Vorremmo ringraziare il Dr. zampa-Min-Thein-Oo, Dr. Han-Thiri-Zin e Sig. ra H. Tsurutani per la loro assistenza tecnica. Questo progetto è stato supportato da localizzativi per giovani scienziati (H.K. e Y.S.), B di ricerca scientifica (D.M.), C di ricerca scientifica (D.M.) e ricerca scientifica in aree Innovative (D.M.), dal Ministero della pubblica istruzione, cultura, sport, scienza, e Tecnologia del Giappone.

tutte le procedure chirurgiche e custodia degli animali erano in conformità con le linee guida per animale sperimentazione di Yamaguchi University School of Medicine e sono state approvate dal istituzionale Animal Care e uso Comitato di Yamaguchi Università.
 1. animali <ol><li>utilizzare ratti Sprague-Dawley maschi di 4 a 5-week-old (postnatale 28 a 31 giorni di età).</li>
	<li>Casa i ratti in gabbie di plastica individuali (40 cm × 25 cm × 25 cm) mantenuti a temperatura costante (23 ° C ± 1 ° C) sotto un ciclo luce/buio di 12 h. Dare ratti ad libitum accesso all'acqua e cibo.</li>
</ol> 2. Test di asta di rotore <ol><li>per indagare le capacità motorie, di apprendimento, ogni ratto di sottoporre alla prova di asta di rotore (diametro stelo 7cm; Larghezza corsia 8,9 cm; altezza caduta 26,7 cm) per 1 o 2 giorni consecutivi ( Figura 1A in Kida et al, 2016 7). Eseguire l'attività in una stanza tranquilla, temperatura controllata (23 ± 1 ° C). Non disturbare o gestire ratti prima il test.</li>
	<li>Impostare l'asta di rotore a modalità di accelerazione, che aumenta linearmente da 4 rotazioni/min a 40 giri/min (8 π/min a 80 π/min) a 5 min.</li>
	<li>Mettere il topo sullo stelo rotante che riposo. Confermare che tutte le arti sono sull'asta.</li>
	<li>Misurare la latenza per cadere dall'asta rotante per valutare le prestazioni del motore.</li>
	<li>Consentire ogni ratto 10 tentativi (prove) con intervalli di 30-s.</li>
	<li>Se il ratto cade dallo stelo rotante, è necessario impostarlo sull'asta dopo un intervallo di 10-20 s.</li>
	<li>Sacrificare il ratto con una overdose di pentobarbital (400 mg/kg) 30 min dopo il giudizio finale. Iniettare i ratti di controllo non addestrato con la stessa dose di anestesia nelle loro gabbie casa.</li>
</ol> 3. Test di inibitorio dell'evitare <ol><li>di indagare apprendimento contestuale, soggetto ratti ad un test di evitamento inibitorio (IA) ( Figura 1 a Mitsushima et al., 2011, 2013 10 , 11) evitare qualsiasi esperienze episodiche il giorno dell'esperimento come contatto con gli altri, cambiamenti di gabbia o di pulizia. Eseguire l'attività in una stanza tranquilla, temperatura controllata (23 ± 1 ° C). 
	Nota: L'apparecchiatura di addestramento di IA è una scatola acrilica due-a temperatura ambiente (lunghezza 33 cm; larghezza 58 cm; altezza 33 cm). Ha un lato sicuro illuminato ed un lato scuro scosse che sono separati da una botola ( Figura 1).</li>
	<li>Posto il ratto nel lato sicuro (illuminato) della finestra illuminata. Gestire il ratto delicatamente senza stress.</li>
	<li>Aspettare un breve tempo (10-20 s) per acclimatare il ratto all'ambiente.</li>
	<li>Aprire la porta scorrevole per consentire il topo a entrare nella scatola scura a volontà.</li>
	<li>Misurare la latenza (s) prima che il topo entra nel lato oscuro romanzo della scatola. La latenza della prima prova rappresenta il ratto &#39; prestazioni di s prima dell'allenamento.</li>
	<li>Dopo l'entrata nel lato oscuro, chiudere la porta e applicare una piede elettrico strapazzate scossa (2 s, 1.6 mA) via coni retinici d'acciaio elettrici impostare nel pavimento della scatola. Consentire ratti walk-through esplorare l'attrezzo ginnico per 1 min senza essere scioccato. Casa ratti non abbinati in una gabbia di scossa illuminato per diversi giorni e improvvisamente daranno la scossa senza esperienze episodiche. Gestire delicatamente senza sforzo in qualsiasi gruppi.</li>
	<li>Mantenere ogni ratto nella casella scura per 10 s prima di tornare alla gabbia a casa.</li>
	<li>A 30 min dopo lo shock di piede, ancora posto il ratto nel lato illuminato della scatola. Misurare la latenza per immettere il lato oscuro.</li>
	<li>Tornare dalla gabbia ratto.</li>
	<li>A 60 min dopo lo shock, sacrificare il ratto con una overdose di pentobarbital (400 mg/kg). Gestire il ratto delicatamente e iniettare l'anestesia per via intraperitoneale. Nei ratti di controllo non addestrati, iniettare l'anestesia nelle loro gabbie casa senza l'esperienza descritta sopra.</li>
</ol> 4. Buffer di dissezione <ol><li>sciogliere cristalli di 0,195 g NaH 2 PO 4-2 H 2 O, 0,188 g KCl, 0,074 g CaCl 2, g 1,423 MgCl 2-6 H 2 O e 12,579 g di cloruro di colina in acqua ultrapura (900 mL a 950 mL) . Vedere la tabella 1.</li>
	<li>Sciogliere i cristalli di acido ascorbico 2,340 g, sale di sodio di acido piruvico 0,342 g, g 2,100 NaHCO 3 e 4,500 g di glucosio.</li>
	<li>Aggiungi acqua fino a 1000 mL. La gamma di osmolalità sarà tra 290 mOsm/L e 300 mOsm/L. Adjust osmolalità aggiungendo acqua ultrapura, se è finita la gamma.</li>
	<li>Bolla la soluzione con 5% CO 2 / 95% O 2 gas miscela alle gelide temperature per 5 min prima dell'uso.</li>
</ol> 5. Liquido cerebrospinale artificiale (aCSF) <ol><li>sciogliere cristalli di 0,186 g KCl, 6,700 g NaCl e g 0,156 NaH 2 PO 4-2 H 2 O in acqua ultrapura (900 mL a 950 mL). Vedere la tabella 2.</li>
	<li>Bolla con la miscela di gas per 5 min.</li>
	<li>Sciogliere i cristalli di 1,800 g glucosio e 2,184 g NaHCO 3 e quindi aggiungere soluzioni di riserva 4 mL MgCl 2 e 4 mL CaCl 2 da 1 M.</li>
	<li>Aggiungi acqua fino a 1000 mL. La gamma di osmolalità sarà tra 290 mOsm/L e 295 mOsm/L. Adjust osmolalità aggiungendo acqua ultrapura, se è finita la gamma.</li>
	<li>Bolla con il priore di miscela di gas da utilizzare.</li>
</ol> 6. Soluzioni intracellulare <ol><li>per corrente-morsetto registrazioni (tabella 3), sciogliere 0,0746 g KCl, 6,089 g K-gluconato, 0,476 g HEPES, 0,0456 g EGTA e 500 µ l MgCl 2 da 1m stock soluzione in 180 mL di acqua ultrapura (aggiustare il pH a 7,2 con KOH).
	<ol><li>Aggiungere g 0,4408 Na 2 - ATP, g 0,0418 Na 3 - GTP e 0,510 g Na-fosfocreatina. Aggiungere acqua a 200 mL e regolare il pH a 7.35 con KOH.</li>
		<li>Regolare il osmolality a circa 290 mOsm/L con l'aggiunta di acqua ultrapura.</li>
		<li>Store come aliquote di 1 mL nel congelatore (-30 ° C).</li>
	</ol></li> <li>Per registrazioni di tensione-morsetto (tabella 4), sciogliere 5,244 g CsMeSO 3, 0,672 g CsCl, soluzioni in 180 mL di acqua ultrapura di riserva 0,476 g HEPES, 0,0456 g EGTA e 500 µ l MgCl 2 da 1 M. Regolare il pH a 7,2 con CsOH. Registrazioni di mEPSPS e mIPSP, utilizzare modificate concentrazione di 5,814 CsMeSO 3 e 0,252 g CsCl per regolare il potenziale di inversione del recettore GABA A risposta 11.
	<ol><li>Aggiungere g 0,4408 Na 2 - ATP, g 0,0418 Na 3 - GTP e 0,510 g Na-fosfocreatina. Aggiungere acqua a 200 mL e regolare il pH a 7.35 con CsOH.</li>
		<li>Regolare il osmolality a circa 290 mOsm/L con l'aggiunta di acqua ultrapura.</li>
		<li>Store come aliquote di 1 mL nel congelatore (-30 ° C).</li>
	</ol></li></ol> 7. Affettare la preparazione <ol><li>priore a sacrificare, cool down tutti gli strumenti di dissezione con ghiaccio tritato ( Figura 2A). Aggiungere circa 500 mL di acqua fredda nel contenitore ghiaccio tritato per aumentare la superficie di contatto. Questa procedura è stata descritta precedentemente 10 , 11 , 12. 
	Nota: Gli strumenti qui sono: grandi forbici, forbici iris, una spatola, una spatola micro, pinze, pinzette, un becher da mL 200 in acciaio inox, una lama per cervello rifilatura, una siringa di aspersione cardiaca 120 mL riempita di tampone di dissezione trattate con la miscela di gas, di un tubo in silicone (20cm) collegato ad un ago calibro 18 appiattito, una fase di dissezione del cervello inox (spessore = 3mm, ϕ = 12 cm) e una fase di montaggio per il vibratome (ϕ = 5cm).</li>
	<li>Sacrificare il ratto 30 min dopo aver completato il paradigma comportamentale di esso anestetizzando con una overdose di pentobarbital (400 mg/kg di peso corporeo). Eseguire la preparazione di fetta rapidamente per garantire che le fette sono sane come possibile 10 , 11 , 12. Il cervello extrprotocollo di azione soddisfa tutti gli standard veterinari per la nostra Università.</li>
	<li>Riempire una siringa di 120 mL con tampone di dissezione ghiacciata (tabella 1) gorgogliare con un 5% CO 2 / 95% O 2 miscela di gas. Rimuovere eventuali bolle d'aria prima della perfusione.</li>
	<li>Dopo aver esposto il cuore, inserire l'ago nella parte posteriore del ventricolo sinistro.</li>
	<li>Eseguire perfusione di aspersione del cervello manualmente utilizzando la siringa. Ratti più grandi richiedono più buffer di dissezione per aspersione. Immergere il cervello con buffer di dissezione ghiacciata per 5 min, bolla il buffer continuamente durante l'immersione.</li>
	<li>Tagliare la parte posteriore del cervello a un parallelo di angolo per l'orientamento dendritica della regione corticale destinazione utilizzando una lama. Poiché il cervello è salire su un palco di dissezione con il fondo di fine taglio, l'angolo iniziale determina l'angolo di tutte le sezioni successive del cervello. Questo passaggio è criticamente importante ( Figura 2B). Un'angolatura errata può tagliare attraverso i neuroni piramidali destinazione. 
	Nota: Gli strumenti qui sono: una lama per il taglio del cervello, una carta da filtro (ϕ = 10 cm), una fase di dissezione del cervello inox (spessore = 3mm, ϕ = 12 cm), una spatola, una supercolla, un contagocce e una fase di montaggio per il vibratome (ϕ = 5cm).</li>
	<li>Fette 350-µm spessore della corona del cervello usando un vibratomo. Riempimento della camera di dissezione con buffer ghiacciata gorgogliare con un 5% CO 2 / 95% O 2 gas miscela ( Figura 2). Il buffer di Bubble continuamente durante la fetta di cervello.</li>
	<li>Tagliare la periferia dell'area target utilizzando forbici iris.</li>
	<li>Lavare le fette tagliate delicatamente a temperatura ambiente aCSF gorgogliare con 5% CO 2 / 95% O 2 (tabella 2).</li>
	Fette di <li>mantenere il profilato in un'aula di interfaccia fino a quando la registrazione è eseguita ( Figura 2D ed E). Incubazione per 1 h in aula migliora la condizione delle cellule, ma i fenotipi cambiare se le fette sono incubate per più di 10 ore. Chiudere il coperchio dell'alloggiamento per racchiudere i gas e le piccole gocce di aCSF.</li>
</ol> 8. Morsetto della intero-cellula patch Nota: le registrazioni della intero-cellula richiedono un amplificatore e un filtro passa-basso che è impostato su una frequenza di taglio di 5 kHz. I segnali sono digitalizzati e archiviati in un PC. I dati memorizzati vengono analizzati non in linea ( Figura 3A).
<ol><li>Elettrodi di vetro Create utilizzando un estrattore orizzontale. Riempire gli elettrodi con una soluzione adeguata (tabelle 3 e 4) usando una siringa da 1 mL in polietilene normale collegato ad un tubo di vetro fine e un filtro da 0,22 µm.</li>
	<li>Prima del contatto con la cellula, mantenere la pressione positiva e regolare la pipetta attuale a zero.</li>
	<li>Dopo che formano una guarnizione gigaohm, applicare una pressione negativa per la rottura della membrana cellulare (configurazione di cellule intere in Figura 3F).</li>
</ol> 9. Analisi corrente-morsetto <ol><li>proprietà della membrana cellulare <ol><li>riempire la patch registrazione pipette con la soluzione intracellulare per corrente-morsetto registrazioni (tabella 3). La resistenza della pipetta è tra 4 MΩ e 7 MΩ nel aCSF.</li>
		<li>Dopo la membrana si rompe, tenere la tensione della membrana a -60 mV in modalità V-CLAMP. Quindi, passare da &#34; vasca &#34; modalità per &#34; cella &#34; modalità nel test membrana utilizzando software per misurare le proprietà intrinseche delle cellule quali capacità di membrana, la resistenza e la costante di tempo.</li>
	</ol></li> <li>Studio corrente di iniezione <ol><li>dopo aver registrato le proprietà intrinseche delle celle, cambiare la modalità da V-CLAMP al brano (I = 0) /I-CLAMP normale per l'iniezione di corrente. Si noti che il potenziale di giunzione liquida non dovrebbe essere corretto 10.</li>
		<li>Iniettare corrente nella cella per 300 m. modificare l'intensità della corrente graduale da &#8722; 100 pA a pA + 550 con incrementi di 50-pA. Contare il numero di picchi (potenziali di azione) suscitata dalle iniezioni corrente.</li>
		<li>Misurare la tensione minima necessaria per indurre un potenziale di azione (è la tensione di soglia).</li>
		<li>Calcolare l'ampiezza di afterhyperpolarization come la differenza tra la tensione all'inizio di spike e il più basso raggiunto durante il afterhyperpolarization 7.</li>
	</ol></li></ol> 10. Analisi di tensione-morsetto <ol><li>The AMPA/NMDA rapporto Nota: AMPA/NMDA il rapporto è un modo convenzionale per valutare postsinaptica plasticità alle sinapsi eccitatorie glutammatergiche 7 , 8 , 9 , 10 , 11. Tuttavia, notare che concomitanti aumenti in entrambi i componenti non possono cambiare il rapporto 13.
	<ol><li>Profumi la camera di registrazione con soluzione fisiologica gorgogliare con la miscela di gas e mantenere la temperatura a 22 ° C-25 picrotoxin di 0,1 mM Aggiungi ° C. per la soluzione di bloccare il GABA A - mediata risposta e aggiungere 4 µM 2- chloroadenosine per stabilizzare la risposta neurale evocata 14.</li>
		<li>Riempire la patch registrazione pipette con la soluzione intracellulare per tensione-morsetto registrazioni (tabella 4). Controllare la resistenza della pipetta registrazione nel aCSF. La resistenza è tra 4 MΩ e MΩ 7.</li>
		<li>Per la registrazione in neuroni piramidali di livello II/III in M1, posizionare un bipolare tungsteno elettrodo 200 µm a 300 µm laterale alle cellule per essere registrato, sotto la superficie pial nella regione della rappresentazione di zampa anteriore di stimolazione (laterale di 2 mm per la linea mediana) 15 , 16 , 17.</li>
		<li>Per la registrazione in un neurone piramidale CA1, posizionare la stimolante elettrodo 200 µm a 300 µm laterale (fibra collaterale di Schaffer) o mediale (via temporoammonic) per le cellule che sarà registrato ( Figura 3B).</li>
		<li>Aumentare l'intensità dello stimolo fino alla risposta sinaptica &#62; 10 PA.</li>
		<li>Calcolare il rapporto AMPA/NMDA come il rapporto tra la corrente di picco misurato al &#8722; 60 mV alla corrente misurata a + 40 mV 150 msec dopo l'inizio di stimolo. Si noti che dovrebbero essere una media di 50 a 100 tracce per calcolare il rapporto.</li>
	</ol></li> <li>Registrazioni correnti postsinaptiche in miniatura Nota: correnti di postsinaptico eccitatorie in miniatura (mIPSCs) sono pensate per riflettere le risposte indotte dal rilascio presinaptico di una singola vescicola di glutammato 18 . Al contrario, correnti postsinaptiche inibitorie di miniatura (mEPSCs) sono pensate per riflettere le risposte indotte dal rilascio presinaptico di una singola vescicola di GABA 18. Aumenti le ampiezze di mIPSCs e mEPSCs riflette trasmissione postsinaptica rafforzamento, mentre aumenta in caso di frequenza aumenti del numero di sinapsi funzionali o la probabilità di rilascio presinaptico 11 .
	<ol><li>Riempire la pipetta di registrazione patch con soluzione intracellulare modificata (tabella 4) per regolare il potenziale di inversione della corrente mediata dal recettore GABA A -60 mV.</li>
		<li>Tetrodotossina µM Aggiungi 0,5 al bagno per bloccare i potenziali di azione spontanei.</li>
		<li>Tenere la tensione a -60 mV a record gli eventi di mEPSC per 5 min.</li>
		<li>Cambiamento nell'azienda potenziale a 0 mV a registrare mIPSC eventi per 5 min. Perché i neuroni M1 mostrano inversione leggermente più alto potenziale per le correnti di recettore AMPA, mEPSCs dei neuroni M1 sono registrate a + 15 mV con 0,1 mM APV.</li>
		<li>Attendere pochi minuti per stabilizzare la corrente.</li>
		<li>Registrare gli eventi di mIPSC per 5 min.</li>
		<li>Rilevare gli eventi in miniatura utilizzando il software e utilizzare gli eventi sopra 10 pA per l'analisi. Contare il numero di eventi mIPSCs o mEPSCs per 5 min determinare la frequenza. Media le ampiezze degli eventi per ottenere l'ampiezza media.</li>
		<li>Confermare se trattamento vasca con 10 µM CNQX o con 10 µM bicucullina methiodide blocca gli eventi mIPSCs e mEPSCs, rispettivamente.</li>
	</ol></li> <li>Analisi Paired-pulse Nota: plasticità presinaptica possono essere analizzati usando analisi di accoppiare-impulso. Un aumento del tasso di accoppiare-impulso suggerisce una diminuzione il glutammato presinaptica o GABA release probabilità 7 , 10 , 11.
	<ol><li>Di analizzare sinapsi eccitatorie, aggiungere picrotoxin 0,1 mM e registrare la risposta a -60 mV. Anche se abbiamo aggiunto 4 µM 2-chloroadenosine per il bagno, abbiamo bisogno di tenere a mente che la droga colpisce la probabilità di rilascio presinaptico 14.</li>
		<li>Per analizzare le sinapsi inibitorie, aggiungere 0,1 mM APV e 4 µM 2-chloroadenosine al bagno e registrare la risposta a 0 mV. Nei neuroni M1, registrare la risposta a + 15 mV.</li>
		<li>Applicare impulsi appaiati con un intervallo di Inter-stimolo di 100 ms o MS 200.</li>
		<li>Registrare 50-100 tracce sequenziale presso ciascuna azienda potenziale e media dei valori in.</li>
		<li>Calcolare il rapporto di impulsi appaiati come il rapporto del secondo picco al primo picco della corrente postsinaptica.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Neher, E., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-channel+currents+recorded+from+membrane+of+denervated+frog+muscle+fibres.">Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres.</a> Nature. 260 (5554), 799-802 (1976).</li><li>Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+patch-clamp+techniques+for+high-resolution+current+recording+from+cells+and+cell-free+membrane+patches.">Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches.</a> Pflugers Arch. 391 (2), 85-100 (1981).</li><li>Edwards, F. 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Gli autori non dichiarano conflitti di interesse. Confermiamo che abbiamo letto posizione del giornale su questioni coinvolte nella pubblicazione etica, e affermiamo che questa relazione è coerenza con tali orientamenti. I finanziatori non avevano alcun ruolo nel disegno dello studio, raccolta dati o analisi, la decisione di pubblicare o la preparazione del manoscritto.

La limitazione principale della tecnica del patch clamp fetta è la registrazione in fetta preparazione, che non rispecchiano ciò che accade in vivo. Anche se in vivo analisi corrente-morsetto è più affidabile, è tecnicamente difficile ottenere dati sufficienti da animali coscienti. Poiché ogni neurone piramidale ha diverse proprietà cellulari, un numero adeguato di cellule è necessaria per analizzare correttamente le differenze nei neuroni dopo l'allenamento. Inoltre, la tensione-morsetto analisi richiede trattamento farmacologico continuo con CNQX, APV o bicucullina per determinare la natura delle risposte postsinaptiche. Per analizzare le risposte in miniatura indotte da una singola vescicola di glutammato o GABA, un trattamento continuo con tetrodotossina è necessaria per bloccare i potenziali di azione spontanei. Sebbene la tecnica di imaging multi-fotone sviluppata di recente è potente per analizzare i cambiamenti morfologici alle sinapsi eccitatorie19, una tecnica combinata patch clamp è necessaria per analizzare la funzione delle sinapsi in vivo. Attualmente è abbastanza difficile da analizzare i cambiamenti morfologici alle sinapsi inibitorie, poiché più inibitorie sinapsi non formano spine. In questo momento, il morsetto di toppa fetta sarebbe la tecnica più adatta per analizzare le proprietà della cella o le funzioni delle sinapsi eccitatorie/inibitorie in animali addestrati.
Usando l'analisi corrente-morsetto (Figura 4), abbiamo recentemente segnalato plasticità motoria indotta da apprendimento intrinseco in neuroni di strato II/III. In particolare, i ratti addestrati di 1 giorno hanno mostrato una diminuzione significativa nel riposo di potenziale di membrana e un aumento della soglia di spike. I ratti addestrati di 2 giorni hanno mostrato un significativo aumento nel potenziale di membrana che hanno portato a una maggiore eccitabilità di riposo. Questi risultati hanno indicato che ci erano cambiamenti dinamici nella plasticità intrinseca dei neuroni II/III livello M1 in ratti addestrati. Tensione-morsetto ulteriori analisi ha rivelato un aumento del rapporto di accoppiare-impulso in ratti addestrati 1-giorno, suggerendo che c'era una diminuzione transitoria in probabilità presinaptici GABA release7. È quindi possibile che disinibizione da GABA a livello II/III sinapsi potrebbe innescare la plasticità indotta da apprendimento risultante in M1. A sostegno di ciò, preparazione di fetta della M1 richiede trattamento vasca con un bloccante del recettore GABAA indurre LTP20.
Analisi dei potenziali postsinaptici in miniatura sono un modo potente per rilevare la plasticità sinaptica in animali addestrati IA. Registrazione sequenziale del mIPSCs e mEPSCs in un singolo neurone CA1 permette l'analisi della forza sinaptica eccitatorio/inibitorio di ogni singolo neurone. Poiché un singolo mE (I) PSC risposta è attribuita a una singola vescicola di glutammato o GABA, un aumento in mE (I) PSC ampiezza suggerisce rafforzamento postsinaptici. ME (I) usando l'analisi PSC, abbiamo trovato le differenze individuali nella forza di input eccitatorio/inibitorio in ogni neurone CA1 (Figura 5). Formazione di IA chiaramente promosso diversità nella forza sinaptica, ma questo non è stato osservato in altri gruppi (tabella 5).
Indotta da apprendimento sinaptico diversità può essere analizzato matematicamente. Calcolando la probabilità di comparsa di ogni punto, i dati da ogni neurone possono essere convertiti a self-entropia usando la teoria dell'informazione di Shannon21(un po'). Un punto con la probabilità di comparsa alta (intorno al livello medio) indica bassa self-entropia, mentre un punto con probabilità molto raro (un punto deviato) indica self-entropia elevata. Rispetto ai ratti non addestrati, l'auto-entropia al neurone era chiaramente aumentato in ratti addestrati IA ma non in spaiati o walk-through ratti22. Questa analisi suggerisce che ci era un aumento in intra-CA1 informazioni dopo l'apprendimento contestuale.
La tecnica del patch clamp fetta può essere utilizzata anche per attirare paura condizionata studi l' amigdala laterale9 e per gli studi di esperienza sensoriale nella corteccia barile8. Inoltre, questa tecnica può essere utilizzata con varie altre tecniche per ulteriori indagini. Per esempio, il virus-mediate proteina fluorescente verde (GFP)-tagged gene consegna tecnica può essere combinata con la tecnica del patch clamp per analizzare la funzione di molecole specifiche. Inoltre, focale microiniezione di un tracciante retrogrado può essere utilizzato per visualizzare specifici neuroni tale progetto a un'area specifica. Quindi, utilizzando la tecnica corrente-clamp, proprietà specifiche della cella possono essere analizzati nei neuroni visualizzati23. Inoltre, combinando due fotoni laser-microscopia con due fotoni laser uncaging del glutammato è stata utilizzata per dimostrare la crescita della colonna vertebrale-specifici e la risposta EPSC nel topo corticale strato II/III neuroni piramidali19. Così, la tecnica del patch clamp fetta viene migliorata attraverso la combinazione con sostanze chimiche romanzo, consegna del gene e tecniche di manipolazione di foto.

La tecnica del patch clamp, sviluppata da Neher e Sakmann, è stato ampiamente utilizzata per esperimenti elettrofisiologici1. La patch di cellule intere morsetto tecnica2 può essere utilizzato per registrare intracellulare corrente o tensione utilizzando la guarnizione gigaohm della membrana cellulare. La tecnica di corrente-morsetto permette di analizzare le differenze nelle proprietà di membrana come potenziale, resistenza e capacità3di riposo. La tecnica del morsetto di tensione permette di analizzare la plasticità sinaptica indotta su apprendimento alle sinapsi sia eccitatori che inibitori.
La corteccia motoria primaria (M1) è una regione centrale che è fondamentale per rendere i movimenti volontari qualificati. Precedenti studi elettrofisiologici hanno dimostrato lo sviluppo di potenziamento a lungo termine (LTP)-come plasticità nel livello II/III eccitatorio sinapsi dopo qualificati formazione motore4. Inoltre, in vivo imaging studi ulteriori hanno dimostrato il rimodellamento delle spine dendritiche M1 dopo un abile raggiungendo compito5,6. Tuttavia, plasticità sinaptica e intrinseco indotta su apprendimento non ha dimostrato in neuroni di M1.
Recentemente abbiamo riferito che un'attività di asta di rotore promosso cambiamenti dinamici nella glutamatergici e GABAergici sinapsi e alterato la plasticità intrinseca in M1 livello II/III neuroni7. Qui abbiamo usato la tecnica del patch clamp fetta per studiare la plasticità indotta su apprendimento. Questa tecnica è utilizzabile anche per studiare altri tipi di plasticità esperienza-dipendente in altre regioni del cervello. Ad esempio, input sensoriali nella corteccia barile può rinforzare AMPA ricevitore-mediata input eccitante nello strato di neuroni II/III8, ed acciaccato paura condizionata rafforza gli input eccitatori sui neuroni amigdala laterale, che è necessaria per paura di memoria9. Inoltre, apprendimento contestuale crea diversità in termini di input sinaptiche eccitatorie ed inibitorie in hippocampal CA1 neuroni10,11.

<table><tbody><tr><td>Rota-Rod Treadmills</td><td>Med Associates Inc.</td><td>ENV577</td><td></td></tr><tr><td>inhibitory avoidance box</td><td>Shinano Seisakusho</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital</td><td>Kyoritsu Seiyaku</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Blade</td><td>Nisshin EM Co., Ltd</td><td>LC05Z</td><td></td></tr><tr><td>Cardiac perfusion syringe</td><td>JMS Co., Ltd</td><td>JS-S00S</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>&amp;nbsp;Leica Microsystems</td><td>VT-1200</td><td></td></tr><tr><td>Horizontal puller</td><td>Sutter Instrument</td><td>Model P97</td><td></td></tr><tr><td>Microfilm 34 gauge</td><td>World Precision Instruments, Inc</td><td>MF34G-5</td><td></td></tr><tr><td>0.22 &amp;micro;m filter</td><td>Millipore</td><td>SLGVR04NL</td><td></td></tr><tr><td>Axopatch&amp;ndash;1D amplifier&amp;nbsp;</td><td>Axon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Digidata 1440 AD board</td><td>Axon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pCLAMP 10 software</td><td>Axon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Upright Microscope</td><td>Olympus</td><td>BX51WI</td><td></td></tr><tr><td>CCD camera</td><td>Olympus</td><td>U-CMAD3</td><td></td></tr><tr><td>Camera controller</td><td>Hamamatsu Photonics K.K.</td><td>C2741</td><td></td></tr><tr><td>Stimulator</td><td>Nihon Kohden</td><td>SEN-3301</td><td></td></tr><tr><td>Isolator</td><td>Nihon Kohden</td><td>SS-104J</td><td></td></tr><tr><td>Motorized manipulator</td><td>Sutter Instrument</td><td>MP-285</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Narishige</td><td>NMN-21</td><td></td></tr><tr><td>Peristaltic Pump&amp;nbsp;</td><td>Gilson, Inc</td><td>MINIPULS&amp;reg; 3</td><td></td></tr><tr><td>Glass capillary</td><td>Narishige</td><td>GD-1.5</td><td></td></tr><tr><td>Ag/AgCl electrode&amp;nbsp;</td><td>World Precision Instruments, Inc</td><td>EP4</td><td></td></tr><tr><td>Slice Anchor</td><td>Warner instruments</td><td>64-0252</td><td></td></tr><tr><td>Stimulus electrode</td><td>Unique Medical Co., Ltd</td><td>KU201-025B</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Materials&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Dissection buffer/&lt;br/&gt; artificial CSF&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; &amp;bull; 2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich Co.</td><td>C1426</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>163-03545</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>039-00475</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; &amp;bull; 6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>135-00165</td><td></td></tr><tr><td>Choline chloride&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich Co.</td><td>C7527</td><td></td></tr><tr><td>Ascorbic acid</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>190-01255</td><td></td></tr><tr><td>Pyruvic acid Na</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>199-03062</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich Co.</td><td>28-1850-5</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich Co.</td><td>07-0680-5</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Materials&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Intracellular solution&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>K-Gluconate</td><td>Sigma-Aldrich Co.</td><td>G4500</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>346-01373</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>348-01311</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; ATP</td><td>Nacalai Tesque</td><td>01072-24</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; GTP</td><td>Sigma-Aldrich Co.</td><td>G-8877</td><td></td></tr><tr><td>Na phosphocreatine</td><td>Sigma-Aldrich Co.</td><td>P-7936</td><td></td></tr><tr><td>CsMeSO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich Co.</td><td>C1426</td><td></td></tr><tr><td>CsCl</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>033-01953</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Materials&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Drugs in aCSF&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-Chloroadenosine</td><td>Sigma-Aldrich Co.</td><td>C5134</td><td></td></tr><tr><td>Picrotoxin&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich Co.</td><td>P-1675</td><td></td></tr><tr><td>Tetrodotoxin</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>207-15901</td><td></td></tr><tr><td>CNQX&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich Co.</td><td>C239</td><td></td></tr><tr><td>APV</td><td>Sigma-Aldrich Co.</td><td>A5282</td><td></td></tr></tbody></table>

slice patch clamp technique for analyzing learning-induced plasticity

La tecnica del patch clamp fetta è un potente strumento per lo studio di apprendimento-indotta di plasticità neurale in regioni specifiche del cervello. Per analizzare la plasticità indotta motore-apprendimento, ci siamo allenati ratti facendo uso di un compito di asta di rotore accelerata. Ratti ha svolto il compito 10 volte a intervalli di 30 s per 1 o 2 giorni. Prestazioni è stata migliorata significativamente nei giorni di allenamento rispetto alla prima prova. Abbiamo quindi preparato fette di cervello acuto della corteccia motoria primaria (M1) in ratti non addestrati e qualificati. Corrente-morsetto analisi ha mostrato i cambiamenti dinamici nel potenziale di membrana, soglia di spike, afterhyperpolarization e resistenza di membrana di riposo in neuroni piramidali di livello II/III. Iniezione di corrente indotta più molti picchi nei ratti addestrati di 2 giorni che nei controlli non addestrati.
Per analizzare la plasticità indotta contestuale-apprendimento, ci siamo allenati ratti utilizzando un compito inibitorio dell'evitare (IA). Dopo aver sperimentato il piede-scossa nel lato oscuro di una casella, i ratti imparato a evitarlo, stare nel lato illuminato. Abbiamo preparato fette hippocampal acute da inesperto, IA-addestrati, spaiati e walk-through ratti. Analisi di tensione-morsetto è stata usata per registrare in sequenza in miniatura eccitatorie ed inibitorie correnti postsinaptiche (mIPSCs e mEPSCs) dal stesso neurone CA1. Abbiamo trovato diverse ampiezze di mEPSC e mIPSC medie in ogni neurone CA1, suggerendo che ogni neurone ha avuto diversi punti di forza postsinaptiche alle sue sinapsi eccitatorie ed inibitorie. Inoltre, rispetto ai comandi non addestrati, IA-addestrato ratti hanno avuti ampiezze superiori di mEPSC e mIPSC, con grande diversità. Questi risultati hanno indicato che contestuale apprendimento crea postsinaptica diversità nelle sinapsi sia eccitatori che inibitori a ogni neurone di CA1.
RecettoriA AMPA o GABA sembravano di mediare le correnti postsinaptiche, dal bagno di trattamento con CNQX o bicucullina bloccato gli eventi mEPSC o mIPSC, rispettivamente. Questa tecnica può essere utilizzata per studiare i diversi tipi di apprendimento in altre regioni, come la corteccia sensoriale e l'amigdala.

Come abbiamo descritto recentemente7, formazione di asta di rotore (Figura 1A) ha indotto cambiamenti dinamici nella plasticità intrinseca dei neuroni piramidali M1 strato II/III. Misurare la latenza fino a quando i ratti cadono dallo stelo rotante permette di stimare le prestazioni di apprendimento specializzato del ratto. Latenza più lunga indica la migliore prestazione del motore. Il giorno 1 della formazione, i ratti migliorato le loro prestazioni di asta di rotore fino a quando il processo si concluse. Il giorno 2, i ratti hanno raggiunto livelli quasi asintotica nella sessione media punteggi (Figura 1B). Confrontato con la latenza al primo processo, analisi post-hoc ha mostrato miglioramenti significativi alle prove finali nei giorni di allenamento (Figura 1).
Figura 4A Mostra un esempio di analisi corrente-morsetto in cui modificare le proprietà di un neurone dopo l'apprendimento di capacità motorie. Iniezioni di pA 400 e 500 pA correnti sono stati necessari per indurre i potenziali di azione del gruppo inesperto e nei ratti addestrati 1-giorno, rispettivamente. Al contrario, l'iniezione di solo un 150 pA corrente era sufficiente per elicitare potenziali d'azione nei ratti addestrati 2 giorni. Il rapporto tra l'intensità di corrente e il numero di potenziali di azione è mostrato in Figura 4B. Appena 50 pA corrente era sufficiente a suscitare picchi in ratti addestrati 2 giorni; al contrario, ratti addestrati 1 giorno ha risposto con meno potenziali di azione che i ratti non addestrati a 350 pA e correnti più elevate. Inoltre, la Figura 4 Mostra che 1 giorno addestrati ratti hanno mostrato che riposa inferiore potenziali, spike superiore soglia e afterhyperpolarization più profondo, mentre ratti addestrati 2 giorni hanno mostrato il più alto potenziale di riposo (Figura 4) e la resistenza della membrana ( Figura 4).
Come abbiamo descritto in precedenza11, formazione di IA (Figura 1) indotta postsinaptica plasticità alle sinapsi eccitatorie ed inibitorie dei neuroni hippocampal CA1. Misurando la latenza nel light box, abbiamo potuto stimare le prestazioni di apprendimento contestuale del ratto. Figura 1E Mostra i risultati dell'attività IA. Dopo la scossa elettrica accoppiata, i ratti imparano a evitare il lato oscuro della scatola e stare nel lato illuminato, che solitamente non preferirebbero. La tendenza ad evitare il lato oscuro di conseguenza indica l'acquisizione di ricordi contestuali.
Figura 5 Mostra un esempio di analisi di tensione-morsetto in cui miniatura correnti postsinaptiche sono state cambiate drammaticamente dopo l'apprendimento contestuale. Per studiare la plasticità indotta su apprendimento, mIPSCs AMPA-mediata spontanea e GABAA-mediata mEPSCs sono stati registrati sequenzialmente in presenza della tetrodotossina di 0,5 µM (Figura 5A e B). Come mostrato su appezzamenti bidimensionale (Figura 5), ogni neurone di CA1 ha avuto diverse ampiezze medie per mIPSCs e mEPSCs. Anche se le ampiezze basse, hanno mostrato una gamma stretta distribuzione in inesperto, spaiati, e ratti walk-through, quelli erano diversi in ratti addestrati IA (tabella 5). ANOVA seguita da analisi post-hoc ha mostrato un aumento significativo in medie ampiezze delle mEPSC e mIPSC in ratti addestrati IA (Figura 5E), suggerendo la plasticità postsinaptica apprendimento-indotta nei neuroni CA1.
Inoltre, ogni neurone di CA1 esposto diverse frequenze mEPSC e mIPSC (Figura 5). Anche se le frequenze basse, hanno mostrato una gamma stretta distribuzione in inesperto, spaiati, e ratti walk-through, quelli erano diversi in ratti addestrati IA (tabella 6). ANOVA seguita da analisi post-hoc ha mostrato un aumento significativo delle frequenze degli eventi mEPSC e mIPSC in ratti addestrati IA (Figura 5F). Ci sono due possibili interpretazioni di questi risultati. Il primo è che l'apprendimento contestuale aumentato il numero delle sinapsi funzionali dei neuroni. L'altro è che l'apprendimento contestuale aumentato la probabilità di rilascio presinaptico del glutammato e GABA.
Per più ulteriormente esaminare plasticità presinaptica, abbiamo anche condotto accoppiare-impulso stimolazioni, come riferito precedentemente10,11.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55876/55876fig1v2.jpg"> 
Figura 1 : Apprendimento di prestazioni dopo l'allenamento. 
A: il disegno sperimentale spettacoli il rotore asta formazione e sezione coronale del cervello. B: la latenza media di cadere dalla canna asta rotore accelerare. C: la latenza media incrostata l'asta sul primo e le prove finali sulla formazione giorni 1 e 27. P&#60; 0.01 vs prima prova. D: Schema della sezione di cervello inibitorio dell'evitare (IA) attività e coronale. E: la latenza media per entrare nella scatola scura prima e dopo IA formazione11. P&#60; 0.01 vs prima dell'allenamento di IA. I numeri dalle sezioni coronali indicano la distanza anteriore il bregma in mm. Il numero di animali è mostrato nella parte inferiore delle barre. Barre di errore indicano SEM. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55876/55876fig1v2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55876/55876fig2.jpg"> 
Figura 2 : Affettare procedure. 
A: le fotografie mostrano la preparazione di fettine di cervello acuto. Gli strumenti di dissezione sono stati raffreddati in prima di ghiaccio tritato di usarla. B: dissezione e rifilatura del cervello. Si noti che l'angolo di taglio sul lato posteriore deve essere orientato in parallelo con l'orientamento dendritica. C: affettare il cervello in una camera del vibratome. Il cervello è bagnato nel buffer di dissezione e gorgogliare continuamente con una miscela di gas2 di 95% O di 5% CO2. D: una camera di interfaccia è costituito da due contenitori di plastica per alimenti e un tubo di silicone. La camera era pieni di liquido Cerebrospinale artificiale e gorgogliare continuamente con la miscela di gas. E: fettine di cervello sono stati collocati su carta da filtro bagnato nell'alloggiamento.Bar = 5 mm. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55876/55876fig2large.jpg" target="_blank">per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55876/55876fig3.jpg"> 
Figura 3 : Procedure di Patch clamp. 
A: il sistema di patch-clamp utilizzato per registrare i segnali elettrici da un neurone. La posizione della stimolante ed elettrodi di registrazione nei neuroni di II/III livello sono mostrati nella corteccia di motore del ratto. B: per analizzare le Schaffer sinapsi di un neurone piramidale CA1, un elettrodo stimolante è stato messo alla strato radiato. Per analizzare le sinapsi temporoammonic, fu collocato un elettrodo stimolante la strato molecolare. Rappresentante tracce di AMPA evocato e correnti postsinaptiche eccitatorie mediata dal recettore NMDA nel stesso neurone CA1 sono mostrate. C: una fetta di ancoraggio è stato utilizzato per stabilizzare la fetta nella camera di registrazione. D: una mappa di rappresentazione nella corteccia motoria, basata sulle carte pubblicate15,16,17. ML = del midline. E: Neuroni II/III prima di strato micrografie IR-DIC della M1 (superiore) e durante la registrazione (inferiore). Bar = 10 µm. F: cambiamenti nella pipetta corrente prima tocco (parte superiore) ed alla rottura della membrana (infondo). <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55876/55876fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55876/55876fig4.jpg"> 
Figura 4 : Risultati rappresentativi di analisi corrente-morsetto7 . 
A: tracce rappresentative dei potenziali d'azione registrata dopo induzione con iniezioni di corrente. B: relazioni tra l'ingresso di corrente media (pA) vs azione potenziale uscita (numero di picchi) nelle fette del cervello da inesperto (bar aperto), 1-giorno addestrate (barre grigie) e 2 giorni ratti addestrati (riempito bar). C: afterhyperpolarization dei neuroni II/III livello, soglia e potenziale di riposo. D: resistenza di membrana e resistenza in serie dei neuroni. Abbiamo usato il 9-10 ratti in ogni gruppo. Il numero di celle viene visualizzato all'interno di ogni barra. Barre di errore indicano SEM. *P&#60; 0.05, * *P&#60; 0.01 vs non addestrati. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55876/55876fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55876/55876fig5.jpg"> 
Figura 5 : Risultati rappresentativi delle analisi tensione-morsetto11 . Rappresentante tracce di miniatura eccitatorie ed inibitorie correnti postsinaptiche (mIPSCs e mEPSCs) di inesperto (A) e inibitorio dell'evitare (IA)-addestrato ratti (B). mIPSCs a-60 mV e mEPSCs a 0 mV sono stati misurati in sequenza nel stesso neurone piramidale CA1 in presenza di tetrodotossina (0,5 µM). Barra verticale = 20 pA, barra orizzontale = 200 msec. C: terreni bidimensionale della media mE (I) PSC ampiezze in inesperto, IA-addestrato, spaiati e walk-through ratti. D: grafici bidimensionali di mE (I) PSC frequenze nei 4 gruppi. Nota che ogni neurone CA1 esposte diverse significa mE (I) frequenze e ampiezze PSC. Formazione di IA non solo ha rafforzato le ampiezze medie (E), ma anche aumentato le frequenze di mE (I) eventi PSC (F). Abbiamo usato 4-6 ratti in ogni gruppo. Il numero di celle viene visualizzato nella parte inferiore delle barre. Segno rosso (C, D) e le barre con linee verticali (E, F) indicano la media ± SEM. * *P&#60; 0.01 vs non addestrato ratti. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55876/55876fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="2">Buffer di dissezione (totale 1L)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4 • 2 H2O</td>
			<td>0,195 g</td>
			<td>1,25 mmol/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>g 0,188</td>
			<td>2,5 mmol/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>0,074 g</td>
			<td>0,5 mmol/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 • 6 H2O</td>
			<td>1,423 g</td>
			<td>7.0 mmol/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cloruro di colina</td>
			<td>12,579 g</td>
			<td>90 mmol/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acido ascorbico</td>
			<td>2,340 g</td>
			<td>11,6 mmol/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acido piruvico</td>
			<td>0,342 g</td>
			<td>3,1 mmol/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>2,100 g</td>
			<td>25 mmol/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucosio</td>
			<td>4,500 g</td>
			<td>25 mmol/L</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabella 1: Una ricetta per il buffer di dissezione
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="2">CSF artificiale (totale 1L)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>0,186 g</td>
			<td>2,5 mmol/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>6,700 g</td>
			<td>114,6 mmol/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4 •2H2O</td>
			<td>0,156 g</td>
			<td>1 mmol/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucosio</td>
			<td>1,800 g</td>
			<td>10 mmol/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>2,184 g</td>
			<td>26 mmol/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M MgCl2</td>
			<td>4 mL</td>
			<td>4 mmol/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M CaCl2</td>
			<td>4 mL</td>
			<td>4 mmol/L</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabella 2: Una ricetta per artificiale del liquido cerebrospinale (CSF)
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="3">Soluzione intracellulare per pinza amperometrica (Totale 200 mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>0,0746 g</td>
			<td>5 mmol/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K-gluconato</td>
			<td>6,089 g</td>
			<td>130 mmol/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>0,476 g</td>
			<td>10 mmol/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>0,0456 g</td>
			<td>0,6 mmol/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M MgCl2</td>
			<td>500 Μ l</td>
			<td>2,5 mmol/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2 ATP</td>
			<td>0,4408 g</td>
			<td>4 mmol/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na3 GTP</td>
			<td>0,0418 g</td>
			<td>0,4 mmol/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fosfocreatina na</td>
			<td>0,510 g</td>
			<td>10 mmol/L</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabella 3: Registrazione di una ricetta per una soluzione intracellulare per pinza amperometrica
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Soluzione intracellulare per morsetto di tensione (Totale 200 mL)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CsMeSO3</td>
			<td>5</td></tr></tbody></table>.244 g
			<td>(5.814) *</td>
			<td>115 mmol/L</td>
			<td>(127,5) *</td>
		
		<tr>
			<td>CsCl</td>
			<td>0,672 g</td>
			<td>(0,252) *</td>
			<td>20 mmol/L</td>
			<td>(7,5) *</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>0,476 g</td>
			<td></td>
			<td>10 mmol/L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>0,0456 g</td>
			<td></td>
			<td>0,6 mmol/L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M MgCl2</td>
			<td>500 Μ l</td>
			<td></td>
			<td>2,5 mmol/L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2 ATP</td>
			<td>0,4408 g</td>
			<td></td>
			<td>4 mmol/L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na3 GTP</td>
			<td>0,0418 g</td>
			<td></td>
			<td>0,4 mmol/L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fosfocreatina na</td>
			<td>0,510 g</td>
			<td></td>
			<td>10 mmol/L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="5">* bassa concentrazione di Cl– per le registrazioni in miniatura</td>
		</tr>
	

Tabella 4: Registrazione di una ricetta per una soluzione intracellulare per morsetto di tensione
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Parametri</td>
			<td></td>
			<td>non addestrato</td>
			<td>IA addestrato</td>
			<td>spaiato</td>
			<td>camminare attraverso</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ampiezza mEPSC</td>
			<td>Varianza</td>
			<td>5.8</td>
			<td>32,1</td>
			<td>4.7</td>
			<td>5.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Deviazione standard</td>
			<td>2.4</td>
			<td>5.7</td>
			<td>2.2</td>
			<td>2.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Coefficiente di variazione</td>
			<td>0,189</td>
			<td>0.326</td>
			<td>0.177</td>
			<td>0.190</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ampiezza mIPSC</td>
			<td>Varianza</td>
			<td>17,1</td>
			<td>56,7</td>
			<td>31,8</td>
			<td>20,7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Deviazione standard</td>
			<td>4.1</td>
			<td>7.5</td>
			<td>5.6</td>
			<td>4.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Coefficiente di variazione</td>
			<td>0.279</td>
			<td>0,387</td>
			<td>0,367</td>
			<td>0.286</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabella 5: La diversità della miniatura inibitori ed eccitatori postsinaptici corrente (mEPSC e mIPSC) ampiezze in inibitorio dell'evitare (IA)-addestrato ratti
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Parametri</td>
			<td></td>
			<td>non addestrato</td>
			<td>IA addestrato</td>
			<td>spaiato</td>
			<td>camminare attraverso</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mEPSC frequenza</td>
			<td>Varianza</td>
			<td>278</td>
			<td>2195</td>
			<td>188</td>
			<td>195</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Deviazione standard</td>
			<td>17</td>
			<td>47</td>
			<td>14</td>
			<td>14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Coefficiente di variazione</td>
			<td>0.902</td>
			<td>1.198</td>
			<td>0.893</td>
			<td>0,874</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mIPSC frequenza</td>
			<td>Varianza</td>
			<td>3282</td>
			<td>27212</td>
			<td>1385</td>
			<td>5135</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Deviazione standard</td>
			<td>57</td>
			<td>165</td>
			<td>37</td>
			<td>72</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Coefficiente di variazione</td>
			<td>1.195</td>
			<td>1.006</td>
			<td>0,955</td>
			<td>0.836</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabella 6: La diversità della miniatura inibitori ed eccitatori postsinaptici corrente (mEPSC e mIPSC) frequenze in inibitorio dell'evitare (IA)-addestrato ratti

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Slice Patch Clamp Technique for Analyzing Learning-Induced Plasticity

La tecnica del patch clamp fetta è un metodo efficace per analizzare i cambiamenti indotti dall'apprendimento nella proprietà intrinseche e plasticità delle sinapsi eccitatorie o inibitorie.

Sezione tecnica del Patch Clamp per l'analisi di plasticità indotta su apprendimento

The slice patch clamp technique is a powerful tool for investigating learning-induced neural plasticity in specific brain regions. To analyze ...

slice-patch-clamp-technique-for-analyzing-learning-induced-plasticity

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.2K Views.  Yamaguchi University Graduate School of Medicine. La tecnica del patch clamp fetta è un metodo efficace per analizzare i cambiamenti indotti dall'apprendimento nella proprietà intrinseche e plasticità delle sinapsi eccitatorie o inibitorie.

Video: Slice Patch Clamp Technique for Analyzing Learning-Induced Plasticity

A Computer-assisted Multi-electrode Patch-clamp System

The patch-clamp technique is today the most well-established method for recording electrical activity from individual neurons or their subcellular compartments. Nevertheless, achieving stable recordings, even from individual cells, remains a time-consuming procedure of considerable complexity. Automation of many steps in conjunction with efficient information display can greatly assist experimentalists in performing a larger number of recordings with greater reliability and in less time. In order to achieve large-scale recordings we concluded the most efficient approach is not to fully automatize the process but to simplify the experimental steps and reduce the chances of human error while efficiently incorporating the experimenter's experience and visual feedback. With these goals in mind we developed a computer-assisted system which centralizes all the controls necessary for a multi-electrode patch-clamp experiment in a single interface, a commercially available wireless gamepad, while displaying experiment related information and guidance cues on the computer screen. Here we describe the different components of the system which allowed us to reduce the time required for achieving the recording configuration and substantially increase the chances of successfully recording large numbers of neurons simultaneously.

Multi-electrode patch-clamp recordings constitute a complex task. Here we show how, by automating of many of the experimental steps, it is possible to accelerate the process leading to qualitative improvement in performance and number of recordings.

Un multi-elettrodo patch-clamp Computer System-assistita

The patch-clamp technique is today the most  well-established method for recording electrical activity from individual  neurons or their subcellular ...

Ricerca

Neuroscienze

Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with simultaneous intracellular biocytin filling allows a correlated analysis of their structural and functional properties. With this method it is possible to identify and characterize both pre- and postsynaptic neurons by their morphology and electrophysiological response pattern. Paired recordings allow studying the connectivity patterns between these neurons as well as the properties of both chemical and electrical synaptic transmission. Here, we give a step-by-step description of the procedures required to obtain reliable paired recordings together with an optimal recovery of the neuron morphology. We will describe how pairs of neurons connected via chemical synapses or gap junctions are identified in brain slice preparations. We will outline how neurons are reconstructed to obtain their 3D morphology of the dendritic and axonal domain and how synaptic contacts are identified and localized. We will also discuss the caveats and limitations of the paired recording technique, in particular those associated with dendritic and axonal truncations during the preparation of brain slices because these strongly affect connectivity estimates. However, because of the versatility of the paired recording approach it will remain a valuable tool in characterizing different aspects of synaptic transmission at identified neuronal microcircuits in the brain.

Patch-clamp recordings and simultaneous intracellular biocytin filling of synaptically coupled neurons in acute brain slices allow a correlated analysis of their structural and functional properties. The aim of this protocol is to describe the essential technical steps of electrophysiological recording from neuronal microcircuits and their subsequent morphological analysis.

Elettrofisiologici e morfologica Caratterizzazione neuronali Microcircuiti in Acute Fette cervello Utilizzando accoppiati di patch-clamp Recordings

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the neuron. In this configuration, the micropipette is in tight contact with the cell membrane, which prevents current leakage and thereby provides more accurate ionic current measurements than the previously used intracellular sharp electrode recording method. Classically, whole-cell recording can be performed on neurons in various types of preparations, including cell culture models, dissociated neurons, neurons in brain slices, and in intact anesthetized or awake animals. In summary, this technique has immensely contributed to the understanding of passive and active biophysical properties of excitable cells. A major advantage of this technique is that it provides information on how specific manipulations (e.g., pharmacological, experimenter-induced plasticity) may alter specific neuronal functions or channels in real-time. Additionally, significant opening of the plasma membrane allows the internal pipette solution to freely diffuse into the cytoplasm, providing means for introducing drugs, e.g., agonists or antagonists of specific intracellular proteins, and manipulating these targets without altering their functions in neighboring cells. This article will focus on whole-cell recording performed on neurons in brain slices,&#160;a preparation that has the advantage of recording neurons in relatively well preserved brain circuits, i.e., in a physiologically relevant context. In particular,&#160;when combined with appropriate pharmacology, this technique is a powerful tool allowing identification of specific neuroadaptations that occurred following any type of experiences, such as learning, exposure to drugs of abuse, and stress. In summary, whole-cell patch-clamp recordings in brain slices provide means to measure in ex vivo preparation long-lasting changes in neuronal functions that have developed in intact awake animals.

This protocol describes basic procedural steps for performing whole-cell patch-clamp recordings. This technique allows the study of&#160;the electrical behavior of neurons, and when performed in brain slices, allows the assessment of various neuronal functions from neurons that are still integrated in relatively well preserved brain circuits.

Registrazioni Whole-cell patch-clamp nel cervello fette

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Application of Automated Image-guided Patch Clamp for the Study of Neurons in Brain Slices

Whole-cell patch clamp is the gold-standard method to measure the electrical properties of single cells. However, the in vitro patch clamp remains a challenging and low-throughput technique due to its complexity and high reliance on user operation and control. This manuscript demonstrates an image-guided automatic patch clamp system for in vitro whole-cell patch clamp experiments in acute brain slices. Our system implements a computer vision-based algorithm to detect fluorescently labeled cells and to target them for fully automatic patching using a micromanipulator and internal pipette pressure control. The entire process is highly automated, with minimal requirements for human intervention. Real-time experimental information, including electrical resistance and internal pipette pressure, are documented electronically for future analysis and for optimization to different cell types. Although our system is described in the context of acute brain slice recordings, it can also be applied to the automated image-guided patch clamp of dissociated neurons, organotypic slice cultures, and other non-neuronal cell types.

This protocol describes how to conduct automatic image-guided patch-clamp experiments using a system recently developed for standard in vitro electrophysiology equipment.

Applicazione di morsetto di patch automatico guidato per immagini per lo studio dei neuroni in fettine di cervello

Whole-cell patch clamp is the gold-standard method to measure the electrical properties of single cells. However, the in vitro patch clamp remains a ...

One-channel Cell-attached Patch-clamp Recording

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate depends on properties intrinsic to each channel protein as well as the mechanism by which it is generated and controlled and represents an important area of current research. Information about the operational dynamics of ion channel proteins can be obtained by observing long stretches of current produced by a single molecule. Described here is a protocol for obtaining one-channel cell-attached patch-clamp current recordings for a ligand gated ion channel, the NMDA receptor, expressed heterologously in HEK293 cells or natively in cortical neurons. Also provided are instructions on how to adapt the method to other ion channels of interest by presenting the example of the mechano-sensitive channel PIEZO1. This method can provide data regarding the channel&#8217;s conductance properties and the temporal sequence of open-closed conformations that make up the channel&#8217;s activation mechanism, thus helping to understand their functions in health and disease.

Described here is a procedure for obtaining long stretches of current recording from one ion channel with the cell-attached patch-clamp technique. This method allows for observing, in real time, the pattern of open-close channel conformations that underlie the biological signal. These data inform about channel properties in undisturbed biological membranes.

Un canale Cell-allegato patch-clamp registrazione

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate ...

Biologia

Assessing Changes in Synaptic Plasticity Using an Awake Closed-Head Injury Model of Mild Traumatic Brain Injury

Mild traumatic brain injuries (mTBIs) are a prevalent health issue in North America. There is increasing pressure to utilize ecologically valid models of closed-head mTBI in the preclinical setting to increase translatability to the clinical population. The awake closed-headed injury (ACHI) model uses a modified controlled cortical impactor to deliver closed-headed injury, inducing clinically relevant behavioral deficits without the need for a craniotomy or the use of an anesthetic.
This technique does not normally induce fatalities, skull fractures, or brain bleeds, and is more consistent with being a mild injury. Indeed, the mild nature of the ACHI procedure makes it ideal for studies investigating repetitive mTBI (r-mTBI). Growing evidence indicates that r-mTBI can result in a cumulative injury that produces behavioral symptoms, neuropathological changes, and neurodegeneration. r-mTBI is common in youths playing sports, and these injuries occur during a period of robust synaptic reorganization and myelination, making the younger population particularly vulnerable to the long-term influences of r-mTBI.
Further, r-mTBI occurs in cases of intimate partner violence, a condition for which there are few objective screening measures. In these experiments, synaptic function was assessed in the hippocampus in juvenile rats that had experienced r-mTBI using the ACHI model. Following the injuries, a tissue slicer was utilized to make hippocampal slices to evaluate bidirectional synaptic plasticity in the hippocampus at either 1 or 7 days following the r-mTBI. Overall, the ACHI model provides researchers with an ecologically valid model to study changes in synaptic plasticity following mTBI and r-mTBI.

Here, it is demonstrated how an awake closed-head injury model can be used for examining the effects of repeated mild traumatic brain injury (r-mTBI) on synaptic plasticity in the hippocampus. The model replicates important features of r-mTBI in patients and is used in conjunction with in vitro electrophysiology.

Valutazione dei cambiamenti nella plasticità sinaptica utilizzando un modello di trauma cranico chiuso sveglio di lieve lesione cerebrale traumatica

Mild traumatic brain injuries (mTBIs) are a prevalent health issue in North America. There is increasing pressure to utilize ecologically valid models of ...

Patch Clamp Electrophysiology

Neuron cell membranes are populated with ion channels that control the movement of charge into and out of the cell, thereby regulating neuron firing. One extremely useful technique for investigating the biophysical properties of these channels is called patch clamp recording. In this method, neuroscientists place a polished glass micropipette against a cell and apply suction to form a high resistance seal. This process isolates a small &#8220;patch&#8221; of membrane that contains one or more ion channels. Using an electrode within the micropipette, researchers can &#8220;clamp&#8221; or control the electrical properties of the membrane, which is important for analysis of channel activity. The electrode also allows for changes in the voltage across the membrane, or the flow of ions through the membrane, to be recorded. This video begins with an overview of the principles behind patch clamp electrophysiology, an introduction to the necessary equipment, and descriptions of the various patch configurations, including whole cell, cell-attached, perforated, inside-out, and outside-out patches. Next, the key steps of a typical whole-cell patch clamp experiment are outlined, in which a current-voltage (IV) curve is generated. Finally, applications of patch clamp recording are provided to demonstrate how the biophysical properties of ion channels, cell excitability, and neuroactive compounds are evaluated in neurophysiology labs today.

Patch Clamp Electrophysiology: Principle &amp; Applications

Patch Clamp Elettrofisiologia

Neuron cell membranes are populated with ion channels that control the movement of charge into and out of the cell, thereby regulating neuron firing. One ...

Didattica

JoVE Science Education

Biologia avanzata

Patch Clamp

Many fundamental cell functions such as muscle contraction and nerve transmission rely on the electrical signals produced by the movement of positively and negatively charged ions across the cell membrane. One competent method to record current flowing across the whole cell or single ion channel is the patch-clamp technique.
In this method, a glass micropipette containing electrolyte solution is tightly sealed against a small portion of the cell membrane. As a result, a patch of the cell membrane is electrically isolated, ensuring that the ions moving across the channels flow only into the micropipette. Further, this tight sealing of the cell membrane prevents ions from escaping into the bath solution in which the cell is suspended.
Different Patch-clamp Methods:
Depending upon the research interest, several variations of the patch-clamp method can be used for measuring the cell&#39;s biophysical properties. For example, researchers can clamp or control the membrane voltage and measure the current passing through it. Alternatively, they can clamp the current and measure any variation in the membrane voltage.
In cell-attached mode, the membrane patch containing a single or a few ion channels remains intact. As a result, the current flowing through the membrane patch alone can be measured. In contrast, the whole-cell method involves disruption of the membrane patch by briefly applying strong suction. Consequently, the interior of the pipette becomes continuous with the cytoplasm. This mode enables the measurement of electrical current and voltage from the entire cell.
Another patch-clamp method requires gentle retraction of the attached pipette. As a result, the membrane patch is excised without affecting the tight seal. In this inside-out configuration, the intracellular portion of the membrane is exposed to the bath solution, allowing the study of intracellular factors affecting the channel functions.

Morsetto patch

Many fundamental cell functions such as muscle contraction and nerve transmission rely on the electrical signals produced by the movement of positively ...

JoVE Core

Cell Biology

Unit 1

Channels and the Electrical Properties of Membranes

TERMINI E CONCETTI CHIAVE

Paired Patch Clamp Recording of the Neuronal Connections in Acute Brain Slices

After preparing slices of the target region, allow them to incubate. During this time, pull the patch pipettes, which should have a long and slender shank. After securing a brain slice with a platinum harp in an experimental chamber, fill a recording pipette with internal solution.
Place the pipette in the preamplifier and patch a putative postsynaptic neuron in whole-cell mode. Using a searching patch pipette of 8 to 10 megaohm resistance filled with an internal solution in which potassium salts is replaced by sodium salts, apply gentle suction to the searching pipette to patch a potential presynaptic neuron in a loose-cell attached configuration.
Hold the membrane potential under the loose seal to between negative 30 and negative 60 millivolts in current clamp mode. Then, apply large current pulses of 0.2 to 2 nanoamps to elicit an action potential in the potential presynaptic cell.
Observe this action potential as a small spike lit on the voltage response. Set the stimulation frequency to 0.1 Hertz to prevent rundown of the postsynaptic response. If the postsynaptic neuron does not respond to stimulation of the tested potentially presynaptic neuron, patch a new potential presynaptic neuron in loose-seal mode.
Test up to 30 potentially presynaptic neurons in this way, continuing to use the same searching patch electrode as long as a seal with a resistance of greater than 30 megaohm can be established.
If stimulation in the loose-seal mode results in an EPSP or IPSP with a latency less than five milliseconds in the postsynaptic neuron, remove the searching pipette from the presynaptic neuron.
Using a recording patch electrode filled with biocytin containing regular internal solution with a resistance of four to eight megaohm, patch the presynaptic neuron and record in whole-cell current clamp mode. Elicit action potentials by current injection in the presynaptic neurons and record the postsynaptic response.

Registrazione accoppiata con patch clamp delle connessioni neuronali in fette cerebrali acute

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neurophysiology

Electrophysiology Techniques

EoE Sub Articles

Automated Image-Guided Patch Clamp Technique for Studying Neurons in Brain Slices

In this step, place one brain slice in the center of the recording chamber. Stabilize the brain slice with a slice holdown or a harp. To detect the fluorescent cell, find the area of interest under the four times magnification. Then, move the microscope stage by turning on &#34;click-to-move&#34; mode, and click the center of the area of interest. Next, switch to the high magnification lens and adjust the focus by moving the microscope in the z-axis using RF on the keypad.
The software directs the microscope in the camera to take a series of images at different depths. Then, these images are subjected to computer vision processing to find fluorescently labeled cells. Click the Detect Cell button on the main column, unit zero. A list of cell coordinates will appear in the memory position&#39;s GUI. Remove undesired cells from the list by clicking the X button next to the coordinates.
Then, click on the cell of interest. A yellow dot with a number will appear on the cell, and the coordinates of the cell will appear in the memory position&#39;s GUI. To perform secondary calibration in order to detect pipette offset coordinates, fill one-third of a glass pipette with internal solution. Then, load the pipette onto the pipette holder attached to the head stage.
At low magnification, use one and two on the keypad to switch between unit one and unit two. Then, bring the pipette into the visual field and adjust the focus using the keypad.
Next, load the primary calibration by clicking on Load Calibration. Switch the microscope lens to high magnification, and click 40 times on the main GUI. Bring the pipette tip to the center. Then, click the secondary calibration button on the main GUI under the unit that is in use. To patch a target cell, click on the Patch Control button to open the patch control GUI. Click the Go To button next to the cell of interest on the coordinate list in the memory position GUI.
Subsequently, click on the CTM button of the unit in the main GUI to enable movement. Click on the cell of interest to move the pipette tip to the cell.
Next, use the Unit 1 Selected button to switch the input signal between the two units. Click on the Patch button on the patch control GUI. Automatic patching will begin, and the pressure and resistance can be monitored on the patch control GUI.
The automatic patching algorithm monitors resistance and controls pressure through a series of logic loops to form a gigaseal. A pop-up window notifies the formation of a gigaseal.
The system utilizes resistance change to recognize cell surface contact. In a situation that the cell surface contact is not detected in time, use the Next button to advance patching stage while remaining in the same automatic patching trial.
Manipulate the automatic process at any point by clicking on the respective buttons on the patch control GUI. Then, select Yes to break in with combined zap and suction. Then, save the experiment patch log.