocampus.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (30), 12503-12508 (2011).</li><li>Mitsushima, D., Sano, A., Takahashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cholinergic+trigger+drives+learning-induced+plasticity+at+hippocampal+synapses.">A cholinergic trigger drives learning-induced plasticity at hippocampal synapses.</a> Nat Commun. 4, 2760 (2013).</li><li>Kida, H., Mitsushima, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch+Clamp+Technique+in+Brain+Slices:+Recording+of+Neuronal+Activity+in+the+Rat+Primary+Motor+Cortex.">Patch Clamp Technique in Brain Slices: Recording of Neuronal Activity in the Rat Primary Motor Cortex.</a> Yamaguchi Medical Journal. 63, (2014).</li><li>Watt, A. J., van Rossum, M. C., MacLeod, K. M., Nelson, S. B., Turrigiano, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+coregulates+quantal+AMPA+and+NMDA+currents+at+neocortical+synapses.">Activity coregulates quantal AMPA and NMDA currents at neocortical synapses.</a> Neuron. 26 (3), 659-670 (2000).</li><li>Baidan, L. V., Zholos, A. V., Wood, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+calcium+currents+by+G-proteins+and+adenosine+receptors+in+myenteric+neurones+cultured+from+adult+guinea-pig+small+intestine.">Modulation of calcium currents by G-proteins and adenosine receptors in myenteric neurones cultured from adult guinea-pig small intestine.</a> Br J Pharmacol. 116 (2), 1882-1886 (1995).</li><li>Tandon, S., Kambi, N., Jain, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overlapping+representations+of+the+neck+and+whiskers+in+the+rat+motor+cortex+revealed+by+mapping+at+different+anaesthetic+depths.">Overlapping representations of the neck and whiskers in the rat motor cortex revealed by mapping at different anaesthetic depths.</a> Eur J Neurosci. 27 (1), 228-237 (2008).</li><li>Adachi, K., Murray, G. M., Lee, J. C., Sessle, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noxious+lingual+stimulation+influences+the+excitability+of+the+face+primary+motor+cerebral+cortex+(face+MI)+in+the+rat.">Noxious lingual stimulation influences the excitability of the face primary motor cerebral cortex (face MI) in the rat.</a> J Neurophysiol. 100 (3), 1234-1244 (2008).</li><li>Tennant, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+organization+of+the+forelimb+representation+of+the+C57BL/6+mouse+motor+cortex+as+defined+by+intracortical+microstimulation+and+cytoarchitecture.">The organization of the forelimb representation of the C57BL/6 mouse motor cortex as defined by intracortical microstimulation and cytoarchitecture.</a> Cereb Cortex. 21 (4), 865-876 (2011).</li><li>Pinheiro, P. S., Mulle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+glutamate+receptors:+physiological+functions+and+mechanisms+of+action.">Presynaptic glutamate receptors: physiological functions and mechanisms of action.</a> Nat Rev Neurosci. 9 (6), 423-436 (2008).</li><li>Kwon, H. B., Sabatini, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate+induces+de+novo+growth+of+functional+spines+in+developing+cortex.">Glutamate induces de novo growth of functional spines in developing cortex.</a> Nature. 474 (7349), 100-104 (2011).</li><li>Hess, G., Donoghue, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+potentiation+of+horizontal+connections+provides+a+mechanism+to+reorganize+cortical+motor+maps.">Long-term potentiation of horizontal connections provides a mechanism to reorganize cortical motor maps.</a> J Neurophysiol. 71 (6), 2543-2547 (1994).</li><li>Shannon, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mathematical+theory+of+communication.">A mathematical theory of communication.</a> Bell Sys Tech J. 27, (1948).</li><li>Ono, K. M., D, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Learning+creates+diversity+of+excitatory+and+inhibitory+synapses+in+the+hippocampal+CA1:+a+possible+amount+of+information+at+a+single+synapse.">Learning creates diversity of excitatory and inhibitory synapses in the hippocampal CA1: a possible amount of information at a single synapse.</a> J Physiol Sci. 67, (2017).</li><li>Wang, L., Conner, J. M., Rickert, J., Tuszynski, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+plasticity+within+highly+specific+neuronal+populations+identifies+a+unique+parcellation+of+motor+learning+in+the+adult+brain.">Structural plasticity within highly specific neuronal populations identifies a unique parcellation of motor learning in the adult brain.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (6), 2545-2550 (2011).</li></ol>

Yazarlar hiçbir çıkar çatışmaları bildirin. Journal'ın konumu konuları etik yayında yer alan üzerinde okudum ve bu raporu bu yönergeleri ile tutarlı olduğunu teyit onaylayın. Fon çalışma tasarım, veri toplama veya analiz, yayımlamaya karar veya el yazması hazırlanması herhangi bir rolü yoktu.

Büyük dilim yama klemp tekniği kayıt içinde vivoolacakları yansıtmıyor olabilir dilim hazırlık kısıtlamasıdır. Vivo akım tipi kelepçe analiz daha güvenilir olsa da, bilinçli hayvanlardan yeterli veri elde etmek için teknik olarak zordur. Piramit her neuron hücresel özellikleri farklı olduğundan, hücreleri yeterli sayıda düzgün nöronlar farklılıkları eğitimden sonra analiz etmek için gereklidir. Ayrıca, Gerilim Tipi Kelepçe analiz sürekli ilaç tedavisi CNQX, APV veya bicuculline postsinaptik yanıt doğasını belirlemek için gerektirir. Glutamat veya GABA tek bir vezikül tarafından indüklenen minyatür yanıt-e doğru çözümlemek için sürekli tedavi Tetradotoksin ile spontan aksiyon potansiyelleri engellemek için gereklidir. Son zamanlarda gelişmiş çoklu foton görüntüleme tekniği eksitatör sinapslarda19morfolojik değişiklikleri analiz etmek için güçlü olsa da, bir kombine yama klemp tekniği sinapslarda vivo içindeişlev analiz etmek için gereklidir. Şu anda en inhibitör sinapslarda dikenleri oluşturmaz bu yana inhibitör sinapslarda, morfolojik değişiklikleri analiz etmek zordur. Şu anda, dilim yama kelepçe hücre özellikleri veya eğitimli hayvanlar eksitatör/inhibitör sinapslarda fonksiyonları çözümlemek için en uygun teknik olacaktır.
Geçerli-kelepçe analizi (şekil 4) kullanarak, biz son zamanlarda öğrenme kaynaklı motor iç plastisite Katman II/III nöronlar içinde bildirdi. Özellikle, 1 günlük eğitimli fareler membran potansiyeli ve artış spike eşik dinlenme içinde önemli bir düşüş gösterdi. 2 günlük eğitimli fareler için artan uyarılabilirlik liderliğindeki membran potansiyeli dinlenme önemli bir artış gösterdi. Bu sonuçlar orada dinamik değişiklikleri M1 Katman II/III nöronlar eğitimli Sıçanlarda içsel plastisite vardı önerdi. Ek gerilim-kelepçe analiz presynaptic GABA yayın olasılık7geçici bir düşüş olduğunu mu ima 1 günlük eğitimli Sıçanlarda eşleştirilmiş-nabız oranı artış saptandı. Bu nedenle mümkündür GABA gelen o Disinhibisyonu II/III synapses katmanında M1 içinde elde edilen öğrenme kaynaklı plastisite tetikleyebilir. Bu destek, dilim hazırlık M1 LTP20ikna etmek için bir GABAA reseptör engelleyici ile banyo tedavi gerektirir.
Minyatür postsinaptik potansiyeller analizini sinaptik plastisite IA eğitimli hayvanlarda tespit etmek için güçlü bir yoldur. Sıralı mEPSCs ve mIPSCs tek bir kayıt CA1 nöron bireysel her neuron sinaptik uyarıcı/inhibitör gücünü analiz sağlar. Beri tek bir bana (ı) PSC yanıt için tek bir vezikül Glutamat veya GABA, artış atfedilen bana (ı) PSC genlik postsinaptik güçlendirilmesi öneriyor. Bana (ı) PSC analizi kullanarak, her CA1 nöron (şekil 5C) içine eksitatör/inhibitör girişi gücünü bireysel farklılıklar bulduk. IA eğitim açıkça çeşitlilik sinaptik gücü terfi ama bu diğer gruplar (tablo 5) gözlenmiştir değil.
Öğrenme kaynaklı sinaptik çeşitlilik matematiksel olarak analiz edilebilir. Her noktası görünüm olasılığını hesaplayarak, her neuron verilerden (Claude E. Shannon21bilgi teorisi kullanarak bit) öz-entropi için dönüştürülebilir. Bir nokta çok nadir olasılık (sapma noktası) ile yüksek öz-entropi gösterirken bir noktaya yüksek görünüm olasılık (çevresinde ortalama düzeyi) ile düşük öz-entropi, gösterir. Eğitimsiz farelerle karşılaştırıldığında, öz-entropi nöron başına açıkça IA eğitimli Rat arttı ama değil unpaired veya gözden geçirme fareler22. Bu analiz içi CA1 bilgi bağlamsal öğrendikten sonra bir artış olduğunu gösteriyor.
Dilim yama klemp tekniği de cued korku yanal amigdala9 çalışmalarda klima ve varil korteks8çalışmalarda duyusal deneyimi için kullanılabilir. Ayrıca, bu teknik ile çeşitli teknikler daha ileri araştırmalar için kullanılabilir. Örneğin, virüs-aracılı yeşil flüoresan protein (GFP)-tagged gen teslim tekniği işlev belirli moleküllerin analiz etmek için yama klemp tekniği ile kombine edilebilir. Buna ek olarak, bir retrograd izleyici odak mikroenjeksiyon proje belirli bir alandaki belirli nöronlar görselleştirmek için kullanılabilir. O zaman, geçerli-klemp tekniği kullanarak, hücre özgü özellikler görüntülenmeyecektir nöronlar23' analiz edilebilir. Ayrıca, İki fotonlu lazer Glutamat uncaging ile Birleşen iki fotonlu mikroskobu lazer tarama Katman II/III piramidal nöronların19omurga özgü büyüme ve fare kortikal EPSC yanıtta göstermek için kullanılmıştır. Böylece, dilim yama klemp tekniği roman kimyasallar, gen teslim ve fotoğraf Manipülasyon teknikleri ile birleştirerek geliştirildi.

Neher ve Sakmann, tarafından geliştirilen yama klemp tekniği Elektrofizyolojik deneyleri1için yaygın olarak kullanmıştır. Bütün hücre yama klemp tekniği2 hücre içi akım veya gerilim hücre zarının gigaohm mühür kullanarak kaydetmek için kullanılabilir. Geçerli-klemp tekniği potansiyeli, direnç ve kapasite3dinlenme gibi membran özelliklerindeki farklılıklar analiz için bize izin verir. Gerilim-klemp tekniği öğrenme kaynaklı sinaptik plastisite eksitatör ve inhibitör sinapslarda, analiz için bize izin verir.
Primer motor korteks (M1) yetenekli gönüllü hareketleri yapmak için önemlidir merkezi bir bölgedir. Önceki Elektrofizyolojik çalışmalar gösterdi uzun vadeli kullanılmasının muhtemelen (LTP) gelişimi-II/III eksitatör synapses yetenekli motor eğitim4' ten sonra katmanda plastisite hangi tarihlerde. Ayrıca, in vivo çalışmalar daha fazla Imaging M1 dendritik omurgalar bir yetenekli ulaşan görev5,6sonra modelleme gösterdi. Ancak, öğrenme kaynaklı sinaptik ve içsel plastisite M1 nöronlarda gösterilmedi.
Biz son zamanlarda bir rotor çubuk görev glutamatergic dinamik değişiklikleri terfi ve GABAergic synapses ve M1 Katman II/III nöronlar7içsel plastisite değişmiş bildirdi. Burada biz öğrenme kaynaklı plastisite araştırmak için dilim yama klemp tekniği kullanılır. Bu teknik deneyim bağımlı plastisite diğer beyin bölgeleri diğer türleri araştırmak için de kullanılabilir. Örneğin, varil korteks duyusal girdi AMPA reseptör aracılı eksitatör giriş Katman II/III nöronlar8içine güçlendirebilir ve hangi için gereklidir yanal amigdala nöronlar üzerine eksitatör girdileri cued korku Klima güçlendirir bellek9korku. Ayrıca, bağlamsal öğrenme Hipokampal CA1 nöronlar10,11eksitatör ve inhibitör sinaptik girdi açısından çeşitlilik oluşturur.

<table><tbody><tr><td>Rota-Rod Treadmills</td><td>Med Associates Inc.</td><td>ENV577</td><td></td></tr><tr><td>inhibitory avoidance box</td><td>Shinano Seisakusho</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital</td><td>Kyoritsu Seiyaku</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Blade</td><td>Nisshin EM Co., Ltd</td><td>LC05Z</td><td></td></tr><tr><td>Cardiac perfusion syringe</td><td>JMS Co., Ltd</td><td>JS-S00S</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>&amp;nbsp;Leica Microsystems</td><td>VT-1200</td><td></td></tr><tr><td>Horizontal puller</td><td>Sutter Instrument</td><td>Model P97</td><td></td></tr><tr><td>Microfilm 34 gauge</td><td>World Precision Instruments, Inc</td><td>MF34G-5</td><td></td></tr><tr><td>0.22 &amp;micro;m filter</td><td>Millipore</td><td>SLGVR04NL</td><td></td></tr><tr><td>Axopatch&amp;ndash;1D amplifier&amp;nbsp;</td><td>Axon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Digidata 1440 AD board</td><td>Axon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pCLAMP 10 software</td><td>Axon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Upright Microscope</td><td>Olympus</td><td>BX51WI</td><td></td></tr><tr><td>CCD camera</td><td>Olympus</td><td>U-CMAD3</td><td></td></tr><tr><td>Camera controller</td><td>Hamamatsu Photonics K.K.</td><td>C2741</td><td></td></tr><tr><td>Stimulator</td><td>Nihon Kohden</td><td>SEN-3301</td><td></td></tr><tr><td>Isolator</td><td>Nihon Kohden</td><td>SS-104J</td><td></td></tr><tr><td>Motorized manipulator</td><td>Sutter Instrument</td><td>MP-285</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Narishige</td><td>NMN-21</td><td></td></tr><tr><td>Peristaltic Pump&amp;nbsp;</td><td>Gilson, Inc</td><td>MINIPULS&amp;reg; 3</td><td></td></tr><tr><td>Glass capillary</td><td>Narishige</td><td>GD-1.5</td><td></td></tr><tr><td>Ag/AgCl electrode&amp;nbsp;</td><td>World Precision Instruments, Inc</td><td>EP4</td><td></td></tr><tr><td>Slice Anchor</td><td>Warner instruments</td><td>64-0252</td><td></td></tr><tr><td>Stimulus electrode</td><td>Unique Medical Co., Ltd</td><td>KU201-025B</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Materials&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Dissection buffer/&lt;br/&gt; artificial CSF&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; &amp;bull; 2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich Co.</td><td>C1426</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>163-03545</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>039-00475</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; &amp;bull; 6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>135-00165</td><td></td></tr><tr><td>Choline chloride&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich Co.</td><td>C7527</td><td></td></tr><tr><td>Ascorbic acid</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>190-01255</td><td></td></tr><tr><td>Pyruvic acid Na</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>199-03062</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich Co.</td><td>28-1850-5</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich Co.</td><td>07-0680-5</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Materials&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Intracellular solution&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>K-Gluconate</td><td>Sigma-Aldrich Co.</td><td>G4500</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>346-01373</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>348-01311</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; ATP</td><td>Nacalai Tesque</td><td>01072-24</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; GTP</td><td>Sigma-Aldrich Co.</td><td>G-8877</td><td></td></tr><tr><td>Na phosphocreatine</td><td>Sigma-Aldrich Co.</td><td>P-7936</td><td></td></tr><tr><td>CsMeSO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich Co.</td><td>C1426</td><td></td></tr><tr><td>CsCl</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>033-01953</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Materials&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Drugs in aCSF&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-Chloroadenosine</td><td>Sigma-Aldrich Co.</td><td>C5134</td><td></td></tr><tr><td>Picrotoxin&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich Co.</td><td>P-1675</td><td></td></tr><tr><td>Tetrodotoxin</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>207-15901</td><td></td></tr><tr><td>CNQX&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich Co.</td><td>C239</td><td></td></tr><tr><td>APV</td><td>Sigma-Aldrich Co.</td><td>A5282</td><td></td></tr></tbody></table>

slice patch clamp technique for analyzing learning-induced plasticity

Dilim yama klemp tekniği öğrenme kaynaklı nöral plastisite belirli beyin bölgelerinde soruşturma için güçlü bir araçtır. Motor-öğrenme indüklenen plastisite analiz etmek, fareler bir hızlandırılmış rotor çubuk görev kullanarak eğitimli. Fareler görev için 1 veya 2 gün 10 kat 30-s aralıklarla gerçekleştirilebilir. Performans önemli ölçüde ilk mahkemeye göre eğitim gün düzelmiştir. Sonra birincil motor korteks (M1) dilim akut beyin de, eğitimsiz ve eğitimli fareler hazırladık. Geçerli-kelepçe analiz membran potansiyeli, spike eşik, afterhyperpolarization ve membran direnç Katman II/III piramidal nöronların dinlenme dinamik değişiklikler gösterdi. Geçerli enjeksiyon birçok spikes Sıçanlarda 2 günlük eğitimli eğitimsiz denetimlerde indüklenen.
Bağlamsal öğrenme indüklenen plastisite analiz etmek, fareler bir inhibitör kaçınma (IA) görev kullanarak eğitimli. Ayak-bir kutu karanlık tarafına şokta ettikten sonra fareler, ışıklı yan kalmayı önlemek öğrendim. Eğitimsiz, IA eğitimli, unpaired akut Hipokampal dilimleri ve gözden geçirme fareler hazırladık. Gerilim Tipi Kelepçe analizi sırayla minyatür eksitatör ve inhibitör postsinaptik akımlardan (mEPSCs ve mIPSCs) aynı CA1 nöron kaydetmek için kullanıldı. Biz her neuron onun eksitatör ve inhibitör sinapslarda farklı postsinaptik güçlü olduğunu düşündüren her CA1 nöron farklı ortalama mEPSC ve mIPSC genlikleri bulundu. Ayrıca, eğitimsiz denetimleri ile karşılaştırıldığında, IA eğitimli fareler geniş çeşitlilik ile daha yüksek mEPSC ve mIPSC genlikleri vardı. Bu sonuçlar bağlamsal öğrenme eksitatör ve inhibitör sinapslarda her CA1 neuron adlı postsinaptik çeşitlilik oluşturur önerdi.
Banyo tedavisi ile CNQX beri postsinaptik akımları, arabuluculuk AMPA veya GABAA reseptörleri görünüyordu veya bicuculline mEPSC veya mIPSC olaylar sırasıyla engellenebilir. Bu teknik öğrenme duyusal korteks ve amigdala gibi diğer bölgelerde, farklı türde eğitim için kullanılabilir.

Biz son zamanlarda7açıklandığı gibi rotor çubuk eğitim (şekil 1A) dinamik değişiklikleri M1 Katman II/III piramidal nöronların içsel plastisite indüklenen. Fareler--dan dönen rod düşmek kadar gecikme süresi ölçme sıçan yetenekli öğrenme performansını tahmin etmek için bize izin verir. Uzun gecikme süresi daha iyi motor performansı gösterir. Duruşma sona erdi kadar eğitim günü 1, fareler rotor çubuk performanslarını geliştirmek. Ortalama oturum elde gün 2, fareler neredeyse asimptotik düzeyde (şekil 1B) puanları. İlk duruşmada, gecikme süresi ile karşılaştırıldığında post-hoc analizi önemli gelişmeler son denemeler eğitim günleri (şekil 1 c) gösterdi.
Şekil 4A nöronal özellikleri motor beceri öğrendikten sonra değişti akım tipi kelepçe analiz bir örneği gösterilir. Enjeksiyonları 400 pA ve 500 pA akımlar aksiyon potansiyelleri eğitimsiz grubunda ve 1 günlük eğitimli Sıçanlarda sırasıyla ikna etmek için ihtiyaç vardı. Buna ek olarak, enjeksiyon sadece 150 PA geçerli aksiyon potansiyelleri 2 günlük eğitimli Sıçanlarda temin yeterliydi. Geçerli yoğunluğu ve aksiyon potansiyelleri sayısı arasındaki ilişki şekil 4B' gösterilir. Kadar az 50 pA geçerli sivri 2 günlük eğitimli Sıçanlarda temin yeterli; Buna ek olarak, 1 günlük eğitimli fareler daha eğitimsiz fareler daha az aksiyon potansiyelleri ile 350 pA ve daha yüksek akımlar için cevap verdi. Ayrıca, daha düşük dinlenme 1 günlük eğitimli fareler potansiyel gösterdi şekil 4 c gösterir, 2 günlük eğitimli fareler daha yüksek istirahat potansiyeli (şekil 4 c) ve membran direnç (gösterdi, ancak daha yüksek eşik ve daha derin afterhyperpolarization, spike Şekil 4 d).
Biz daha önce11açıklandığı gibi IA eğitim (şekil 1 d) postsinaptik plastisite eksitatör ve inhibitör sinapslarda Hipokampal CA1 nöronların, indüklenen. Işık kutusunu gecikme ölçerek, fareyi bağlamsal öğrenme performansını tahmin. Şekil 1E IA görev sonuçlarını gösterir. Sonra eşleştirilmiş elektrik çarpması, fareler kutusunun karanlık tarafında önlemek ve genellikle onlar değil tercih ederdim ışıklı Side'de kalmak öğrenmek. Karanlık tarafa kaçınmak eğilimi bu nedenle bağlamsal anılar Alım gösterir.
Şekil 5 hangi minyatür postsinaptik akımları önemli ölçüde bağlamsal öğrendikten sonra değiştirilmiş olan gerilim tipi kelepçe analiz bir örneği gösterilir. Öğrenme kaynaklı plastisite, spontan AMPA aracılı mEPSCs ve GABAAaraştırmak için-aracılı mIPSCs ardışık olarak 0.5 µM Tetradotoksin (şekil 5A ve B) huzurunda kaydedildi. İki boyutlu araziler (şekil 5C) üzerinde gösterildiği gibi her CA1 nöron mEPSCs ve mIPSCs için farklı ortalama genlikleri vardı. Her ne kadar genlikleri düşüktü ve içindeki dar dağıtım aralığına gösterdi eğitimsiz, unpaired, ve gözden geçirme fareler, IA eğitimli Rat (tablo 5) çeşitli bunlardı. ANOVA Post-hoc analizi tarafından takip içinde IA eğitimli rats (şekil 5E), öğrenme kaynaklı postsinaptik plastisite CA1 nöronlar içinde düşündüren mEPSC ortalama genlikleri önemli bir artış ve mIPSC gösterdi.
Ayrıca, her CA1 nöron farklı mEPSC ve mIPSC Frekanslar (şekil 5 d) sergilenmektedir. Her ne kadar frekansları düşüktü ve içindeki dar dağıtım aralığına gösterdi eğitimsiz, unpaired, ve gözden geçirme fareler, IA eğitimli Rat (tablo 6) çeşitli bunlardı. ANOVA Post-hoc analizi tarafından takip içinde IA eğitimli rats (şekil 5F) mEPSC ve mIPSC olayları frekanslarda önemli bir artış gösterdi. Bu sonuçlar iki muhtemel yorumları vardır. Bağlamsal öğrenme fonksiyonel sinapslarda nöronların sayısı arttı ilkidir. Diğer bağlamsal öğrenme presynaptic yayın olasılığını Glutamat ve GABA artış olduğunu.
Biz de eşleştirilmiş-nabız daha da presynaptic plastisite incelemek için yürütülen elektrodlar, daha önce10,11bildirildiği gibi.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55876/55876fig1v2.jpg"> 
Resim 1 : Eğitim sonrası performans öğrenme. 
A: rotor çubuk eğitim ve koronal beyin dilim deneysel tasarım gösterir. B: hızlanan rotor çubuk namlu düşmeye ortalama gecikmesi. C: ilk ve son denemeler gün 1 ve 27eğitim kapalı çubuk düşmeye ortalama gecikmesi. P&#60; 0,01 vs ilk deneme. D: şema inhibitör kaçınma (IA) görev ve koronal beyin dilimin. E: koyu kutu önce ve IA eğitim11' den sonra girmek için ortalama gecikme süresi. P&#60; 0,01 vs IA eğitim önce. Koronal bölümleri sayıları anterior bregma mm mesafe gösterir. Hayvan sayısı çubukları alt kısmında gösterilir. Hata Çubuklarõn SEM <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55876/55876fig1v2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55876/55876fig2.jpg"> 
Resim 2 : Dilim yordamlar. 
A: fotoğrafları göster: Akut beyin dilimleri hazırlanması. Diseksiyon araçları kullanmadan içinde ezilmiş buz önce soğutmalı. B: beyin diseksiyon ve düzeltme. Not Düzeltme açısını arka tarafında dendritik yönlü paralel odaklı gerekir. C: beyin vibratome odasında dilimleme. Beyin diseksiyon arabellekte banyo ve sürekli bir % 5 CO2/95% O2 gaz karışımı ile bubbled. D: iki plastik saklama kapları ve silikon tüp bir arayüz odası yapılmış. Oda yapay CSF ile dolu ve sürekli gaz karışımı ile bubbled. E: beyin dilimleri odasında ıslak filtre kağıdı üzerine yerleştirildi.Çubuk 5 mm. = <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55876/55876fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55876/55876fig3.jpg"> 
Şekil 3 : Yama kelepçe yordamlar. 
A: elektrik sinyalleri bir nöron kaydetmek için kullanılan yama-kelepçe sistemi. Uyarıcı ve Katman II/III nöronlarda elektrotlar kayıt konumunu sıçan motor korteks içinde gösterilir. B: CA1 piramit nöron Schaffer sinapslarda analiz etmek için bir uyarıcı elektrot stratum radiatum yerleştirildi. Temporoammonic sinapslar analiz etmek için bir uyarıcı elektrot stratum moleculare yerleştirildi. Temsilcisi uyarılmış AMPA izler ve NMDA reseptör aracılı eksitatör postsinaptik akımlar aynı CA1 nöron gösterilir. C: bir dilim çapa kayıt odası dilimi dengelemek için kullanılmıştır. D: bir temsil harita üzerinde yayımlanmış belgeleri15,16,17dayalı motor korteks. ML orta çizgi =. E: IR-DIC Filmler M1, Katman II/III nöronlar daha önce (üst) ve (alt) kayıt sırasında. Çubuk 10 µm. F=: değişiklikleri geçerli touch (üst) önce ve membran Rüptürü (alt), pipet. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55876/55876fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55876/55876fig4.jpg"> 
Şekil 4 : Geçerli-kelepçe analiz7 ' nin temsilcisi sonuçları . 
A: Aksiyon potansiyelleri temsilcisi izleri kaydedilen indüksiyon geçerli enjeksiyonları ile sonra. B: ortalama geçerli giriş (pA) aksiyon potansiyeli çıktıda beyin dilimleri (sivri sayısı) vs eğitimsiz (açık bar), 1 günlük eğitimli (gri çubuklar) ve 2 günlük eğitimli rats (doldurulmuş çubuğu) arasındaki ilişkiler. C: potansiyeli, eşik ve afterhyperpolarization Katman II/III nöronların dinleniyor. D: membran direnci ve seri direnç nöronların. Her grupta 9-10 fareler kullanılır. Hücre sayısı her çubuk içinde gösterilir. Hata Çubuklarõn SEM *P&#60; 0,05, **P&#60; eğitimsiz 0,01 vs . <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55876/55876fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55876/55876fig5.jpg"> 
Şekil 5 : Gerilim Tipi Kelepçe analiz11 temsilcisi sonuçları . Minyatür eksitatör ve inhibitör postsinaptik akımlar (mEPSCs ve mIPSCs) eğitimsiz (A) ve inhibitör kaçınma (IA) temsilcisi izleri-eğitimli fareler (B). mEPSCs-60 mV ve mV ölçülen sırayla aynı CA1 piramit nöron Tetradotoksin (0.5 µM) huzurunda 0, mIPSCs. Dikey çubuk 20 pA, yatay bar = 200 = MSN. C: iki boyutlu ortalamasını bana (ı) PSC Arsalar genlikleri içinde eğitimsiz, IA eğitimli unpaired ve gözden geçirme fareler. D: (I) PSC bana ve iki boyutlu araziler 4 grup frekansları. Not her CA1 nöron farklı sergilenen demek bana (ı) PSC genlikleri ve frekansları. IA eğitim sadece ortalama genlikleri güçlendirilmiş (E) ama aynı zamanda bana (ı) frekansları PSC olayları arttı (F). Her grupta 4-6 fareler kullanılır. Hücre sayısı çubukları alt kısmında gösterilir. Kırmızı artı işaretlerini (C, D) ve (E, F) dikey çizgiler ile barlar belirtmek ortalama ± SEM **P&#60; 0,01 vs eğitimsiz fareler. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55876/55876fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="2">Diseksiyon arabellek (Toplam 1L)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4 • 2 H2O</td>
			<td>0.195 g</td>
			<td>1,25 mmol/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>0,188 g</td>
			<td>2.5 mmol/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>0,074 g</td>
			<td>0.5 mmol/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 • 6 H2O</td>
			<td>1.423 g</td>
			<td>7.0 mmol/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kolin klorür</td>
			<td>12.579 g</td>
			<td>90 mmol/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Askorbik asit</td>
			<td>2.340 g</td>
			<td>11,6 mmol/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pirüvik asit</td>
			<td>0.342 g</td>
			<td>3.1 mmol/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>2,100 g</td>
			<td>25 mmol/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glikoz</td>
			<td>4.500 g</td>
			<td>25 mmol/L</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tablo 1: Diseksiyon arabelleği için bir reçete
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="2">Yapay CSF (Toplam 1L)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>0,186 g</td>
			<td>2.5 mmol/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>6.700 g</td>
			<td>114,6 mmol/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4 •2H2O</td>
			<td>0,156 g</td>
			<td>1 mmol/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glikoz</td>
			<td>1.800 g</td>
			<td>10 mmol/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>2.184 g</td>
			<td>26 mmol/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M MgCl2</td>
			<td>4 mL</td>
			<td>4 mmol/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M CaCl2</td>
			<td>4 mL</td>
			<td>4 mmol/L</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tablo 2: Yapay beyin-omurilik sıvısı (bos) için bir reçete
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="3">Hücre içi çözüm için geçerli kelepçe (Toplam 200 mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>0.0746 g</td>
			<td>5 mmol/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K-glukonat</td>
			<td>6.089 g</td>
			<td>130 mmol/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>0.476 g</td>
			<td>10 mmol/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>0.0456 g</td>
			<td>0.6 mmol/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M MgCl2</td>
			<td>500 ΜL</td>
			<td>2.5 mmol/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2 ATP</td>
			<td>0.4408 g</td>
			<td>4 mmol/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na3 GTP</td>
			<td>0.0418 g</td>
			<td>0,4 mmol/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na phosphocreatine</td>
			<td>0.510 g</td>
			<td>10 mmol/L</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tablo 3: Geçerli kelepçe için hücre içi bir çözüm için bir reçete kayıt
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Hücre içi çözüm için gerilim kelepçe (Toplam 200 mL)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CsMeSO3</td>
			<td>5</td></tr></tbody></table>.244 g
			<td>(5.814) *</td>
			<td>115 mmol/L</td>
			<td>(127.5) *</td>
		
		<tr>
			<td>CsCl</td>
			<td>0.672 g</td>
			<td>(0,252) *</td>
			<td>20 mmol/L</td>
			<td>(7,5) *</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>0.476 g</td>
			<td></td>
			<td>10 mmol/L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>0.0456 g</td>
			<td></td>
			<td>0.6 mmol/L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M MgCl2</td>
			<td>500 ΜL</td>
			<td></td>
			<td>2.5 mmol/L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2 ATP</td>
			<td>0.4408 g</td>
			<td></td>
			<td>4 mmol/L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na3 GTP</td>
			<td>0.0418 g</td>
			<td></td>
			<td>0,4 mmol/L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na phosphocreatine</td>
			<td>0.510 g</td>
			<td></td>
			<td>10 mmol/L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="5">* düşük Cl- konsantrasyonu minyatür kayıtları için</td>
		</tr>
	

Tablo 4: Gerilim kelepçe için hücre içi bir çözüm için bir reçete kayıt
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Parametreleri</td>
			<td></td>
			<td>eğitimsiz</td>
			<td>Eğitimli IA</td>
			<td>unpaired</td>
			<td>yürümek-den geçerek</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mEPSC genlik</td>
			<td>Varyans</td>
			<td>5.8</td>
			<td>32,1</td>
			<td>4.7</td>
			<td>5,9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Standart sapma</td>
			<td>2.4</td>
			<td>5,7</td>
			<td>2.2</td>
			<td>2.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Varyasyon katsayısı</td>
			<td>0.189</td>
			<td>0.326</td>
			<td>0.177</td>
			<td>0.190</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mIPSC genlik</td>
			<td>Varyans</td>
			<td>17,1</td>
			<td>56.7</td>
			<td>31,8</td>
			<td>20,7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Standart sapma</td>
			<td>4.1</td>
			<td>7.5</td>
			<td>5.6</td>
			<td>4.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Varyasyon katsayısı</td>
			<td>0.279</td>
			<td>0.387</td>
			<td>0.367</td>
			<td>0.286</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tablo 5: Minyatür eksitatör ve inhibitör postsinaptik geçerli (mEPSC ve mIPSC) genlikleri inhibitör kaçınma (IA) içinde çeşitlilik-eğitimli fareler
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Parametreleri</td>
			<td></td>
			<td>eğitimsiz</td>
			<td>Eğitimli IA</td>
			<td>unpaired</td>
			<td>yürümek-den geçerek</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mEPSC frekans</td>
			<td>Varyans</td>
			<td>278</td>
			<td>2195</td>
			<td>188</td>
			<td>195</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Standart sapma</td>
			<td>17</td>
			<td>47</td>
			<td>14</td>
			<td>14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Varyasyon katsayısı</td>
			<td>0.902</td>
			<td>1.198</td>
			<td>0.893</td>
			<td>0.874</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mIPSC frekans</td>
			<td>Varyans</td>
			<td>3282</td>
			<td>27212</td>
			<td>1385</td>
			<td>5135</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Standart sapma</td>
			<td>57</td>
			<td>165</td>
			<td>37</td>
			<td>72</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Varyasyon katsayısı</td>
			<td>1.195</td>
			<td>1.006</td>
			<td>0.955</td>
			<td>0.836</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tablo 6: Minyatür eksitatör ve inhibitör postsinaptik geçerli (mEPSC ve mIPSC) frekansları inhibitör kaçınma (IA) çeşitliliği-eğitimli fareler

Watch this Scientific Journal Video about Slice Patch Clamp Technique for Analyzing Learning-Induced Plasticity at JoVE.com

Slice Patch Clamp Technique for Analyzing Learning-Induced Plasticity

Dilim yama klemp tekniği içsel özelliklerini ve uyarıcı ya da inhibitör sinapslarda plastisite öğrenme kaynaklı değişiklikleri analiz etmek için etkili bir yöntemdir.

Dilim yama klemp tekniği öğrenme kaynaklı plastisite analiz etmek için

The slice patch clamp technique is a powerful tool for investigating learning-induced neural plasticity in specific brain regions. To analyze ...

slice-patch-clamp-technique-for-analyzing-learning-induced-plasticity

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.2K Görüntüleme.  Yamaguchi University Graduate School of Medicine. Dilim yama klemp tekniği içsel özelliklerini ve uyarıcı ya da inhibitör sinapslarda plastisite öğrenme kaynaklı değişiklikleri analiz etmek için etkili bir yöntemdir.

Video: Slice Patch Clamp Technique for Analyzing Learning-Induced Plasticity

Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with simultaneous intracellular biocytin filling allows a correlated analysis of their structural and functional properties. With this method it is possible to identify and characterize both pre- and postsynaptic neurons by their morphology and electrophysiological response pattern. Paired recordings allow studying the connectivity patterns between these neurons as well as the properties of both chemical and electrical synaptic transmission. Here, we give a step-by-step description of the procedures required to obtain reliable paired recordings together with an optimal recovery of the neuron morphology. We will describe how pairs of neurons connected via chemical synapses or gap junctions are identified in brain slice preparations. We will outline how neurons are reconstructed to obtain their 3D morphology of the dendritic and axonal domain and how synaptic contacts are identified and localized. We will also discuss the caveats and limitations of the paired recording technique, in particular those associated with dendritic and axonal truncations during the preparation of brain slices because these strongly affect connectivity estimates. However, because of the versatility of the paired recording approach it will remain a valuable tool in characterizing different aspects of synaptic transmission at identified neuronal microcircuits in the brain.

Patch-clamp recordings and simultaneous intracellular biocytin filling of synaptically coupled neurons in acute brain slices allow a correlated analysis of their structural and functional properties. The aim of this protocol is to describe the essential technical steps of electrophysiological recording from neuronal microcircuits and their subsequent morphological analysis.

Akut Beyin Dilimleri nöronal Mikro şemalar Elektrofizyolojik ve Morfolojik Karakterizasyonu Eşleştirilmiş Patch-Kelepçe Kayıtlar Kullanma

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with ...

Nörobilim

Recording Light-evoked Postsynaptic Responses in Neurons in Dark-adapted, Mouse Retinal Slice Preparations Using Patch Clamp Techniques

The retina is the gateway to the visual system. To understand visual signal processing mechanisms, we investigate retinal neural network functions. Retinal neurons in the network comprise of numerous subtypes. More than 10 subtypes of bipolar cells, ganglion cells, and amacrine cells have been identified by morphological studies. Multiple subtypes of retinal neurons are thought to encode distinct features of visual signaling, such as motion and color, and form multiple neural pathways. However, the functional roles of each neuron in visual signal processing are not fully understood. The patch clamp method is useful to address this fundamental question. Here, a protocol to record light-evoked synaptic responses in mouse retinal neurons using patch clamp recordings in dark-adapted conditions is provided. The mouse eyes are dark-adapted O/N, and retinal slice preparations are dissected in a dark room using infrared illumination and viewers. Infrared light does not activate mouse photoreceptors and thus preserves their light responsiveness. Patch clamp is used to record light-evoked responses in retinal neurons. A fluorescent dye is injected during recordings to characterize neuronal morphological subtypes. This procedure enables us to determine the physiological functions of each neuron in the mouse retina.

We will demonstrate how to prepare retinal slices from the mouse eye and record light responses in retinal neurons. The entire procedure is conducted in dark-adapted conditions.

Kayıt Patch Kelepçe Teknikleri Kullanarak Koyu adapte Fare Retina Dilim Hazırlıkları Nöronlar içinde postsinaptik Yanıtları Işık-uyarılmış

The retina is the gateway to the visual system. To understand visual signal processing mechanisms, we investigate retinal neural network functions. ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the neuron. In this configuration, the micropipette is in tight contact with the cell membrane, which prevents current leakage and thereby provides more accurate ionic current measurements than the previously used intracellular sharp electrode recording method. Classically, whole-cell recording can be performed on neurons in various types of preparations, including cell culture models, dissociated neurons, neurons in brain slices, and in intact anesthetized or awake animals. In summary, this technique has immensely contributed to the understanding of passive and active biophysical properties of excitable cells. A major advantage of this technique is that it provides information on how specific manipulations (e.g., pharmacological, experimenter-induced plasticity) may alter specific neuronal functions or channels in real-time. Additionally, significant opening of the plasma membrane allows the internal pipette solution to freely diffuse into the cytoplasm, providing means for introducing drugs, e.g., agonists or antagonists of specific intracellular proteins, and manipulating these targets without altering their functions in neighboring cells. This article will focus on whole-cell recording performed on neurons in brain slices,&#160;a preparation that has the advantage of recording neurons in relatively well preserved brain circuits, i.e., in a physiologically relevant context. In particular,&#160;when combined with appropriate pharmacology, this technique is a powerful tool allowing identification of specific neuroadaptations that occurred following any type of experiences, such as learning, exposure to drugs of abuse, and stress. In summary, whole-cell patch-clamp recordings in brain slices provide means to measure in ex vivo preparation long-lasting changes in neuronal functions that have developed in intact awake animals.

This protocol describes basic procedural steps for performing whole-cell patch-clamp recordings. This technique allows the study of&#160;the electrical behavior of neurons, and when performed in brain slices, allows the assessment of various neuronal functions from neurons that are still integrated in relatively well preserved brain circuits.

Beyin Dilimleri tüm hücre Patch-kelepçe Kayıtlar

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Application of Automated Image-guided Patch Clamp for the Study of Neurons in Brain Slices

Whole-cell patch clamp is the gold-standard method to measure the electrical properties of single cells. However, the in vitro patch clamp remains a challenging and low-throughput technique due to its complexity and high reliance on user operation and control. This manuscript demonstrates an image-guided automatic patch clamp system for in vitro whole-cell patch clamp experiments in acute brain slices. Our system implements a computer vision-based algorithm to detect fluorescently labeled cells and to target them for fully automatic patching using a micromanipulator and internal pipette pressure control. The entire process is highly automated, with minimal requirements for human intervention. Real-time experimental information, including electrical resistance and internal pipette pressure, are documented electronically for future analysis and for optimization to different cell types. Although our system is described in the context of acute brain slice recordings, it can also be applied to the automated image-guided patch clamp of dissociated neurons, organotypic slice cultures, and other non-neuronal cell types.

This protocol describes how to conduct automatic image-guided patch-clamp experiments using a system recently developed for standard in vitro electrophysiology equipment.

Beyin dilimlerinde nöronların çalışması için otomatik görüntü yönlendirmeli Yama Kelepçesi Uygulaması

Whole-cell patch clamp is the gold-standard method to measure the electrical properties of single cells. However, the in vitro patch clamp remains a ...

One-channel Cell-attached Patch-clamp Recording

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate depends on properties intrinsic to each channel protein as well as the mechanism by which it is generated and controlled and represents an important area of current research. Information about the operational dynamics of ion channel proteins can be obtained by observing long stretches of current produced by a single molecule. Described here is a protocol for obtaining one-channel cell-attached patch-clamp current recordings for a ligand gated ion channel, the NMDA receptor, expressed heterologously in HEK293 cells or natively in cortical neurons. Also provided are instructions on how to adapt the method to other ion channels of interest by presenting the example of the mechano-sensitive channel PIEZO1. This method can provide data regarding the channel&#8217;s conductance properties and the temporal sequence of open-closed conformations that make up the channel&#8217;s activation mechanism, thus helping to understand their functions in health and disease.

Described here is a procedure for obtaining long stretches of current recording from one ion channel with the cell-attached patch-clamp technique. This method allows for observing, in real time, the pattern of open-close channel conformations that underlie the biological signal. These data inform about channel properties in undisturbed biological membranes.

Tek kanallı bir hücre-bağlı Patch-clamp kayıt

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate ...

Biyoloji

Assessing Changes in Synaptic Plasticity Using an Awake Closed-Head Injury Model of Mild Traumatic Brain Injury

Mild traumatic brain injuries (mTBIs) are a prevalent health issue in North America. There is increasing pressure to utilize ecologically valid models of closed-head mTBI in the preclinical setting to increase translatability to the clinical population. The awake closed-headed injury (ACHI) model uses a modified controlled cortical impactor to deliver closed-headed injury, inducing clinically relevant behavioral deficits without the need for a craniotomy or the use of an anesthetic.
This technique does not normally induce fatalities, skull fractures, or brain bleeds, and is more consistent with being a mild injury. Indeed, the mild nature of the ACHI procedure makes it ideal for studies investigating repetitive mTBI (r-mTBI). Growing evidence indicates that r-mTBI can result in a cumulative injury that produces behavioral symptoms, neuropathological changes, and neurodegeneration. r-mTBI is common in youths playing sports, and these injuries occur during a period of robust synaptic reorganization and myelination, making the younger population particularly vulnerable to the long-term influences of r-mTBI.
Further, r-mTBI occurs in cases of intimate partner violence, a condition for which there are few objective screening measures. In these experiments, synaptic function was assessed in the hippocampus in juvenile rats that had experienced r-mTBI using the ACHI model. Following the injuries, a tissue slicer was utilized to make hippocampal slices to evaluate bidirectional synaptic plasticity in the hippocampus at either 1 or 7 days following the r-mTBI. Overall, the ACHI model provides researchers with an ecologically valid model to study changes in synaptic plasticity following mTBI and r-mTBI.

Here, it is demonstrated how an awake closed-head injury model can be used for examining the effects of repeated mild traumatic brain injury (r-mTBI) on synaptic plasticity in the hippocampus. The model replicates important features of r-mTBI in patients and is used in conjunction with in vitro electrophysiology.

Hafif Travmatik Beyin Hasarının Uyanık Kapalı Kafa Travması Modelini Kullanarak Sinaptik Plastisitedeki Değişikliklerin Değerlendirilmesi

Mild traumatic brain injuries (mTBIs) are a prevalent health issue in North America. There is increasing pressure to utilize ecologically valid models of ...

Patch Clamp Electrophysiology

Neuron cell membranes are populated with ion channels that control the movement of charge into and out of the cell, thereby regulating neuron firing. One extremely useful technique for investigating the biophysical properties of these channels is called patch clamp recording. In this method, neuroscientists place a polished glass micropipette against a cell and apply suction to form a high resistance seal. This process isolates a small &#8220;patch&#8221; of membrane that contains one or more ion channels. Using an electrode within the micropipette, researchers can &#8220;clamp&#8221; or control the electrical properties of the membrane, which is important for analysis of channel activity. The electrode also allows for changes in the voltage across the membrane, or the flow of ions through the membrane, to be recorded. This video begins with an overview of the principles behind patch clamp electrophysiology, an introduction to the necessary equipment, and descriptions of the various patch configurations, including whole cell, cell-attached, perforated, inside-out, and outside-out patches. Next, the key steps of a typical whole-cell patch clamp experiment are outlined, in which a current-voltage (IV) curve is generated. Finally, applications of patch clamp recording are provided to demonstrate how the biophysical properties of ion channels, cell excitability, and neuroactive compounds are evaluated in neurophysiology labs today.

Patch Clamp Electrophysiology: Principle &amp; Applications

Neuron cell membranes are populated with ion channels that control the movement of charge into and out of the cell, thereby regulating neuron firing. One ...

Education

JoVE Science Education

İleri Biyoloji

Patch Clamp

Many fundamental cell functions such as muscle contraction and nerve transmission rely on the electrical signals produced by the movement of positively and negatively charged ions across the cell membrane. One competent method to record current flowing across the whole cell or single ion channel is the patch-clamp technique.
In this method, a glass micropipette containing electrolyte solution is tightly sealed against a small portion of the cell membrane. As a result, a patch of the cell membrane is electrically isolated, ensuring that the ions moving across the channels flow only into the micropipette. Further, this tight sealing of the cell membrane prevents ions from escaping into the bath solution in which the cell is suspended.
Different Patch-clamp Methods:
Depending upon the research interest, several variations of the patch-clamp method can be used for measuring the cell&#39;s biophysical properties. For example, researchers can clamp or control the membrane voltage and measure the current passing through it. Alternatively, they can clamp the current and measure any variation in the membrane voltage.
In cell-attached mode, the membrane patch containing a single or a few ion channels remains intact. As a result, the current flowing through the membrane patch alone can be measured. In contrast, the whole-cell method involves disruption of the membrane patch by briefly applying strong suction. Consequently, the interior of the pipette becomes continuous with the cytoplasm. This mode enables the measurement of electrical current and voltage from the entire cell.
Another patch-clamp method requires gentle retraction of the attached pipette. As a result, the membrane patch is excised without affecting the tight seal. In this inside-out configuration, the intracellular portion of the membrane is exposed to the bath solution, allowing the study of intracellular factors affecting the channel functions.

Yama Kelepçesi

Many fundamental cell functions such as muscle contraction and nerve transmission rely on the electrical signals produced by the movement of positively ...

JoVE Core

Hücre Biyolojisi

Unit 1

Hücre Zarının Kanalları ve Elektriksel Özellikleri

KEY TERMS AND CONCEPTS

Paired Patch Clamp Recording of the Neuronal Connections in Acute Brain Slices

After preparing slices of the target region, allow them to incubate. During this time, pull the patch pipettes, which should have a long and slender shank. After securing a brain slice with a platinum harp in an experimental chamber, fill a recording pipette with internal solution.
Place the pipette in the preamplifier and patch a putative postsynaptic neuron in whole-cell mode. Using a searching patch pipette of 8 to 10 megaohm resistance filled with an internal solution in which potassium salts is replaced by sodium salts, apply gentle suction to the searching pipette to patch a potential presynaptic neuron in a loose-cell attached configuration.
Hold the membrane potential under the loose seal to between negative 30 and negative 60 millivolts in current clamp mode. Then, apply large current pulses of 0.2 to 2 nanoamps to elicit an action potential in the potential presynaptic cell.
Observe this action potential as a small spike lit on the voltage response. Set the stimulation frequency to 0.1 Hertz to prevent rundown of the postsynaptic response. If the postsynaptic neuron does not respond to stimulation of the tested potentially presynaptic neuron, patch a new potential presynaptic neuron in loose-seal mode.
Test up to 30 potentially presynaptic neurons in this way, continuing to use the same searching patch electrode as long as a seal with a resistance of greater than 30 megaohm can be established.
If stimulation in the loose-seal mode results in an EPSP or IPSP with a latency less than five milliseconds in the postsynaptic neuron, remove the searching pipette from the presynaptic neuron.
Using a recording patch electrode filled with biocytin containing regular internal solution with a resistance of four to eight megaohm, patch the presynaptic neuron and record in whole-cell current clamp mode. Elicit action potentials by current injection in the presynaptic neurons and record the postsynaptic response.

Akut Beyin Dilimlerinde Nöronal Bağlantıların Eşleştirilmiş Yama Kelepçesi Kaydı

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neurophysiology

Electrophysiology Techniques

EoE Sub Articles

Automated Image-Guided Patch Clamp Technique for Studying Neurons in Brain Slices

In this step, place one brain slice in the center of the recording chamber. Stabilize the brain slice with a slice holdown or a harp. To detect the fluorescent cell, find the area of interest under the four times magnification. Then, move the microscope stage by turning on &#34;click-to-move&#34; mode, and click the center of the area of interest. Next, switch to the high magnification lens and adjust the focus by moving the microscope in the z-axis using RF on the keypad.
The software directs the microscope in the camera to take a series of images at different depths. Then, these images are subjected to computer vision processing to find fluorescently labeled cells. Click the Detect Cell button on the main column, unit zero. A list of cell coordinates will appear in the memory position&#39;s GUI. Remove undesired cells from the list by clicking the X button next to the coordinates.
Then, click on the cell of interest. A yellow dot with a number will appear on the cell, and the coordinates of the cell will appear in the memory position&#39;s GUI. To perform secondary calibration in order to detect pipette offset coordinates, fill one-third of a glass pipette with internal solution. Then, load the pipette onto the pipette holder attached to the head stage.
At low magnification, use one and two on the keypad to switch between unit one and unit two. Then, bring the pipette into the visual field and adjust the focus using the keypad.
Next, load the primary calibration by clicking on Load Calibration. Switch the microscope lens to high magnification, and click 40 times on the main GUI. Bring the pipette tip to the center. Then, click the secondary calibration button on the main GUI under the unit that is in use. To patch a target cell, click on the Patch Control button to open the patch control GUI. Click the Go To button next to the cell of interest on the coordinate list in the memory position GUI.
Subsequently, click on the CTM button of the unit in the main GUI to enable movement. Click on the cell of interest to move the pipette tip to the cell.
Next, use the Unit 1 Selected button to switch the input signal between the two units. Click on the Patch button on the patch control GUI. Automatic patching will begin, and the pressure and resistance can be monitored on the patch control GUI.
The automatic patching algorithm monitors resistance and controls pressure through a series of logic loops to form a gigaseal. A pop-up window notifies the formation of a gigaseal.
The system utilizes resistance change to recognize cell surface contact. In a situation that the cell surface contact is not detected in time, use the Next button to advance patching stage while remaining in the same automatic patching trial.
Manipulate the automatic process at any point by clicking on the respective buttons on the patch control GUI. Then, select Yes to break in with combined zap and suction. Then, save the experiment patch log.