Bu çalışma, Kanada Sağlık Araştırma ve Doğa Bilimleri Enstitülerince desteklenmiştir.

Tüm işlemler, McGill Üniversitesi Hayvan Bakım Komitesi ve Canadian Care on Canadian Care Council tarafından onaylanan protokollere ve yönergelere uygun olarak gerçekleştirildi. 1. Akut Hipokampus İn Vitro Hazırlık NOT: Sağlam hipokampal preparatın izole edilmesi üç ana aşamadan oluşur: (1) solüsyonların ve ekipmanın hazırlanması, (2) hipokampüsün diseksiyonu ve (3) intrensek teta salınımlarının oluşturulması için gerekli olan hızlı perfüzyon oranının ayarlanması. Bu protokolde, diseksiyondan rekorda prosedürlerin zamanında uygulanması özellikle önemlidir, çünkü izole edilmiş hipokampüs, yapının in vitro işlevsel bağlantısını korumanın büyük önem arzetmesi için yoğun ama narin bir hazırlık oluşturmasıdır. Herşeyi önceden hazırlamak, hücre d en aza indirmek için mümkün olduğunca erken bir perfüzyon seviyesinin mevcut olmasını sağlarFizyolojik fonksiyonu sürdürür ve sürdürür. <ol><li> Sükroz bazlı yapay Serebral Spinal Sıvı (aCSF) çözeltisi <ol><li> Diseksiyon ve post-diseksiyon inkübasyon için kullanılacak 1X stok sakaroz çözeltisi hazırlayın. Tablo 1&#39;de listelenen tüm bileşenleri CaCl 2 hariç olmak üzere 1 L iyonu alınmış suya birleştirin ve en fazla 2 hafta süreyle 4 ° C&#39;de saklayın. </li></ol></li><li> Standart aCSF çözümü <ol><li> Elektrofizyolojik kayıtlar sırasında izole edilmiş hipokampüsün yüksek akış hızı perfüzyonu için standart aCSF hazırlayın. Konsantre edilir (5X) stok aCSF yapmak için, 4 ° C&#39;de iyonu giderilmiş su ve mağaza 2 L, CaCl2 hariç Tablo 2&#39;de listelenen tüm bileşenleri, çözülür. </li></ol></li><li> Ekipmanı hazırla <ol><li> Diseksiyona başlamadan önce, tezgah alanını buz dolu bir plastik tepsi (30 x 20 x 5 cm), karbogen bağlı tüp hatları ve trEe cam Petri kapları (10 x 2 cm) (Bkz. Şekil 1 ). </li><li> 500 mL&#39;lik bir behere 300 mL sükroz çözeltisi (1X stok) ekleyin, karbojen (% 95 O 2 ,% 5 CO 2 ) ile kabarcıklayın ve Ca 2+ [1.2 mM] ekleyin. </li><li> 60 mL&#39;lik bir sakaroz çözeltisini bir cam Petri kabına aktarın ve oda sıcaklığında bırakın. Gerisini, 10 ° - 15 dakika boyunca 4 ° C&#39;lik bir dondurucuya yerleştirin. </li><li> Diseksiyon boyunca karbojen ile buz gibi sakaroz çözeltisini kabarcıklar. </li><li> Sakkaroz solüsyonu (4 ° C) ile ikinci bir Petri kabını (soğuk tutma odası) doldurun ve buzda tutun. </li><li> 50 mL&#39;lik bir behere 30 mL buz soğuk sakaroz çözeltisi ekleyin. </li></ol></li></ol> 2. Tüm Hipokampus Diseksiyonu NOT: İzole edilmiş hipokampüsün ayrıştırılması için kullanılan yöntem esas olarak 22&#39;de tarif edilen ve geliştirilen yöntemle özdeştir, fakat peRfüzyon hızı ve kayıt teknikleri. <ol><li> Beyin diseksiyonu <ol><li> Fareye (P20 - 35), kafese eklenen 1 mL izofluran (% 100) ile ıslatılmış küçük bir kağıt havlu ile duman kapağı altında anestezi uygulayın. </li><li> Anestezi uygulanmış fareyi kesiniz ve başlığı buz gibi soğuk sakaroz çözeltisine (50 mL beher, ~ 5 s) daldırın. Kağıt havluya aktarın. </li><li> Medial deri insizyonu (rostral kaudal) yapmak için bir neşter kullanın ve kafatası maruz kalacak şekilde kenarlarından itin. </li><li> Kafatasını küçük bir makasla açın ve beyin hızla özütlemek için bir spatula kullanın ve buz gibi sakaroz çözeltisi içeren Petri kabına koyun. Beyinin soğuması için 1-2 dakika bekleyin. </li><li> Beyin iyileşirken, buz üzerinde bir lens kağıdı kaplı Petri (diseksiyon) çanağına 2 - 3 mL sakaroz çözeltisi ekleyin. </li></ol></li><li> Hipokampusu izole etme <ol><li> Beyni diseksiyon çanağına dik duran bir positio üzerine yerleştirinn. </li><li> Bir bıçak ağzı ile serebellum ve frontal korteksi çıkartın. Beyni midsagital düzlem boyunca yarı yarıya kesin ve iki izole yarımküreyi tutma odasına geri gönderin. İyileşme için 1-2 dakika daha bekleyin. </li><li> Tekli hemisected beyin diseksiyon yuvasına dik yerleştirin. </li><li> Midsagittal yapılar gözlemciye bakana dek çanağı döndürün ve septal kompleksin gömülü anahatları, talamusun önündeki ince bir armut şekilli doku katmanı olarak görülebilir. </li><li> Hemiset bulunan beyini mikro spatula ile sabit tutun ve politetrafluoroetilen (PTFE) kaplı spatula&#39;nın küçük ucunu septal bölgenin hemen arkasına (kaudal) yerleştirin. </li><li> Kaplanmış spatula septumun altına yerleştirin ve ucu aşağıya doğru diseksiyon çanağına ulaşana kadar aşağıya doğru hareket ettirin. Septal bölgede kaudal bağlanan lifleri ayırın. Aynı işlemi septumun ön kenarı boyunca tekrarlayın ve beynin ön kısmına bağlanan lifleri kesin. </li><li> Spatula hafifçe korteksin iç kısmını hipokampüsten dik konumda tutarak, talamik, hipotalamik ve kalan beyin sapı çekirdeklerini dikkatle aşağı çekmek için mikro spatuyu kullanın. Çıkarılan dokuyu kesmek ve çıkarmak için spatula kullanın. </li><li> İzole edilmiş yarımkürede yan tarafını çevirin ve hipokampüsün dış çizgisini belirleyin. </li><li> Kaplamalı spatula, yanal ventriküle, dorsal hipokampüsün rostral ucunun altına yerleştirilir. </li><li> Spatayı yatay olarak hemiplejik beyin midsagital düzlemiyle aynı hizaya getirin ve ucun kaudal yönde ortaya çıkıncaya kadar ventriküler duvarların pürüzsüz konturuyla kaydırın. </li><li> Hipokampusun altında spatula tutun ve hafifçe onu bağlayan elyaf üzerine basın, iç katman boyunca hipokampus üst korteks ile katılır. Mikrogözenekleri bu tabakanın dış tarafına uygulayın ve kaplama spatula üzerine kaydırarak bağlantı fiBers. </li><li> Çıkarmayı tamamlamak için diseksiyon çanağını döndürün ve kaplamalı spatula&#39;yı ventral hipokampüsün altına yerleştirin. Hafifçe kortikal katın iç kısmını spatula ile tutun ve mikro spatulaya karşı dilim hareketi kullanarak entorinal bağlantıları kesin. NOT: Bütün septohipokampal kompleks, kaplanmış spatülün tüm hipokampüsün altına yerleştirilmesi ve geri kalan beyin dokusunun altından çıkarılmasıyla çıkarılabilir. </li><li> İzolasyon tamamlandıktan sonra, hipokampüsü yemeğin üzerinde tutun ve soğuk tutmak için bir damla buz soğuk sakaroz çözeltisi ekleyin. Kalan tüm korteksi ve lifleri dikkatlice kesin ve forniks içerisine hafifçe bir traş bıçağı uygulayarak hipokampusu septumdan ayırın. NOT: Yama tutturma kayıtları piramidal hücrelerden gerçekleştirilecekse (bkz. Kısım 4.6 Optogenetik kontrol), izole edilmiş hipokampus, CA1&#39;in piramidal tabakasını açığa çıkarmak için 45 ° açıyla çapraz olarak kesilebilir (&quot;anglE-cut &quot;hazırlığı), hipokampüsün geri kalan kısmındaki yerel ağ devresinden ödün vermeden. </li><li> Preparat oda sıcaklığında sükroz çözeltisine aktarın ve kayıt odasına aktarılmadan önce 15-30 dakika geri kazmasına izin verin. </li></ol></li></ol> 3. İzole Hipokampusu Kaydetmek İçin Hızlı Perfüzyon Kurma <ol><li> 20 - 25 mL / dak&#39;da oksijenli aCSF&#39;nin sürekli yüksek hızlı girmesini sağlamak için yerçekimi beslemeli perfüzyon sistemini kurun. <ol><li> Önceden bir CSF (1X) şişeler hazırlayın ve deney başlamadan önce en az 15 dakika boyunca onları ısıtma banyosuna (~ 30 ° C) daldırın. Hat çözümü ısıtıcı sistemini açın (30 ° C). </li><li> Deney boyunca aCSF oksijen ve [mM 2], önceki perfüzyonun başlamasından CaCl2 eklemek için bir karbojen tankına bağlanan akvaryum kabarcık oluşturucu ve boru hatları kullanın. </li><li> ACSF akışını durdurun ve hipokampüsünü geniş kullanarak kayıt odasına aktarınBir cam pipetin ucunda. Sakaroz doymuş preparatın batmasına ve altına yerleşmesine izin verin. </li><li> Hazırlama yüzeyini CA1 ve SUB düz yüzeyleri üstte olacak şekilde kayıt odasının merkezine yerleştirin (giriş-çıkış ekseni doğrultusunda). Septal ve temporal ekstremitelerde küçük ağırlıklarla hipokampusu dengeleyin ve aCSF akışını yeniden başlatın. </li></ol></li></ol> 4. İzole Hipokampusta Elektrofizyoloji <ol><li> İn vitro hippokampal teta salınımlarının ekstraselüler kayıtları <ol><li> Lokal Alan Potansiyelinin (LFP) hücre dışı izlenmesi veya in vitro izole edilmiş hipokampüsten alınan tekli ünite aktivitesi için aCSF ile dolu cam mikropipetler (1 - 3 MΩ) kullanın. Kazanç x1000, çevrimiçi bant geçiren filtreleme 0.1-500 Hz ve örnekleme hızı 5-20 kHz olan bir patch clamp amplifikatör ile düşük gürültülü AC-bağlı alan potansiyel sinyallerini kaydedin. NOT: Bu protokolde kullanılan özel yapılı mikroskopHipokampüsün düşük büyütme görüntüsü için düşük (2,5X) ve yüksek büyütme (40X) hedefleri ile birlikte tek hücreli tanıma için kızılötesi video mikroskopisi ve epifloresans ile donatılmıştır. Bu sistemin bileşenleri dik flüoresan mikroskop, flüoresan filtre küpleri, analog video kamera ve görüntüleme yazılımı olan dijital çerçeve kaptör, nöronal kayıtlar için yüksek performanslı mikromanipülatörler ve sahne özel perfüzyon odası ( Şekil 2A , inset i) Optik fiber yerleşimi. </li><li> Hipokampal preparatın düşük büyütme (2.5X) altında incelenmesi için mikroskopta monte edilen kamerayı bir bilgisayar ekranına bağlayın ve dış yüzeye herhangi bir alttan kesik veya hasar olmadığını hızla kontrol edin. Alfabe elyaflarının CA1&#39;in pürüzsüz yüzeyi boyunca diyagonal olarak yönlendirilmesi, iletilen ışığı hipokamdan parlattığında görülebilir olmalıdır ( Şekil 2A , ekteki ii)irin. </li><li> İzole edilmiş hipokampüsün ve LFP elektrotlarının belirli kayıt konumlarına yerleştirilmesini görüntülemek için düşük büyütmeli geniş alan hedefini kullanın. NOT: Şekil 2A&#39;da , farklı kayıt yerlerine yerleştirilmiş çok elektrotlu izole hipokampal preparatın bir düzeni gösterilmiştir. </li><li> Bir LFP elektrotunu CA1 alanının yüzeyine (alveus) dokunana kadar banyoya indirin. NOT: Bu, genellikle, AC birleşimli kayıtta, elektrot kayıt ortamıyla temasa geldiğinde olana benzer şekilde hızlı bir geçiş üretir. Bir ses monitörü, bu adımdan sonra LFP kanal sinyalini dinlemek için yararlı olabilir. NOT: Genellikle, erken aktivite belirtileri yalnızca 10-15 dakika sonra ortaya çıkacaktır, bu nedenle hazırlığın hızla ilerlememesi önemlidir. Yüzey LFP elektrodu hala bu aktiviteyi takip edemezse, stratum oriensleri boyunca biraz ilerletinVe ana hücre katmanına yaklaşırken herhangi bir etkinlik biçiminin olup olmadığını görmek için periyodik olarak duraklatın. Başka bir şey 5-10 dakika sonra algılanmazsa, elektrodu dikkatli bir şekilde geri çekin ve aynı bölge boyunca başka bir yere yerleştirin. </li><li> LFP elektrodunu piramit tabakası boyunca ilerletin. Münferit nöronlardan (çoğunlukla piramidal ve inhibitör sepet hücrelerinden) tek birimli deşarj bulunursa, hücre dışı spor aktivitesinin başlangıçta arttığını gözlemleyin. Elektrotu daha da alçaltın ve ucu radyasyona geçerken yayılma tekrar solmaya başlar. Kayıt mevkisi radyasyon yoluyla düştüğü için, teta frekans aralığında (4 - 12 Hz) açıkça görülebilen ağ salınımının belirginleştiğini ve maksimum genliğe (~ 100 - 300 μV) ulaştığını gözlemleyin. </li></ol></li><li> Tek bir bölgede teta salınımları <ol><li> CA1 bölgesi boyunca spontan teta salınımlarının mekansal özelliklerini test etmek için, ucunFa referans LFP elektrodunu medial CA1 bölgesinde (medialde uzunlamasına septo-temporal eksende bulunur) ve daha önce tarif edildiği gibi radyasyona indirgemektir. </li><li> İkinci bir LFP elektrodu bir CA1 alanına (200 - 800 um septal veya ilk LFP&#39;den temporal) yerleştirin ve CA1 teta salınımlarının nispeten geniş mesafelerde senkronize olabileceğini gözlemleyin. </li></ol></li><li> Katlar arası teta salınımları <ol><li> Hipokampal tabakalardaki teta salınımlarının özelliklerini test etmek için bir CA1 radyasyon sitesinde bir referans LFP elektrodu bırakın. Tabaka oriflerinin hemen üstünden başlayarak ikinci bir elektrotu piramidal hücre katmanına ve radyasyon yoluyla indirgeyin. Piramit katman boyunca LFP sinyalinin kademeli olarak tersine çevrilmesini (bağıl faz tersine çevirme) izleyin. NOT: Bu tür aktivitelerin temsili örnekleri için bkz. Şekil 2B . Laminer / derinlik profilleri ve Akım Kaynak Yoğunluğu (CSD) analizlerine örneklerIzole hipokampusta faz geçişi yerini göstermekte olup daha önce 23 , 24 , 25 yayınlanmıştır. </li></ol></li><li> Sağlam hipokampusta gam osilasyonları ve teta-gama kuplajı <ol><li> CA1 / SUB kenarlığına bir alan elektrod yerleştirin ve piramidal ve molekül katmanları arasındaki ara yüze oturuncaya kadar aşağı indirin. Bu seviyede, genlikte değişikliklerle birlikte açık gama titreşimleri sergileyen bir alan potansiyeli, yerel teta ritmine faz kilidi kaydedilebilir 24 . Teta-gama bağlantının yavaş zaman ölçeğini gözlemlemek için ölçeklemeyi ayarlayın. Gama patlamaları, yavaş (25-50 Hz) ve hızlı gamma (150-250 Hz) aralığında devam eden LFP sinyalini bant geçiren filtreleme ile ortaya çıkartabilen iki farklı frekans bandında ortaya çıkar. (Temsil edilen filtreleme için Şekil 2C&#39;ye bakın. izleri). </li></ol></li><li> In vitro hipokampal teta salınımlarında tüm hücre yaması kelepçesi kaydı NOT: Protokolün bu bölümünde, PV destekleyicisinin kontrolü altındaki floresan proteini, tdTomato&#39;yu eksprese eden transjenik PV-TOM farelerinden izole edilmiş hipokampideki belirlenmiş internöronlardan, görsel olarak yönlendirilen tüm hücre yaması tutam kayıtlarını elde etmek amaçlanmıştır (for Daha fazla bilgi için bkz. Malzemeler ve Ref. 26 ). <ol><li> Bir PV-TOM faresinden alınan bir hipokampal preparatın yüzeyinin yakınında bulunan tdTomato pozitif internöronlarını görselleştirmek için düşük (2.5X) ve yüksek güç (40X) büyütme ile floresan video-mikroskopi kullanın ( Şekil 3 ). PV-TOM nöronları alveus yoluyla (100 μm&#39;ye kadar) yama için başarıyla görselleştirilebilir ve hedeflenebilirken, hipokampus açılı kesim tekniği ile hazırlandığında floresan olmayan piramidal hücrelere nispeten kolayca ulaşılabilir (bkz. Bölüm 2.2.14 notu).</li><li> Hipokampusun düşük büyütme görüntüsünde, patch clamp deneyleri hazırlanırken teta salınımlarını izlemek için CA1 / SUB&#39;da bir LFP elektrodu yerleştirin. </li><li> 40X büyütme moduna geçin ve hedefi hedef bölge üzerine daldırın; Üst katmanlar görünene kadar indirin. Karşı taraftan yama pipet yaklaşımı için yeterli açık erişim sağlamak için mikroskopun konumunu değiştirin. </li><li> Floresan mikroskopi altında, bir floresan PV-TOM hücresi seçin ve standart hücre içi çözüm ile dolu bir yama pipet (2 - 3 MΩ) ile yaklaşın. </li><li> Pipete hafif pozitif basınç uygulamak için bir ağızlık kullanın ve elektrot hücreye indirildiğinde direnci izleyin. İpucu hedef hücre ile karşılaştığında, pipet direnci artar ve pozitif basınç membran üzerine itildiğinde net bir çukur belirir. Basıncı tahliye edin ve bir mühür oluşmaya başlarken akım darbesinin düzgünleştiğini kontrol edin. Hemen clAmplifikatör ile hiperpolarize bir potansa (-70 mV) getirin ve bir kez GΩ mühür elde edildikten sonra, hücre zarını pipet tutucu yoluyla uygulanan küçük miktarda negatif basınç ile parçalayın. </li><li> Tam hücre konfigürasyonuna girdikten sonra, spontan hipokampal salınımlar sırasında tanımlanan PV hücrenin fizyolojik özelliklerini inceleyin ( Şekil 3B ). </li><li> PV hücrelerinden alınan hücre içi membran potansiyel kayıtlarının hızlı yayılma davranışı ve devam eden CA1 / SUB teta ritmine senkronize edilen aksiyon potansiyelleri patlaması ile karakterize edildiğini gözlemleyin. </li><li> Voltaj kelepçesine geçin ve intrinsik ritmik aktivite tarafından üretilen inhibitör sinaptik akımlara karşı eksitatörün oranını karakterize etmek için hücreyi farklı zar potansiyellerinde tutun. Piramidal bir hücreden yama kelepçesi kaydı örneği, karşılaştırma için Şekil 3A&#39;da gösterilmiştir. </li></ol></li><li> İzole edilmiş hipokampusta optogenetik kontrol </strong&gt; Not: Bu hücreler izole hipokampus 25 ana hücre popülasyonları senkronize önemli bir rol oynadıkları gösterilmiştir olarak hipokampal ağ etkinliğinin Optogenetic kontrolü için, PV içeren GABAerjik hücrelerinin ritmik aktivasyonunu kapsayan bir hücre tipi özel stratejisi burada kullanılır. PV hücrelerinde eksitatör kanalı rhodopsin-2&#39;nin (ChR2) seçici ifadesi, PV-Cre fare hattını, ChR2 Cre&#39;ye bağlı olarak ifade eden farelerle (Ai32) çaprazlamak, böylece PV-ChY fareleri üretmek sureti ile elde edilir. Alternatif olarak, viral vektör yapıları ( örneğin , AAVdj-ChETA-eYFP), CA1 / SUB internöronlarında eksitatör opsin ekspresyonunu yönlendirmek için PV-Cre veya PV-TOM farelerinin hipokampusuna (P15-16) enjekte edilebilir ( Şekil 4A ). NOT: Bu strateji daha önce 25 açıklanmıştır. <ol><li> CA1 / SUB alanına bir LFP elektrod yerleştirin ve izole edilmiş hipokoda yakınlardaki bir piramidal hücreyi yamalayınAmpulü fotovoltaj hücrelerinde mavi ışığa duyarlı eksitatör opsin ChR2&#39;yi ifade etti. </li><li> Hipokampal preparatın üzerine bir optik fiber ışık kılavuzu (0,2-1 mm çap) yerleştirin ve kaydedilen bölgenin üzerine ortalayın. Optogenetik uyarımı için bir LED kaynağından mavi ışık (473 nm) kullanın; ışık darbelerinden (10- 20 ms, bir transistör-transistör mantık sinyali tarafından tetiklenir) veya sinir dalga voltaj komutlarını teta frekanslarında (4-12 Hz) teslim edin. NOT: Özel LED tabanlı ışık uyarı tertibatı başka bir yerde tarif edilmiştir 25 . </li><li> Kendiliğinden teta salınımları sırasında piramidin aktivitesini karakterize etmek için mevcut kelepçeye geçin. </li><li> Uyarılma protokolünü başlatın ve ışık tepkilerini kaydedin. Kaydedilen nörondaki alan salınımlarının ve sinaptik aktivitenin optogenetik uyarılma esnasında gittikçe senkronize edildiğini ve PV hücrelerinin ritmik hızlanmasının hem frekansın sağlam bir kontrolü sağladığını gözlemleyinSaya ve salınımların gücü ( Şekil 4 ). </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Buzsaki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Theta+rhythm+of+navigation:+link+between+path+integration+and+landmark+navigation,+episodic+and+semantic+memory.">Theta rhythm of navigation: link between path integration and landmark navigation, episodic and semantic memory.</a> Hippocampus. 15 (7), 827-840 (2005).</li><li>Sanders, H., Renno-Costa, C., Idiart, M., Lisman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Grid+Cells+and+Place+Cells:+An+Integrated+View+of+their+Navigational+and+Memory+Function.">Grid Cells and Place Cells: An Integrated View of their Navigational and Memory Function.</a> Trends Neurosci. 38 (12), 763-775 (2015).</li><li>O'Keefe, J., Recce, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+relationship+between+hippocampal+place+units+and+the+EEG+theta+rhythm.">Phase relationship between hippocampal place units and the EEG theta rhythm.</a> Hippocampus. 3 (3), 317-330 (1993).</li><li>Winson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+hippocampal+theta+rhythm+results+in+spatial+memory+deficit+in+the+rat.">Loss of hippocampal theta rhythm results in spatial memory deficit in the rat.</a> Science. 201 (4351), 160-163 (1978).</li><li>M'Harzi, M., Jarrard, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategy+selection+in+a+task+with+spatial+and+nonspatial+components:+effects+of+fimbria-fornix+lesions+in+rats.">Strategy selection in a task with spatial and nonspatial components: effects of fimbria-fornix lesions in rats.</a> Behav Neural Biol. 58 (3), 171-179 (1992).</li><li>Osipova, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Theta+and+gamma+oscillations+predict+encoding+and+retrieval+of+declarative+memory.">Theta and gamma oscillations predict encoding and retrieval of declarative memory.</a> J Neurosci. 26 (28), 7523-7531 (2006).</li><li>Stumpf, C., Petsche, H., Gogolak, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+significance+of+the+rabbit's+septum+as+a+relay+station+between+the+midbrain+and+the+hippocampus.+II.+The+differential+influence+of+drugs+upon+both+the+septal+cell+firing+pattern+and+the+hippocampus+theta+activity.">The significance of the rabbit's septum as a relay station between the midbrain and the hippocampus. II. The differential influence of drugs upon both the septal cell firing pattern and the hippocampus theta activity.</a> Electroencephalogr Clin Neurophysiol. 14, 212-219 (1962).</li><li>Mitchell, S. J., Ranck, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+theta+rhythm+in+medial+entorhinal+cortex+of+freely+moving+rats.">Generation of theta rhythm in medial entorhinal cortex of freely moving rats.</a> Brain Res. 189 (1), 49-66 (1980).</li><li>Alonso, A., Garcia-Austt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+sources+of+theta+rhythm+in+the+entorhinal+cortex+of+the+rat.+I.+Laminar+distribution+of+theta+field+potentials.">Neuronal sources of theta rhythm in the entorhinal cortex of the rat. I. Laminar distribution of theta field potentials.</a> Exp Brain Res. 67 (3), 493-501 (1987).</li><li>Vertes, R. P., Kocsis, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brainstem-diencephalo-septohippocampal+systems+controlling+the+theta+rhythm+of+the+hippocampus.">Brainstem-diencephalo-septohippocampal systems controlling the theta rhythm of the hippocampus.</a> Neuroscience. 81 (4), 893-926 (1997).</li><li>Bland, B. H., Colom, L. V., Konopacki, J., Roth, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+records+of+carbachol-induced+theta+rhythm+in+hippocampal+slices.">Intracellular records of carbachol-induced theta rhythm in hippocampal slices.</a> Brain Res. 447 (2), 364-368 (1988).</li><li>Cobb, S. R., Buhl, E. H., Halasy, K., Paulsen, O., Somogyi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronization+of+neuronal+activity+in+hippocampus+by+individual+GABAergic+interneurons.">Synchronization of neuronal activity in hippocampus by individual GABAergic interneurons.</a> Nature. 378 (6552), 75-78 (1995).</li><li>Williams, J. H., Kauer, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+carbachol-induced+oscillatory+activity+in+rat+hippocampus.">Properties of carbachol-induced oscillatory activity in rat hippocampus.</a> J Neurophysiol. 78 (5), 2631-2640 (1997).</li><li>Chapman, C. A., Lacaille, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholinergic+induction+of+theta-frequency+oscillations+in+hippocampal+inhibitory+interneurons+and+pacing+of+pyramidal+cell+firing.">Cholinergic induction of theta-frequency oscillations in hippocampal inhibitory interneurons and pacing of pyramidal cell firing.</a> J Neurosci. 19 (19), 8637-8645 (1999).</li><li>Strata, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+oscillations+in+CA3+hippocampal+pyramids:+physiological+relevance+to+theta+rhythm+generation.">Intrinsic oscillations in CA3 hippocampal pyramids: physiological relevance to theta rhythm generation.</a> Hippocampus. 8 (6), 666-679 (1998).</li><li>Kocsis, B., Bragin, A., Buzsaki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interdependence+of+multiple+theta+generators+in+the+hippocampus:+a+partial+coherence+analysis.">Interdependence of multiple theta generators in the hippocampus: a partial coherence analysis.</a> J Neurosci. 19 (14), 6200-6212 (1999).</li><li>Fellous, J. M., Sejnowski, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholinergic+induction+of+oscillations+in+the+hippocampal+slice+in+the+slow+(0.5-2+Hz),+theta+(5-12+Hz),+and+gamma+(35-70+Hz)+bands.">Cholinergic induction of oscillations in the hippocampal slice in the slow (0.5-2 Hz), theta (5-12 Hz), and gamma (35-70 Hz) bands.</a> Hippocampus. 10 (2), 187-197 (2000).</li><li>Gillies, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+of+atropine-resistant+theta+oscillations+in+rat+hippocampal+area+CA1.">A model of atropine-resistant theta oscillations in rat hippocampal area CA1.</a> J Physiol. 543 (Pt 3), 779-793 (2002).</li><li>Gloveli, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orthogonal+arrangement+of+rhythm-generating+microcircuits+in+the+hippocampus.">Orthogonal arrangement of rhythm-generating microcircuits in the hippocampus.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (37), 13295-13300 (2005).</li><li>Konopacki, J., Eckersdorf, B., Kowalczyk, T., Golebiewski, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Firing+cell+repertoire+during+carbachol-induced+theta+rhythm+in+rat+hippocampal+formation+slices.">Firing cell repertoire during carbachol-induced theta rhythm in rat hippocampal formation slices.</a> Eur J Neurosci. 23 (7), 1811-1818 (2006).</li><li>Hajos, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintaining+network+activity+in+submerged+hippocampal+slices:+importance+of+oxygen+supply.">Maintaining network activity in submerged hippocampal slices: importance of oxygen supply.</a> Eur J Neurosci. 29 (2), 319-327 (2009).</li><li>Manseau, F., Goutagny, R., Danik, M., Williams, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hippocamposeptal+pathway+generates+rhythmic+firing+of+GABAergic+neurons+in+the+medial+septum+and+diagonal+bands:+an+investigation+using+a+complete+septohippocampal+preparation+in+vitro.">The hippocamposeptal pathway generates rhythmic firing of GABAergic neurons in the medial septum and diagonal bands: an investigation using a complete septohippocampal preparation in vitro.</a> J Neurosci. 28 (15), 4096-4107 (2008).</li><li>Goutagny, R., Jackson, J., Williams, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-generated+theta+oscillations+in+the+hippocampus.">Self-generated theta oscillations in the hippocampus.</a> Nat Neurosci. 12 (12), 1491-1493 (2009).</li><li>Jackson, J., Goutagny, R., Williams, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+slow+gamma+rhythms+are+intrinsically+and+independently+generated+in+the+subiculum.">Fast and slow gamma rhythms are intrinsically and independently generated in the subiculum.</a> J Neurosci. 31 (34), 12104-12117 (2011).</li><li>Amilhon, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parvalbumin+Interneurons+of+Hippocampus+Tune+Population+Activity+at+Theta+Frequency.">Parvalbumin Interneurons of Hippocampus Tune Population Activity at Theta Frequency.</a> Neuron. 86 (5), 1277-1289 (2015).</li><li>Huh, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitatory+Inputs+Determine+Phase-Locking+Strength+and+Spike-Timing+of+CA1+Stratum+Oriens/Alveus+Parvalbumin+and+Somatostatin+Interneurons+during+Intrinsically+Generated+Hippocampal+Theta+Rhythm.">Excitatory Inputs Determine Phase-Locking Strength and Spike-Timing of CA1 Stratum Oriens/Alveus Parvalbumin and Somatostatin Interneurons during Intrinsically Generated Hippocampal Theta Rhythm.</a> J Neurosci. 36 (25), 6605-6622 (2016).</li><li>Gu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMDA-dependent+phase+synchronization+between+septal+and+temporal+CA3+hippocampal+networks.">NMDA-dependent phase synchronization between septal and temporal CA3 hippocampal networks.</a> J Neurosci. 33 (19), 8276-8287 (2013).</li><li>Jackson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversal+of+theta+rhythm+flow+through+intact+hippocampal+circuits.">Reversal of theta rhythm flow through intact hippocampal circuits.</a> Nat Neurosci. 17 (10), 1362-1370 (2014).</li><li>Gonzalez-Burgos, G., Lewis, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABA+neurons+and+the+mechanisms+of+network+oscillations:+implications+for+understanding+cortical+dysfunction+in+schizophrenia.">GABA neurons and the mechanisms of network oscillations: implications for understanding cortical dysfunction in schizophrenia.</a> Schizophr Bull. 34 (5), 944-961 (2008).</li></ol>

Yazarlar rakip ticari veya finansal çıkarların olmadığını beyan ettiler.

Akut hipokampal dilimlerden gelen elektrofizyolojik kayıtlar standart bir in vitro teknik oluştururken, burada sunulan yöntemler klasik yaklaşımı önemli ölçüde farklılık göstermektedir. Belirli hücre katmanlarının yüzeyde görünür olduğu ve doğrudan incelenebilen ince dilim preparatlarının aksine, bozulmamış hipokampal müstahzarlar, elektrotlar, tek tek katmanlardan geçerken hedeflenen beyin bölgelerine indirildiği in vivo konfigürasyonlara daha yakındır. Hipokampusun bütünlüğü fonksiyonel bağlantı ve lokal nöronal popülasyonların özellikleri ile birlikte korunur. Bu, hipokampustaki küçük ve büyük ölçekli ağ salınımlarını araştırmak için karmaşık ve güçlü bir araç sağlar. Örneğin, ağdaki önceden kablolanmış devre ve hücre tipi spesifik özelliklerin kombinasyonu, hippoca&#39;nın önemli özelliklerini taklit eden kendiliğinden ve kendiliğinden üretilen ritmik teta ve gama salınımları üretirIn vivo aktivite. Bu protokolde sunulan yöntemleri kullanarak, hipokampüs kemirgen beyninden hızla çıkarılabilir ve hızla akan aCSF ortamında birkaç saat boyunca yaşayabilir kalır. Temel elektrofizyolojik teknikler, spesifik nöronal tiplerin senkron aktivitesinin ve sinaptik fonksiyonunun hipokampal dinamiği nasıl etkilediğini araştırmak için kolayca uygulanır. Prosedürümüz, in vitro hipokampusun tüm septo-temporal (dorso-ventral) ekseni boyunca yerel alan potansiyel salınımlarının dinamiklerini sistematik olarak keşfetmek için ilk fırsat sağlamıştır (bkz. Ref 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 ). Ağ ve fizyolojik seviyelerde, bozulmamış preparat şu özellikleri korur: 1) Fonksiyonel sinüsIn vivo frekans aralığı ve profili ile intrensek ağ salınımlarını güvenilir bir şekilde desteklemek için gerekli hücreler arasındaki ptic etkileşimleri, 2) Tabaka piramid düzeyinde teta salınımının göreceli fazındaki keskin değişim, 3) Theta&#39;nın mekansal dağılımı ve tutarlılığı Hipokampusta salınım ve yerel gama frekans ritimleri ile etkileşimi, 4) Theta / gamma dalgalarının genlik-faz ilişkisi ve 5) Alan potansiyeli teta salınımlarıyla ana hücrenin ve internöron ateşlemesinin spesifik zamansal ilişkisi. Hipokampusa harici girdi olmaması, tekniğe bir sınırlama olarak görünebilir; aynı zamanda, in vivo olarak yapılamayacak şekilde, hipokampüsün iç dinamiklerinin incelenmesine izin verir. Buna ek olarak, harici girdiler, spesifik lif terminalleri ve afferent yolakların optogenetik uyarımı ile taklit edilebilir. Sağlam hazırlıklar, çalışmak için yeni imkanlar sunarAğ faaliyetlerinin yayılımı ve etkileşimi, hipokampüs ve diğer bağlı yapıları içeren büyük ölçekli ağlarda. Bu nedenle, bozulmamış hazırlama tekniğinin bir ana uygulaması, beyin bölgeleri arasındaki veya beyindeki bölgeler arasındaki fonksiyonel ağ bağlantısının araştırılmasıdır. Dolayısıyla, in vitro bozulmamış hipokampusun kullanılması, sadece hipokampüsün hücresel ve ağ özellikleri hakkında daha fazla bilgi sağlamaz, aynı zamanda bunların şekil işleme, bütünleşme ve beynin içindeki bilginin üretilmesi ile nasıl etkileşime girdiğine ışık tutar. Büyük nöronal toplulukların eşgüdümlü elektro-kimyasal sinyallerine giren ritmik ağ salınımları beyin alanları içinde ve çevresinde bilgi aktarmak, depolamak ve aktarmak için merkezi bir mekanizma olarak görev yapmaktadır. Hipokampal salınımların, spatiotemporal bilgi, kodlama ve bellek işlemesi için çok önemli olduğu düşünülmektedir. Aksine, hipokampal disfonksiyonun,H Alzheimer hastalığı ve şizofreni olarak değişmiş salınım paternleriyle ilişkili 29 . Bu nedenle, bozulmamış hipokampal müstahzarlar kullanılarak kendi kendine üretilen hipokampal salınımların incelenmesi, sinir sistemi fonksiyonlarının ve işlev bozukluğunun temel özelliklerini aydınlatmak için yeni bir araç haline gelmiştir.

Hipokampal teta salınımları (4 - 12 Hz), memeli beyinde ritmik aktivitenin en baskın formları arasındadır ve spatiotemporal bilginin işlenmesi ve episodik hatıraların oluşturulması gibi bilişsel işlevlerde anahtar rol oynadığı düşünülmektedir 1 , 2 , 3 . Theta modülasyonlu yer-hücrelerinin uzamsal seyrüsefer ve lezyon çalışmaları ile ilişkisini vurgulayan bazı in vivo çalışmalar ve klinik bulgular, hipokampal teta salınımlarının bellek oluşumu 4 , 5 , 6&#39;da yer aldığı görüşünü desteklemekle birlikte, ilişkili mekanizmalar Hipokampal teta salınımlarının oluşumu hala tam olarak anlaşılamamıştır. İn vivo erken araştırmalar, teta aktivitesinin esas olarak dışsal salınımcılara, özellikle de ritmik girdiye dayandığını ileri sürdüSeptum ve entorinal korteks 7 , 8 , 9 , 10 gibi aferent beyin yapılarından. Hipokampal sinir ağlarının iç bağlantısının hipokampal nöronların özellikleri ile birlikte intrensek faktörlerin rolü aynı zamanda in vitro gözlemlere dayanılarak 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 varsayımıyla da ileri sürülmüştür. Bununla birlikte, 19 , 20 , 21 numaralı birkaç dönüm noktası çalışmasının yanı sıra, basit in vitro dilim hazırlamada fizyolojik olarak gerçekçi popülasyon aktivitelerini çoğaltabilen yaklaşım geliştirme zorluklarıUzun süredir hipokampüsün ve ilgili alanların kendi kendine teta salınımlarını üretme yeteneklerinin daha ayrıntılı olarak deneysel olarak incelenmesini geciktirdi. Standart in vitro ince dilim deney ortamının önemli bir dezavantajı, beyin yapılarının 3D hücresel ve sinaptik organizasyonunun tehlikeye girmesidir. Bu, lokalize gruplardan (≤1 mm yarıçapı) bir veya daha fazla beyn alanına (&gt; 1 mm) yayılmış nöron popülasyonlarına kadar uzanan uzaysal olarak dağıtılan hücre gruplarına dayanan uyumlu ağ faaliyetlerinin birçok formunun desteklenemediği anlamına gelir. Bu düşünceler göz önüne alındığında, otonom titreşimlerin hipokampusta nasıl ortaya çıktığı ve ilgili kortikal ve subkortikal çıkış yapılarına nasıl yayılacağı üzerinde farklı bir yaklaşım gerekiyordu. Son yıllarda, çift yönlü intera incelemek için &quot;komple septo-hipokampal&quot; preparatın ilk gelişimiiki yapı 22 ve &quot;izole edilmiş hipokampus&quot; preparasyon ardından gelen evrimin seksiyonlar, içsel teta salınımlar dış ritmik girişi 23 eksik hipokamp spontan olarak meydana çıkarmıştır. Bu yaklaşımların değeri, in vitro 22&#39;de bir teta ritm jeneratörü olarak işlev görmek için bu bölgelerin tüm fonksiyonel yapısının korunması gereken ilk anlayışa dayanmaktadır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="820">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Reagents</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:247px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sucrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaH2PO4 - sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S8282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnesium sulfate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C5080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Ascorbate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7631-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:319px;">Name</td>
			<td style="width:135px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Standard Dissecting Scissors</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-951-25</td>
			<td>brain extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Scalpel Handle #4, 14cm</td>
			<td>WPI</td>
			<td>500237</td>
			<td>brain extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Filter forceps, flat jaws, straight (11cm)</td>
			<td>WPI</td>
			<td>500456</td>
			<td>brain extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paragon Stainless Steel Scalpel Blades #20</td>
			<td>Ultident</td>
			<td>02-90010-20</td>
			<td>brain extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fine Point Curved Dissecting Scissors</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>711999</td>
			<td>brain extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Teflon (PTFE) -coated thin spatula</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-534</td>
			<td>hippocampal preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hayman Style Microspatula</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21-401-25A</td>
			<td>hippocampal preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lab spoon</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-375-20</td>
			<td>hippocampal preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Borosilicate Glass Pasteur Pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-20A</td>
			<td>hippocampal preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Droper</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>hippocampal preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Razor blades Single edged</td>
			<td>VWR</td>
			<td>55411-055</td>
			<td>hippocampal preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lens paper (4X6 inch)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>52846-001</td>
			<td>hippocampal preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass petri dishes (100 x 20 mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25354-080</td>
			<td>hippocampal preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plastic tray for ice; size 30 x 20 x 5 cm</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>hippocampal preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Single Inline Solution Heater</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>SH-27B</td>
			<td>perfusion system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Aquarium air stones for bubbling</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>perfusion system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tygon E-3603 tubing (ID 1/16 OD 1/8)</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>14-171-129</td>
			<td>perfusion system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Electric Skillet</td>
			<td>Black &#38; Decker</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>perfusion system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">95% O2/5% CO2 gas mixture (carbogen)&#160;</td>
			<td>Vitalaire</td>
			<td>SG466204A</td>
			<td>perfusion system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass bottles/flasks (4 x 1 L)</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>perfusion system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Submerged recording Chamber</td>
			<td>custom design (FM)</td>
			<td>n.a.</td>
			<td style="width:247px;">Commercial alternative may be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass pipettes (1.5 / 0.84 OD/ID (mm) )</td>
			<td>WPI</td>
			<td>1B150F-4</td>
			<td>electrophysiology</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hum Bug 50/60 Hz Noise Eliminator</td>
			<td>Quest Scientific</td>
			<td>Q-Humbug</td>
			<td>electrophysiology</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Multiclamp 700B patch-clamp amplifier</td>
			<td>Molecular devices</td>
			<td>MULTICLAMP</td>
			<td>electrophysiology</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Multiclamp 700B Commander Program</td>
			<td>Molecular devices</td>
			<td>MULTICLAMP</td>
			<td>electrophysiology</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Digital/Analogue converter</td>
			<td>Molecular devices</td>
			<td>DDI440</td>
			<td>electrophysiology</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PCLAMP10</td>
			<td>Molecular devices</td>
			<td>PCLAMP10</td>
			<td>electrophysiology</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vibration isolation table&#160;</td>
			<td>Newport</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>electrophysiology</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micromanipulators (manually operated )</td>
			<td>Siskiyou&#160;</td>
			<td>MX130</td>
			<td>electrophysiology (LFP)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micromanipulators (automated)</td>
			<td>Siskiyou&#160;</td>
			<td>MC1000e</td>
			<td>electrophysiology (patch)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Audio monitor&#160;</td>
			<td>A-M Systems</td>
			<td>Model 3300</td>
			<td>electrophysiology</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micropipette/Patch pipette puller</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>P-97</td>
			<td>electrophysiology</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Custom-built upright fluorescence microscope</td>
			<td>Siskiyou</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Analogue video camera</td>
			<td>COHU</td>
			<td>4912-2000/0000</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Digital frame grabber with imaging software</td>
			<td>EPIX, Inc</td>
			<td>PIXCI-SV7</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Olympus 2.5x objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>MPLFLN</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Olympus 40x water immersion objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UIS2 LUMPLFLN</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Custom-made light-emitting diode (LED) system&#160;</td>
			<td>custom</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>optogenetic stimulation (Amhilon et al., 2015)</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:319px;">Name</td>
			<td style="width:135px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Animals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">PV::Cre (KI) mice</td>
			<td style="width:135px;">Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:119px;">stock number 008069</td>
			<td style="width:247px;">Allow&#160; Cre-directed gene expression in PV interneurons</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Constitutive-conditional Ai9 mice (R26-lox-stop-lox-tdTomato (KI))</td>
			<td style="width:135px;">Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:119px;">stock number 007905</td>
			<td style="width:247px;">Express TdTomato following Cre-mediated recombination</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Ai32 mice (R26-lox-stop-lox-ChR2(H134R)-EYFP</td>
			<td style="width:135px;">Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:119px;">stock 
			number 012569</td>
			<td style="width:247px;">Express the improved channelrhodopsin-2/EYFP fusion protein following exposure to Cre recombinase</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PVChY mice</td>
			<td>In house breeding</td>
			<td>n.a.</td>
			<td style="width:247px;">Offspring obtained from cross-breeding the PV-Cre line with Ai32 mice (R26-lox-stop-lox-ChR2(H134R)-EYFP</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tuning in the hippocampal theta band in vitro: methodologies for recording from the isolated rodent septohippocampal circuit

Bu protokol, teta salınımlarının incelenmesi için metodolojilerdeki ve uygulamalardaki son gelişmelerle birlikte, izole edilmiş bütün hipokampüs, WT ve transjenik farelerin hazırlanması ve kaydedilmesi için prosedürleri özetlemektedir. İzole edilmiş hipokampal preparatın basit bir karakterizasyonu sunulmuştur; burada iç hippokampal teta osilatörleri arasındaki ilişki, cornu ammonis-1 (CA1) ve subikülüm (SUB) bölgelerinin piramidal hücrelerin aktivitesi ve GABAergik internöronlarla birlikte incelenmiştir. Genel olarak, izole hipokampusun in vitro intrinsik teta salınımları üretebildiğini ve hipokampusta üretilen ritmozitenin, parvalbümin pozitif (PV) internöronların optogenetik uyarımıyla tam olarak manipüle edilebileceğini göstermektedir. İn vitro izole edilmiş hipokampal preparat, görsel olarak tanımlanmış nor&#39;den eşzamanlı alan ve hücre içi yama tutma kayıtlarını kullanmak için benzersiz bir fırsat sunarTheta ritim üretiminin altında yatan mekanizmaları daha iyi anlamak için rons.

<html> Bu bölüm , in vitro fare izole hipokampal preparatta teta salınımlarını inceleyerek elde edilebilecek sonuç örneklerini göstermektedir. İzole edilmiş hipokampüsün çıkarılması için diseksiyon prosedürü Şekil 1&#39;de gösterilmiştir. Bu preparatı kullanarak intrensek teta salınımları, çoklu alan elektrodlarının yerleştirilmesi sırasında incelenebilir, izole edilmiş hipokampüsün farklı bölgelerindeki ve katlarındaki nöronal popülasyonlara genel aktivite ve senkronize sinaptik girdiler kaydedilir ( Şekil 2 ). Eşzamanlı tüm hücre yaması kelepçesi ve hücre dışı kayıtların temsilci sonuçları spontan hipokampal teta salınımları sırasında spesifik hücre tiplerinin ateşleme ve sinaptik özelliklerini karakterize etmek için sunulmuştur ( Şekil 3 ) ve ayrıca ritmik aktivitenin optogenetik manipülasyonu sırasındaG &quot;&gt; Şekil 4). <img alt="Şekil 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55851/55851fig1.jpg" /> Şekil 1: İzole edilmiş bozulmamış hipokampus hazırlığı için diseksiyon prosedürü. ( A ) Diseksiyon kurulumunun genel görünümü. Sağ üst: karbojenlenmiş buz soğukluğunda sakaroz çözeltisi şişesi (1); Sol alt: buz dolu plastik tepsi (2) diseksiyon çanağını lens kağıdıyla (3) tutarak; Sakaroz çözeltisini (4) içeren soğuk tutma odası; Ve bir dizi cerrahi alet (5). ( B ) Diseksiyon çanağındaki hemiseksiyon öncesi fare beyninin görünümü. ( C ) Soğuk tutma odasında hemisected beyin geri kazanıp, septumun altındaki kaplanmış spatula küçük ucunu yerleştirmeden önce sol beyin yarı küresinin yakınlaştırılmış görünümü (inset). ( D ) İzole edilmiş hipokampusun altında, CA1 / SUB bölgesi boyunca kalan beynin bulunduğu kaplamalı spatulaDoku alttan çıkarılır. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55851/55851fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55851/55851fig2.jpg" /> Şekil 2: Batık Kayıt Odasındaki Hasarsız Hipokampal Hazırlığından In vitro Teta Salınımlarının Kaydedilmesi İçin Yapılandırmanın Yapılandırılması. ( A ) İzole edilmiş hipokampüs, hipokampal bölgelerin bir düzeniyle ve septometrik olarak dağıtılan dört farklı kayıt alanına (beyaz yıldızlarla gösterilen) yerleştirilen çoklu elektrotlarla gösterilir. Yukarıda gösterilen kayıt odacığı platformu (ekteki i) açısından, hızlı-perfüzyon akışı için giriş ve çıkış numaraları (1, 2) numaralarıyla gösterilir. Aşağıda gösterilen hipokampüsün büyütülmüş görüntüsünde (içeçek ii), tek bir elektrod ortaSepetotemporal CA1 ve alveusların lifleri, subikülümün karşısına çapraz olarak ilerleyerek kolayca görülebilir. S: septal, T: zamansal, f / fx: fimbria-fornik. ( B ) Katman orifiyallerinden (gri) ve katman radyasyonundan (siyah) eşzamanlı olarak kaydedilen temsili LFP izleriyle CA1 katmanlarının organizasyonunun şematik temsili. İki kat arasındaki sinyallerin ters fazını not edin. Alv: stratum alveus, Halkla ilişkiler: stratum pyramidale, SR: stratum radiatum. SLM: Stratum Lacunosum Moleculare. ( C ) Filtrelenmemiş sinyalden CA1 / SUB alanından (20 sn segment) ve 2 sn genişletilmiş segmentlerden (aşağıda) kaydedilen spontan teta salınımını gösteren örnek LFP izi; Teta frekansları (0.5-12 Hz) için bant geçiren filtreleme; Yavaş gam (25-55 Hz); Ve hızlı gama (125-250 Hz). <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55851/55851fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> Şekil 3: Bir PV-TOM Faresinden Sağlam Hipokampal Hazırlamada Spontan Teta Salınımları Sırasındaki Piramidal Hücrenin ve PV Interneuronun Hücre Tipi Spesifik Aktivitesi. ( A ) Theta salınımlarında bir piramidal hücreden kaydedilen sinaptik aktivite. Akım kıskaç izleri (sol panel), dinlenme sırasındaki spontan ancak ritmik ateşlemeyi ve yavaş yavaş ortaya çıkan LFP salınımıyla açıkça senkronize edilmeyen inhibitör postsinaptik potansiyelleri (iPSP&#39;ler) göstermektedir. Voltaj kelepçesi kayıtları (sağ panel), karşılık gelen inhibitör postsinaptik akımların (iPSC&#39;lerin) -70 mV civarında ters potansiyel taşıdıklarını göstermektedir. ( B ) Sinaptik aktivite, teta salınımları sırasında hızlı spike olan bir fluoresan PV internörüründen kaydedildi. Akım kıskaçında (solda), bu hücre kendiliğinden geride ateş ediyor ve ritmik eksitatör poStsynaptik potansiyelleri (ePSPs) dengeli LFP titreşimi ile faz kilitli idi. Voltaj kelepçesi kayıtlarında (sağda) eksitatör postsinaptik akım geri dönüşüm potansiyeli yaklaşık 0 mV idi. Şematik çizimler, deneysel düzeneği, kaydedilmiş piramidal hücre ve floresan PV internöronunun CA1 / SUB ve yüksek (40X) büyütme görüntülerinde yama ve alan elektrotlarının yerleştirilmesi ile birlikte göstermektedir. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55851/55851fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55851/55851fig4.jpg" /> Şekil 4: İzole Hipokampusta Spontan ve Optogenetik Olarak Titreşimler Sırasında Tek CA1 / SUB Piramidal ve PV Nöronlarından Lokal Alan Potansiyel ve Eşzamanlı Yama Kelepçe Kayıtları. ( A </stRong&gt;) Mavi ışığa duyarlı bir opsin (ChETA fluorofor eYFP ile birleştirilmiş) ifade eden CA1 / SUB bölgesinin üzerine fiber optik kılavuz yerleştirilerek LFP ve yama elektrot kayıt alanlarını gösteren diyagram. ( B ) Kaydedilen hücrenin tipik Regular-Spiking (RS) özelliklerini (üstte) ve yüksek büyütme (40X) görüntüsünü gösteren bir piramidal nöronun karakterizasyonu (altta). ( C ) Aynı hücrenin depolarize membran potansiyelinde (siyah) LFP sinyaliyle (gri) birlikte örnekleme ve spontan salınım sırasında (solda) ve teta frekansı (6 Hz) ışık uyarı srasnda senkronize ritmik IPSP&#39;leri gösteren örnek akım-kelepçe kaydı sağ). Işık uyarımının deseni (mavi gölgeleme) gerilim izlerinin üstünde tasvir edilmiştir. ( D ) 6 Hz ışık simülasyonundan önce, sırasında ve sonrasında LFP dalga formunun spektrogramı ve güç spektrumu (taban çizgisi, uyar, mesaj). ( E ) İzolatın düşük büyütme parlak-alan ve floresan görüntüleriCA1 / SUB bölgesinde lokalize eYFP flöresanını (yeşil renkte) gösteren bir hippokampal preparat. ( F ) Kaydedilmiş bir PV-TOM interneuronunun Hızlı Spike (FS) davranışını gösteren şu andaki basamaklar karakterizasyonu (40X floresans görüntüsü). ( G ) Spontan alan salınımı sırasında (solda) ve 3 saniye sonra ışık uyarımı sırasında (sağda) LFP sinyaliyle senkronize edilen kaydedilen PV hücresinin büyük EPSP&#39;lerini ve ritmik ateşlemesini gösteren membran potansiyel kaydı. ( H ) CA1 / SUB LFP sinyali üzerinde PV hücresi sivri uçlarının alan tetiklemeli ortalaması (FTA). PV hücrenin birden çok deneme boyunca boşaltılması (LFP doruklarına odaklanmıştır), spontan salınım (taban çizgisi) sırasında ve ışık uyarımı sırasında (stim) kaydedilen sivri uçların bir FTA&#39;sına dönüştürüldü. Orta ve alt grafikler, sivri uçların ve sıçrama olasılığı histogramlarının raster çizimlerini göstermektedir (ortalama olasılık kırmızı renkte gösterilir). En üstteki grafikler, lig sırasında güç artan ortalama LFP sinyalinin grafiğini göstermektedirHt stimülasyonu, PV hücrenin yüksek oranda senkronize ateşlemesine paralel olarak LFP salınım zirvesine faz kilitli olarak uygulanır. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55851/55851fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="4"> İZOLELİ HİPOK KAMPÜSÜ İÇİN İLAÇ ÇÖZÜMLERİ (1X) </td></tr><tr><td colspan="2"> (Ana çözelti) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> bileşik </td><td> MW </td><td> Final Conc. (mM): </td><td> 1 L (g) için miktar </td></tr><tr><td> sakaroz </td><td> 342.3 </td><td> 252 </td><td> 86.26 g </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> 84,01 </td><td> 24 </td><td> 2.020 g </td></tr><tr><td> glikoz </td><td> 180.2 </td><td> 10 </td><td&gt; 1.800 g </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 74,55 </td><td> 3 </td><td> 0.223 g </td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td> 120.4 </td><td> 2 </td><td> 0.241 g </td></tr><tr><td> NaH2 4 </td><td> 120 </td><td> 1.25 </td><td> 0.150 g </td></tr><tr><td> CaCl2 .2H2O [1 M] hazır </td><td> 147 </td><td> 1.2 </td><td> 120 uL / ​​0.1 L * </td></tr><tr><td colspan="4"> * 360 uL CaCl2 [1 M] 0.3 L oksijenli sukroz çözeltisi için ilave </td></tr><tr><td></td><td></td><td colspan="2"> Oksijenlendiğinde pH = 7.4, Osm 310-320 </td></tr></tbody></table> Tablo 1. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="4"> PERFÜZYON İÇİN STANDART ACSF ÇÖZÜMLEMESİ (5X) </td></tr><tr><td colspan="2"> (Ana çözelti) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> bileşik </td><td> MW </td><td> Final Conc. (mM): </td><td> 2 L 5X Miktarı </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 58.44 </td><td> 126 </td><td> 73.6 </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> 84,01 </td><td> 24 </td><td> 20.2 </td></tr><tr><td> glikoz </td><td> 180.2 </td><td> 10 </td><td> 18 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 74,55 </td><td> ♦ 4.5 </td><td> 3,355 </td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td> 120.4 </td><td> 2 </td><td> 2.41 </td></tr><tr><td> NaH2 4 </td><td> 120 </td><td> 1.25 </td><td> 1.5 </td></tr><tr><td> askorbat </td><td> 176.1 </td><td> 0.4 </td><td> 0.705 </td></tr><tr><td> CaCl2 .2H2O [1 M] hazır </td><td> 147 </td><td> 2 </td><td> 2 mL / L *</td></tr><tr><td colspan="4"> X 1 L CSF (1 kez) oksijenli çözelti 2 mL CaCl2 [1 M] ekleyin </td></tr><tr><td></td><td></td><td colspan="2"> Oksijenlendiğinde pH = 7.4, Osm 310-320 </td></tr><tr><td colspan="4"> ♦ Bu aCSF solüsyonu (normal aCSF 2.5 mM KCl&#39;ye kıyasla) biraz yükselmiş [K + ] o, hipokampal ağların eksitabilitesini arttırmak ve teta salınımlarının oluşumunu kolaylaştırmak için kullanılır. </td></tr></tbody></table> Tablo 2.

Watch this Scientific Journal Video about Tuning in the Hippocampal Theta Band In Vitro: Methodologies for Recording from the Isolated Rodent Septohippocampal Circuit at JoVE.com

Tuning in the Hippocampal Theta Band In Vitro: Methodologies for Recording from the Isolated Rodent Septohippocampal Circuit

Burada, izole edilmiş bir tüm hipokampal preparattan ritmik nöronal ağ teta ve gama titreşimleri kaydetmek için bir protokol sunuyoruz. Hipokampusun çıkarılmasından teta ritminin optogenetik pacinginin yanı sıra alan, üniter ve tüm hücre yama klemp kayıtlarının ayrıntılarına kadar olan deneysel adımları açıklıyoruz.

Hipokampal Theta Bandında Tuning<em&gt; In vitro</em&gt;: İzole edilmiş Kemirgen Protokokal Circüse Kayıt için Metodolojiler

This protocol outlines the procedures for preparing and recording from the isolated whole hippocampus, of WT and transgenic mice, along with recent ...

tuning-hippocampal-theta-band-vitro-methodologies-for-recording-from

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Tuning in the Hippocampal Theta Band In Vitro: Methodologies for Recording from the Isolated Rodent Septohippocampal Circuit

9.7K Görüntüleme.  McGill University.  Burada, izole edilmiş bir tüm hipokampal preparattan ritmik nöronal ağ teta ve gama titreşimleri kaydetmek için bir protokol sunuyoruz. Hipokampusun çıkarılmasından teta ritminin optogenetik pacinginin yanı sıra alan, üniter ve tüm hücre yama klemp kayıtlarının ayrıntılarına kadar olan deneysel adımları açıklıyoruz. 

Video: Tuning in the Hippocampal Theta Band In Vitro: Methodologies for Recording from the Isolated Rodent Septohippocampal Circuit

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from individual neurons are critical for understanding how neural circuits function under natural conditions. Traditionally, these recordings have been performed 'blind', meaning the identity of the recorded cell is unknown at the start of the recording. Cellular identity can be subsequently determined via intracellular1, juxtacellular2 or loose-patch3 iontophoresis of dye, but these recordings cannot be pre-targeted to specific neurons in regions with functionally heterogeneous cell types. Fluorescent proteins can be expressed in a cell-type specific manner permitting visually-guided single-cell electrophysiology4-6. However, there are many model systems for which these genetic tools are not available. Even in genetically accessible model systems, the desired promoter may be unknown or genetically homogenous neurons may have varying projection patterns. Similarly, viral vectors have been used to label specific subgroups of projection neurons7, but use of this method is limited by toxicity and lack of trans-synaptic specificity. Thus, additional techniques that offer specific pre-visualization to record from identified single neurons in vivo are needed. Pre-visualization of the target neuron is particularly useful for challenging recording conditions, for which classical single-cell recordings are often prohibitively difficult8-11. The novel technique described in this paper uses retrograde transport of a fluorescent dye applied using tungsten needles to rapidly and selectively label a specific subset of cells within a particular brain region based on their unique axonal projections, thereby providing a visual cue to obtain targeted electrophysiological recordings from identified neurons in an intact circuit within a vertebrate CNS.
The most significant novel advancement of our method is the use of fluorescent labeling to target specific cell types in a non-genetically accessible model system. Weakly electric fish are an excellent model system for studying neural circuits in awake, behaving animals12. We utilized this technique to study sensory processing by "small cells" in the anterior exterolateral nucleus (ELa) of weakly electric mormyrid fish. "Small cells" are hypothesized to be time comparator neurons important for detecting submillisecond differences in the arrival times of presynaptic spikes13. However, anatomical features such as dense myelin, engulfing synapses, and small cell bodies have made it extremely difficult to record from these cells using traditional methods11, 14. Here we demonstrate that our novel method selectively labels these cells in 28% of preparations, allowing for reliable, robust recordings and characterization of responses to electrosensory stimulation.

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde transport of fluorescent dye labels a sub-population of neurons based on anatomical projection. Labeled axons can be visually targeted in vivo, permitting extracellular recording from identified axons. This technique facilitates recording when neurons cannot be labeled through genetic manipulation or are difficult to isolate using 'blind' in vivo approaches.

Retrograd Floresan Etiketleme Belirlenen Nöronlar gelen Hedefli Hücre dışı Tek ünitesi Kayıt izin verir<em&gt; In vivo</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Nörobilim

Investigations on Alterations of Hippocampal Circuit Function Following Mild Traumatic Brain Injury

Traumatic Brain Injury (TBI) afflicts more than 1.7 million people in the United States each year and even mild TBI can lead to persistent neurological impairments 1. Two pervasive and disabling symptoms experienced by TBI survivors, memory deficits and a reduction in seizure threshold, are thought to be mediated by TBI-induced hippocampal dysfunction 2,3. In order to demonstrate how altered hippocampal circuit function adversely affects behavior after TBI in mice, we employ lateral fluid percussion injury, a commonly used animal model of TBI that recreates many features of human TBI including neuronal cell loss, gliosis, and ionic perturbation 4-6.
	Here we demonstrate a combinatorial method for investigating TBI-induced hippocampal dysfunction. Our approach incorporates multiple ex vivo physiological techniques together with animal behavior and biochemical analysis, in order to analyze post-TBI changes in the hippocampus. We begin with the experimental injury paradigm along with behavioral analysis to assess cognitive disability following TBI. Next, we feature three distinct ex vivo recording techniques: extracellular field potential recording, visualized whole-cell patch-clamping, and voltage sensitive dye recording. Finally, we demonstrate a method for regionally dissecting subregions of the hippocampus that can be useful for detailed analysis of neurochemical and metabolic alterations post-TBI.
	These methods have been used to examine the alterations in hippocampal circuitry following TBI and to probe the opposing changes in network circuit function that occur in the dentate gyrus and CA1 subregions of the hippocampus (see Figure 1). The ability to analyze the post-TBI changes in each subregion is essential to understanding the underlying mechanisms contributing to TBI-induced behavioral and cognitive deficits. 
	The multi-faceted system outlined here allows investigators to push past characterization of phenomenology induced by a disease state (in this case TBI) and determine the mechanisms responsible for the observed pathology associated with TBI.

A multi-faceted approach to investigating functional changes to hippocampal circuitry is explained. Electrophysiological techniques are described along with the injury protocol, behavioral testing and regional dissection method. The combination of these techniques can be applied in similar fashion for other brain regions and scientific questions.

Hafif Travmatik Beyin Hasarı takiben Hipokampal Devre İşlev değişimler üzerine araştırmalar

Traumatic Brain Injury (TBI) afflicts more than 1.7 million people in the United States each year and even mild TBI can lead to persistent neurological ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

Akut Hipokampal Dilimler içinde Synaptically-uyarılmış astroglial ve Nöronal Cevaplarının İkili Elektrofizyolojik Kayıtlar

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust (Schistocerca Americana) Olfactory Circuits

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar olfactory systems suggesting that the biological approach to chemical sensing has been optimized over evolutionary time1. In the insect olfactory system, odorants are transduced by olfactory receptor neurons (ORN) in the antenna, which convert chemical stimuli into trains of action potentials. Sensory input from the ORNs is then relayed to the antennal lobe (AL; a structure analogous to the vertebrate olfactory bulb). In the AL, neural representations for odors take the form of spatiotemporal firing patterns distributed across ensembles of principal neurons (PNs; also referred to as projection neurons)2,3. The AL output is subsequently processed by Kenyon cells (KCs) in the downstream mushroom body (MB), a structure associated with olfactory memory and learning4,5. Here, we present electrophysiological recording techniques to monitor odor-evoked neural responses in these olfactory circuits.
First, we present a single sensillum recording method to study odor-evoked responses at the level of populations of ORNs6,7. We discuss the use of saline filled sharpened glass pipettes as electrodes to extracellularly monitor ORN responses. Next, we present a method to extracellularly monitor PN responses using a commercial 16-channel electrode3. A similar approach using a custom-made 8-channel twisted wire tetrode is demonstrated for Kenyon cell recordings8. We provide details of our experimental setup and present representative recording traces for each of these techniques.

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust Schistocerca Americana Olfactory Circuits

We demonstrate variations of the extracellular multi-unit recording technique to characterize odor-evoked responses in the first three stages of the invertebrate olfactory pathway. These techniques can easily be adapted to examine ensemble activity in other neural systems as well.

Locust Sinir Aktivitesi Karakterize Multi-ünite Kayıt Yöntemleri (<em&gt; Schistocerca Americana</em&gt;) Olfaktör Devreler

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival  of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar ...

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses specifically on antisense oligonucleotides (ASOs), though the techniques shown in the video here can also be used to deliver a plethora of other drugs to the CNS. Antisense oligonucleotides (ASOs) have the capability to knockdown sequence-specific targets 1 as well as shift isoform ratios of specific genes 2. To achieve widespread gene knockdown or splicing in the CNS of mice, the ASOs can be delivered into the brain using two separate routes of administration, both of which we demonstrate in the video.
The first uses Alzet osmotic pumps, connected to a catheter that is surgically implanted into the lateral ventricle. This allows the ASOs to be continuously infused into the CNS for a designated period of time. The second involves a single bolus injection of a high concentration of ASO into the right lateral ventricle. Both methods use the mouse cerebral ventricular system to deliver the ASO to the entire brain and spinal cord, though depending on the needs of the study, one method may be preferred over the other.

We describe a method to target drugs to the central nervous system by either implanting a catheter or performing a bolus injection into the right lateral ventricle in mice. We focus specifically on the delivery of antisense oligonucleotides. This technique is readily adaptable to other drugs and to rats.

Kemirgen Merkezi Sinir Sistemi İlaçların doğrudan Intraventriküler teslim

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

The enteric nervous system is a vast network of neurons and glia running the length of the gastrointestinal tract that functionally controls gastrointestinal motility. A procedure for the isolation and culture of a mixed population of neurons and glia from the myenteric plexus is described. The primary cultures can be maintained for over 7 days, with connections developing among the neurons and glia. The longitudinal muscle strip with the attached myenteric plexus is stripped from the underlying circular muscle of the mouse ileum or colon and subjected to enzymatic digestion. In sterile conditions, the isolated neuronal and glia population are preserved within the pellet following centrifugation and plated on coverslips. Within 24-48 hr, neurite outgrowth occurs and neurons can be identified by pan-neuronal markers. After two days in culture, isolated neurons fire action potentials as observed by patch clamp studies. Furthermore, enteric glia can also be identified by GFAP staining. A network of neurons and glia in close apposition forms within 5 - 7 days. Enteric neurons can be individually and directly studied using methods such as immunohistochemistry, electrophysiology, calcium imaging, and single-cell PCR. Furthermore, this procedure can be performed in genetically modified animals. This methodology is simple to perform and inexpensive. Overall, this protocol exposes the components of the enteric nervous system in an easily manipulated manner so that we may better discover the functionality of the ENS in normal and disease states.

An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

We demonstrate a cell culture protocol for the direct study of neuronal and glial components of the enteric nervous system. A neuron/glia mixed culture on coverslips is prepared from the myenteric plexus of adult mouse providing the ability to examine individual neuron and glia function by electrophysiology, immunohistochemical, etc.

Bir<em&gt; In-vitro</emYetişkin Mouse myenterik Pleksus izole edilen enterik Nöronlar ve Glia bir&gt; hazırlanması

The enteric nervous system is a vast network of neurons and glia running the length of the gastrointestinal tract that functionally controls ...

Utilizing Combined Methodologies to Define the Role of Plasma Membrane Delivery During Axon Branching and Neuronal Morphogenesis

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular guidance cues like netrin-1 and results in dramatic increases to the surface area of the axonal plasma membrane. Netrin-1-dependent axon branching likely involves temporal and spatial control of plasma membrane expansion, the components of which are supplied through exocytic vesicle fusion. These fusion events are preceded by formation of SNARE complexes, comprising a v-SNARE, such as VAMP2 (vesicle-associated membrane protein 2), and plasma membrane t-SNAREs, syntaxin-1 and SNAP25 (synaptosomal-associated protein 25). Detailed herein isa multi-pronged approach used to examine the role of SNARE mediated exocytosis in axon branching. The strength of the combined approach is data acquisition at a range of spatial and temporal resolutions, spanning from the dynamics of single vesicle fusion events in individual neurons to SNARE complex formation and axon branching in populations of cultured neurons. This protocol takes advantage of established biochemical approaches to assay levels of endogenous SNARE complexes and Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy of cortical neurons expressing VAMP2 tagged with a pH-sensitive GFP (VAMP2-pHlourin) to identify netrin-1 dependent changes in exocytic activity in individual neurons. To elucidate the timing of netrin-1-dependent branching, time-lapse differential interference contrast (DIC) microscopy of single neurons over the order of hours is utilized. Fixed cell immunofluorescence paired with botulinum neurotoxins that cleave SNARE machinery and block exocytosis demonstrates that netrin-1 dependent axon branching requires SNARE-mediated exocytic activity.

Light microscopy techniques coupled with biochemical assays elucidate the involvement of SNARE-mediated exocytosis in netrin-dependent axon branching. This combination of techniques permits identification of molecular mechanisms controlling axon branching and cell shape change.

Kombine Metodolojileri kullanan Akson Dallanman ve Nöronal Morfogenez sırasında Plazma Membran Teslimat Rolü tanımlayın

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular ...

Recording Gamma Band Oscillations in Pedunculopontine Nucleus Neurons

Synaptic efferents from the PPN are known to modulate the neuronal activity of several intralaminar thalamic regions (e.g., the centrolateral/parafascicular; Cl/Pf nucleus). The activation of either the PPN or Cl/Pf nuclei in vivo has been described to induce the arousal of the animal and an increment in gamma band activity in the cortical electroencephalogram (EEG). The cellular mechanisms for the generation of gamma band oscillations in Reticular Activating System (RAS) neurons are the same as those found to generate gamma band oscillations in other brains nuclei. During current-clamp recordings of PPN neurons (from parasagittal slices from 9 - 25 day-old rats), the use of depolarizing square steps rapidly activated voltage-dependent potassium channels that prevented PPN neurons from being depolarized beyond -25 mV.
Injecting 1 - 2 sec long depolarizing current ramps gradually depolarized PPN membrane potential resting values towards 0 mV. However, injecting depolarizing square pulses generated gamma-band oscillations of membrane potential that showed to be smaller in amplitude compared to the oscillations generated by ramps. All experiments were performed in the presence of voltage-gated sodium channels and fast synaptic receptors blockers. It has been shown that the activation of high-threshold voltage-dependent calcium channels underlie gamma-band oscillatory activity in PPN neurons. Specific methodological and pharmacological interventions are described here, providing the necessary tools to induce and sustain PPN subthreshold gamma band oscillation in vitro.

The pedunculopontine nucleus (PPN) is located in the brainstem and its neurons are maximally activated during waking and rapid eye movement (REM) sleep brain states. This work describes the experimental approach to record in vitro gamma band subthreshold membrane oscillation in PPN neurons.

Pedunculopontine Nucleus Nöronlar Kayıt Gama Bant Salınımlılığı

Synaptic efferents from the PPN are known to modulate the neuronal activity of several intralaminar thalamic regions (e.g., the ...

Personalized Needles for Microinjections in the Rodent Brain

Microinjections have been used for a long time for the delivery of drugs or toxins within specific brain areas and, more recently, they have been used to deliver gene or cell therapy products. Unfortunately, current microinjection techniques use steel or glass needles that are suboptimal for multiple reasons: in particular, steel needles may cause tissue damage, and glass needles may bend when lowered deeply into the brain, missing the target region. In this article, we describe a protocol to prepare and use quartz needles that combine a number of useful features. These needles do not produce detectable tissue damage and, being very rigid, ensure reliable delivery in the desired brain region even when using deep coordinates. Moreover, it is possible to personalize the design of the needle by making multiple holes of the desired diameter. Multiple holes facilitate the injection of large amounts of solution within a larger area, whereas large holes facilitate the injection of cells. In addition, these quartz needles can be cleaned and re-used, such that the procedure becomes cost-effective.

We describe here a protocol for microinjection in the rodent brain that uses quartz needles. These needles do not produce detectable tissue damage and ensure reliable delivery even in deep regions. Moreover, they can be adapted to research needs by personalized designs and can be re-used.

Microinjections kemirgen beyin için kişiselleştirilmiş iğneler

Microinjections have been used for a long time for the delivery of drugs or toxins within specific brain areas and, more recently, they have been used to ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful analysis of synaptic transmission modulation when performing field potential or intracellular recordings. This manuscript describes methodological aspects that might be helpful in improving experimental conditions for the maintenance of acute brain slices and for recording field excitatory postsynaptic potentials in a commercially available submersion chamber with an outflow-carbogenation unit. The outflow-carbogenation helps to stabilize the oxygen level in experiments that rely on the recycling of a small buffer reservoir to enhance the cost-efficiency of drug experiments. In addition, the manuscript presents representative experiments that examine the effects of different carbogenation modes and stimulation paradigms on the activity-dependent synaptic plasticity of synaptic transmission.

This protocol describes the stabilization of the oxygen level in a small volume of recycled buffer and methodological aspects of recording activity-dependent synaptic plasticity in submerged acute hippocampal slices.

Sinaptik plastisite akut Hipokampal dilimleri bir küçük hacimli geri dönüşüm-, perfüzyon- ve batma-tipi oda sistemi içinde tutulan kayıt

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...