This work was supported by core facilities of the Center for Translational Neuroscience supported by NIH award P20 GM103425 and P30 GM110702 to Dr. Garcia-Rill. This work was also supported by grants from FONCYT-Agencia Nacional de Promoci&#242;n Cient&#236;fica y Tecnol&#242;gica; BID 1728 OC.AR. PICT-2012-1769 and UBACYT 2014-2017 #20120130101305BA (to Dr. Urbano).

Tüm deneysel protokoller Arkansas Tıbbi Bilimler Üniversitesi (Protokol numarası # 3593) Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmış ve bakım ve laboratuvar hayvanlarının kullanımına ilişkin Sağlık kılavuzların National Institutes ile anlaşma idi. Standart yapay beyin omurilik sıvısının hazırlanması 1. (CSF) <ol><li> Stok Çözeltisi A Hazırlanması <ol><li> kimyasal ilave edilmeden önce, temiz bir 1 L&#39;lik bir kap için distile su, 700 ml ilave edilir. </li><li> Sürekli 500 ml bir hacme karıştırılırken, NaCI 136,75 g KCI 6.99 g, MgSO 4 2.89 g, ve NaH 2 PO 4 2.83 g ekleyin. </li><li> Seyreltildikten sonra 1 L bir son hacme ulaşmak için daha fazla damıtılmış su ekleyin, her bir bileşiğin nihai konsantrasyon 117 mM NaCI, 4.69 mM KCI olduğu, 1.2 ila 4 mm MgSO, ve 1.18 mM NaH 2 PO 4. </li><li> 2 hafta boyunca 4 ° C&#39;de buzdolabında tutun. </li></ol></li><li> Stok Çözeltisi B&#39;nin Hazırlanması <ol><li> kimyasal ilave edilmeden önce, temiz bir 1 L çanağa damıtılmış 700 ml su ekleyin. </li><li> Sürekli 500 ml bir hacme karıştırılırken, D-glukoz 41.45 g NaHCO 3 41.84 g ekleyin. </li><li> Seyreltildikten sonra 1 L bir son hacme ulaşmak için daha fazla damıtılmış su ekleyin, her bir bileşiğin nihai konsantrasyon 11.5 mM D-glikoz ve 24.9 mM NaHCO 3&#39;tür. </li><li> 2 hafta boyunca 4 ° C&#39;de buzdolabında tutun. </li><li> Her deney karışımı önce 50 50 ml stok B ile stok ml sürekli karbojen (-% 5 CO2 karışımı% 95 O 2) ile oksijene ederken nihai konsantrasyon aCSF solüsyon elde etmek ve oda sıcaklığında bırakın damıtılmış su ile 1 L&#39;ye getir en az 30 dakika karıştırıldı. Sadece her bir deney başında nihai konsantrasyon aCSF hazırlayın ve günün sonunda atın. </li></ol></li></ol> Sakkaroz-yapay beyin omurilik sıvısının 2. Hazırlık(Sakroz-CSF) <ol><li> Stok Çözeltisi C hazırlanması <ol><li> kimyasal ilave edilmeden önce, temiz bir 1 L&#39;lik bir kap için distile su, 700 ml ilave edilir. </li><li> Sürekli damıtık su 500 mi karıştırılırken, sükroz, 240 g, NaHCO 3 6.55 g, KCI 0.671 g, MgCl2 4.88 g, CaCI2 0.22 g askorbik asit, 0.21 g ekleyin. </li><li> Seyreltildikten sonra 1 L bir son hacme ulaşmak için daha fazla damıtılmış su ekleyin, her bir bileşiğin nihai konsantrasyon 701,1 mM sakaroz, 78 mM NaHCO 3, 9 mM KCI, 24 mM MgCl2, 1.5 mM CaCl2 ve 1.2 mM askorbik asit . </li><li> en fazla bir hafta boyunca 4 ° C&#39;de stok çözeltisi C tutun. </li><li> Her deney karışımı önce sürekli bir karbojen (% 95 O 2-5% CO2 karışımı) ile oksijene ise son konsantrasyonda sukroz-CSF çözelti elde etmek ve oda sıcaklığında bırakın distile su, 600 ml stok C, 50 ml, 300 mi en az 30 dakika karıştırıldı. </li></ol&gt; </li></ol> 3. Dilim Hazırlık <ol><li> karbojen ile oksijene, buz içinde 100 mi sükroz aCSF çözeltisi ile temiz bir beher yerleştirilir ve 0.1 M NaOH solüsyonu birkaç damla eklenirken bir pH metre kullanılarak 7.4 pH düzeltme (zaman pH &lt;7.4) ya da 0.1 M HCI çözeltisi ( pH&gt; 7.4). </li><li> sakaroz-aCSF ile bir vibratome bir kesim odasına kadar doldurun ve oksijen. Kesme odasına bağlanmış gliserol tabanlı soğutma sistemi açın ve 0 kadar soğuması için 15 dakika bekleyin - 4 ° C. </li><li> (; &lt;50 ul son hacim ile 70 mg / kg, ip), Ketamin ile (yetişkin Zamanlı gebe Sprague-Dawley fareleri ile 12 yaş 9) yavrular anestezisi. yavru sakin olduğunda, çift o kuyruk tutam refleks yoktur edin. </li><li> yavrular başını kesmek. <ol><li> Bir karbonlu çelik neşter bıçak kullanarak geri ve forseps kullanarak yanlara cilt çekin önden uzunlamasına kafa cildi kesin. sc hareketli beyini çevreleyen kemik kesmekyanal issors ve tamamen beyin açığa çıkarın. </li><li> Sonra hızla (başlangıçta hafifçe en kaudal alanlara doğru en rostral beyni dışarı itmek için koku ampul altına) bir spatula kullanarak beyin kaldırmak. Yavaşça buzla soğutulmuş oksijenli sükroz yapay beyin omurilik sıvısı (sükroz-CSF) içine beyin itin. </li></ol></li><li> (Yarımkürede yaklaşık üçte birini öldürmesi) sağ hemisfer bir parasagital kesim olun ve manyetik içeren sagital 400 mikron bölümleri kesmek için bir vibroslicer kesme odasına sabit olacak bir metalik diske beynin kesilmiş tarafını tutkal pedunculopontine çekirdeği (PPN). bütün hücre patch-clamp kayıtları önce 45 dakika boyunca oda sıcaklığında PPN dilimleri tutun. </li></ol> PPN Dilimleri 4. Kayıtlar Gamma-bant Salınımlılığı <ol><li> Potasyum glukonat hücre içi Çözüm hazırlanması (High-K + Çözümü) <ol><li> Yerleştirmekdistile su 10 ml ile temiz bir beher buz. K + -gluconate, 90,68 mg phosphocreatine di Tris tuz, 47.66 mg HEPES, 1.5 mg EGTA, 40.58 mg Mg 2+ ATP ve 4 mg Na + 2 -GTP: Sürekli eklemek karıştırırken. </li><li> KOH 7.3 (damıtılmış su içinde 100 mM), pH ayarlama. 20 mL&#39;lik bir son hacme ulaşmak için saf su ekle. 290 mOsm - gerekli olduğunda, 280 olarak sakaroz (damıtılmış su içinde 100 mM) ile, ozmolarite ayarlayın. Seyreltildikten sonra, her bir bileşiğin nihai konsantrasyon 124 mM K + -gluconate olan, 10 mM fosfokreatin di Tris tuzu, 10 mM HEPES, 0.2 mM EGTA, 4 mM Mg2 + -ATP ve 0.3 mM, Na + 2 -GTP. </li><li> Kısım hücre 1 ml tüpler çözeltiler ve dondurularak -20 ° C&#39;de ilave edildi. günde bir kısım kullanın ve deneyler süresince 4 ° C&#39;de tutun. </li></ol></li><li> Tüm hücre yama Kelepçe Kayıtlar <ol><li> bir daldırma bölmesi dilimleri yerleştirin ve oksijenli ile (1.5 mL / dakika) ile perfüze(% 95 O2 - CO2,% 5), aşağıdaki reseptör antagonistlerini içeren CSF: Selektif NMDA reseptör antagonisti, bir 2-amino-5-phosphonovaleric asit (APV, 40 uM), rekabetçi AMP A / kainat bir glutamat reseptör antagonisti 6-siyano-7- nitrokuinoksalin-2,3-dion (CNQX, 10 uM), glisin reseptör antagonisti striknin (STR, 10 uM), belirli bir GABA A reseptör antagonisti gabazine (GBZ, 10 uM) ve sodyum kanal bloke tetrodoksin (TTX 3μM) NOT: sonuçlar ve rakamlar, bu antagonistleri toplu olarak sinaptik bloker veya SBs adlandırılır. </li><li> Kayıt yama pipetler dolgu, bir ticari olarak elde edilebilen parça pipet dolgu maddeleri kullanılarak hücre içi yüksek K + çözeltisi (Direnç 2-7 MQ 1,0 mm dış çapı ve 0.6 mm iç çap normal, ticari olarak temin edilebilir kalın duvarlı borosilikat cam kılcal yapılmış) çözelti filtre. onun amplifikatörün tutucu pipet yerleştirin. Küçük bir pos uygulaBir üç yollu vanaya bağlı bir silikon tüp kullanılarak pipet sahibine bağlı 1 ml&#39;lik şırınga ile gösterilmiş pozitif basıncı. Bir yama kelepçe amplifikatör pipet tutucu arka bağlayın. </li><li> yakın kızılötesi diferansiyel girişim kontrast optik kombine bir 4X objektif kullanılarak PPN çekirdeğe yakın bir mekanik mikromanipülatör kullanarak kayıt pipet hareket ettirin. NOT: PPN çekirdeği superior serebellar sapı ile dilimler dorsal görülebilir (SCP; akson kalın bir paket olarak gözlemlenebilir). Kayıt pipetler PPN&#39;nin yerleşmişti sapı arka ucuna dorsal hemen bulunduğu compactadaki, pars. </li><li> 40X suya daldırma lens kullanarak görüntülenmiştir iken PPN nöron ile temas halinde kayıt pipet getirin ve hızla hücre ile bir mühür formu negatif emiş uygulanır. </li><li> Üreticinin protokolü kullanılarak negatif emme sırasında pipet direnci izlemek için gerilim kelepçe mühür yazılımını kullanın. <ol><li> Ne zaman olumsuz suction yavaş yavaş artar ve pipet ucu yama-kelepçe monitör tarafından okuma direnç değerleri 80 ulaşır - hızla mV -50 ve negatif basınç serbest tutma potansiyeli değiştirmek, 100 Mohm. Sürekli nöronun membran ve elektrik ile erişim tam hücre konfigürasyonunda elde edilir yırtılma girene kadar, emme uygulamak başlayın. </li><li> gerilim kelepçe mühür yazılımı ile ölçülen erişim direnç değerleri 10 MOhm veya daha yüksek ise, o zaman küçük miktarlarda negatif emme uygulayarak devam edin. </li></ol></li><li> Kapasitans telafi gerilim kelepçe modunda ve seri direnç (yani, yavaş ve hızlı geçici hücrenin zarı kırılması sonra gözlenen). Köprü değerleri telafi hızla geçerli kelepçe kayıt moduna geçmek ve (örneğin, amplifikatör düğmesini taşımak veya computer&#39;s fareyi kullanarak otomatik kompanzasyon menüsünü tıklayın). <ol><li> PPN nöronun sürekli dinlenme monitörü zar potansiyeli u kaydediliyorüreticinin protokolünü şarkı. depolarizan veya hiperpolarizan değerlere doğru membran potansiyeli kayması istirahat, daha sonra optimum -50 mV nihai değerini tutmak için doğru akım (100 pA kadar) küçük miktarlarda kullanın. NOT: -48 mV istikrarlı istirahat membran potansiyeli (RMP) veya daha fazla hiperpolarize (yani, RMP &lt;-48 mV) ile sadece PPN nöronlar tutun. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Profice, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurophysiological+evaluation+of+the+pedunculopontine+nucleus+in+humans.">Neurophysiological evaluation of the pedunculopontine nucleus in humans.</a> J. Neural. Transm (Vienna). 118 (10), 1423-1429 (2011).</li><li>Steriade, M., Datta, S., Pare, D., Oakson, G., Curro Dossi, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+activities+in+brain-stem+cholinergic+nuclei+related+to+tonic+activation+processes+in+thalamocortical+systems.">Neuronal activities in brain-stem cholinergic nuclei related to tonic activation processes in thalamocortical systems.</a> J. Neurosci. 10 (8), 2541-2559 (1990).</li><li>Steriade, M., Dossi, R. C., Pare, D., Oakson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+oscillations+(20-40+Hz)+in+thalamocortical+systems+and+their+potentiation+by+mesopontine+cholinergic+nuclei+in+the+cat.">Fast oscillations (20-40 Hz) in thalamocortical systems and their potentiation by mesopontine cholinergic nuclei in the cat.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88 (10), 4396-4400 (1991).</li><li>Deurveilher, S., Hennevin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lesions+of+the+pedunculopontine+tegmental+nucleus+reduce+paradoxical+sleep+(PS)+propensity:+evidence+from+a+short-term+PS+deprivation+study+in+rats.">Lesions of the pedunculopontine tegmental nucleus reduce paradoxical sleep (PS) propensity: evidence from a short-term PS deprivation study in rats.</a> Eur. J. Neurosci. 13 (10), 1963-1976 (2001).</li><li>Steriade, M., Pare, D., Datta, S., Oakson, G., Curro Dossi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+cellular+types+in+mesopontine+cholinergic+nuclei+related+to+ponto-geniculo-occipital+waves.">Different cellular types in mesopontine cholinergic nuclei related to ponto-geniculo-occipital waves.</a> J. Neurosci. 10 (8), 2560-2579 (1990).</li><li>Steckler, T., Inglis, W., Winn, P., Sahgal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pedunculopontine+tegmental+nucleus:+a+role+in+cognitive+processes?.">The pedunculopontine tegmental nucleus: a role in cognitive processes?.</a> Brain Res. Brain Res. Rev. 19 (3), 298-318 (1994).</li><li>Garcia-Rill, E., Simon, C., Smith, K., Kezunovic, N., Hyde, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pedunculopontine+tegmental+nucleus:+from+basic+neuroscience+to+neurosurgical+applications:+arousal+from+slices+to+humans:+implications+for+DBS.">The pedunculopontine tegmental nucleus: from basic neuroscience to neurosurgical applications: arousal from slices to humans: implications for DBS.</a> J. Neural. Transm. 118 (10), 1397-1407 (2011).</li><li>Mazzone, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implantation+of+human+pedunculopontine+nucleus:+a+safe+and+clinically+relevant+target+in+Parkinson's+disease.">Implantation of human pedunculopontine nucleus: a safe and clinically relevant target in Parkinson's disease.</a> Neuroreport. 16 (17), 1877-1881 (2005).</li><li>Simon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gamma+band+unit+activity+and+population+responses+in+the+pedunculopontine+nucleus.">Gamma band unit activity and population responses in the pedunculopontine nucleus.</a> J. Neurophysiol. 104 (1), 463-474 (2010).</li><li>Kezunovic, N., Urbano, F. J., Simon, C., Hyde, J., Smith, K., Garcia-Rill, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+behind+gamma+band+activity+in+pedunculopontine+nucleus+(PPN).">Mechanism behind gamma band activity in pedunculopontine nucleus (PPN).</a> Eur. J. Neurosci. 34 (3), 404-415 (2011).</li><li>Hyde, J. R., Kezunovic, N., Urbano, F. J., Garcia-Rill, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+properties+of+high+speed+calcium+oscillations+in+the+pedunculopontine+nucleus.">Spatiotemporal properties of high speed calcium oscillations in the pedunculopontine nucleus.</a> J. Appl. Physiol (1985). 115 (9), 1402-1414 (2013).</li><li>Llinas, R. R., Leznik, E., Urbano, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+binding+via+cortical+coincidence+detection+of+specific+and+nonspecific+thalamocortical+inputs:+a+voltage-dependent+dye-imaging+study+in+mouse+brain+slices.">Temporal binding via cortical coincidence detection of specific and nonspecific thalamocortical inputs: a voltage-dependent dye-imaging study in mouse brain slices.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (1), 449-454 (2002).</li><li>Boucetta, S., Cisse, Y., Mainville, L., Morales, M., Jones, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discharge+profiles+across+the+sleep-waking+cycle+of+identified+cholinergic,+gabaergic,+and+glutamatergic+neurons+in+the+pontomesencephalic+tegmentum+of+the+rat.">Discharge profiles across the sleep-waking cycle of identified cholinergic, gabaergic, and glutamatergic neurons in the pontomesencephalic tegmentum of the rat.</a> J. Neurosci. 34 (13), 4708-4727 (2014).</li><li>Datta, S., Siwek, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+activity+patterns+of+pedunculopontine+tegmentum+neurons+across+the+sleep-wake+cycle+in+the+freely+moving+rats.">Single cell activity patterns of pedunculopontine tegmentum neurons across the sleep-wake cycle in the freely moving rats.</a> J. Neurosci. Res. 70 (4), 79-82 (2002).</li><li>Datta, S., Siwek, D. F., Stack, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+cholinergic+and+non-cholinergic+neurons+in+the+pons+expressing+phosphorylated+cyclic+adenosine+monophosphate+response+element-binding+protein+as+a+function+of+rapid+eye+movement+sleep.">Identification of cholinergic and non-cholinergic neurons in the pons expressing phosphorylated cyclic adenosine monophosphate response element-binding protein as a function of rapid eye movement sleep.</a> Neuroscience. 163 (1), 397-414 (2009).</li><li>Kayama, Y., Ohta, M., Jodo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Firing+of+'possibly'+cholinergic+neurons+in+the+rat+laterodorsal+tegmental+nucleus+during+sleep+and+wakefulness.">Firing of 'possibly' cholinergic neurons in the rat laterodorsal tegmental nucleus during sleep and wakefulness.</a> Brain Res. 569 (2), 210-220 (1992).</li><li>Sakai, K., El Mansari, M., Jouvet, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+by+carbachol+microinjections+of+presumptive+cholinergic+PGO-on+neurons+in+freely+moving+cats.">Inhibition by carbachol microinjections of presumptive cholinergic PGO-on neurons in freely moving cats.</a> Brain Res. 527 (2), 213-223 (1990).</li><li>Lindsley, D. B., Bowden, J. W., Magoun, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+upon+the+EEG+of+acute+injury+to+the+brainstem+activating+system.">Effect upon the EEG of acute injury to the brainstem activating system.</a> Electroenceph. Clin. Neurophysiol. 1 (4), 475-486 (1949).</li><li>Moruzzi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sleep-waking+cycle.">The sleep-waking cycle.</a> Ergeb. Physiol. 64, 1-165 (1972).</li><li>Moruzzi, G., Magoun, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+stem+reticular+formation+and+activation+of+the+EEG.">Brain stem reticular formation and activation of the EEG.</a> Electroenceph. Clin. Neurophysiol. 1 (4), 455-473 (1949).</li><li>Steriade, M., Constantinescu, E., Apostol, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlations+between+alterations+of+the+cortical+transaminase+activity+and+EEG+patterns+of+sleep+and+wakefulness+induced+by+brainstem+transections.">Correlations between alterations of the cortical transaminase activity and EEG patterns of sleep and wakefulness induced by brainstem transections.</a> Brain Res. 13 (1), 177-180 (1969).</li><li>Ishibashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orexin+receptor+activation+generates+gamma+band+input+to+cholinergic+and+serotonergic+arousal+system+neurons+and+drives+an+intrinsic+Ca2++-dependent+resonance+in+LDT+and+PPT+cholinergic+neurons.">Orexin receptor activation generates gamma band input to cholinergic and serotonergic arousal system neurons and drives an intrinsic Ca2+ -dependent resonance in LDT and PPT cholinergic neurons.</a> Frontiers Neurol. 6, e120 (2015).</li><li>Brown, R. E., Winston, S., Basheer, R., Thakkar, M. M., McCarley, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+characterization+of+neurons+in+the+dorsolateral+pontine+REM+sleep+induction+zone+of+the+rat:+intrinsic+membrane+properties+and+responses+to+carbachol+and+orexins.">Electrophysiological characterization of neurons in the dorsolateral pontine REM sleep induction zone of the rat: intrinsic membrane properties and responses to carbachol and orexins.</a> Neuroscience. 143 (3), 739-755 (2006).</li><li>Goetz, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+role+of+the+pedunculopontine+nucleus+and+mesencephalic+reticular+formation+in+locomotion+in+non-human+primates.">On the role of the pedunculopontine nucleus and mesencephalic reticular formation in locomotion in non-human primates.</a> J. Neurosci. 36 (18), 4917-4929 (2016).</li><li>Fraix, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pedunculopontine+nucleus+area+oscillations+during+stance,+stepping+and+freezing+in+Parkinson's+disease.">Pedunculopontine nucleus area oscillations during stance, stepping and freezing in Parkinson's disease.</a> PLOS ONE. 8 (12), e83919 (2013).</li><li>Luster, B., Hyde, J., D'Onofrio, S., Urbano, F. J., Garcia-Rill, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+behind+gamma+band+activity+in+the+pedunculopontine+nucleus+(PPN).">Mechanisms behind gamma band activity in the pedunculopontine nucleus (PPN).</a> Abstr Soc Neurosci. 38, 257.20 (2014).</li><li>Luster, B., D'Onofrio, S., Urbano, F. J., Garcia-Rill, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-threshold+Ca2++channels+behind+gamma+band+activity+in+the+pedunculopontine+nucleus+(PPN).">High-threshold Ca2+ channels behind gamma band activity in the pedunculopontine nucleus (PPN).</a> Physiol. Rep. 3 (6), e12431 (2015).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

PPN nöronlar onları uyanık ya da REM uykusu sırasında değil, yavaş dalga uykusu 2,3,5,13-17 sırasında olan hayvanlardan elde in vivo kayıtları sırasında beta / gama bandı frekanslarında aksiyon potansiyelleri ateş izin içsel özelliklere sahiptir. PPN EEG kayıtları sırasında gama frekansları azaltılmış dışında yazarlar daha ön seviyelerinde olduğu beyin sapı terimleri göstermiştir. Beyin sapı lezyonları bu çekirdek bulunduğu yere posterior Ancak, PPN&#39;nin doğrudan uyarılması EEG 2,3,5,18-21 kortikal gama aktivitesinin tezahürü izin verdi. Gama bant sinirsel aktivite 24 locomoting zaman primatlarda PPN alanında, in vivo 3 kedi, (PPN 23 projeleri hangi) sıçan REM uyku indüksiyon alanında, in vitro 22 fare PPN rapor ve olmuştur 25 adım sırasında insanlarda PPN&#39;nin bölgede. Bu gama bandı etkinliği i için yeterli kanıt yoktur, olduğunun türler arasında PPN. Burada ayrıntılı Bu deneysel protokol, tüm sıçan PPN hücre tipleri 10 mevcut gama salınımlarının açıklamasına izin verdi. tip I, II ve III veya verici: Aslında, iç mekanizmaları altında yatan gama salınımları ne olursa olsun önceki kullanılan sınıflandırmalar veya sinaptik verici Çeşidi (PPN etrafında hücreleri bu özelliği paylaşan yok ederken) her PPN nöron bulunması anlatıldı tipi, kolinerjik, glutamaterjik veya GABAerjik özelliği 10 üreten aynı gama-band paylaşıyoruz. Geçerli rampaları kullanımı deney boyunca istirahat membran potansiyeli sürekli izlenmesi ve kalıcı köprü tazminat gerektiren sınırlama vardır. Rampa süreler 5 saniye ya da daha uzun deney sırasında kompanse kalacak membran direnci değişikliklere neden Bazı durumlarda, 1 saniyeden daha kısa rampalar, tam olarak voltaj geçitli kalsiyum kanalı aktive gözlenmiştir. durumda nRampa süresi o gama salınımları gözlendi, küçük ayarlamalar gama bandı salınım genlikleri artırmak olabilir. Bu PPN hücreleri (~% 50) N- ve P / Q tipi bloke edici önemli bir kısmının bu tarif spesifik toksinlerle akım rampaları depolarize edici birleştiren kanalların kalsiyum kanalları indirgenmiş y salınım (ω-CgTx ve ω-Ağa her ikisini de kullanarak) P / Q- ve N-tipi hücreleri olarak sınıflandırılmış bize izin genlik. diğer hücreler (% 20), gama salınımları sadece bu hücrelerin sadece P / Q tipi kanalları dile düşündüren, ω-Ağa tarafından etkilenmiştir. hücreleri (% 30) sadece geri kalanında co-CgTx bu PPN nöronlar sadece N tipi kanalları vardı düşündüren, onları engelledi. Bu sonuçlar, farklı voltaj bağımlı kalsiyum kanallarının 26,27 ifadesi ile gama bandı salınımlar tezahür PPN hücrelerin varlığını doğruladı. Bu yeni protokol aynı zamanda yeni bir PPN hücre typ giriş izin önemli bir araç olarak kabul edilebiliralanına e sınıflandırılması. Aslında, sadece uyanma sırasında N-tipi sadece PPN nöronlar REM uykusunda ( &quot;REM-on&quot;), P / Q tipi boyunca sadece yangın olduğu öne sürülmüştür ( &quot;Wake-on&quot;), ya da N tipi + U / uyanma ve REM uykusu ( &quot;Wake / REM-on&quot;) 26,27 hem sırasında Q-tipi. Ayrıca, bu protokol diğer beyin bölgelerinde titreşimli aktivite tanımlamak ve bunları tetikleme iç özelliklerini göstermek için, gelecekteki deneylerde kullanılabilir.

PPN çekirdeği anatomik kaudal Mezensefalik tegmentumdaki dahildir. PPN RAS 1 önemli bir bileşenidir. PPN (uyanma, REM uykusu yani) 2 davranışsal aktif devletlerin bakım katılır. Sıçan bilateral PPN lezyonların azalır veya REM uykusunu 4 elimine ederken, kortikal EEG 3 - (40 Hz 20) in vivo PPN&#39;nin elektrik stimülasyonu hızlı salınım kaynaklı. PPN nöronların çoğunluğu beta / gama-bant frekansı aksiyon potansiyelleri ateş ederken (20-80 Hz), bazı nöronlar spontan ateşleme düşük oranlar sundu (&lt;10 Hz) 5. Ayrıca, PPN gibi motivasyon ve dikkat 6 gibi davranış diğer yönleri dahil olmak görünüyor. Doğrudan yüksek frekans (40 - 60 Hz) deserebre hayvanlarda PPN çekirdeğinin 7 elektrik stimülasyonu hareketlilik teşvik edebilir. Son yıllarda, derin beyin stimülasyonu (DBS) PPN&#39;nin sağa sola şikayet eden hastaları tedavi etmek için kullanılır olmuşturParkinson hastalığı (PH) 8 olarak yürüyüş açıkları kapsayan m bozukluklar. Önceki raporlar kare akım darbeleri 9 kullanılarak depolarize zaman neredeyse tüm PPN nöronlar gamma bant frekansı aksiyon potansiyelleri ateş göstermiştir. Çünkü mV kadar veya -25 altında kare bakliyat depolarizasyonlarından sırasında voltaj bağımlı potasyum kanallarının şiddetli aktivasyon. Bunun bir sonucu olarak, herhangi bir güçlü gama salınımlar Tetrodotoksin 10 kullanılarak aksiyon potansiyelleri nesil engelleme sonra gözlenmiştir. Böyle bir sorun atlamak için bir çaba, 1 - uzun cari rampaları depolarizan 2 sn kullanıldı. Kısmen voltaj bağımlı potasyum kanallarını inaktive ederken Rampaları yavaş yavaş, 0 mV kadar değerleri istirahat membran potansiyeli depolarize. Net gama bandı membran salınımlar 10 (-25 mV ve -0 mV arasında, yani) yüksek eşik kalsiyum kanallarının voltaj bağımlılığı penceresi içinde belirgindi. Sonuç olarak, gama bandı olduğu faaliyetlerty PPN nöronlar 9 gözlendi ve her iki P / Q ve N-tipi voltaj bağımlı kalsiyum kanalları PPN 10 gama bant salınımları oluşturmak amacıyla aktive edilmesi gerekir. bir dizi çalışma PPN nöronlarda yüksek eşik kalsiyum kanallarının yerini tespit edilmiştir. Boyaların kombinasyonunu enjekte oranlı metrik floresan görüntüleme geçerli rampalar 11 ile depolarize zaman farklı dendritler aktive edilir voltaj kapılı kalsiyum kanalları aracılığıyla geçici kalsiyum gösterdi. PPN nöronların içsel özellikleri dolayısıyla RAS ve talamokortikal döngüler arasında yüksek frekanslı titreşimli nöronal aktiviteyi uyaran, uyanma ve REM uykusu sırasında bu hücrelerin simultane aktivasyonu izin öne sürülmüştür. Bu tür uzun erimli bir etkileşim güvenilir bir şekilde sürekli olarak 12 etrafımızdaki dünya değerlendirebilecek bir beyin durumunu desteklemek için kabul edilir. Burada, biz denemeyi tarifGerekli al koşulları oluşturmak ve in vitro PPN hücrelerinde gama bandı salınımını korumak için. Bu protokol daha önce tarif edilmemiştir, ve diğer beyin alanlarında gama bandı aktivitesini aracılık içsel membran özelliklerini incelemek için grupların bir dizi yardımcı olacaktır. Ayrıca, mevcut adım y bandı aktivitesi bu hücrelerde üretilen edilemez hatalı sonuca yol açabilir.

<table><tbody><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8501</td><td>C&lt;sub&gt;12&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;22&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;11&lt;/sub&gt;, molecular weight = 342.30</td></tr><tr><td>Sodium Bicarbonate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6014</td><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;, molecular weight = 84.01</td></tr><tr><td>Potassium Chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td>KCl, molecular weight = 74.55</td></tr><tr><td>Magnesium Chloride Hexahydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9272</td><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; &amp;middot; 6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, molecular weight =&amp;nbsp; 203.30</td></tr><tr><td>Calcium Chloride Dihydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3881</td><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; &amp;middot; 2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, molecular weight =147.02</td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5767</td><td>C&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;12&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;, molecular weight = 180.16</td></tr><tr><td>L-Ascorbic Acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5960</td><td>C&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;8&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;, molecular weight =176.12</td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Acros Organics</td><td>327300025</td><td>NaCl, molecular weight =&amp;nbsp; 58.44</td></tr><tr><td>Potassium Gluconate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4500</td><td>C&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;11&lt;/sub&gt;KO&lt;sub&gt;7&lt;/sub&gt;, molecular weight =&amp;nbsp; 234.25</td></tr><tr><td>Phosphocreatine di(tris) salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1937</td><td>C&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;10&lt;/sub&gt;N&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;5&lt;/sub&gt;P &amp;middot; 2C&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;11&lt;/sub&gt;NO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;, molecular weight =&amp;nbsp; 453.38</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td>C&lt;sub&gt;8&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;18&lt;/sub&gt;N&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;S, molecular weight = 238.30</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E0396</td><td>[-CH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;OCH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;CH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;N(CH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;H)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;]&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, molecular weight = 380.40</td></tr><tr><td>Adenosine 5&#039;-triphosphate magnesium salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9187</td><td>&amp;nbsp;C&lt;sub&gt;10&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;16&lt;/sub&gt;N&lt;sub&gt;5&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;13&lt;/sub&gt;P&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; &amp;middot; xMg2+, molecular weight = 507.18</td></tr><tr><td>Guanosine 5&#039;-triphosphate sodium salt hydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8877</td><td>C&lt;sub&gt;10&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;16&lt;/sub&gt;N&lt;sub&gt;5&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;14&lt;/sub&gt;P&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; &amp;middot; xNa+, molecular weight = 523.18</td></tr><tr><td>Tetrodotoxin citrate</td><td>Alomone Labs</td><td>T-550</td><td>C&lt;sub&gt;11&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;17&lt;/sub&gt;N&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;8&lt;/sub&gt;, molecular weight = 319.27</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;DL-2-Amino-5-Phosphonovaleric Acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5282</td><td>&amp;nbsp;C&lt;sub&gt;5&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;12&lt;/sub&gt;NO&lt;sub&gt;5&lt;/sub&gt;P, molecular weight = 197.13</td></tr><tr><td>CNQX disodium salt hydrate&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C239</td><td>C&lt;sub&gt;9&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;N&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; &amp;middot; xH2O, molecular weight = 276.12</td></tr><tr><td>Strychnine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0532</td><td>C&lt;sub&gt;21&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;22&lt;/sub&gt;N&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, molecular weight = 334.41</td></tr><tr><td>Mecamylamine hydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9020</td><td>&amp;nbsp;C&lt;sub&gt;11&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;21&lt;/sub&gt;N &amp;middot; HCl, molecular weight = 203.75</td></tr><tr><td>Gabazine (SR-95531)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S106</td><td>C&lt;sub&gt;15&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;18&lt;/sub&gt;BrN&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;, molecular weight = 368.23</td></tr><tr><td>Ketamine hydrochloride</td><td>Mylan</td><td>67457-001-00</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Nikon</td><td>Eclipse E600FN</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Sutter Instruments</td><td>ROE-200</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Sutter Instruments</td><td>MPC-200</td><td></td></tr><tr><td>Amplifier</td><td>Molecular Devices</td><td>Multiclamp 700B</td><td></td></tr><tr><td>A/D converter</td><td>Molecular Devices</td><td>Digidata 1440A</td><td></td></tr><tr><td>Heater</td><td>Warner Instruments</td><td>TC-324B</td><td></td></tr><tr><td>Pump</td><td>Cole-Parmer</td><td>Masterflex L/S 7519-20</td><td></td></tr><tr><td>Pump cartridge</td><td>Cole-Parmer</td><td>Masterflex 7519-85</td><td></td></tr><tr><td>Pipette puller</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Camera</td><td>Q-Imaging</td><td>RET-200R-F-M-12-C</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica Biosystems</td><td>&amp;nbsp;Leica VT1200 S</td><td></td></tr><tr><td>Refrigeration system</td><td>Vibratome Instruments</td><td>900R</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>microscope</td><td>Nikon</td><td>Eclipse E600FN</td><td></td></tr><tr><td>micromanipulator</td><td>Sutter Instruments</td><td>ROE-200</td><td></td></tr><tr><td>micromanipulator</td><td>Sutter Instruments</td><td>MPC-200</td><td></td></tr><tr><td>amplifier</td><td>Molecular Devices</td><td>Multiclamp 700B</td><td></td></tr><tr><td>A/D converter</td><td>Molecular Devices</td><td>Digidata 1440A</td><td></td></tr><tr><td>heater</td><td>Warner Instruments</td><td>TC-324B</td><td></td></tr><tr><td>pump</td><td>Cole-Parmer</td><td>Masterflex L/S 7519-20</td><td></td></tr><tr><td>pump cartridge</td><td>Cole-Parmer</td><td>Masterflex 7519-85</td><td></td></tr><tr><td>pipette puller</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>camera</td><td>Q-Imaging</td><td>RET-200R-F-M-12-C</td><td></td></tr></tbody></table>

recording gamma band oscillations in pedunculopontine nucleus neurons

(Cı / PG çekirdeği, örneğin, centrolateral / parafascicular) PPN sinaptik efferentler birçok intralaminar talamik bölgelerin nöronal aktivitenin modüle bilinmektedir. PPN veya in vivo Cı / PG çekirdekleri ya aktivasyonu hayvanın uyarılma ve kortikal elektroansefalogram (EEG) gama bandı aktivitesinde bir artış uyarılması için tarif edilmiştir. Retiküler Aktive Sistemde gama bandı salınımları üretimi için hücresel mekanizmalar (RAS) nöronlar diğer beyinleri çekirdeklerde gama bandı salınımlarını oluşturmak için bulunanlarla aynıdır. (9 dan parasagital dilim - 25 gün eski sıçan) PPN nöronlarının akım kelepçe kayıtları sırasında, kare adımlar depolarizan kullanımı hızla -25 mV ötesinde depolarize olmaktan PPN nöronlar engelledi voltaj bağımlı potasyum kanallarını aktive. 1 enjekte - uzun cari rampaları depolarizan 2 sn yavaş yavaş PPN zar potansiyeli res depolarizeting 0 mV doğru değerleri. Ancak, enjekte depolarizan kare bakliyat rampalar tarafından oluşturulan salınımlar kıyasla genlik küçük olması gösterdi membran potansiyelinin gama-bant salınımlar oluşturdu. Bütün deneyler, voltaj bağımlı sodyum kanalı ve hızlı sinaptik reseptörleri bloke edicilerin mevcudiyetinde gerçekleştirilmiştir. Yüksek eşikli gerilime-bağlı kalsiyum kanallarının aktivasyonu PPN nöronlarda y-bant salınımlı aktivitesi altında yatan gösterilmiştir. Spesifik metodolojik ve farmakolojik müdahalelerin neden ve in vitro PPN eşikaltı gama bandı salınımını sürdürmek için gerekli araçları sağlayarak, burada açıklanmıştır.

Başlangıçta, gama salınımlar kare akım darbeleri kullanarak uyarılmış bulundu. Sinaptik bloker ve TTX huzurunda PPN nöronların Güncel kelepçe kayıt sürekli istirahat membran potansiyeli ~ -50 mV (Şekil 1A) istikrarlı tutuldu sağlamak için izlenmiştir. İki saniyelik kare akım darbeleri 200 Pa ila 600 Pa (Şekil 1A) genliği artan kayıt pipet ile yama kelepçe amplifikatör tarafından hücre enjekte edilmiştir. Membran potansiyeli -20 mV yakın gerilim seviyelerine depolarize zaman 600 pA, küçük genlikli gama salınımları ile sonuçlanır. Gama salınımlarının Yetkileri spektrumları çok küçük genlikli değerlerini sundu (yani &lt;0.01; Şekil 1B). Öte yandan, iki adet ikinci depolarizasyon akımı rampalar sağlam y titreşimler üretmek kayıt pipet ile yama kelepçe amplifikatör tarafından hücre enjekte edilmiştirDaha yüksek bir güç amplitüdleri sunulmaktadır (Şekil 2A) (Şekil 2B). Önceki çalışma 10 meydanda arasındaki farkları bağlantılı ve eski ani depolarizasyon sırasında voltaj bağımlı potasyum kanallarının dize aktivasyonuna mevcut protokolleri rampa vardır. Yavaş depolarizan rampaları yerine potasyum kanallarını inaktive olabilir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54685/54685fig1.jpg" /> Tüm hücre Şekil 1. Membran Titreşimler Genlik Artırılması Güncel Meydanı Bakliyat kullanarak PPN Nöronlar kaydedildi. Sinaptik bloker ve TTX varlığında, kayıt pipet aracılığıyla yama kelepçe amplifikatör tarafından hücre enjekte artan genlik 2 sn uzun kare adımlar depolarizan (A) Temsilcisi membran potansiyeli yanıtları. (B) Çakışandepolarizan adımlarla tarafından oluşturulan 60 Hz bant geçiren filtreleme salınımları - A.Gücü spektrumları gösterilen kare darbeleri kullanılarak elde edilen salınımlar için güç spektrumu amplitüdleri 20 sonra Hamming pencere fonksiyonu kullanılarak elde edilmiştir. PPN nöron yüksek K + hücre içi çözüm ve TTX Protokolde tanımlanan sinaptik bloker + birleştirerek akım kelepçe konfigürasyonunda kaydedildi. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54685/54685fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54685/54685fig2.jpg" /> Tüm-hücrede Şekil 2. Gama Band Membran Titreşimler artırmada Genlik Güncel Rampaları kullanarak PPN Nöronlar kaydedildi. Hücre kayıt pipet, gösterisi ile yama kelepçe amplifikatör tarafından enjekte 2 sn uzun rampalar depolarizan (A) Temsilcisi membran potansiyeli yanıtları60 Hz bant geçiren filtreleme salınımlar depolarizan rampa tarafından oluşturulan -. 20 sonra sinaptik bloker ve TTX varlığında genlik artan ing (B) A. Gücü spektrumları gösterilen rampaları kullanılarak elde salınımlar için güç spektrumu genlikleri Çakışan bir Hamming pencere fonksiyonu kullanılarak elde edilmiştir . PPN nöron yüksek K + hücre içi çözüm ve TTX Protokolde tanımlanan sinaptik bloker + birleştirerek akım kelepçe konfigürasyonunda kaydedildi. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54685/54685fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Recording Gamma Band Oscillations in Pedunculopontine Nucleus Neurons at JoVE.com

Recording Gamma Band Oscillations in Pedunculopontine Nucleus Neurons

pedunculopontine çekirdeği (PPN) beyin sapı bulunur ve nöronlar maksimum uyanma ve hızlı göz hareketleri (REM) uykusu beyin devletler sırasında aktive edilir. Bu eser PPN nöronlar in vitro gama bandı eşik altı membran salınım kayıt için deneysel bir yaklaşım anlatılmaktadır.

Pedunculopontine Nucleus Nöronlar Kayıt Gama Bant Salınımlılığı

Synaptic efferents from the PPN are known to modulate the neuronal activity of several intralaminar thalamic regions (e.g., the ...

recording-gamma-band-oscillations-in-pedunculopontine-nucleus-neurons

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.6K Görüntüleme.  University of Buenos Aires.  pedunculopontine çekirdeği (PPN) beyin sapı bulunur ve nöronlar maksimum uyanma ve hızlı göz hareketleri (REM) uykusu beyin devletler sırasında aktive edilir. Bu eser PPN nöronlar in vitro gama bandı eşik altı membran salınım kayıt için deneysel bir yaklaşım anlatılmaktadır. 

Video: Recording Gamma Band Oscillations in Pedunculopontine Nucleus Neurons

Dual Somatic Recordings from Gonadotropin-Releasing Hormone (GnRH) Neurons Identified by Green Fluorescent Protein (GFP) in Hypothalamic Slices

Gonadotropin-Releasing Hormone (GnRH) is a small neuropeptide that regulates pituitary release of luteinizing hormone (LH) and follicle-stimulating hormone (FSH). These gonadotropins are essential for the regulation of reproductive function. The GnRH-containing neurons are distributed diffusely throughout the hypothalamus and project to the median eminence where they release GnRH from their axon terminals into the hypophysiotropic portal system (1). In the portal capillaries, GnRH travels to the anterior pituitary gland to stimulate release of gonadotropins into systemic circulation. GnRH release is not continuous but rather occurs in episodic pulses. It is well established that the intermittent manner of GnRH release is essential for reproduction (2, 3).
Coordination of activity of multiple GnRH neurons probably underlies GnRH pulses. Total peptide content in GnRH neurons is approximately 1.0 pg/cell (4), of which 30% likely comprises the releasable pool. Levels of GnRH during a pulse (5, 6), suggest multiple GnRH neurons are probably involved in neurosecretion. Likewise, single unit activity extracted from hypothalamic multi-unit recordings during LH release indicates changes in activity of multiple neurons (7). The electrodes with recorded activity during LH pulses are associated with either GnRH somata or fibers (8). Therefore, at least some of this activity arises from GnRH neurons.
The mechanisms that result in synchronized firing in hypothalamic GnRH neurons are unknown. Elucidating the mechanisms that coordinate firing in GnRH neurons is a complex problem. First, the GnRH neurons are relatively few in number. In rodents, there are 800-2500 GnRH neurons. It is not clear that all GnRH neurons are involved in episodic GnRH release. Moreover, GnRH neurons are diffusely distributed (1). This has complicated our understanding of coordination of firing and has made many technical approaches intractable. We have optimized loose cell-attached recordings in current-clamp mode for the direct detection of action potentials and developed a recording approach that allows for simultaneous recordings from pairs of GnRH neurons.

Dual Somatic Recordings from Gonadotropin-Releasing Hormone GnRH Neurons Identified by Green Fluorescent Protein GFP in Hypothalamic Slices

Activity in neuronal systems often requires synchronous action potential discharges from neurons within a specific population. For example, pulses of gonadotropin-releasing hormone (GnRH) likely require coordinated activity between GnRH neurons. We present our methodological approach for reliably obtaining simultaneous electrophysiological recordings from the diffusely distributed GnRH neurons.

Çift Somatik Kayıtlar Gonadotropin-Releasing Hipotalamik Dilimleri Yeşil Floresan Protein (GFP) Belirlenmiş Hormon (GnRH) Nöronlar

Gonadotropin-Releasing Hormone (GnRH) is a small neuropeptide that regulates pituitary release of luteinizing hormone (LH) and follicle-stimulating ...

Nörobilim

Manufacturing and Using Piggy-back Multibarrel Electrodes for In vivo Pharmacological Manipulations of Neural Responses

In vivo recordings from single neurons allow an investigator to examine the firing properties of neurons, for example in response to sensory stimuli. Neurons typically receive multiple excitatory and inhibitory afferent and/or efferent inputs that integrate with each other, and the ultimate measured response properties of the neuron are driven by the neural integrations of these inputs. To study information processing in neural systems, it is necessary to understand the various inputs to a neuron or neural system, and the specific properties of these inputs. A powerful and technically relatively simple method to assess the functional role of certain inputs that a given neuron is receiving is to dynamically and reversibly suppress or eliminate these inputs, and measure the changes in the neuron's output caused by this manipulation. This can be accomplished by pharmacologically altering the neuron's immediate environment with piggy-back multibarrel electrodes. These electrodes consist of a single barrel recording electrode and a multibarrel drug electrode that can carry up to 4 different synaptic agonists or antagonists. The pharmacological agents can be applied iontophoretically at desired times during the experiment, allowing for time-controlled delivery and reversible reconfiguration of synaptic inputs. As such, pharmacological manipulation of the microenvironment represents a powerful and unparalleled method to test specific hypotheses about neural circuit function.
Here we describe how piggy-back electrodes are manufactured, and how they are used during in vivo experiments. The piggy-back system allows an investigator to combine a single barrel recording electrode of any arbitrary property (resistance, tip size, shape etc) with a multibarrel drug electrode. This is a major advantage over standard multi-electrodes, where all barrels have more or less similar shapes and properties. Multibarrel electrodes were first introduced over 40 years ago 1-3, and have undergone a number of design improvements 2,3 until the piggy-back type was introduced in the 1980s 4,5. Here we present a set of important improvements in the laboratory production of piggy-back electrodes that allow for deep brain penetration in intact in vivo animal preparations due to a relatively thin electrode shaft that causes minimal damage. Furthermore these electrodes are characterized by low noise recordings, and have low resistance drug barrels for very effective iontophoresis of the desired pharmacological agents.

Manufacturing and Using Piggy-back Multibarrel Electrodes for In vivo Pharmacological Manipulations of Neural Responses

Iontophoresis of neural agonists and antagonists during extracellular in vivo recordings is a powerful way to manipulate a neuron&#x2019;s microenvironment. These manipulations can most easily be done via piggy-back multibarrel electrodes. Here we describe how to manufacture them and use them during auditory recordings.

Için Multibarrel Elektrodları Üretim ve Piggy-back kullanma<em&gt; In vivo</emSinir Cevaplarının&gt; Farmakolojik Çarpıtmalar

In vivo recordings from single neurons allow an investigator to examine the firing properties of neurons, for example in response to sensory stimuli. ...

Generation of Local CA1 &#947; Oscillations by Tetanic Stimulation

Neuronal network oscillations are important features of brain activity in health and disease and can be modulated by a range of clinically used drugs. A protocol is provided to generate a model for studying CA1 &#947; oscillations (20 - 80 Hz). These &#947; oscillations are stable for at least 30 min&#160;and depend upon excitatory and inhibitory synaptic activity in addition to activation of pacemaker currents. Tetanically stimulated oscillations have a number of reproducible and easily quantifiable characteristics including spike count, oscillation duration, latency and frequency that report upon the network state. The advantages of the electrically stimulated oscillations include stability, reproducibility and episodic acquisition enabling robust characterization of network function. This model of CA1 &#947; oscillations can be used to study cellular mechanisms and to systematically investigate how neuronal network activity is altered in disease and by drugs. Disease state pharmacology can be readily incorporated by the use of brain slices from genetically modified or interventional animal models to enable selection of drugs that specifically target disease mechanisms.

Oscillations are fundamental network properties and are modulated by disease and drugs. Studying brain-slice oscillations allows characterization of isolated networks under controlled conditions. Protocols are provided for the preparation of acute brain slices for evoking CA1 &#947; oscillations.

Tetanik Uyarım tarafından Yerel CA1 γ Titreşim Üretimi

Neuronal network oscillations are important features of brain activity in health and disease and can be modulated by a range of clinically used drugs. A ...

Tuning in the Hippocampal Theta Band In Vitro: Methodologies for Recording from the Isolated Rodent Septohippocampal Circuit

This protocol outlines the procedures for preparing and recording from the isolated whole hippocampus, of WT and transgenic mice, along with recent improvements in methodologies and applications for the study of theta oscillations. A simple characterization of the isolated hippocampal preparation is presented whereby the relationship between internal hippocampal theta oscillators is examined together with the activity of pyramidal cells, and GABAergic interneurons, of the cornu ammonis-1 (CA1) and subiculum (SUB) areas. Overall, we show that the isolated hippocampus is capable of generating intrinsic theta oscillations in vitro and that rhythmicity generated within the hippocampus can be precisely manipulated by optogenetic stimulation of parvalbumin-positive (PV) interneurons. The in vitro isolated hippocampal preparation offers a unique opportunity to use simultaneous field and intracellular patch-clamp recordings from visually-identified neurons to better understand the mechanisms underlying theta rhythm generation.

Tuning in the Hippocampal Theta Band In Vitro: Methodologies for Recording from the Isolated Rodent Septohippocampal Circuit

Here, we present a protocol for recording rhythmic neuronal network theta and gamma oscillations from an isolated whole hippocampal preparation. We describe the experimental steps from extraction of the hippocampus to details of field, unitary and whole-cell patch clamp recordings as well as optogenetic pacing of the theta rhythm.

Hipokampal Theta Bandında Tuning<em&gt; In vitro</em&gt;: İzole edilmiş Kemirgen Protokokal Circüse Kayıt için Metodolojiler

This protocol outlines the procedures for preparing and recording from the isolated whole hippocampus, of WT and transgenic mice, along with recent ...

Acute In Vivo Electrophysiological Recordings of Local Field Potentials and Multi-unit Activity from the Hyperdirect Pathway in Anesthetized Rats

Converging evidence shows that many neuropsychiatric diseases should be understood as disorders of large-scale neuronal networks. To better understand the pathophysiological basis of these diseases, it is necessary to precisely characterize in which way the processing of information is disturbed between the different neuronal parts of the circuit. Using extracellular in vivo electrophysiological recordings, it is possible to accurately delineate neuronal activity within a neuronal network. The application of this method has several advantages over alternative techniques, e.g., functional magnetic resonance imaging and calcium imaging, as it allows a unique temporal and spatial resolution and does not rely on genetically engineered organisms. However, the use of extracellular in vivo recordings is limited since it is an invasive technique that cannot be universally applied. In this article, a simple and easy to use method is presented with which it is possible to simultaneously record extracellular potentials such as local field potentials and multiunit activity at multiple sites of a network. It is detailed how a precise targeting of subcortical nuclei can be achieved using a combination of stereotactic surgery and online analysis of multi-unit recordings. Thus, it is demonstrated, how a complete network such as the hyperdirect cortico-basal ganglia loop can be studied in anesthetized animals in vivo.

Acute In Vivo Electrophysiological Recordings of Local Field Potentials and Multi-unit Activity from the Hyperdirect Pathway in Anesthetized Rats

In this study, the methodology is presented on how to perform multi-site in vivo electrophysiological recordings from the hyperdirect pathway under urethane anesthesia.

Akut<emIn vivo</em&gt; Anestezi Uygulanan Sıçanlarda Hiperdirect Pathway&#39;den Lokal Alan Potansiyellerinin Elektrofizyolojik Kayıtları ve Çoklu Ünite Aktivitesi

Converging evidence shows that many neuropsychiatric diseases should be understood as disorders of large-scale neuronal networks. To better understand the ...

Optogenetic Entrainment of Hippocampal Theta Oscillations in Behaving Mice

Extensive data on relationships of neural network oscillations to behavior and organization of neuronal discharge across brain regions call for new tools to selectively manipulate brain rhythms. Here we describe an approach combining projection-specific optogenetics with extracellular electrophysiology for high-fidelity control of hippocampal theta oscillations (5-10 Hz) in behaving mice. The specificity of the optogenetic entrainment is achieved by targeting channelrhodopsin-2 (ChR2) to the GABAergic population of medial septal cells, crucially involved in the generation of hippocampal theta oscillations, and a local synchronized activation of a subset of inhibitory septal afferents in the hippocampus. The efficacy of the optogenetic rhythm control is verified by a simultaneous monitoring of the local field potential (LFP) across lamina of the CA1 area and/or of neuronal discharge. Using this readily implementable preparation we show efficacy of various optogenetic stimulation protocols for induction of theta oscillations and for the manipulation of their frequency and regularity. Finally, a combination of the theta rhythm control with projection-specific inhibition addresses the readout of particular aspects of the hippocampal synchronization by efferent regions.

We describe the use of optogenetics and electrophysiological recordings for selective manipulations of hippocampal theta oscillations (5-10 Hz) in behaving mice. The efficacy of the rhythm entrainment is monitored using local field potential. A combination of opto- and pharmacogenetic inhibition addresses the efferent readout of hippocampal synchronization.

Hipokampal teta salınımlarını fareler davranışlar içinde Optogenetic sürüklenme

Extensive data on relationships of neural network oscillations to behavior and organization of neuronal discharge across brain regions call for new tools ...

Recording Spatially Restricted Oscillations in the Hippocampus of Behaving Mice

The local field potential (LFP) emerges from ion movements across neural membranes. Since the voltage recorded by LFP electrodes reflects the summed electrical field of a large volume of brain tissue, extracting information about local activity is challenging. Studying neuronal microcircuits, however, requires a reliable distinction between truly local events and volume-conducted signals originating in distant brain areas. Current source density (CSD) analysis offers a solution for this problem by providing information about current sinks and sources in the vicinity of the electrodes. In brain areas with laminar cytoarchitecture such as the hippocampus, one-dimensional CSD can be obtained by estimating the second spatial derivative of the LFP. Here, we describe a method to record multilaminar LFPs using linear silicon probes implanted into the dorsal hippocampus. CSD traces are computed along individual shanks of the probe. This protocol thus describes a procedure to resolve spatially restricted neuronal network oscillations in the hippocampus of freely moving mice.

This protocol describes the recording of local field potentials with multi-shank linear silicon probes. Conversion of the signals using current source density analysis allows the reconstruction of local electrical activity in the mouse hippocampus. With this technique, spatially restricted brain oscillations can be studied in freely moving mice.

Dağınık şekilde kayıt sınırlı salınım oluşur içinde fareler davranmak

The local field potential (LFP) emerges from ion movements across neural membranes. Since the voltage recorded by LFP electrodes reflects the summed ...

Photodiode-Based Optical Imaging for Recording Network Dynamics with Single-Neuron Resolution in Non-Transgenic Invertebrates

The development of transgenic invertebrate preparations in which the activity of specifiable sets of neurons can be recorded and manipulated with light represents a revolutionary advance for studies of the neural basis of behavior. However, a downside of this development is its tendency to focus investigators on a very small number of &#8220;designer&#8221; organisms (e.g., C. elegans and Drosophila), potentially negatively impacting the pursuit of comparative studies across many species, which is needed for identifying general principles of network function. The present article illustrates how optical recording with voltage-sensitive dyes in the brains of non-transgenic gastropod species can be used to rapidly (i.e., within the time course of single experiments) reveal features of the functional organization of their neural networks with single-cell resolution. We outline in detail the dissection, staining, and recording methods used by our laboratory to obtain action potential traces from dozens to ~150 neurons during behaviorally relevant motor programs in the CNS of multiple gastropod species, including one new to neuroscience &#8211; the nudibranch Berghia stephanieae. Imaging is performed with absorbance voltage-sensitive dyes and a 464-element photodiode array that samples at 1,600 frames/second, fast enough to capture all action potentials generated by the recorded neurons. Multiple several-minute recordings can be obtained per preparation with little to no signal bleaching or phototoxicity. The raw optical data collected through the methods described can subsequently be analyzed through a variety of illustrated methods. Our optical recording approach can be readily used to probe network activity in a variety of non-transgenic species, making it well suited for comparative studies of how brains generate behavior.

This protocol presents a method for imaging neuronal population activity with single-cell resolution in non-transgenic invertebrate species using absorbance voltage-sensitive dyes and a photodiode array. This approach enables a rapid workflow, wherein imaging and analysis can be pursued over the course of a single day.

Transgenik Olmayan Omurgasızlarda Tek Nöron Çözünürlüğü ile Ağ Dinamiklerini Kaydetmek için Fotodiyot Tabanlı Optik Görüntüleme

The development of transgenic invertebrate preparations in which the activity of specifiable sets of neurons can be recorded and manipulated with light ...

Biyoloji

Recording Gamma Band Oscillations From Pedunculopontine Nucleus Neurons in a Brain Slice

Source: Urbano, F. J., et al. <a href="https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/54685">Recording Gamma Band Oscillations in Pedunculopontine Nucleus Neurons.</a> J. Vis. Exp. (2016).
The video demonstrates the method to record gamma-band oscillations in PPN neurons. Using a sagittal brain section with synaptic blockers in aCSF, it employs positive current pulses via a patch pipette to open calcium channels, inducing crucial subthreshold activity for wakefulness.

Bir beyin diliminde pedunkülopontin çekirdek nöronlarından gama bandı salınımlarının kaydedilmesi

All procedures involving animal models have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review board.
1. ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neurophysiology

Electrophysiology Techniques

In Vivo Electrophysiological Recordings of Brain Activities from Multiple Sites in Rats

Source: Haumesser, J. K., et al. <a href="https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/55940">Acute In Vivo Electrophysiological Recordings of Local Field Potentials and Multi-unit Activity from the Hyperdirect Pathway in Anesthetized Rats.</a> J. Vis. Exp.(2017).
This video demonstrates the detailed procedure for preparing an anesthetized rat for electrophysiological recordings of brain activity from multiple sites. The scalp is dissected to access the skull, and holes are drilled at precise locations to install and secure electrodes. Tungsten microwire electrodes are then inserted into the targeted location to record the data.

Pedunculopontine Nucleus Nöronlar Kayıt Gama Bant Salınımlılığı

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Çift Somatik Kayıtlar Gonadotropin-Releasing Hipotalamik Dilimleri Yeşil Floresan Protein (GFP) Belirlenmiş Hormon (GnRH) Nöronlar

Için Multibarrel Elektrodları Üretim ve Piggy-back kullanma

Tetanik Uyarım tarafından Yerel CA1 γ Titreşim Üretimi

Hipokampal Theta Bandında Tuning

Akut

Hipokampal teta salınımlarını fareler davranışlar içinde Optogenetic sürüklenme

Dağınık şekilde kayıt sınırlı salınım oluşur içinde fareler davranmak

Transgenik Olmayan Omurgasızlarda Tek Nöron Çözünürlüğü ile Ağ Dinamiklerini Kaydetmek için Fotodiyot Tabanlı Optik Görüntüleme

Bir beyin diliminde pedunkülopontin çekirdek nöronlarından gama bandı salınımlarının kaydedilmesi

Sıçanlarda Birden Fazla Bölgeden Beyin Aktivitelerinin İn Vivo Elektrofizyolojik Kayıtları