Bu çalışma NIH GM62999, NIH EB007268, NIH AG15820, B &amp; B Seed Grant tarafından finanse edildi ve NI, FR, BB bursundan CM, CDT bursuna RG&#39;ye bir Yardım Masası ek yardımı ile finanse edildi.

1. Slayt Hazırlama <ol><li> 6 cm&#39;lik hücre kültürü kaplarında 22 mm x 40 mm&#39;lik cam mikroskop lamı koyun, tabağa 1 slayt yerleştirin. </li><li> Steril bir kaputta sterilize etmek için her slaydın her yanını ve 6 cm çanağı ultraviyole (UV) ışığa 15-20 dakika maruz bırakın. </li><li> Parafilm ile içinde slaytlar bulunan bulguları kapatın ve kullanıma hazır olana kadar 4 ° C&#39;de saklayın. </li></ol> 2. Medyanın Hazırlanması, Tamponlar, Çözümler ve Reaktifler <ol><li> Deiyonize suda 1 L Hank dengelenmiş tuz çözeltisi (HBSS) hazırlayın ve 10 mM HEPES, 5 mM NaHCO 3 ve 1 mM EGTA ekleyin. NaOH ile pH 7.2-7.3&#39;e ayarlayın. Otoklavlanmış bir şişeye 0.22 μm&#39;lik bir filtre ile tampon filtre edin. </li><li> Deiyonize suda 900 mL yüksek glikoz Dulbecco Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) hazırlayın. 44 mM NaHC03 ilave edin ve pH&#39;ı HC1 ile 7.2-7.3&#39;e ayarlayın. Medyayı 0,22 μm&#39;lik bir filtre ile otoklavlanmış bir şişeye süzün. 100 mL fetal boviNe serum (FBS) ortamına% 10 FBS konsantrasyonu yapmak için. 4 ° C&#39;de saklayın. </li><li> Deiyonize suda 1 L intraselüler tampon (125 mM KCI, 25 mM NaCl, 10 mM HEPES, 0.2 mM CaCl2, 0.5 mM EGTA, 0.2 mM MgCl2) hazırlayın ve pH&#39;ı 7.25&#39;e ayarlayın. Son [Ca 2+ ] ~ 100 nM olacaktır. Kullanmadan önce 0.5 mM ATP ekleyin. Oda sıcaklığında saklayın. </li><li> Deiyonize suda 1 L Ringer tamponu (121 mM NaCl, 2.4 mM K2HPO4, 0.4 mM KH2PO4, 10 mM HEPES ve 1.2 mM MgCl2) hazırlayın ve pH&#39;ı 7.2&#39;ye ayarlayın. Oda sıcaklığında saklayın. Kullanmak için, 50 mL&#39;lik bir alikot 50 mL tüp içine yerleştirin ve 1.8 mM Ca 2+ ve 10 mM glikoz ekleyin. </li><li> Deiyonize suda 1 L KCl durulama solüsyonu (125 mM KCI, 25 mM NaCl, 10 mM HEPES, 0.2 mM MgCl2) hazırlayın ve pH&#39;ı 7.25&#39;e ayarlayın. </li><li> 5 mg iyonomisin 1 mL dimetil sülfoksid (DMSO) içinde eritilir. Mikrotüpler içine 30 uL&#39;lik kısım ayırın ve -20&#39;de saklayın6 ° C. </li><li> CPA&#39;yı DMSO&#39;ya eriterek siklopiazonik asit (CPA) stokunu hazırlayın. Apoptozu önlemek için hücrelere eklenen CPA için DMSO&#39;nun son yüzdesinin ≤% 1 olduğundan emin olun. Filtrelenmiş H20 içine eritilerek ve bir gece boyunca 37 ° C&#39;de çalkalanarak bırakılarak 20 mM 4-kloro-m-kresol (4 cmc) hazırlayın. Filtrelenmiş H20 içerisinde 100 mM&#39;ye eriterek ATP stokunu hazırlayın. </li><li> İn situ Kd&#39;yi belirlemek için , 100 uL&#39;lik bir KCl tamponu içinde 15 mM&#39;lik 1 mM EGTA, 0.2 mM, 0.6 mM, 2 mM, 5 mM, 10 mM, 20 mM, 50 mM ve 100 mM Ca2 + MM EGTA stok ve deiyonize su içerisinde çözündürülmüş bir 1 M CaCl 2 stokunu içermektedir. </li></ol> 3. Hücre Kültürü <ol><li> Kültür C2C12 miyoblast ve HEK293 hücreleri, steril bir UV kaputunda her biri 10 cm&#39;lik hücre kültürü kapları kullanan ATCC protokollerine göre. NOT: C2C12 hücrelerinin ~ 70% konfluansa oranla daha fazla büyümesine izin verilmemelidir, çünkü miyoblastlar farklılaşmaya başlarMiyotüpler içine te. Hem HEK293 hem de C2C12 hücreleri kolayca büyür ve hücre bütünlüğünü korumak için% 100 konfluenasyondan sonra büyümesine izin verilmemelidir. Buna ek olarak, hücrelerin sağlığını korumak için bir denemede kullanmadan önce hücreler, 10 kereden fazla pasajlanmamalıdır. </li></ol> 4. HEK293 Hücrelerinin Transfeksiyon Edilmesi <ol><li> Tohumlanmış HEK293 hücreleri 6 cm&#39;lik tabaklardaki sterilize edilmiş 22 mm x 40 mm cam mikroskop lamı üzerine yerleştirilir, böylece transfeksiyon gününde ~% 70 konfluent olurlar. </li><li> Ertesi gün, indirgenmiş serum ortamında ( örn. Opti-MEM) 2 μg Catcher + cDNA ve 1: 3 (ağırlık / hacim) DNA: transfeksiyon reaktif oranı kullanarak transfekte reaktifinin üreticinin protokolünü takip edin. </li><li> DMEM ortamını çanaktan boşaltın ve 3 mL düşürülmüş serum ortamı ekleyin. DNA ekleyin: transfeksiyon reaktif karışımı çanak ve 4-6 saat 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> İnkübasyondan sonra hücreleri 5-6 mL HBSS ile yıkayın. HBSS&#39;yi atın fÇanak ve yerine 3 ml taze DMEM ile değiştirin ve GECI ekspresyonuna izin vermek için 48 saat boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> C2C12 miyoblast hücrelerinin transfeksiyonu <ol><li> C2C12 miyoblast hücreleri için, çanak (1-2 mL) altını örtecek kadar tripsin ekleyerek hücreleri tripsinleştirin. Tripsinin tabağın altındaki hücrelerin gevşetilmesine izin vermek için 2-6 dakika 37 ° C inkübatörde çanağı yerleştirin. </li><li> Kuluçka tamamlandıktan sonra tripsin çıkarın ve hücreleri 8 mL DMEM içinde aspire edin. DMEM ile hücreleri iyice pipetleyin ve te hücrelerini tekrar süspanse edin ve yeniden süspanse edin ve 3 cm&#39;lik DMEM içeren 6 cm&#39;lik hücre kültürü kaplarında steril lamellerin üzerine tohumlayın böylece böylece nihai konfluenasyon% 60 olacaktır. </li><li> Adım 4.2-4.3&#39;te özetlendiği gibi hücreleri aynı güne nakledin. 24 saat boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Adım 4.4&#39;ü tekrarlayın. </li></ol></li></ol> 5. Slayt ve Floresan Mikroskop Hazırlama <ol><li> M açınMikroskop ve ışık kaynağına bağlayın, ardından Basit PCI programını açın. Mikroskopun 15-20 dakika boyunca veya şarj kuplajlı cihaz (CCD) kamerası -65 ° C&#39;ye soğuyana kadar ısınmasına izin verin. Odayı hazırlayın ve beklerken hücrelerle birlikte sürün. </li><li> Düşük profilli açık elmas banyosu görüntüleme bölmesinin tabanını, pamuklu çubukla ince bir tabaka yapıştırın. </li><li> İnkübatörden transfekte edilmiş hücreler içeren slayt alın ve 1 mL Ringer tamponu ile 10 mM glikoz ve 1.8 mM Ca 2+ 37 ° C&#39;de önceden ısıtılmış üç kez yavaşça durulayın. </li><li> Hücrelerin kurumasını önlemek için 1 mL Ringer tamponunu çanakta bırakın ve çanağın dışına çıkarmak için forseps kullanın. Aşırı solüsyonun bir laboratuar dokusunda slaytun kenarına dokunarak bir laboratuar dokusunda emilmesine izin verin. Ardından, gres içeren bölmenin yanındaki hücrelerin yağa doğru bakmasını sağlayın ve bir tornavida kullanarak sahne montajına sabitleyin. </li><li> 1 ekleML Ringer tamponu hücrenin sahne üzerine monte edilmesi ve mikroskop kurulumunun geri kalan kısmının tamamlanması sırasında kurutulmasını önlemek için hazneye gelmektedir. Vakum emme hortumu hazneye tutturulduktan sonra hazneyi tutan nihai hacim ~ 450 mcL&#39;dir. </li><li> 40X yağ daldırma objektif mikroskop objektif geçin. </li><li> Amacı temizlemek ve kurutmak için lens kağıdı ve lens temizleme solüsyonunu kullanın. Amacı ovmayın. Yüzey temiz olana kadar yavaşça dikkatle dokundurun. </li><li> Amaçya daldırma yağının bir damla ekleyin. </li><li> Mount mikroskop sahneye yerleştirin ve odasına vakum ucu ekleyin. Vakum emme hortumu hazneye tutturulduktan ve açıldığında, hazneyi tutan nihai hacim ~ 450 mcL&#39;dir. Bu nihai hacim, odanın kenarlarıyla aynı seviyededir. Deney sırasında, aşırı doldurma nedeniyle çözeltinin objektifin içine dökülmesini önlemek için oda çözeltisinin düz olması zorunludur. </li><lI&gt; Nesneyi yükseltin ve objektifteki yağ yansıtılıncaya kadar kaba ayarı kullanın. </li><li> Parlak alan modunu kullanarak kazançları 175&#39;e, pozlama süresini hücreleri odaklamak için 0,03 saniyeye ayarlayın. </li><li> Hücreler odaklandığında, 488 nm uyarılmayı kullanarak floresans moduna geçin. Pozlama süresini 0,07 saniyeye değiştirin. Görüntü için yeterli flüoresan ile sağlıklı olan yeterli hücrelere sahip bir görüş alanını bulun. </li><li> Bir görüş alanı seçildikten sonra, flüoresan ve parlak alan modunda fotoğraf çekin. </li><li> Hücrelerde bir ilgi alanını (ROI) daire içine yerleştirin veya seçilen bölgedeki yoğunluğu kaydetmek için tüm hücrenin etrafını sarın. </li></ol> 6. İlaca bağlı Ca 2+ Geçici ve Yerinde K d Kalibrasyonunun Görüntülenmesi <ol><li> Her 5 saniyede bir ayarlanan kare hızıyla yoğunluk ölçümünü başlatın. </li><li> Baz yoğunluğunun 20-30 çerçeve (100-150 s) boyunca sabit kalmasına izin verin. Gerekirse fr azaltınAmes / s, bu aşamada fotokopelliğin önlenmesi için. </li><li> 200 uM&#39;lik bir nihai konsantrasyon sağlamak için ~ 450 mcL&#39;lik son bölme hacmine dayanan 20 mM&#39;lik bir stoktan gerekli 4 cmc&#39;lik miktarı hesaplayın. Stokların dilüsyonlarını gerektiği gibi yapın. </li><li> Dikkatle bölmeden 60 μL Ringer tamponunu alın ve bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin. Hesaplanan miktarı 4 cmc&#39;ye bu çözeltiyle seyreltin ve görüntülenecek hücrelerden istenen tepkiyi uyandırmak için bölmeye geri ekleyin. </li><li> Hesaplanan miktarı 4 cmc&#39;lik mikrosantrifüj tüpüne ilave edin ve pipetleme ile karıştırın. </li><li> Eşzamanlı olarak yoğunluk ölçüsünde etkinlik işaretleyicisini eklerken, görüş alanına solüsyonu hafifçe ekleyin. </li><li> İlaç reseptöre bağlanma ve ardından sinyal azalması için zaman tanıyın, ardından etkinlik işaretleyicisini eklerken 1.8 mM Ca 2+ ve 10 mM glikoz ile 3-6 mL Ringer tamponu ile yıkayın. Oda hacmi 450 &amp;# 181; L ve bir vakuma bağlı, 3-6 mL tampon eklenerek ilacın bulunduğu eski solüsyonun yıkanması ve yerine yeni eklenen solüsyon ile değiştirilmesi sağlanır. </li><li> Her tahlil için transfekte edilmiş hücrelerin yeni bir slaydı kullanılarak 100 uM ATP ve 15 uM CPA için 6.1-6.7 tekrarlayın. </li><li> Ölçüm tamamlandıktan sonra yoğunluk ölçüm penceresindeki Veri toplama işlemini Basit PCI programında sonlandırın. </li><li> Hücrelerin floresan ve parlak görüntülerini alın. </li><li> Deney için veri dosyasını açın. Burada, gerekirse yoğunluk değerlerini yeniden hesaplamak için ilgili hücreleri veya bölgeleri tekrar daire haline getirin. </li><li> C2C12 miyoblast hücrelerinde in situ K d&#39; yi belirlemek için, bölüm 4.2 ve bölüm 5&#39;de özetlendiği gibi protokolü uygulayın ve bölmede 1 mL, 0 mM Ca 2+ Ringer tamponu koyun. <ol><li> Hücreleri, hücre içi tamponda 0.002-0.005% saponin ile 15-30 saniye boyunca Permeabilize ederek herhangi birinin hücrelerini boşaltın.Catcher + sitosolda olabilir. Hücreleri, 10 uM ionomisin ile KCl tamponu içinde 3-6 mL 1 mL EGTA ile yıkayın. Bir platoya erişinceye kadar yoğunluğun düşmesine izin verin. </li><li> 10 uM ionomisin ile 3-6 mL KCl tamponu ile durulayın ve yoğunluğun dengelenmesine izin verin, ardından adım 2.7&#39;de detaylandırılan her Ca 2+ solüsyonunu ekleyin. Her ilavenin yoğunluğunun bir platoya erişmesine izin verin. </li></ol></li><li> Algılayıcıyı bazal [Ca 2+ ] ölçümü için kalibre etmek için adım 6.12&#39;yi izleyin. Minimum ve maksimum floresans yoğunluğunu elde etmek için adım 2.7&#39;deki EGTA ve 100 mM Ca 2+ tamponunu kullanın. </li></ol> 7. Veri İşleme <ol><li> Yoğunluk ölçüm verilerinin elektronik tablo dosyasını indirin. </li><li> Her bir hücre için verileri taban çizgisi yoğunluğuna (F / F 0 ) göre normalleştirin. Herhangi bir grafik programında zamana karşı normalleştirilmiş verileri çizin. </li><li> % Değişimini hesaplamak için, normalleştirilmiş tepe değerini çıkarınUe&#39;dan 1&#39;e çarpın ve 100 ile çarpın. Birden fazla hücre görüntülendiğinde ortalama ve standart sapmayı hesaplayın. </li><li> SNR sinyalini hesaplamak için, deneyden kaydedilen görüntü dosyasını ImageJ gibi bir görüntü işleme yazılımında açın ve sinyali, transfekte hücreleri ve gürültüyü, arka planı ölçün. SNR = sinyal / gürültü denklemini kullanarak SNR&#39;yi hesaplayın. </li><li> Toplanan floresans görüntüleme verilerinden in situ Kd&#39;yi hesaplamak için, her Ca2 + konsantrasyonunun ve EGTA&#39;nın (0 mM Ca2 + ) ilavesinden sonra yaylaları içeren yoğunluk verisinin ortalamasını alın. Θ, göreli yoğunluk, F, herhangi bir noktadaki flüoresan, F min minimum floresan yoğunluğu olduğu durumda, θ = (F - F min ) / (F max - F min ) kullanılarak kesirli doygunluğun (göreli yoğunluk) hesaplanması ve Fmax, t yoğunluğundaki değişimi görmek için maksimum floresans yoğunluğudurMinimum yoğunluğa kıyasla Ca 2+ ilavesi ile sondaj yapar. Herhangi bir grafik ve eğri uydurma programında [Ca 2+ ] karşı göreli yoğunluk verilerini çizin. K d hesaplamak için herhangi bir grafikleme ve eğri uydurma programı için tercüme edilmiş 1: 1 bağlanma denklemi θ = [M T ] / (K d + [M T ]) kullanın. M T toplam metal konsantrasyonudur. </li><li> 6.13&#39;te özetlenen kalibrasyondan alınan bazal kalsiyumun miktarını belirlemek için, 1 mM EGTA (Fmin) ve 100 mM Ca2 + (Fmaks) ilavesinden sonra yaylaları içeren yoğunluk verilerini ortalaması alın. Bazal kalsiyum hesaplamak için kalibrasyon denklemi [Ca 2+ ] = K d ([F - F min ) / (F max - F)] kullanın. </li></ol>

<ol>
	<li>Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+versatility+and+universality+of+calcium+signalling.">The versatility and universality of calcium signalling.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1 (1), 11-21 (2000).</li><li>Berridge, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signalling+remodelling+and+disease.">Calcium signalling remodelling and disease.</a> Biochem. Soc. Trans. 40, 297-309 (2012).</li><li>Tang, S., Reddish, F., Zhuo, Y., Yang, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+kinetics+of+calcium+signaling+and+sensor.">Fast kinetics of calcium signaling and sensor.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 27, 90-97 (2015).</li><li>Rizzuto, R., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microdomains+of+intracellular+Ca2+:+Molecular+determinants+and+functional+consequences.">Microdomains of intracellular Ca2+: Molecular determinants and functional consequences.</a> Physiol. Rev. 86 (1), 369-408 (2006).</li><li>Berridge, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endoplasmic+reticulum:+a+multifunctional+signaling+organelle.">The endoplasmic reticulum: a multifunctional signaling organelle.</a> Cell Calcium. 32 (5-6), 235-249 (2002).</li><li>Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+Signaling.">Calcium Signaling.</a> Cell. 131 (6), 1047-1058 (2007).</li><li>HerrmannFrank, A., Richter, M., Sarkozi, S., Mohr, U., LehmannHorn, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4-chloro-m-cresol,+a+potent+and+specific+activator+of+the+skeletal+muscle+ryanodine+receptor.">4-chloro-m-cresol, a potent and specific activator of the skeletal muscle ryanodine receptor.</a> Biochimica Et Biophysica Acta-General Subjects. 1289 (1), 31-40 (1996).</li><li>Ferris, C. D., Huganir, R. L., Bredt, D. S., Cameron, A. M., Snyder, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inositol+trisphosphate+receptor:+phosphorylation+by+protein+kinase+C+and+calcium+calmodulin-dependent+protein+kinases+in+reconstituted+lipid+vesicles.">Inositol trisphosphate receptor: phosphorylation by protein kinase C and calcium calmodulin-dependent protein kinases in reconstituted lipid vesicles.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 88 (6), 2232-2235 (1991).</li><li>Dubyak, G. R., el-Moatassim, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+transduction+via+P2-purinergic+receptors+for+extracellular+ATP+and+other+nucleotides.">Signal transduction via P2-purinergic receptors for extracellular ATP and other nucleotides.</a> Am. J. Physiol., Cell Physiol. 265 (3 Pt 1), C577-C606 (1993).</li><li>Song, Z., Vijayaraghavan, S., Sladek, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP+increases+intracellular+calcium+in+supraoptic+neurons+by+activation+of+both+P2X+and+P2Y+purinergic+receptors.">ATP increases intracellular calcium in supraoptic neurons by activation of both P2X and P2Y purinergic receptors.</a> Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 292 (1), R423-R431 (2007).</li><li>Brini, M., Carafoli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+Pumps+in+Health+and+Disease.">Calcium Pumps in Health and Disease.</a> Physiol. Rev. 89 (4), 1341-1378 (2009).</li><li>Michelangeli, F., East, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+diversity+of+SERCA+Ca2++pump+inhibitors.">A diversity of SERCA Ca2+ pump inhibitors.</a> Biochem. Soc. Trans. 39 (3), 789-797 (2011).</li><li>Hofer, A. M., Landolfi, B., Debellis, L., Pozzan, T., Free Curci, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++dynamics+measured+in+agonist-sensitive+stores+of+single+living+intact+cells:+a+new+look+at+the+refilling+process.">Ca2+ dynamics measured in agonist-sensitive stores of single living intact cells: a new look at the refilling process.</a> Embo J. 17 (7), 1986-1995 (1998).</li><li>Hofer, A. M., Machen, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technique+For+InSitu+Measurement+of+Calcium+in+Intracellular+Inositol+1,4,5-Trisphosphate-Sensitive+Stores+Using+The+Fluorescent+Indicator+Mag-Fura-2.">Technique For InSitu Measurement of Calcium in Intracellular Inositol 1,4,5-Trisphosphate-Sensitive Stores Using The Fluorescent Indicator Mag-Fura-2.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90 (7), 2598-2602 (1993).</li><li>Raju, B., Murphy, E., Levy, L. A., Hall, R. D., London, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorescent+indicator+for+measuring+cytosolic+free+magnesium.">A fluorescent indicator for measuring cytosolic free magnesium.</a> Am J Physiol. 256, (1989).</li><li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+green+fluorescent+protein.">The green fluorescent protein.</a> Annu. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).</li><li>Miyawaki, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+indicators+for+Ca2++based+on+green+fluorescent+proteins+and+calmodulin.">Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin.</a> Nature. 388 (6645), 882-887 (1997).</li><li>Palmer, A. E., Jin, C., Reed, J. C., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bcl-2-mediated+alterations+in+endoplasmic+reticulum+Ca2++analyzed+with+an+improved+genetically+encoded+fluorescent+sensor.">Bcl-2-mediated alterations in endoplasmic reticulum Ca2+ analyzed with an improved genetically encoded fluorescent sensor.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101 (50), 17404-17409 (2004).</li><li>Heim, N., Griesbeck, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+Encoded+Indicators+of+Cellular+Calcium+Dynamics+Based+on+Troponin+C+and+Green+Fluorescent+Protein.">Genetically Encoded Indicators of Cellular Calcium Dynamics Based on Troponin C and Green Fluorescent Protein.</a> J. Biol. Chem. 279 (14), 14280-14286 (2004).</li><li>Mank, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+FRET-based+calcium+biosensor+with+fast+signal+kinetics+and+high+fluorescence+change.">A FRET-based calcium biosensor with fast signal kinetics and high fluorescence change.</a> Biophys. J. 90 (5), 1790-1796 (2006).</li><li>Garaschuk, O., Griesbeck, O., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Troponin+C-based+biosensors:+A+new+family+of+genetically+encoded+indicators+for+in+vivo+calcium+imaging+in+the+nervous+system.">Troponin C-based biosensors: A new family of genetically encoded indicators for in vivo calcium imaging in the nervous system.</a> Cell Calcium. 42 (4-5), 351-361 (2007).</li><li>Carlson, H. J., Campbell, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutational+Analysis+of+a+Red+Fluorescent+Protein-Based+Calcium+Ion+Indicator.">Mutational Analysis of a Red Fluorescent Protein-Based Calcium Ion Indicator.</a> Sensors. 13 (9), 11507-11521 (2013).</li><li>Wang, Q., Shui, B., Kotlikoff, M. I., Sondermann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Basis+for+Calcium+Sensing+by+GCaMP2.">Structural Basis for Calcium Sensing by GCaMP2.</a> Structure. 16 (12), 1817-1827 (2008).</li><li>Koldenkova, V. P., Nagai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+Ca2++indicators:+Properties+and+evaluation.">Genetically encoded Ca2+ indicators: Properties and evaluation.</a> Biochim. Biophys. Acta-Mol. Cell Res. 1833 (7), 1787-1797 (2013).</li><li>Tang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+application+of+a+class+of+sensors+to+monitor+Ca2++dynamics+in+high+Ca2++concentration+cellular+compartments.">Design and application of a class of sensors to monitor Ca2+ dynamics in high Ca2+ concentration cellular compartments.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108 (39), 16265-16270 (2011).</li><li>Zou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+sensors+for+real-time+measurement+of+high+Ca2++concentrations.">Developing sensors for real-time measurement of high Ca2+ concentrations.</a> Biochemistry. 46 (43), 12275-12288 (2007).</li><li>Wang, Z. -. M., Tang, S., Messi, M. L., Yang, J. J., Delbono, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Residual+sarcoplasmic+reticulum+Ca2++concentration+after+Ca2++release+in+skeletal+myofibers+from+young+adult+and+old+mice.">Residual sarcoplasmic reticulum Ca2+ concentration after Ca2+ release in skeletal myofibers from young adult and old mice.</a> Pflugers Arch., EJP. 463 (4), 615-624 (2012).</li><li>Pedelacq, J. D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+and+characterization+of+a+superfolder+green+fluorescent+protein.">Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein.</a> Nat. Biotechnol. 24 (1), 79-88 (2006).</li><li>Siemering, K. R., Golbik, R., Sever, R., Haseloff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+that+suppress+the+thermosensitivity+of+green+fluorescent+protein.">Mutations that suppress the thermosensitivity of green fluorescent protein.</a> Current Biology. 6 (12), 1653-1663 (1996).</li><li>Reddish, F. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Design Of Genetically-Encoded Ca2+ Probes With Rapid Kinetics for Sub-Cellular Application [dissertation]. , (2016).</li><li>Seo, M. D., Enomoto, M., Ishiyama, N., Stathopulos, P. B., Ikura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+endoplasmic+reticulum+stored+calcium+regulation+by+inositol+1,4,5-trisphosphate+and+ryanodine+receptors.">Structural insights into endoplasmic reticulum stored calcium regulation by inositol 1,4,5-trisphosphate and ryanodine receptors.</a> Biochim. Biophys. Acta-Mol. Cell Res. 1853 (9), 1980-1991 (2015).</li><li>Lambert, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Calcium signaling protocols. , (1999).</li><li>Stephens, D. J., Allan, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+microscopy+techniques+for+live+cell+imaging.">Light microscopy techniques for live cell imaging.</a> Science. 300 (5616), 82-86 (2003).</li><li>Bootman, M. D., Rietdorf, K., Collins, T., Walker, S., Sanderson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2+-sensitive+fluorescent+dyes+and+intracellular+Ca2++imaging.">Ca2+-sensitive fluorescent dyes and intracellular Ca2+ imaging.</a> Cold Spring Harb. 2013 (2), 83-99 (2013).</li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Catcher + gibi flüoresan probların canlı tek hücreli görüntülemesi, reseptör agonistlerine veya antagonistlerine yanıt olarak her bir hücredeki karmaşık ER / SR Ca 2+ sinyalleme süreçlerini analiz etmek için etkili bir tekniktir. Bu teknik, sırasıyla hem ER hem de sitozolik kalsiyum değişikliklerini izlemek için birlikte Fura-2 için veya Catcher + ve Rhod-2 görüntüsü için gerekli olan gibi, aynı anda birden çok dalga boyunu kullanan görüntüleme için de yararlıdır. Bu protokolde birkaç kritik adım vardır; Hücre transfeksiyonunun görüntüleme canlılığı üzerinde büyük etkisi olabilir. Düşük transfeksiyon oranları, kalsiyum yanıtlarını izlemek için GECI&#39;nin yetersiz ekspresyonuna neden olabilir. Öte yandan, Catcher + &#39;yı aşırı ifade etmek, sentetik kalsiyum boyaları ile ilgili bir sorun olan ER / ER Ca 2+ üzerinde bir tamponlama etkisi oluşturmaz. Ca 2+ sondalarının tamponlayıcı etkileri, organelle&#39;deki [Ca 2+ ], p&#39;nin K d&#39; inden etkilenirElbise ve ölçüm için gerekli olan prob konsantrasyonu. Sitosolik [Ca 2+ ], tipik olarak düşük nanomolar aralıktadır, ancak gerekli prob konsantrasyonu karşılaştırılabilir bir aralıktadır. Bu durumda, sitosolik kalsiyumu tamponlamada boya konsantrasyonunun ve bunun kabiliyetinin miktarı hücresel görüntüleme için büyük bir endişe kaynağıydı ve bu da büyük bir endişe kaynağıydı. Aksine, farklı memeli hücre soyları 25 için belirlendiği üzere, ER / SR [Ca 2+ ] 100 mikromolar ila milimolar aralığı 31&#39;dedir. Catcher + &#39;ın 0.1-1 μM ekspresyonu, ER kalsiyumunun tespit edilmesini sağlamak için yeterlidir, Catcher&#39;in tamponlama etkisi önemsizdir. Böylece Catcher + , Ca 2+ akığını yüksek [Ca 2+ ] ortamlarda luminal ER / SR Ca 2+ 32 üzerinde tamponlama etkisi olmadan izleyebilir. GECI&#39;nin transfeksiyon verimliliğini etkileyebilecek birkaç faktör, inkübasyon süresi,E transfeksiyon reaktifi, kuluçka sıcaklığı ve hücre konfluansı. Hücreleri slaytta tohumlarken hücre konflueni görüntüleme kalitesini önemli ölçüde etkileyebilir. Düşük konfluyon düşük hücre sayısına (n) ve daha az istatistiksel doğruluka neden olurken yüksek konfluen seviyeler görüntülemede büyük değişkenler üreten hücrelerin üst üste binmesine yol açar. Transfeksiyon için zaman ve sıcaklık, hücre türüne göre optimize edilmelidir. Buna ek olarak, azaltılmış serum ortamı ile DMEM eklenmesi, apoptozu önlemek için daha uzun transfeksiyon süreleri için optimaldir. Memeli hücrelerde orijinal GECI Catcher floresansı, kültürlendiğinde ve transfekte edildiğinde sadece 30 ° C idi. Catcher&#39;in flüoresansı, 37 ° C&#39;de ekspresyon için başarıyla optimize edildi ve geliştirildi, sonuçta yeni geliştirilmiş Catcher + geliştirmesi sağlandı. EGFP&#39;ye karşı bir antikor kullanan bir batı leke, Ca2 + sondasının ekspresyonunu teyit etmek için gerçekleştirilebilir. Üstelik beniReaktif teslimatının tutarlılığı ve önemi kritiktir. Reaktifler odaya perfüzyon, küçük hacimli difüzyon veya mekanik pompalar ile eklenebilir, bunların hepsi farklı tepkiler verebilir. Çözüm haznesinin, haznenin dibinde, slaydın üzerine yerleştirilecek bir sızdırmazlık macunu gres örtüsü uygulayarak düzgün şekilde kapatılmış olması zorunludur. Prob için doğru dalga boyları seçilmelidir. Catcher + için uyarma ve emisyon dalga boyları sırasıyla 395/488 nm ve 510 nm&#39;dir. Hücre görüntüleme için, UV ışığının hücreler üzerindeki zararlı etkisini önlemek için uyarılma için sadece 488 nm kullanılır. Bu nedenle, 488 nm&#39;de uyaran ve 510 nm&#39;de emisyonu toplamayan herhangi bir optik filtreyi kullanmak, Catcher + ile görüntü oluşturmak için kabul edilebilir olacaktır. Fotobirik oluşumunu önlemek için ışık yoğunluğunu ve çerçeve / s 33 gibi ışık hassasiyetini optimize etmek için yoğun çaba sarf edilebilir. Bu protokol, etkinliği analiz etmek için ideal olsa daER / SR değişiklikleri, Catcher + Ca 2+ ER / SR floresan probu kullanılarak değiştirildiğinde, herhangi bir deneyde beklendiği gibi sınırlamalar vardır. Tek hücreli canlı görüntüleme yalnızca küçük bir hücre kümesini analiz ettiğinden, hücrelerin sayısı (n) ortalama 1-100 hücre arasında değişebilir, ancak daha büyük hücre hatları için daha düşük olabilir. Bu, hücre sayısının azalmasına ve birden fazla denemeden istatistiksel olarak farklı sonuçlara yol açar. İstatistiksel doğruluk için bir n&gt; 6 gereklidir. Daha büyük bir n elde etmek için, birçok yemekler görüntülenecek veya diğer teknikler aynı anda kullanılmalıdır. Ayrıca, Catcher + , tek bir dalga boyu ER / SR Ca 2+ probudur, bu sinyali nicelemek mümkün olmayan diğer tek dalga boyundaki sondalar ve boyalar ile ilgili sorunlara yol açar, hücrenin bozulmasına karşı sinyalin doğru olup olmadığını bilmemektedir Artifaktı ve ratiyometrik sistemlere nazaran daha büyük gürültüye sahip 34 . Bu çalışma, bu optimize Ca 2+ sondaların,Reseptör aracılı ER / SR Ca 2+ salınımını izlemek için farklı hücre tiplerinde veya doku tiplerinde uygulanabilir. Catcher + , tek bir dalga boyundaki ER / SR Ca 2+ probudur. Bu nedenle, deneysel parametrelerin ve ayarların niceliksel ölçüm için tutarlı olması önemlidir. Kalsiyum konsantrasyonunun ve K d kalsiyum sensörünün hücre çizgilerinde ayrıntılı bir kalibrasyonu niceliksel analiz için ek önemli ölçümlerdir. Bu gelişmiş kalsiyum sensörleri, çeşitli biyolojik ve patolojik koşullardaki küresel Ca 2+ değişimlerine kıyasla var olan, büyük ölçüde farklı Ca 2+ geçişlerini izlemek için ER / SR&#39;deki belirli lokasyonlara da hedef olabilir. Bu bulgular, Ca 2+ ile ilişkili hastalıkların teşhisinde gelecek araçları sağlamak için Ca 2+ görüntüleme ve sonda tarama alanlarını ilerletmeye devam edecektir. Bildirilen protokoller ve gelişmiş sensör ilaç d için de uyarlanabilirKalsiyum sinyaliyle ilişkili hastalıklara karşı korunma.

Hücre içi kalsiyum (Ca 2+ ) geçici maddelerinin uzay-zamansal özellikleri, çeşitli biyolojik fonksiyonları aktive eder 1 . Bu Ca 2+ sinyal olayları hücre dışı olarak farklı uyarılarla tetiklenir ve hücre içi olarak büyük Ca 2+ depolama organelleri ve sayısız Ca 2+ pompalar, kanallar ve Ca 2+ bağlayıcı proteinler tarafından kontrol edilir. Ca 2+ transientleri, sinyal modülasyonlu kusurların bir sonucu olarak farklı hastalıklara yol açarak önemli ölçüde değişebilir 2 . Merkezde endo (ER) ve sarkoplazmik retikül (SR) bulunan Ca 2+ sinyal sisteminin hızı ve karmaşıklığı nedeniyle, hızlı kinetik ile memelilerin ekspresyonu için optimize edilmiş genetik olarak kodlanmış Ca 2+ probları gereklidir Farklı hücrelerdeki küresel ve yerel Ca 2+ değişimlerini gözlemlemek 3 . ER ve SR, Kas hücrelerindeki muadili, büyük intraselüler Ca 2+ depolama organelleri olup Ca 2+ sinyallerinin amplifiye edilmesine yardımcı olan Ca 2+ lavabo gibi hareket eder. ER / SR, Ca 2+ sinyallerinin ayrılmaz bir parçasıdır ve sinyaller 5 vericisi ve alıcısı olarak ikili rolleri vardır. Riyanodin reseptörü (RyR) ve inositol 1,4,5-trifosfat reseptörü (IP 3 R), Ca 2+ 6 ile regüle edilen ER / SR membranlarında bulunan Ca 2+ serbest reseptörleridir. Diğer ajanlar doğrudan veya dolaylı olarak bu reseptörlerin işlevini uyarır. 4-kloro-m-kresol (4-cmc), her ikisi de düzenli olarak RyR aracılı Ca 2+ salınımını incelemek için kullanıldığında, SR Ca 2+ salınımını tetiklemek için kafeinden 10 kat daha yüksek bir hassasiyete sahip olan, RyR&#39;nin güçlü bir agonistidir Sağlıklı ve hastalıklı hücreler 7 . ATP, IP 3 aracılı Ca 2+ reIP 3 R 8 üzerinden kiralayın . ATP, bir G-proteine ​​bağlı reseptör (GPCR) olan purinergik reseptör P2YR&#39;ye bağlanır ve IP 3 R&#39;ye bağlanan IP 3 üretimini tetikleyerek Ca 2+ &#39;yı ER 9 , 10&#39;dan salınır. Sarkoz endoplazmik retikulum kalsiyum ATPaz (SERCA) pompası, aynı zamanda ER / SR zarında bulunan ve sitosolik Ca 2+ miktarını azaltan ve iyonu ER / SR lümenine aktif olarak pompalayarak ER / SR&#39;yi tekrar dolduran bir P tipi ATPaz pompasıdır 11 . SERCA pompasının spesifik önleyicileri, Thapsia garganica&#39;ndan thapsigargin ve Aspergillus ve Penicillium&#39;dan siklopiazonik asit (CPA) içerir . CPA, pompa için düşük afiniteye sahiptir ve Ca 2+ erişim noktasını 12 tersine çevrilebilir şekilde bloke eder. Thapsigargin, diğer yandan, nanomol ile M3 helezonunda F256 kalıntısında Ca 2+ serbest pompaya geri döndürülemez şekilde bağlanırAf affinity 11 . Ca 2+ uyarılmış olaylarla ilgili değişiklikleri analiz etmek ve nicelleştirmek bir sorun olmuştur ve halen bir meydan okuma olmaya devam etmektedir. ER / SR, Ca 2+ sinyalinin yayılımında merkez işlevli ana hücre içi Ca 2+ ihtiva eden kompartıman olduğundan, ER / SR Ca 2+ sinyalizasyonunu anlama konusunda çok çalışılmıştır. Sentetik Ca 2 + boyalarının oluşturulması, Ca 2+ görüntülemenin tarla ve uygulamasına yardımcı olmuştur. Mag-Fura-2 gibi boyalar, farklı hücrelerdeki bölümlü Ca 2+ miktarını ölçmek için yaygın olarak kullanılmasına rağmen, 13 , 14 , 15 düzensiz boya yüklemesi, foto-ağartma ve belirli organelleri hedef alamama gibi sınırlamaları vardır . Yeşil floresan protein (GFP) keşfi ve floresan protein-Tabanlı Ca 2+ sondaları Ca 2+ görüntüleme alanını ilerletti 16 . Mevcut GECI&#39;lerin bazıları sarı floresan protein (YFP), camgöbeği flüoresan proteini (CFP), kalmodulin ve M13 bağlayıcı peptid 17 , 18 içeren Förster rezonans enerji transferi (FRET) çiftleri. Troponin C tabanlı GECI&#39;ler, FRET&#39;in CFP ve Sitrin çiftleri olarak ve tekli florofor probları 19 , 20 , 21 olarak da mevcuttur. GCaMP2 ve R-GECO gibi diğerleri, kalmodulin 22 , 23 içeren tekli florofor sensörleridir. Ca2 + bağlanma alanlarında 24 bulunan çoklu Ca2 + bağlanma yerleri ile ilişkili Kd ve kooperatif bağlamanın dar ayarlamanın sınırlamalarını aşmak için yeni bir kalsiyum sınıfı sınıfıSors, ​​gelişmiş yeşil flüoresan protein (EGFP) 25 , 26&#39;nın kromofor duyarlı bir konumunda beta varilin yüzeyinde Ca2 + bağlama sitesi tasarlanarak oluşturuldu. CatchER olarak adlandırılan bu yüksek duyarlıklı sensör, ~ 0,18 mM&#39;lik bir Kd&#39;ye, difüzyon sınırının yakınında ak&#39;a ve 700 s&#39;lik bir ak&#39;a sahiptir. Catcher, HeLa, HEK293 ve C2C12 25 gibi farklı memeli hücre dizilerinde reseptör aracılı ER / SR kalsiyum salımını izlemek için kullanılmıştır. Hızlı kinetiklerinden dolayı Catcher, genç ve yaşlı Friend Virüs B NIH Jackson (FVB) farelerinin flexor digitorum brevis (FDB) kas liflerinde FDB&#39;de 2 s depolarizasyon sonrasında SR&#39;de daha fazla Ca 2+ kalmış olduğunu göstermek için kullanıldı Eski farelerin elyafları genç farelerinkine kıyasla 27 . Memelinin kalsiyum görüntülemedeki uygulamalarını engelleyen, 37 ° C&#39;de düşük flüoresansının üstesinden gelmek içinCatcher + denilen Catcher&#39;ın geliştirilmiş bir versiyonunu geliştirdik. Catcher + , memeli hücrelerinde daha iyi uygulama için 37 ° C&#39;de gelişmiş floresan sergilemektedir. 37 ° C&#39;de 28 , 29 ° C&#39;de termostabilite ve flüoresanı iyileştirmek için Catcher + &#39; e ek mutasyon eklendi. Catcher + , Sinyal-gürültü oranına (SNR) Catcher 30&#39;a göre altı kat arttı. Burada, Catcher + ile HEK293 ve C2C12 hücrelerinin kültürlenmesi ve transfeksiyonu için protokoller ve ER / SR reseptör aracılı kalsiyum geçişlerini izlemek için uygulanması sunulmuştur. Temsilci sonuçlar, 4 cmc, CPA ve ATP ile muamele edilmiş HEK293 hücrelerinde ifade edilen Catcher + için gösterilmiştir. C2C12 miyoblast hücrelerinde Catcher + in situ K d&#39; sini belirlemek için bir protokol de sunuyoruzBazal [Ca 2+ ] ntifikasyonu.

<table><tbody><tr><td>4-Chloro-3-methylphenol (4-CmC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C55402</td><td></td></tr><tr><td>515DCXR dichroic mirror</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>NC338059</td><td></td></tr><tr><td>Adenosine 5&amp;prime;-triphosphate disodium salt hydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A26209</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride dihydrate</td><td>EMD Millipore</td><td>102382</td><td></td></tr><tr><td>Corning tissue-culture treated culture dishes (100 mm)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430167</td><td></td></tr><tr><td>Corning tissue-culture treated culture dishes (60 mm)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430166</td><td></td></tr><tr><td>Cyclopiazonic Acid (CPA)</td><td>EMD Millipore</td><td>239805</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Glucose</td><td>ACROS Organics</td><td>41095-0010</td><td></td></tr><tr><td>Dow Corning 111 Valve Lubricant &amp;amp; Sealant</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0275</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Modified Eagle&amp;rsquo;s Medium (DMEM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D7777</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenebis(oxyethylenenitrilo)&lt;br/&gt; tetraacetic Acid (EGTA)</td><td>ACROS Organics</td><td>409911000&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>ThermoFisher</td><td>26140087</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Cover Glasses 22x40 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>&amp;nbsp;12-544B</td><td></td></tr><tr><td>Hanks&amp;rsquo; Balanced Salts (HBSS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4891</td><td></td></tr><tr><td>HEPES, Free Acid, Molecular Biology Grade</td><td>EMD Millipore</td><td>391340</td><td></td></tr><tr><td>Immersion Oil without autofluorescence</td><td>Leica</td><td>11513859</td><td></td></tr><tr><td>Ionomycin, Free Acid</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-230-5804</td><td></td></tr><tr><td>Leica DM6100B inverted microscope with a cooled EM-CCD camera</td><td>Hamamatsu</td><td>C9100-13</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 Transfection Reagent</td><td>ThermoFisher</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000 Transfection Reagent</td><td>ThermoFisher</td><td>L3000015</td><td></td></tr><tr><td>Low Profile Open Diamond Bath Imaging Chamber</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-26GLP</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Chloride Hexahydrate</td><td>Fisher Scientific</td><td>M33-500</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>ThermoFisher</td><td>51985034</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Chloride</td><td>EMD Millipore</td><td>PX1405</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Phosphate, Dibasic</td><td>EMD Millipore</td><td>PX1570</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Phosphate, Monobasic</td><td>EMD Millipore</td><td>PX1565</td><td></td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>SimplePCI Image Analysis Software</td><td>Hamamatsu</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Bicarbonate</td><td>Fisher Scientific</td><td>S233-3</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-500</td><td></td></tr><tr><td>Sterivex-GV 0.22 &amp;micro;m filter</td><td>EMD Millipore</td><td>SVGVB1010</td><td></td></tr><tr><td>Till Polychrome V Xenon lamp</td><td>Till Photonics</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin (2.5%), no phenol red (10x)</td><td>ThermoFisher</td><td>15090046</td><td></td></tr></tbody></table>

monitoring er/sr calcium release with the targeted ca2+ sensor catcher+

Hücre dıĢı uyaranlar tarafından uyarılan hücre içi kalsiyum (Ca2 + ) geçicileri canlılarda çok sayıda biyolojik proses başlatır. Hücre içi kalsiyum salınımının merkezinde, kas hücrelerinde büyük hücreiçi kalsiyum depolama organelleri, endoplazmik retikulum (ER) ve daha özelleşmiş sarkoplazmik retikulum (SR) bulunur. Bu organellerden kalsiyumun dinamik olarak salınması, sarko / endoplasmik retikulum kalsiyum ATPaz (SERCA) pompası vasıtasıyla yeniden doldurma ile birlikte riyano-nodin reseptörü (RyR) ve inositol 1,4,5-trifosfat reseptörü (IP 3 R) aracılığı ile sağlanır. ER / SR&#39;den hızlı kalsiyum salımını izlemek için, Catcher adı verilen, genetik olarak kodlanmış bir kalsiyum sensörü (GECI) oluşturuldu. Burada, HEK293 ve C2C12 hücrelerinde gelişmiş ER / SR hedef GECI Catcher + &#39;ın transfeksiyonu ve ekspresyonu için ayrıntılı protokoller ve IP 3 R, RyR ve SERCA pompa aracılıklı kalsiyum geçiciHEK293 hücrelerinde floresan mikroskobu kullanılarak özetlenmiştir. Seçilen reseptör agonisti veya inhibitörü oda çözeltisine dağıtılır ve yoğunluk değişiklikleri gerçek zamanlı olarak kaydedilir. Bu yöntemle, ER kalsiyumunda bir azalma, 4-kloro-m-kresol (4-cmc), adenosin trifosfat (ATP) ile dolaylı olarak IP 3 R&#39;yi aktive eden RyR aktivasyonu ve siklopiazonik SERCA pompasının inhibisyonu ile görülür Asit (CPA). Ayrıca in situ K d&#39; yi belirlemek ve C2C12 hücrelerinde bazal [Ca 2+ ] miktarını belirlemek için protokolleri tartışıyoruz. Özetle, Catcher + ile birlikte kullanılan bu protokoller ER / SR kalsiyum ile ilgili patolojilerin incelenmesinde gelecekte uygulanacak olan ER&#39;den reseptör aracılı kalsiyum salımını ortaya çıkarabilir.

Bu bölüm, ER / SR Ca 2+ değişikliklerini farklı reseptör aracılı yollarla izlemek için optimize edilmiş ER / SR hedef GECI Catcher + kullanılarak önceden açıklanan yöntemleri kullanarak elde edilen sonuçları gösterecektir. Şekil 1 , 200 uM 4 cmc ile uyarılan RyR boyunca boşaltılmayı göstermektedir. 4 cmc, RyR&#39;nin bir agonistidir. İlacın ilavesi, Catcher + floresan yoğunluğundaki azalma ile ölçülen ER kalsiyumunda bir düşüşe neden olur. İşaretlendiği gibi, burada özetlenen protokol, ER Ca 2+ &#39; daki değişiklikler hakkında bilgi sağlayan Catcher + &#39; ı kullanarak reseptör aracılı Ca 2+ transientlerin görselleştirilmesini ve ölçülmesini sağlar. Şekil 2&#39;de gösterildiği gibi, 1SERCA pompasını tersine bloke etmek için 5 uM CPA, bir plato oluşturan floresan yoğunluğunda büyük bir azalma meydana getirir. SERCA pompasının fonksiyonu engellendiğinde, ER Ca 2+ serbest bırakma kanalları hala Ca 2+ &#39;yı sitoplazmaya aktif olarak salmaktadır ve floresan yoğunluğunun azalmasına neden olmaktadır. Hücreler CPA&#39;yı 1.8 mM Ca2 + ve 10 mM glukoz içeren Ringer tamponuyla yıkadıktan sonra iyileşirler. Bu sonuçlar, Catcher + &#39;nın SERCA pompasına özgü Ca2 + geçişlerini izleyebilme kabiliyetini teyit eder. Şekil 3 , Catcher + ile transfekte edilmiş HEK293 hücrelerinde IP 3 R&#39;nin 200 uM ATP ile dolaylı olarak aktive edilmesi için temsili verileri göstermektedir. ATP, IP 3 R yoluyla Ca 2+ salınımını aktive eden IP 3 üreten bir G-proteini eşlenmiş reseptör olan P2Y reseptörüne bağlanır.Küçük olsa da, 200 μM ATP ilavesi, sinyal yoğunluğunda görünür bir azalma meydana getirir. Hücrelerin 1.8 mM Ca 2+ ve 10 mM glikoz içeren Ringer tamponu ile yıkanması, ER&#39;ye yeniden doldurulmasını ve sinyalin taban çizgisine dönmesini sağlar. Bu sonuçlar, Catcher + &#39;nın dolaylı uyarılma yoluyla IP 3 R aracılı kalsiyum salınımını izleyebilme yeteneğini vurgulamaktadır. Şekil 4&#39;te , Catcher + , in situ Kd&#39;yi belirlemek için C2C12 miyoblast hücrelerine nakledildi. Veriler protokolde belirtildiği gibi toplandı. C2C12 miyoblast hücreleri 15-30 sn boyunca% 0.005 saponin ile permeabilize edildi, sonra 10 uM ionomisin içeren KCl tamponu içerisinde 1 mM EGTA ile yıkandı. Çeşitli Ca2 + konsantrasyonları 10 uM iyonomisin ihtiva eden KCl tamponu içinde hazırlandı ve kademeli olarak ilave edildi. Veriler normalleştirildi ve 1: 1 bağlama kullanılarak takıldıIng denklemi. 7 hücre için ortalama Kd, 3.1 ± 1.4 mM idi. Catcher + &#39;un zayıf afinitesi, ER veya SR gibi yüksek Ca 2+ organellerinde Ca 2+&#39; yu hissetmesini sağlar. SR&#39;de bazal [Ca 2+ ] &#39;yi belirlemek için, C2C12 hücreleri 15-30 sn boyunca% 0.005 saponin ile permeabilize edildi, KCl tamponu ile yıkandı ve daha sonra F mıkanasını elde etmek için 10 uM iyonomisin içeren KCl tamponu içerisinde 1 mM EGTA ile yıkandı . EGTA&#39;yı KCl tamponu ile yıkadıktan sonra, 10 uM iyonomisin ile 100 mM Ca 2+ maksimum bir Fmax ilave edildi. Bazal Ca 2+ 0.4 ± 0.2 mM olarak hesaplandı. <img alt="Şekil 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55822/55822fig1.jpg" /> Şekil 1: HEK293 hücrelerinde 4 cmc kullanılarak RyR&#39;nin uyarılması. ( A ) RyR&#39;nin 4 cmc ile aktivasyonunun tasvir edilmesi. ( B ) HEK293 hücrelerinin yoğunluk kaydıER&#39;de lokalize Catcher + ile transfekte edilmiş, 200 uM 4 cmc ile muamele edilmiştir. RyR&#39;nin 4 cmc ile stimüle edilmesi, normalize flüoresan yoğunluğunda, [Ca 2+ ] ER&#39;deki bir azalmayla direkt olarak korelasyona neden olan bir azalmaya neden olur. N, görüntülendiği hücrelerin sayısını belirtir. Ortalama sinyal azalması% 12.0 ± 2.2 idi. Ringer tamponunda 1.8 mM Ca 2+ bulunması, yoğunluğun toparlanma düzeyine yansıyan ER&#39;yi yeniden doldurmayı kolaylaştırdı. Çizilmiş resimler, hücreleri 4-cmc ile tedavi öncesi ve sonrası göstermektedir. SNR, 4.3 ± 0.8 olarak hesaplandı. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55822/55822fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55822/55822fig2.jpg" /> Şekil 2: Tersinir SERCA p&#39;yi kullanarak [Ca 2+ ] ER&#39;de azalmaHEK293 hücrelerinde ump inhibitörü CPA. ( A ) CPA ile SERCA pompasının inhibisyonu. ( B ) 15 μM CPA ile tedavi edilen ER&#39;de lokalize Catcher + ile transfekte edilmiş HEK293 hücrelerinin canlı görüntülemesi. Ca 2+ hala IP 3 R ve RyR&#39;den akabildiğinden, SERCA pompasını CPA ile bloke etmek, normalize floresan yoğunluğunda bir azalmaya neden olur ve bu da doğrudan [Ca 2+ ] ER&#39;de bir azalmaya karşılık gelir. N, görüntülendiği hücrelerin sayısını belirtir. Çizilmiş resimler, tedavi öncesi ve sonrası Catcher + ile transfekte edilmiş HEK293 hücreleridir. Ortalama sinyal azalması% 21.0 ± 0.3&#39;tü. Ringer tamponunda 1.8 mM Ca 2+ bulunması, yoğunluğun toparlanma düzeyine yansıyan ER&#39;yi yeniden doldurmayı kolaylaştırdı. SNR, 5.5 ± 0.8 olarak hesaplandı. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55822/55822fig2large.jpg" target="_blank">Daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a>bu figür. <img alt="Şekil 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55822/55822fig3.jpg" /> Şekil 3: ATP, HEK293 hücrelerinde [Ca 2+ ] ER&#39;yi azaltır. ( A ) IP 3 R&#39;nin ATP ile P2YR purinerjik reseptörü aracılığıyla dolaylı olarak aktivasyonunun şeması. P2YR, ATP&#39;ye bağlandığında IP 3 üreten bir GPCR&#39;dir. IP 3 , ER&#39;den kalsiyum salınmasını uyaran IP 3 R&#39;yi aktive eder. ( B ) 200 uM ATP ile tedavi edilen ER&#39;de lokalize Catcher + ile transfekte edilmiş HEK293 hücrelerinin gerçek zamanlı görüntülemesi. ATP ile P2Y reseptörü aracılığıyla IP 3 R&#39;nin dolaylı uyarımı, normalize edilmiş floresan yoğunluğunda, doğrudan [Ca 2+ ] ER&#39;de bir düşüşle bağlantılı olan bir azalmaya neden olur. N, görüntülendiği hücrelerin sayısını belirtir. Ortalama sinyal azalması% 6.0 ± 3.0&#39;dır. SNR c6,7 ± 2,7 olarak hesaplandı. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55822/55822fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55822/55822fig4.jpg" /> Şekil 4: C2C12 miyoblast hücrelerinde Catcher + in situ K d&#39; si. Catcher + ile transfekte edilmiş permeabilize edilmiş C2C12 miyoblast hücrelerinden toplanan normalize yoğunluğun temsili izi. Hücreler, hücre içi tamponda% 0,005&#39;lik saponin ile 15-30 s süreyle permeabilize edildi. EGTA ve Ca 2+ solüsyonları KCl tamponu içerisinde hazırlanmış, n, görüntülemiş hücre sayısını belirtir. ( A ) Gelen floresan görüntüleri, tedaviden önce ve sonra hücrelerin temsilcisidir. 10 uM varlığında permeabilize C2C12 miyoblast hücrelerine 0.3, 0.6, 2, 5, 10, 20, 50 ve 100 mM Ca2 +3.1 ± 1.4 mM bir Kd elde etmek için İyonomisin kullanılmıştır. ( B ) Inzet flüoresans görüntüleri sırasıyla 10 uM ionomisin ile 1 mM EGTA ve 100 mM Ca 2+ eklendikten sonra, minimum ve maksimum değerlerde hücrelerin temsilcisidir. Bazal Ca 2+ 0.4 ± 0.2 mM olarak hesaplandı. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55822/55822fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring ER/SR Calcium Release with the Targeted Ca2+ Sensor CatchER+ at JoVE.com

Monitoring ER/SR Calcium Release with the Targeted Ca2+ Sensor CatchER+

HEK293&#39;ün endoplazmik / sarkoplazmik retikulumdaki (ER / SR) hızlı kalsiyum geçişlerini ve gerçek zamanlı floresan mikroskopisi kullanarak iskelet kası C2C12 hücrelerini izlemek için hedeflenmiş genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergesi (GECI) Catcher + &#39;ün uygulanması için protokoller sunuyoruz. Yerinde K d ölçümü ve kalibrasyonu için bir protokol de tartışılmıştır.

Hedeflenen Ca ile ER / SR Kalsiyum Salınımının İzlenmesi<sup&gt; 2+</sup&gt; Sensör Catcher<sup&gt; +</sup

Intracellular calcium (Ca2+) transients evoked by extracellular stimuli initiate a multitude of biological processes in living organisms. At the center of ...

monitoring-ersr-calcium-release-with-the-targeted-ca2-sensor-catcher

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Monitoring ER/SR Calcium Release with the Targeted Ca2+ Sensor CatchER+

14.8K Görüntüleme.  Georgia State University.  HEK293'ün endoplazmik / sarkoplazmik retikulumdaki (ER / SR) hızlı kalsiyum geçişlerini ve gerçek zamanlı floresan mikroskopisi kullanarak iskelet kası C2C12 hücrelerini izlemek için hedeflenmiş genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergesi (GECI) Catcher + 'ün uygulanması için protokoller sunuyoruz. Yerinde K d ölçümü ve kalibrasyonu için bir protokol de tartışılmıştır. 

Video: Monitoring ER/SR Calcium Release with the Targeted Ca2+ Sensor CatchER+

Monitoring Changes in the Intracellular Calcium Concentration and Synaptic Efficacy in the Mollusc Aplysia

It has been suggested that changes in intracellular calcium mediate the induction of a number of important forms of synaptic plasticity (e.g., homosynaptic facilitation) 1. These hypotheses can be tested by simultaneously monitoring changes in intracellular calcium and alterations in synaptic efficacy. We demonstrate how this can be accomplished by combining calcium imaging with intracellular recording techniques. Our experiments are conducted in a buccal ganglion of the mollusc Aplysia californica. This preparation has a number of experimentally advantageous features: Ganglia can be easily removed from Aplysia and experiments use adult neurons that make normal synaptic connections and have a normal ion channel distribution. Due to the low metabolic rate of the animal and the relatively low temperatures (14-16 &deg;C) that are natural for Aplysia, preparations are stable for long periods of time. 
To detect changes in intracellular free calcium we will use the cell impermeant version of Calcium Orange 2 which is easily 'loaded' into a neuron via iontophoresis. When this long wavelength fluorescent dye binds to calcium, fluorescence intensity increases. Calcium Orange has fast kinetic properties 3 and, unlike ratiometric dyes (e.g., Fura 2), requires no filter wheel for imaging. It is fairly photo stable and less phototoxic than other dyes (e.g., fluo-3) 2,4. Like all non-ratiometric dyes, Calcium Orange indicates relative changes in calcium concentration. But, because it is not possible to account for changes in dye concentration due to loading and diffusion, it can not be calibrated to provide absolute calcium concentrations. 
An upright, fixed stage, compound microscope was used to image neurons with a CCD camera capable of recording around 30 frames per second. In Aplysia this temporal resolution is more than adequate to detect even a single spike induced alteration in the intracellular calcium concentration. Sharp electrodes are simultaneously used to induce and record synaptic transmission in identified pre- and postsynaptic neurons. At the conclusion of each trial, a custom script combines electrophysiology and imaging data. To ensure proper synchronization we use a light pulse from a LED mounted in the camera port of the microscope. Manipulation of presynaptic calcium levels (e.g. via intracellular EGTA injection) allows us to test specific hypotheses, concerning the role of intracellular calcium in mediating various forms of plasticity.

Monitoring Changes in the Intracellular Calcium Concentration and Synaptic Efficacy in the Mollusc Aplysia

We demonstrate how changes in the intracellular free calcium concentration and synaptic efficacy can be simultaneously monitored in a ganglion preparation of Aplysia. We image intracellular calcium using a fluorescent dye, Calcium Orange, and induce and monitor synaptic transmission with sharp (intracellular) electrodes.

Mollusk içinde hücre içi kalsiyum konsantrasyonu ve Synaptic Etkinliği İzlenmesi Değişiklikler<em&gt; Aplysia&#39;nın</em

It has been suggested that changes in intracellular calcium mediate the induction of a number of important forms of synaptic plasticity (e.g., ...

Nörobilim

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, well-characterized nervous system allows identification and fluorescence imaging of any neuron within the intact animal. Simple immobilization techniques with minimal impact on the animal's physiology allow extended time-lapse imaging. The development of genetically-encoded calcium sensitive fluorophores such as cameleon 1 and GCaMP 2 allow in vivo imaging of neuronal calcium relating both cell physiology and neuronal activity. Numerous transgenic strains expressing these fluorophores in specific neurons are readily available or can be constructed using well-established techniques. Here, we describe detailed procedures for measuring calcium dynamics within a single neuron in vivo using both GCaMP and cameleon. We discuss advantages and disadvantages of both as well as various methods of sample preparation (animal immobilization) and image analysis. Finally, we present results from two experiments: 1) Using GCaMP to measure the sensory response of a specific neuron to an external electrical field and 2) Using cameleon to measure the physiological calcium response of a neuron to traumatic laser damage. Calcium imaging techniques such as these are used extensively in C. elegans and have been extended to measurements in freely moving animals, multiple neurons simultaneously and comparison across genetic backgrounds. C. elegans presents a robust and flexible system for in vivo neuronal imaging with advantages over other model systems in technical simplicity and cost.

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

With its small transparent body, well-documented neuroanatomy and a host of amenable genetic techniques and reagents, C. elegans makes an ideal model organism for in vivo neuronal imaging using relatively simple, low-cost techniques. Here we describe single neuron imaging within intact adult animals using genetically encoded fluorescent calcium indicators.

C. vivo Nöronal Kalsiyum Imaging&#39;de elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Live Cell Calcium Imaging Combined with siRNA Mediated Gene Silencing Identifies Ca2+ Leak Channels in the ER Membrane and their Regulatory Mechanisms

In mammalian cells, the endoplasmic reticulum (ER) plays a key role in protein biogenesis as well as in calcium signalling1. The heterotrimeric Sec61 complex in the ER membrane provides an aqueous path for newly-synthesized polypeptides into the lumen of the ER. Recent work from various laboratories suggested that this heterotrimeric complex may also form transient Ca2+ leak channels2-8. The key observation for this notion was that release of nascent polypeptides from the ribosome and Sec61 complex by puromycin leads to transient release of Ca2+ from the ER. Furthermore, it had been observed in vitro that the ER luminal protein BiP is involved in preventing ion permeability at the level of the Sec61 complex9,10. We have established an experimental system that allows us to directly address the role of the Sec61 complex as potential Ca2+ leak channel and to characterize its putative regulatory mechanisms11-13. This system combines siRNA mediated gene silencing and live cell Ca2+ imaging13. Cells are treated with siRNAs that are directed against the coding and untranslated region (UTR), respectively, of the SEC61A1 gene or a negative control siRNA. In complementation analysis, the cells are co-transfected with an IRES-GFP vector that allows the siRNA-resistant expression of the wildtype SEC61A1 gene. Then the cells are loaded with the ratiometric Ca2+-indicator FURA-2 to monitor simultaneously changes in the cytosolic Ca2+ concentration in a number of cells via a fluorescence microscope. The continuous measurement of cytosolic Ca2+ also allows the evaluation of the impact of various agents, such as puromycin, small molecule inhibitors, and thapsigargin on Ca2+ leakage. This experimental system gives us the unique opportunities to i) evaluate the contribution of different ER membrane proteins to passive Ca2+ efflux from the ER in various cell types, ii) characterize the proteins and mechanisms that limit this passive Ca2+ efflux, and iii) study the effects of disease linked mutations in the relevant components.

Live Cell Calcium Imaging Combined with siRNA Mediated Gene Silencing Identifies Ca2+ Leak Channels in the ER Membrane and their Regulatory Mechanisms

The endoplasmic reticulum plays a key role in protein biogenesis and in calcium homeostasis. We have established an experimental system that allows us to address the role of Ca2+ leak channels and to characterize their putative regulatory mechanisms. This system involves siRNA mediated gene silencing and live cell Ca2+ imaging.

Canlı Hücre Kalsiyum Görüntüleme siRNA aracılığı ile gen susturma ile birlikte Ca tanımlar 2 + ER Membran Kaçak Kanallar ve Düzenleme Mekanizmaları

In mammalian cells, the endoplasmic reticulum (ER) plays a key role in protein biogenesis as well as in calcium signalling1. The heterotrimeric Sec61 ...

Biyoloji

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized animals. Highly sensitive, genetically encoded fluorescent reporters of Ca2+ have revolutionized the recording of cell and synaptic activity using non-invasive optical approaches in behaving animals. When combined with genetic and optogenetic techniques, the molecular mechanisms that modulate cell and circuit activity during different behavior states can be identified.
Here we describe methods for ratiometric Ca2+ imaging of single neurons in freely behaving Caenorhabditis elegans worms. We demonstrate a simple mounting technique that gently overlays worms growing on a standard Nematode Growth Media (NGM) agar block with a glass coverslip, permitting animals to be recorded at high-resolution during unrestricted movement and behavior. With this technique, we use the sensitive Ca2+ reporter GCaMP5 to record changes in intracellular Ca2+ in the serotonergic Hermaphrodite Specific Neurons (HSNs) as they drive egg-laying behavior. By co-expressing mCherry, a Ca2+-insensitive fluorescent protein, we can track the position of the HSN within ~ 1 &#181;m and correct for fluctuations in fluorescence caused by changes in focus or movement. Simultaneous, infrared brightfield imaging allows for behavior recording and animal tracking using a motorized stage. By integrating these microscopic techniques and data streams, we can record Ca2+ activity in the C. elegans egg-laying circuit as it progresses between inactive and active behavior states over tens of minutes.

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

This protocol describes the use of genetically encoded Ca2+ reporters to record changes in neural activity in behaving Caenorhabditis elegans worms. &#8195;

Ratiometric kalsiyum görüntüleme Caenorhabditis Elegans davranışlar içinde bireysel nöronların

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized ...

Dissection of Local Ca2+ Signals in Cultured Cells by Membrane-targeted Ca2+ Indicators

Calcium ion (Ca2+) is a universal intracellular messenger molecule that drives multiple signaling pathways, leading to diverse biological outputs. The coordination of two Ca2+ signal sources&#8212;&#8220;Ca2+ influx&#8221; from outside the cell and &#8220;Ca2+ release&#8221; from the intracellular Ca2+ store endoplasmic reticulum (ER)&#8212;is considered to underlie the diverse spatio-temporal patterns of Ca2+ signals that cause multiple biological functions in cells. The purpose of this protocol is to describe a new Ca2+ imaging method that enables monitoring of the very moment of &#8220;Ca2+ influx&#8221; and &#8220;Ca2+ release&#8221;. OER-GCaMP6f is a genetically encoded Ca2+ indicator (GECI) comprising GCaMP6f, which is targeted to the ER outer membrane. OER-GCaMP6f can monitor Ca2+ release at a higher temporal resolution than conventional GCaMP6f. Combined with plasma membrane-targeted GECIs, the spatio-temporal Ca2+ signal pattern can be described at a subcellular resolution. The subcellular-targeted Ca2+ indicators described here are, in principle, available for all cell types, even for the in vivo imaging of Caenorhabditis elegans neurons. In this protocol, we introduce Ca2+ imaging in cells from cell lines, neurons, and glial cells in dissociated primary cultures, and describe the preparation of frozen stock of rat cortical neurons.

Dissection of Local Ca2+ Signals in Cultured Cells by Membrane-targeted Ca2+ Indicators

Here we present a protocol for Ca2+ imaging in neurons and glial cells, which enables the dissection of Ca2+ signals at subcellular resolution. This process is applicable to all cell types that allow the expression of genetically encoded Ca2+ indicators.

Yerel Ca2 + sinyalleri membran hedefli Ca2 + göstergeleri tarafından kültürlü hücrelerdeki diseksiyon

Calcium ion (Ca2+) is a universal intracellular messenger molecule that drives multiple signaling pathways, leading to diverse biological outputs. The ...

Direct Imaging of ER Calcium with Targeted-Esterase Induced Dye Loading (TED)

Visualization of calcium dynamics is important to understand the role of calcium in cell physiology. To examine calcium dynamics, synthetic fluorescent Ca2+ indictors have become popular. Here we demonstrate TED (= targeted-esterase induced dye loading), a method to improve the release of Ca2+ indicator dyes in the ER lumen of different cell types. To date, TED was used in cell lines, glial cells, and neurons in vitro. TED bases on efficient, recombinant targeting of a high carboxylesterase activity to the ER lumen using vector-constructs that express Carboxylesterases (CES). The latest TED vectors contain a core element of CES2 fused to a red fluorescent protein, thus enabling simultaneous two-color imaging. The dynamics of free calcium in the ER are imaged in one color, while the corresponding ER structure appears in red. At the beginning of the procedure, cells are transduced with a lentivirus. Subsequently, the infected cells are seeded on coverslips to finally enable live cell imaging. Then, living cells are incubated with the acetoxymethyl ester (AM-ester) form of low-affinity Ca2+ indicators, for instance Fluo5N-AM, Mag-Fluo4-AM, or Mag-Fura2-AM. The esterase activity in the ER cleaves off hydrophobic side chains from the AM form of the Ca2+ indicator and a hydrophilic fluorescent dye/Ca2+ complex is formed and trapped in the ER lumen. After dye loading, the cells are analyzed at an inverted confocal laser scanning microscope. Cells are continuously perfused with Ringer-like solutions and the ER calcium dynamics are directly visualized by time-lapse imaging. Calcium release from the ER is identified by a decrease in fluorescence intensity in regions of interest, whereas the refilling of the ER calcium store produces an increase in fluorescence intensity. Finally, the change in fluorescent intensity over time is determined by calculation of &Delta;F/F0.

Direct Imaging of ER Calcium with Targeted-Esterase Induced Dye Loading TED

Targeted-esterase induced dye loading (TED) supports the analysis of intracellular calcium store dynamics by fluorescence imaging. The method bases on targeting of a recombinant Carboxylesterase to the endoplasmic reticulum (ER), where it improves the local unmasking of synthetic low-affinity Ca2+ indicator dyes in the ER lumen.

Hedefli-esteraz ile ER Kalsiyum Doğrudan Görüntüleme Kaynaklı Boya Yükleme (TED)

Visualization of calcium dynamics is important to understand the role of calcium in cell physiology. To examine calcium dynamics, synthetic fluorescent ...

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, electrical excitability and cell proliferation. The diversity and specificity of Ca2+ signaling derives from mechanisms by which Ca2+ signals are generated to act over different time and spatial scales, ranging from cell-wide oscillations and waves occurring over the periods of minutes to local transient Ca2+ microdomains (Ca2+ puffs) lasting milliseconds. Recent advances in electron multiplied CCD (EMCCD) cameras now allow for imaging of local Ca2+ signals with a 128 x 128 pixel spatial resolution at rates of &#62;500 frames sec-1 (fps). This approach is highly parallel and enables the simultaneous monitoring of hundreds of channels or puff sites in a single experiment. However, the vast amounts of data generated (ca. 1 Gb per min) render visual identification and analysis of local Ca2+ events impracticable. Here we describe and demonstrate the procedures for the acquisition, detection, and analysis of local IP3-mediated Ca2+ signals in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators using both wide-field epi-fluorescence (WF) and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Furthermore, we describe an algorithm developed within the open-source software environment Python that automates the identification and analysis of these local Ca2+ signals. The algorithm localizes sites of Ca2+ release with sub-pixel resolution; allows user review of data; and outputs time sequences of fluorescence ratio signals together with amplitude and kinetic data in an Excel-compatible table.

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Here we present techniques for imaging local IP3-mediated Ca2+ events using fluorescence microscopy in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators together with an algorithm that automates identification and analysis of these events.

Görüntüleme Yerel Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Kültürlenmiş memeli hücrelerinde sinyaller

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, ...

Monitoring Endoplasmic Reticulum Calcium Homeostasis Using a Gaussia Luciferase SERCaMP

The endoplasmic reticulum (ER) contains the highest level of intracellular calcium, with concentrations approximately 5,000-fold greater than cytoplasmic levels. Tight control over ER calcium is imperative for protein folding, modification and trafficking. Perturbations to ER calcium can result in the activation of the unfolded protein response, a three-prong ER stress response mechanism, and contribute to pathogenesis in a variety of diseases. The ability to monitor ER calcium alterations during disease onset and progression is important in principle, yet challenging in practice. Currently available methods for monitoring ER calcium, such as calcium-dependent fluorescent dyes and proteins, have provided insight into ER calcium dynamics in cells, however these tools are not well suited for in vivo studies. Our lab has demonstrated that a modification to the carboxy-terminus of Gaussia luciferase confers secretion of the reporter in response to ER calcium depletion. The methods for using a luciferase based, secreted ER calcium monitoring protein (SERCaMP) for in vitro and in vivo applications are described herein. This video highlights hepatic injections, pharmacological manipulation of GLuc-SERCaMP, blood collection and processing, and assay parameters for longitudinal monitoring of ER calcium.

Monitoring Endoplasmic Reticulum Calcium Homeostasis Using a Gaussia Luciferase SERCaMP

Endoplasmic reticulum calcium homeostasis is disrupted in diverse pathologies. A secreted ER calcium monitoring protein (SERCaMP) reporter can be used to detect disruptions in the ER calcium store. This protocol describes the use of a Gaussia luciferase SERCaMP to examine ER calcium homeostasis in vitro and in vivo.

Bir kullanılması Endoplazmik retikulum kalsiyum dengesi İzleme<em&gt; Gaussia</em&gt; Lusiferaz SERCaMP

The endoplasmic reticulum (ER) contains the highest level of intracellular calcium, with concentrations approximately 5,000-fold greater than cytoplasmic ...

High-Throughput Optical Controlling and Recording Calcium Signal in iPSC-Derived Cardiomyocytes for Toxicity Testing and Phenotypic Drug Screening

Understanding how excitable cells work in health and disease and how that behavior can be altered by small molecules or genetic manipulation is important. Genetically encoded calcium indicators (GECIs) with multiple emission windows can be combined (e.g., for simultaneous observation of distinct subcellular events) or used in extended applications with other light-dependent actuators in excitable cells (e.g., combining genetically encoded optogenetic control with spectrally compatible calcium indicators). Such approaches have been used in primary or stem cell-derived neurons, cardiomyocytes, and pancreatic beta-cells. However, it has been challenging to increase the throughput, or duration of observation, of such approaches due to limitations of the instruments, analysis software, indicator performance, and gene delivery efficiency. Here, a high-performance green GECI, mNeonGreen-GECO (mNG-GECO), and red-shifted GECI, K-GECO, is combined with optogenetic control to achieve all-optical control and visualization of cellular activity in a high-throughput imaging format using a High-Content Imaging System. Applications demonstrating cardiotoxicity testing and phenotypic drug screening with healthy and patient-derived iPSC-CMs are shown. In addition, multi-parametric assessments using combinations of spectral and calcium affinity indicator variants (NIR-GECO, LAR-GECO, and mtGCEPIA or Orai1-G-GECO) are restricted to different cellular compartments are also demonstrated in the iPSC-CM model.

The present protocol describes all-optical control and observation of triggered cellular activity in iPSC-derived cardiomyocytes (iPSC-CMs) for high throughput drug screening and toxicity testing. Multi-parametric quantification of phenotypic patterns in time, and space, are shown. Long-term effects of drugs over hours, or sequential measurements over days, are demonstrated.

Toksisite Testi ve Fenotipik İlaç Taraması için iPSC Türevi Kardiyomiyositlerde Yüksek Verimli Optik Kontrol ve Kalsiyum Sinyalinin Kaydedilmesi

Understanding how excitable cells work in health and disease and how that behavior can be altered by small molecules or genetic manipulation is important. ...

Tıp

Measurement of Calcium Fluctuations Within the Sarcoplasmic Reticulum of Cultured Smooth Muscle Cells Using FRET-based Confocal Imaging

Maintenance of steady-state calcium (Ca2+) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall health. A significant portion of intracellular Ca2+ content is found within the SR stores in VSMCs. As the only intracellular organelle with a close association to the surrounding extracellular space through plasma membrane-SR junctions, the SR can be considered to constitute the first line of response to any irregularity in Ca2+ transients, or stress experienced by the cell. Among its many functions, one of the most important is its role in the transmission of Ca2+-regulated signals throughout the cell to induce further cell-wide reactions downstream. The more common use of cytoplasmic Ca2+ indicators in this regard is overall insufficient for research into the highly dynamic changes to the intraluminal SR Ca2+ store that have yet to be fully characterized. Here, we provide a detailed protocol for the direct and clear measurement of luminal SR Ca2+. This tool is useful for investigation into the nuanced changes in SR Ca2+ that have significant subsequent effects on the normal function and health of the cell. Fluctuations in SR Ca2+ content specifically can provide us with a significant amount of information pertaining to cellular responses to disease or stress conditions experienced by the cell. In this method, a modified version of a SR-targeted Ca2+ indicator, D1SR, is used to detect Ca2+ fluctuations in response to the introduction of agents to cultured rat aortic smooth muscle cells (SMCs). Following incubation with the D1SR indicator, confocal fluorescence microscopy and fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based imaging are used to directly observe changes to intraluminal SR Ca2+ levels under control conditions and with the addition of agonist agents that function to induce intracellular Ca2+ movement.

Currently, most available calcium indicators are used to quantify cytoplasmic calcium transients as indirect measures of calcium released from the sarcoplasmic reticulum in cultured smooth muscle cells. This protocol describes the use of a specific FRET-based indicator that allows direct measurement of calcium signals within the sarcoplasmic reticulum lumen.

Kullanımı Kültür düz kas hücrelerinin sarkoplazmik retikulum içinde Kalsiyum Değişiminin Ölçülmesi FRET tabanlı Konfokal Görüntüleme

Maintenance of steady-state calcium (Ca2+) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall ...

Hedeflenen Ca ile ER / SR Kalsiyum Salınımının İzlenmesi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Mollusk içinde hücre içi kalsiyum konsantrasyonu ve Synaptic Etkinliği İzlenmesi Değişiklikler

C. vivo Nöronal Kalsiyum Imaging'de elegans

Canlı Hücre Kalsiyum Görüntüleme siRNA aracılığı ile gen susturma ile birlikte Ca tanımlar^{2 +} ER Membran Kaçak Kanallar ve Düzenleme Mekanizmaları

Ratiometric kalsiyum görüntüleme Caenorhabditis Elegans davranışlar içinde bireysel nöronların

Yerel Ca^{2 +} sinyalleri membran hedefli Ca^{2 +} göstergeleri tarafından kültürlü hücrelerdeki diseksiyon

Hedefli-esteraz ile ER Kalsiyum Doğrudan Görüntüleme Kaynaklı Boya Yükleme (TED)

Görüntüleme Yerel Ca

Bir kullanılması Endoplazmik retikulum kalsiyum dengesi İzleme

Toksisite Testi ve Fenotipik İlaç Taraması için iPSC Türevi Kardiyomiyositlerde Yüksek Verimli Optik Kontrol ve Kalsiyum Sinyalinin Kaydedilmesi

Kullanımı Kültür düz kas hücrelerinin sarkoplazmik retikulum içinde Kalsiyum Değişiminin Ölçülmesi FRET tabanlı Konfokal Görüntüleme