Este trabalho foi financiado pelo NIH GM62999, NIH EB007268, NIH AG15820, B &amp; B Seed Grant, e um NIH Suplementar Grant para FR, BB bolsa para CM, CDT bolsa para RG.

1. Preparação do Slide <ol><li> Coloque as lâminas de microscópio de vidro de 22 mm x 40 mm em placas de cultura celular de 6 cm, 1 lâmina por prato. </li><li> Exponha cada lado de cada lâmina, bem como o prato de 6 cm à luz ultravioleta (UV) por 15-20 min para esterilizar em uma capa estéril. </li><li> Cubra os pratos com lâminas dentro com parafilme e armazene a 4 ° C até pronto para usar. </li></ol> 2. Preparação de meios, tampões, soluções e reagentes <ol><li> Preparar 1 L de solução salina equilibrada de Hank (HBSS) em água desionizada e adicionar HEPES 10 mM, NaHCO3 5 mM e EGTA 1 mM. Ajustar para pH 7,2-7,3 com NaOH. Filtrar o tampão com um filtro de 0,22 μm num frasco autoclavado. </li><li> Preparar 900 mL de meio de Eagle modificado por Dulbecco de alta glicose (DMEM) h em água desionizada. Adicionar NaHCO3 44 mM e ajustar o pH a 7,2-7,3 com HCl. Filtrar o meio com um filtro de 0,22 μm num frasco autoclavado. Adicionar 100 mL de bovi fetal(FBS) ao meio para se obter uma concentração de FBS de 10%. Armazenar a 4 ° C. </li><li> Preparar 1 L de tampão intracelular (KCl 125 mM, NaCl 25 mM, HEPES 10 mM, CaCl2 0,2 ​​mM, EGTA 0,5 mM, MgCl2 0,2 ​​mM) em água desionizada, e ajustar o pH a 7,25. O [Ca2 + ] final será ~ 100 nM. Antes da utilização, adicionar ATP 0,5 mM. Armazenar em temperatura ambiente. </li><li> Preparar 1 L de tampão Ringer (NaCl 121 mM, K2HPO4 2,4 mM, KH2PO4 0,4 ​​mM, HEPES 10 mM e MgCl2 1,2 mM) em água desionizada e ajustar o pH a 7,2. Armazenar em temperatura ambiente. Para usar, alíquota de 50 mL para um tubo de 50 mL e adicionar Ca 2+ 1,8 mM e glicose 10 mM. </li><li> Preparar 1 L de solução de enxágüe KCl (KCl 125 mM, NaCl 25 mM, HEPES 10 mM, MgCl2 0,2 ​​mM) em água desionizada e ajustar o pH a 7,25. </li><li> Dissolver 5 mg de ionomicina em 1 mL de sulfóxido de dimetilo (DMSO). Alíquota 30 μL em microtubos e armazenar a -206; C. </li><li> Preparar o estoque de ácido ciclopiazônico (CPA) por dissolução de CPA em DMSO. Certifique-se de que a percentagem final de DMSO é ≤ 1% para o CPA adicionado às células para evitar a apoptose. Preparar 4-cloro-m-cresol (4 cmc) 20 mM por dissolução em H2O filtrada e deixar dissolver durante a noite por agitação a 37 ° C. Preparar o estoque de ATP dissolvendo em H 2 O filtrado até 100 mM. </li><li> Para determinar o K d in situ , preparar 15 mL de cada um de EGTA 1 mM, 0,2 mM, 0,6 mM, 2 mM, 5 mM, 10 mM, 20 mM, 50 mM e 100 mM de Ca2 + em tampão de KCl utilizando uma solução de 100 MM de EGTA e uma pasta de CaCl2 1 M dissolvida em água desionizada. </li></ol> 3. Cultura celular <ol><li> Cultura de mioblastos C2C12 e células HEK293 de acordo com protocolos ATCC para cada utilização de placas de cultura celular de 10 cm numa cobertura de UV estéril. NOTA: As células C2C12 não devem ser deixadas crescer mais do que ~ 70% de confluência uma vez que os mioblastos começarão a diferenciarTe em myotubes. As células HEK293 e C2C12 crescem prontamente e não devem ser deixadas crescer após 100% de confluência para manter a integridade celular. Além disso, as células não devem ser passadas mais de 10 vezes antes de usá-los para uma experiência para preservar a saúde celular. </li></ol> 4. Transfecção de células HEK293 <ol><li> Semear as células HEK293 em lâminas de microscópio de vidro 22 mm x 40 mm esterilizadas em placas de 6 cm de modo que elas são ~ 70% confluentes no dia da transfecção. </li><li> No dia seguinte, siga o protocolo do fabricante para o reagente de transfecção para transfectar células utilizando 2 ug de ADNc de CatchER + e uma proporção de ADN: transfecção de 1: 3 (peso / volume) nos meios de soro reduzidos ( eg Opti-MEM). </li><li> Esvazie a mídia DMEM do prato e adicione 3 mL de meio soro reduzido. Adicionar ADN: mistura de reagente de transfecção à placa e incubar durante 4-6 h a 37 ° C. </li><li> Após incubação, lavar as células com 5-6 mL de HBSS. Descarte o HBSS fRom o prato e substituir por 3 mL de DMEM fresco e incuba-los a 37 ° C durante 48 h para permitir a expressão do GECI. </li><li> Transfecção de células mioblásticas C2C12 <ol><li> Para as células de mioblasto C2C12, trypsinize células através da adição de tripsina suficiente para cobrir o fundo do prato (1-2 mL). Coloque o prato em uma incubadora a 37 ° C por 2-6 min para permitir que a tripsina para afrouxar as células do fundo do prato. </li><li> Uma vez completada a incubação, remover a tripsina e aspirar as células em 8 mL de DMEM. Pipetar bem as células com o DMEM para dispersar uniformemente e re-suspender as células te e semeá-las em lamínulas estéreis em placas de cultura de células de 6 cm contendo 3 mL de DMEM de modo que a confluência final seja de 60%. </li><li> Transfectar as células no mesmo dia descrito no passo 4.2-4.3. Incubar durante 24 h a 37 ° C. </li><li> Repita o passo 4.4. </li></ol></li></ol> 5. Preparação do microscópio de diapositivas e fluorescência <ol><li> Ative mIcroscope e fonte de luz, abra o programa Simple PCI. Permitir que o microscópio para aquecer por 15-20 minutos ou até que o dispositivo de carga acoplada (CCD) câmera esfria a -65 ° C. Prepare a câmara e deslize com as células enquanto espera. </li><li> Cubra o fundo da câmara de imagem de banho de diamante aberto de baixo perfil com uma fina camada de vedante, usando um cotonete. </li><li> Retire a lâmina contendo as células transfectadas da incubadora e enxágüe suavemente três vezes com 1 mL de tampão de Ringer com glucose 10 mM e Ca 2+ 1,8 mM pré-aquecido a 37 ° C. </li><li> Deixe 1 mL de tampão Ringer no prato, para evitar que as células de secagem, e use fórceps para tirar o slide fora do prato. Permitir que a solução em excesso absorva em um tecido de laboratório, tocando a borda da lâmina para um tecido de laboratório. Em seguida, coloque no lado da câmara que contém a graxa com as células voltadas para cima em direção a graxa e segura a câmara sobre o palco de montagem usando uma chave de fenda. </li><li> Adicionar 1ML de tampï¿½ de Ringer ï¿½ cï¿½ara para impedir que as cï¿½ulas sequem ao montar a cï¿½ara no andar e completar o resto da configuraï¿½o do microscï¿½io. Uma vez que a mangueira de sucção de vácuo está ligada à câmara, o volume final da câmara é ~ 450 μL. </li><li> Mude o objetivo do microscópio para o objetivo de imersão de óleo 40X. </li><li> Use papel de lentes e solução de limpeza de lentes para limpar e secar o objetivo. Não esfregue o objetivo. Dab suavemente até que a superfície está limpa. </li><li> Adicione uma gota do óleo de imersão ao objetivo. </li><li> Coloque o suporte no microscópio e adicione a ponta do vácuo à câmara. Uma vez que a mangueira de sucção de vácuo está ligada à câmara e ligada, o volume final da câmara é de ~ 450 μL. Este volume final está nivelado com os lados da câmara. É imperativo que a solução da câmara seja nivelada, durante o experimento, para evitar que a solução derrame para baixo no objetivo devido ao enchimento excessivo. </li><lI&gt; Levante o objetivo e use o ajuste grosso até que o óleo no objetivo toque no fundo do slide. </li><li> Usando o modo de campo brilhante, ajuste o ganho para 175 eo tempo de exposição para 0,03 s para focalizar as células. </li><li> Uma vez que as células estão focadas, mude para o modo de fluorescência usando excitação de 488 nm. Alterar o tempo de exposição para 0.07 s. Localize um campo de visão que tenha células suficientes que sejam saudáveis ​​com fluorescência adequada à imagem. </li><li> Uma vez que um campo de visão foi escolhido, tirar fotos em fluorescência e campo brilhante modo. </li><li> Círculo de uma região de interesse (ROI) nas células ou círculo a célula inteira para gravar a intensidade da área escolhida. </li></ol> 6. Transtornos Ca 2+ induzidos por imagem e Calibração In Situ K d <ol><li> Inicie a medição de intensidade com a taxa de quadros ajustada em uma cada 5 s. </li><li> Permita que a intensidade da linha de base se estabilize durante 20 a 30 fotogramas (100-150 s). Se necessário, diminua o frAmes / s durante esta etapa para impedir o fotoblanqueamento. </li><li> Calcular a quantidade de 4 cmc necessária a partir de uma reserva de 20 mM com base no volume da câmara final de ~ 450 μL para se obter uma concentração final de 200 μM. Fazer diluições do estoque, se necessário. </li><li> Tomar cuidadosamente 60 μL de tampão Ringer da câmara e colocar num tubo de microcentrífuga. Diluir a quantidade calculada de 4 cmc com esta solução e adicionar novamente à câmara para evocar a resposta pretendida a partir das células que estão a ser formadas imagens. </li><li> Adicionar a quantidade calculada de 4 cmc ao tubo de microcentrífuga e misturar por pipetagem. </li><li> Adicione suavemente a solução sobre o campo de visão enquanto simultaneamente adiciona o marcador de evento na medição de intensidade. </li><li> Deixar tempo para que o fármaco se ligue ao receptor e subsequente diminuição do sinal, depois lavar com 3-6 mL de tampão de Ringer com Ca2 + 1,8 mM e glucose 10 mM enquanto adiciona simultaneamente o marcador de evento. Uma vez que o volume da câmara é 450 &amp;# 181; L e está ligado a um vácuo, a adição de 3-6 mL de tampão assegura que a primeira solução contendo o fármaco tenha sido removida por lavagem e substituída com a solução adicionada recentemente. </li><li> Repetir 6,1-6,7 para ATP 100 μM e CPA 15 μM, utilizando uma nova lâmina de células transfectadas para cada ensaio. </li><li> Quando a medição estiver concluída, termine a coleta de dados na janela de medição de intensidade no programa Simple PCI. </li><li> Tome fotos fluorescência e brightfield das células. </li><li> Abra o arquivo de dados para a experiência. Aqui, recriar as células ou regiões de interesse para recalcular os valores de intensidade, se necessário. </li><li> Para determinar o K d in situ em células de mioblasto C2C12, siga o protocolo como delineado na secção 4.2 e secção 5 e colocar 1 mL de tampão Ca 2+ Ringer 0 mM na câmara. <ol><li> Permeabilizar as células com 0,002-0,005% de saponina em tampão intracelular durante 15-30 s para esvaziar as células de qualquerCatchER + que pode estar no citosol. Lavar as células com 3-6 mL de 1 mL de EGTA em tampão KCl com ionomicina 10 μM. Permitir que a intensidade de diminuir até um platô é atingido. </li><li> Enxaguar com 3-6 mL de tampão KCl com ionomicina 10 μM e deixar a intensidade estabilizar, depois adicionar cada solução de Ca2 + detalhada no passo 2.7. Permitir que a intensidade de atingir um platô entre cada adição. </li></ol></li><li> Para calibrar o sensor para a quantificação basal [Ca2 + ], siga o passo 6.12. Utilizar o EGTA eo tampão Ca2 + 100 mM do passo 2.7 para obter a intensidade de fluorescência mínima e máxima. </li></ol> 7. Processamento de dados <ol><li> Faça o download do arquivo de planilha dos dados de medição de intensidade. </li><li> Normalize os dados para cada célula para a intensidade da linha de base (F / F 0 ). Trace os dados normalizados em função do tempo em qualquer programa gráfico. </li><li> Para calcular a% de alteração, subtraia o pico normalizado valUe de 1 e multiplicar por 100. Calcular a média eo desvio padrão se várias células foram visualizadas. </li><li> Para calcular a relação sinal / ruído, SNR, abrir o arquivo de imagem salva da experiência em um software de processamento de imagem, como ImageJ, e depois medir o sinal, células transfectadas e ruído de fundo. Calcule o SNR usando a equação SNR = sinal / ruído. </li><li> Para calcular o K j in situ a partir dos dados de imagem de fluorescência recolhidos, mede-se os dados de intensidade, compreendendo os platôs, após adição de cada concentração de Ca2 + e EGTA (0 mM Ca2 + ). Calcular a saturação fracionária (intensidade relativa) usando θ = (F - F min ) / (Fmax - F min ), onde θ é a intensidade relativa, F é a fluorescência em qualquer ponto, F min é a intensidade de fluorescência mínima e F max é a intensidade de fluorescência máxima, para ver a mudança na intensidade de tEle sonda com a adição de Ca 2 + em comparação com a intensidade mínima. Trace os dados de intensidade relativa contra o [Ca2 + ] em qualquer programa gráfico e de ajuste de curvas. Utilize a equação de ligação 1: 1 θ = [M T ] / (K d + [M T ]) traduzida para qualquer programa gráfico e de ajuste de curva para calcular o K d . M T é a concentração total de metal. </li><li> Para quantificar o cálcio basal a partir da calibração delineada em 6.13, a média dos dados de intensidade, compreendendo os platôs, após a adição de EGTA 1 mM (F min ) e 100 mM Ca 2+ (F max ). Utilizar a equação de calibração [Ca2 + ] = Kd ([F - Fmin) / (Fmax - F)] para calcular o cálcio basal. </li></ol>

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Os autores não têm nada a revelar.

A imagiologia com células vivas de sondas fluorescentes, tal como CatchER + , é uma técnica eficaz para analisar processos de sinalização intrínsecos de ER / SR Ca2 + em cada célula em resposta a agonistas ou antagonistas de receptores. Esta técnica também é útil para imagens usando múltiplos comprimentos de onda simultaneamente, como necessário para Fura-2 ou para a imagem CatchER + e Rhod-2 em conjunto para monitorar ER e citosólicas alterações de cálcio, respectivamente. Existem várias etapas críticas neste protocolo; Transfecção celular pode ter um grande efeito sobre a viabilidade da imagem. Baixas taxas de transfecção podem resultar em expressão insuficiente do GECI para monitorar as respostas ao cálcio. Por outro lado, a sobreexpressão de CatchER + não terá um efeito tampão sobre ER / ER Ca 2+ , um problema associado com corantes sintéticos de cálcio. Os efeitos tampão das sondas de Ca2 + são influenciados pelo [Ca2 + ] na organela, o Kd da pRótula ea concentração da sonda necessária para a medição. O citosólico [Ca2 + ] está tipicamente na gama nanomolar baixa, no entanto, a concentração de sonda necessária está numa gama comparável. Neste caso, a quantidade de concentração de corante e a sua capacidade para tamponar cálcio citosólico foi, e é, uma grande preocupação para a formação de imagens celulares. Em contraste, ER / SR [Ca2 + ] está na faixa de 100s de micromolar a milimolar 31 como foi determinado para diferentes linhas de células de mamífero 25 . Uma vez que a expressão de 0,1-1 μM de CatchER + é suficiente para permitir a detecção de cálcio ER, o efeito de tamponamento de CatchER é negligenciável. Deste modo, CatchER + pode monitorizar o fluxo de Ca2 + em ambientes elevados de [Ca2 + ] sem qualquer efeito tampão na luminal ER / SR Ca2 + 32 . Vários fatores podem afetar a eficiência de transfecção do GECI, como o tempo deE o reagente de transfecção, a temperatura de incubação e a confluência celular. A confluência celular, quando se semeia as células no slide, pode afetar significativamente a qualidade da imagem. A baixa confluência pode resultar em um número baixo de células (n) e menor precisão estatística, enquanto altos níveis de confluência levam a camadas sobrepostas de células produzindo grandes variáveis ​​na imagem. O tempo e a temperatura para a transfecção devem ser optimizados com base no tipo de célula. Adicionalmente, a adição de DMEM com meios de soro reduzidos é óptima para tempos de transfecção mais longos para evitar a apoptose. A fluorescência GECI CatchER original em células de mamífero, quando cultivada e transfectada, era apenas de 30 ° C. A fluorescência de CatchER foi optimizada com sucesso e melhorada para expressão a 37 ° C resultando na nova variante melhorada CatchER + . Pode ser realizada uma transferência de Western utilizando um anticorpo contra EGFP para confirmar a expressão da sonda de Ca2 + . Além disso, o meE a consistência da distribuição do reagente são críticas. Os reagentes podem ser adicionados à câmara por perfusão, difusão de pequeno volume ou por bombas mecânicas, o que pode provocar respostas diferentes. É imperativo que a câmara de solução esteja devidamente selada aplicando uma camada de gordura vedante no fundo da câmara que será colocada sobre a corrediça. Os comprimentos de onda corretos devem ser selecionados para a sonda. Os comprimentos de onda de excitação e emissão para CatchER + são 395/488 nm e 510 nm, respectivamente. Para imagens de células, apenas 488 nm é utilizado para excitação para evitar o efeito prejudicial da luz UV sobre as células. Por conseguinte, a utilização de quaisquer filtros ópticos que excitam a 488 nm e recolham a emissão a 510 nm seria aceitável para utilização com a imagem com CatchER + . Para evitar o foto-branqueamento, os esforços podem ser focados para otimizar a intensidade da luz e a exposição à luz, como quadros / s 33 . Enquanto este protocolo é ideal para analisar o effDas alterações ER / SR usando a sonda fluorescente CatchER + Ca 2+ ER / SR, há limitações esperadas em qualquer experimento. Uma vez que a imagiologia viva de célula única analisa apenas um pequeno quadro de células, o número de células (n) pode variar de 1 a 100 células, em média, mas pode ser menor para linhas de células maiores. Isto leva a números de células mais baixos e resultados estatisticamente variados sem ensaios múltiplos. Um n&gt; 6 é necessário para a precisão estatística. Para obter um n maior, muitos pratos devem ser fotografados ou outras técnicas devem ser utilizadas, simultaneamente. Além disso, CatchER + é uma única sonda de comprimento de onda ER / SR Ca 2+ , isto leva a questões de outras sondas de comprimento de onda único e corantes com não ser capaz de quantificar o sinal, não saber se o sinal é verdadeiro em oposição à interrupção das células Artefato, e tendo maior ruído, em comparação com sistemas ratiometric 34 . Este trabalho mostra que essas sondas de Ca 2+ otimizadasSer aplicados em diferentes tipos de células ou tipos de tecidos para monitorizar a libertação de Ca / 2 mediada por receptor ER / SR. CatchER + é uma sonda de comprimento de onda único ER / SR Ca2 + . Portanto, é importante que os parâmetros e configurações experimentais sejam consistentes para a medição quantitativa. Uma calibração detalhada da concentração de cálcio e K d do sensor de cálcio nas linhas celulares são medidas adicionais importantes para a análise quantitativa. Esses sensores de cálcio desenvolvidos também podem ser direcionados a locais específicos dentro da ER / SR para monitorar os diferentes transientes Ca 2+ que existem em comparação com as alterações globais de Ca 2+ em várias condições biológicas e patológicas. Estes achados irão continuar a empurrar os campos de Ca 2 + imagiologia e sonda design para a frente para fornecer ferramentas futuras para diagnosticar Ca 2 + -related doenças. Os protocolos relatados e sensor desenvolvido também podem ser adaptados para droga dCoberturas contra doenças associadas à sinalização do cálcio.

Os atributos espaço-temporais dos transientes de cálcio intracelular (Ca 2+ ) ativam várias funções biológicas 1 . Estes eventos de sinalização de Ca2 + são desencadeados extracelularmente através de diferentes estímulos e controlados intracelularmente pela maior organela de armazenamento de Ca2 + e por numerosas bombas de Ca2 + , canais e proteínas de ligação de Ca2 + . Os transientes de Ca 2+ podem ser significativamente alterados como resultado de defeitos com modulação do sinal, levando a diferentes doenças 2 . Devido à velocidade e complexidade do sistema de sinalização Ca 2+ , com o retículo endo- (ER) e sarcoplasmático (SR) no centro, sondas de Ca 2+ geneticamente codificadas que foram otimizadas para expressão de mamíferos com cinética rápida são necessárias Para observar global e local Ca 2 + mudanças em diferentes células 3 . O ER eo SR, Sua contrapartida em células musculares, são os principais organelos de armazenamento intracelular de Ca 2+ e atuam como sumidouros de Ca 2+ que ajudam a amplificar o sinal de Ca 2+ 4 . O ER / SR é parte integrante da sinalização Ca 2+ com papéis duais como transmissor e receptor de sinais 5 . O receptor de rianodina (RyR) e o receptor de inositol 1,4,5-trifosfato (IP3R) são receptores de libertação de Ca2 + localizados nas membranas da ER / SR reguladas por Ca2 + 6 . Outros agentes estimulam directa ou indirectamente a função destes receptores. O 4-cloro-m-cresol (4 cmc) é um potente agonista do RyR, tendo uma sensibilidade 10 vezes maior do que a cafeína para induzir a libertação de SR Ca 2+ onde ambos são regularmente utilizados para estudar a libertação de Ca 2+ mediada por RyR Saudáveis ​​e doentes 7 . ATP aumenta Ca 2 + mediado por IP 3Locação através do IP 3 R 8 . O ATP liga-se ao receptor purinérgico P2YR, um receptor acoplado à proteína G (GPCR), desencadeando a produção de IP 3 que se liga ao IP 3 R para libertar Ca 2+ do ER 9 , 10 . A bomba de ATPase de cálcio reticular sarco-endoplasmático (SERCA) é uma bomba ATPase de tipo P, também localizada na membrana ER / SR que reduz o Ca 2+ citosólico e reabastece o ER / SR ao bombear ativamente o íon no lúmen ER / SR 11 . Inibidores específicos da bomba SERCA incluem tapsigargina, de Thapsia garganica e ácido ciclopiazónico (CPA), de Aspergillus e Penicillium . O CPA tem uma baixa afinidade para a bomba e bloqueia reversivelmente o ponto de acesso Ca 2 + 12 . A tapsigargina, por outro lado, liga-se irreversivelmente à bomba livre de Ca2 + no resíduo F256 na hélice M3 com nanomolAr afinidade 11 . Analisar e quantificar as alterações envolvidas nos eventos estimulados com Ca2 + tem sido e continua a ser um desafio. Uma vez que o ER / SR é o maior subcelular Ca 2 + contendo compartimento com uma função central na propagação do Ca 2 + sinal, muito trabalho tem sido focada na compreensão ER / SR Ca 2 + sinalização 5 . A criação de corantes sintéticos de Ca 2 + ajudou a avançar o campo ea prática de Ca 2 + imagem. Embora corantes, como o Mag-Fura-2, tenham sido amplamente utilizados para medir o Ca 2+ compartimentado em diferentes células, 13,14,15 têm limitações tais como carga de corante desigual, fotodegradação ea incapacidade de ser direcionado para organelas específicas . A descoberta da proteína verde fluorescente (GFP) eo avanço da proteína fluorescente-Baseado Ca 2 + propulsou o campo de Ca 2 + imagem para a frente 16 . Alguns dos GECIs existentes são pares de transferência de energia de ressonância de Förster (FRET) envolvendo proteína fluorescente amarela (YFP), proteína fluorescente ciana (CFP), calmodulina e o péptido de ligação a M13 17 , 18 . Os GECI baseados em troponina C também estão disponíveis como pares FRET de CFP e Citrino e como sondas únicas de fluoróforo 19 , 20 , 21 . Outros, tais como GCaMP2 e R-GECO são sensores de fluoróforo único envolvendo calmodulina 22 , 23 . Para ultrapassar as limitações da afinação estreita de Kd e da ligação cooperativa associada a múltiplos locais de ligação de Ca2 + encontrados nos seus domínios de ligação a Ca2 + 24 , uma nova classe de cálcio senSors foi criado por projetar um local de ligação Ca 2 + na superfície do barril beta em um local sensível ao cromóforo de proteína verde fluorescente reforçada (EGFP) 25 , 26 . Este altamente touted sensor, chamado CatchER, tem um K d de ~ 0.18 mM, ak em perto do limite de difusão, e ak off de 700 s -1 . CatchER tem sido utilizado para monitorizar a libertação de cálcio ER / SR mediada por receptor em diferentes linhas de células de mamífero tais como HeLa, HEK293 e C2C12 25 . Devido à sua cinética rápida, o CatchER foi utilizado em fibras musculares flexor digitorum brevis (FDB) de jovens e velhos ratos Friend Friend B NIH Jackson (FVB) para revelar que mais Ca 2 + permanece no SR após 2 s de despolarização no FDB De camundongos velhos em comparação com a de camundongos jovens 27 . Para superar a sua baixa fluorescência a 37 ° C, o que dificulta as suas aplicações na imagiologia de cálcio de mamíferosCélulas, desenvolvemos uma versão melhorada do CatchER chamado CatchER + . CatchER + exibe fluorescência melhorada a 37 ° C para melhor aplicação em células de mamífero. Foram incorporadas mutações adicionais no CatchER para melhorar a termoestabilidade e fluorescência a 37 ° C 28 , 29 , para criar CatchER + . CatchER + exibe um aumento de seis vezes em sua relação sinal / ruído (SNR) sobre CatchER 30 . Aqui são apresentados os protocolos para a cultura e transfecção de células HEK293 e C2C12 com CatchER + e a sua aplicação para monitorizar transientes de cálcio mediados por receptores ER / SR. Apresentam-se resultados representativos para CatchER + expresso em células HEK293 tratadas com 4 cmc, CPA e ATP. Nós também fornecemos um protocolo para determinar o K d in situ de CatchER + em células de mioblasto C2C12 e quaNação de Ca2 + ] basal.

<table><tbody><tr><td>4-Chloro-3-methylphenol (4-CmC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C55402</td><td></td></tr><tr><td>515DCXR dichroic mirror</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>NC338059</td><td></td></tr><tr><td>Adenosine 5&amp;prime;-triphosphate disodium salt hydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A26209</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride dihydrate</td><td>EMD Millipore</td><td>102382</td><td></td></tr><tr><td>Corning tissue-culture treated culture dishes (100 mm)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430167</td><td></td></tr><tr><td>Corning tissue-culture treated culture dishes (60 mm)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430166</td><td></td></tr><tr><td>Cyclopiazonic Acid (CPA)</td><td>EMD Millipore</td><td>239805</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Glucose</td><td>ACROS Organics</td><td>41095-0010</td><td></td></tr><tr><td>Dow Corning 111 Valve Lubricant &amp;amp; Sealant</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0275</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Modified Eagle&amp;rsquo;s Medium (DMEM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D7777</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenebis(oxyethylenenitrilo)&lt;br/&gt; tetraacetic Acid (EGTA)</td><td>ACROS Organics</td><td>409911000&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>ThermoFisher</td><td>26140087</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Cover Glasses 22x40 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>&amp;nbsp;12-544B</td><td></td></tr><tr><td>Hanks&amp;rsquo; Balanced Salts (HBSS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4891</td><td></td></tr><tr><td>HEPES, Free Acid, Molecular Biology Grade</td><td>EMD Millipore</td><td>391340</td><td></td></tr><tr><td>Immersion Oil without autofluorescence</td><td>Leica</td><td>11513859</td><td></td></tr><tr><td>Ionomycin, Free Acid</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-230-5804</td><td></td></tr><tr><td>Leica DM6100B inverted microscope with a cooled EM-CCD camera</td><td>Hamamatsu</td><td>C9100-13</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 Transfection Reagent</td><td>ThermoFisher</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000 Transfection Reagent</td><td>ThermoFisher</td><td>L3000015</td><td></td></tr><tr><td>Low Profile Open Diamond Bath Imaging Chamber</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-26GLP</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Chloride Hexahydrate</td><td>Fisher Scientific</td><td>M33-500</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>ThermoFisher</td><td>51985034</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Chloride</td><td>EMD Millipore</td><td>PX1405</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Phosphate, Dibasic</td><td>EMD Millipore</td><td>PX1570</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Phosphate, Monobasic</td><td>EMD Millipore</td><td>PX1565</td><td></td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>SimplePCI Image Analysis Software</td><td>Hamamatsu</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Bicarbonate</td><td>Fisher Scientific</td><td>S233-3</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-500</td><td></td></tr><tr><td>Sterivex-GV 0.22 &amp;micro;m filter</td><td>EMD Millipore</td><td>SVGVB1010</td><td></td></tr><tr><td>Till Polychrome V Xenon lamp</td><td>Till Photonics</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin (2.5%), no phenol red (10x)</td><td>ThermoFisher</td><td>15090046</td><td></td></tr></tbody></table>

monitoring er/sr calcium release with the targeted ca2+ sensor catcher+

Os transientes intracelulares de cálcio (Ca2 + ) evocados por estímulos extracelulares iniciam uma multiplicidade de processos biológicos em organismos vivos. No centro da libertação de cálcio intracelular estão as principais organelas de armazenamento de cálcio intracelular, o retículo endoplasmático (RE) eo retículo sarcoplasmático (SR) mais especializado nas células musculares. A liberação dinâmica de cálcio a partir destas organelas é mediada pelo receptor de rianodina (RyR) e pelo receptor de inositol 1,4,5-trifosfato (IP3R) com reenchimento ocorrendo através da bomba sarco / retina de cálcio reticular ATPase (SERCA). Um sensor de cálcio geneticamente codificado (GECI) chamado CatchER foi criado para monitorar a rápida liberação de cálcio do ER / SR. Aqui, os protocolos detalhados para a transfecção e expressão do GECI CatchER + melhorado em células HEK293 e C2C12 direccionadas para ER / SR e a sua aplicação na monitorização de transiente de cálcio mediado por bomba IP3R, RyR e SERCAS em células HEK293 utilizando microscopia de fluorescência é delineada. O agonista ou inibidor de receptor de escolha está disperso na solução de câmara e as alterações de intensidade são registadas em tempo real. Com este método, observa-se uma diminuição do cálcio ER com a activação de RyR com 4-cloro-m-cresol (4 cmc), a activação indirecta de IP3R com adenosina trifosfato (ATP) ea inibição da bomba SERCA com ciclopiazónico Ácido (CPA). Também discutimos protocolos para determinar o in situ K d e quantificação basal [Ca 2 + ] em C2C12 células. Em resumo, estes protocolos, utilizados em conjunto com CatchER + , podem desencadear a libertação de cálcio mediada pelo receptor a partir da ER com aplicação futura no estudo de ER / SR relacionadas com cálcio patologias.

Esta secção irá ilustrar os resultados que foram alcançados utilizando os métodos descritos anteriormente utilizando o optimizado ER / SR-alvo GECI CatchER + para monitorar mudanças em ER / SR Ca 2 + através de diferentes vias mediadas pelo receptor. A Figura 1 ilustra o esvaziamento de ER através do RyR estimulado com 200 μM de 4 cmc. 4-cmc é um agonista do RyR. A adição do fármaco induz uma diminuição no cálcio ER medida pela diminuição da intensidade de fluorescência CatchER + . Conforme marcado, o protocolo delineado aqui permite a visualização e medição de receptores mediados Ca 2 + transientes usando CatchER +, que fornece informações sobre as alterações em ER Ca 2 + . Conforme ilustrado na Figura 2 , a adição de 1CPA 5 μM, para bloquear reversivelmente a bomba SERCA, produz uma grande diminuição na intensidade de fluorescência que forma um platô. Uma vez que a função da bomba SERCA é inibida, os canais de libertação de ER Ca2 + estão ainda a libertar activamente Ca2 + no citosol fazendo com que a intensidade de fluorescência diminua. As cï¿½ulas recuperam-se apï¿½ lavagem de CPA com tampï¿½ de Ringer contendo Ca 2+ 1,8 mM e glicose 10 mM. Estes resultados confirmam a capacidade de CatchER + para monitorizar os transientes de Ca2 + específicos para a bomba SERCA. A Figura 3 mostra dados representativos para a activaï¿½o indirecta do IP 3 R com ATP 200 ï¿½ em cï¿½ulas HEK293 transfectadas com CatchER + . O ATP liga-se ao receptor P2Y, um receptor acoplado à proteína G, que gera IP 3 que activa a libertação de Ca2 + através do IP 3 R. Embora a alteraçãoÉ pequena, a adição de 200 μM de ATP produz uma diminuição visível na intensidade do sinal. A lavagem das células com tampão de Ringer contendo Ca 2+ 1,8 mM e glucose a 10 mM permite que o RE reabasteça eo sinal para voltar à linha de base. Estes resultados realçam a capacidade de CatchER + monitorizar a libertação de cálcio mediada por IP 3 R através de estimulação indirecta. Na Figura 4 , CatchER + foi transfectado em células de mioblasto C2C12 para determinar o K j in situ . Os dados foram recolhidos como descrito no protocolo. As células de mioblasto C2C12 foram permeabilizadas com saponina a 0,005% durante 15-30 s e depois lavadas com EGTA 1 mM em tampão KCl contendo 10 uM de ionomicina. As várias concentrações de Ca2 + foram preparadas em tampão KCl contendo 10 uM de ionomicina e foram adicionadas de um modo passo a passo. Os dados foram normalizados e ajustados utilizando a ligação 1: 1Equação. A média Kd foi de 3,1 ± 1,4 mM para 7 células. A afinidade fraca de CatchER + permite que ele detecte Ca 2 + em organelos de Ca 2+ alto como o ER ou SR. Para determinar o Ca2 + basal na SR, as células C2C12 foram permeabilizadas com 0,005% de saponina durante 15-30 s, lavadas com tampão KCl e depois lavadas com EGTA 1 mM em tampão KCl contendo 10 uM de ionomicina para obter F min . Depois de se ter lavado o EGTA com tampão KCl, adicionou-se um máximo, Fmax, 100 mM de Ca2 + com 10 uM de ionomicina. O Ca2 + basal foi calculado como sendo 0,4 ± 0,2 mM. <img alt="figura 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55822/55822fig1.jpg" /> Figura 1: Estimulação de RyR utilizando 4-cmc em células HEK293. ( A ) Descrição da activação de RyR com 4 cmc. ( B ) Gravação de intensidade de células HEK293Transfectadas com CatchER + , localizadas na ER, tratadas com 200 μM 4-cmc. A estimulação do RyR com 4 cmc provoca uma diminuição na intensidade de fluorescência normalizada que se correlaciona directamente com uma diminuição de [Ca2 + ] ER . N refere-se ao número de células fotografadas. A diminuição média do sinal foi de 12,0 ± 2,2%. A presença de Ca 2+ 1,8 mM no tampão de Ringer facilitou o reenchimento do RE refletido na recuperação de intensidade até à linha de base. As imagens inseridas mostram as células antes e depois do tratamento com 4 cmc. A SNR foi calculada em 4,3 ± 0,8. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55822/55822fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55822/55822fig2.jpg" /> Figura 2: Diminuição de [Ca2 + ] ER utilizando o método reversível SERCA pUmp inibidor CPA em células HEK293. ( A ) A inibição da bomba SERCA por CPA. ( B ) Imagens ao vivo de células HEK293 transfectadas com CatchER + , localizadas na ER, tratadas com CPA 15 μM. Porque Ca 2 + ainda pode fluir através do IP 3 R e RyR, bloqueando a bomba SERCA com CPA provoca uma diminuição na intensidade de fluorescência normalizada que diretamente correlaciona a uma diminuição de [Ca 2 + ] ER . N refere-se ao número de células fotografadas. As imagens inseridas são células HEK293 transfectadas com CatchER + antes e depois do tratamento. A diminuição média do sinal foi de 21,0 ± 0,3%. A presença de Ca 2+ 1,8 mM no tampão de Ringer facilitou o reenchimento do RE refletido na recuperação de intensidade até à linha de base. A SNR foi calculada como sendo de 5,5 ± 0,8. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55822/55822fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior</a>esta figura. <img alt="Figura 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55822/55822fig3.jpg" /> Figura 3: ATP diminui [Ca2 + ] ER em células HEK293. ( A ) Esquema da ativação indireta de IP3R com ATP através do receptor purinérgico P2YR. P2YR é um GPCR que gera IP 3 após ligação a ATP. O IP 3 activa o IP 3 R, estimulando a libertação de cálcio da ER. ( B ) Imagens em tempo real de células HEK293 transfectadas com CatchER + , localizadas na ER, tratadas com ATP 200 μM. A estimulação indirecta do IP 3 R através do receptor P2Y com ATP provoca uma diminuição na intensidade de fluorescência normalizada que se correlaciona directamente com uma diminuição de [Ca2 + ] ER . N refere-se ao número de células fotografadas. A diminuição média do sinal foi de 6,0 ± 3,0%. SNR foi cFoi de 6,7 ± 2,7. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55822/55822fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55822/55822fig4.jpg" /> Figura 4: Kd in situ de CatchER + em células de mioblasto C2C12. Traço representativo para a intensidade normalizada recolhida a partir de células de mioblasto C2C12 permeabilizadas transfectadas com CatchER + . As células foram permeabilizadas com 0,005% de saponina em tampão intracelular durante 15-30 s. As soluções de EGTA e Ca2 + foram preparadas em tampão KCl, n refere-se ao número de células fotografadas. ( A ) As imagens de fluorescência de inserção são representativas das células antes e depois do tratamento. 0,3, 0,6, 2, 5, 10, 20, 50 e 100 mM de Ca2 + foram adicionados a células de mioblasto C2C12 permeabilizadas na presença de 10 uMIonomicina para obter uma Kd de 3,1 ± 1,4 mM. ( B ) As imagens de fluorescência inseridas são representativas de células a valores mínimos e máximos, após adição de 1 mM de EGTA e 100 mM de Ca2 + com 10 uM de ionomicina cada, respectivamente. O Ca2 + basal foi calculado como sendo 0,4 ± 0,2 mM. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55822/55822fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Monitoring ER/SR Calcium Release with the Targeted Ca2+ Sensor CatchER+

Apresentamos protocolos para a aplicação de nosso indicador de cálcio codificado geneticamente codificado (GECI) CatchER + para monitorar transientes rápidos de cálcio no retículo endoplasmático / sarcoplasmático (ER / SR) de HEK293 e células C2C12 de músculo esquelético usando microscopia de fluorescência em tempo real. Um protocolo para a medição e calibração in situ K d também é discutido.

Monitorização da libertação de cálcio ER / SR com o Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Captador<sup-benzóico.</sup

Intracellular calcium (Ca2+) transients evoked by extracellular stimuli initiate a multitude of biological processes in living organisms. At the center of ...

monitoring-ersr-calcium-release-with-the-targeted-ca2-sensor-catcher

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Monitoring ER/SR Calcium Release with the Targeted Ca2+ Sensor CatchER+

14.8K visualizações.  Georgia State University.  Apresentamos protocolos para a aplicação de nosso indicador de cálcio codificado geneticamente codificado (GECI) CatchER + para monitorar transientes rápidos de cálcio no retículo endoplasmático / sarcoplasmático (ER / SR) de HEK293 e células C2C12 de músculo esquelético usando microscopia de fluorescência em tempo real. Um protocolo para a medição e calibração in situ K d também é discutido. 

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Monitoring Changes in the Intracellular Calcium Concentration and Synaptic Efficacy in the Mollusc Aplysia

It has been suggested that changes in intracellular calcium mediate the induction of a number of important forms of synaptic plasticity (e.g., homosynaptic facilitation) 1. These hypotheses can be tested by simultaneously monitoring changes in intracellular calcium and alterations in synaptic efficacy. We demonstrate how this can be accomplished by combining calcium imaging with intracellular recording techniques. Our experiments are conducted in a buccal ganglion of the mollusc Aplysia californica. This preparation has a number of experimentally advantageous features: Ganglia can be easily removed from Aplysia and experiments use adult neurons that make normal synaptic connections and have a normal ion channel distribution. Due to the low metabolic rate of the animal and the relatively low temperatures (14-16 &deg;C) that are natural for Aplysia, preparations are stable for long periods of time. 
To detect changes in intracellular free calcium we will use the cell impermeant version of Calcium Orange 2 which is easily 'loaded' into a neuron via iontophoresis. When this long wavelength fluorescent dye binds to calcium, fluorescence intensity increases. Calcium Orange has fast kinetic properties 3 and, unlike ratiometric dyes (e.g., Fura 2), requires no filter wheel for imaging. It is fairly photo stable and less phototoxic than other dyes (e.g., fluo-3) 2,4. Like all non-ratiometric dyes, Calcium Orange indicates relative changes in calcium concentration. But, because it is not possible to account for changes in dye concentration due to loading and diffusion, it can not be calibrated to provide absolute calcium concentrations. 
An upright, fixed stage, compound microscope was used to image neurons with a CCD camera capable of recording around 30 frames per second. In Aplysia this temporal resolution is more than adequate to detect even a single spike induced alteration in the intracellular calcium concentration. Sharp electrodes are simultaneously used to induce and record synaptic transmission in identified pre- and postsynaptic neurons. At the conclusion of each trial, a custom script combines electrophysiology and imaging data. To ensure proper synchronization we use a light pulse from a LED mounted in the camera port of the microscope. Manipulation of presynaptic calcium levels (e.g. via intracellular EGTA injection) allows us to test specific hypotheses, concerning the role of intracellular calcium in mediating various forms of plasticity.

Monitoring Changes in the Intracellular Calcium Concentration and Synaptic Efficacy in the Mollusc Aplysia

We demonstrate how changes in the intracellular free calcium concentration and synaptic efficacy can be simultaneously monitored in a ganglion preparation of Aplysia. We image intracellular calcium using a fluorescent dye, Calcium Orange, and induce and monitor synaptic transmission with sharp (intracellular) electrodes.

Alterações de monitoramento da concentração de cálcio intracelular e eficácia sináptica no Molusco<em&gt; Aplysia</em

It has been suggested that changes in intracellular calcium mediate the induction of a number of important forms of synaptic plasticity (e.g., ...

Neurociência

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, well-characterized nervous system allows identification and fluorescence imaging of any neuron within the intact animal. Simple immobilization techniques with minimal impact on the animal's physiology allow extended time-lapse imaging. The development of genetically-encoded calcium sensitive fluorophores such as cameleon 1 and GCaMP 2 allow in vivo imaging of neuronal calcium relating both cell physiology and neuronal activity. Numerous transgenic strains expressing these fluorophores in specific neurons are readily available or can be constructed using well-established techniques. Here, we describe detailed procedures for measuring calcium dynamics within a single neuron in vivo using both GCaMP and cameleon. We discuss advantages and disadvantages of both as well as various methods of sample preparation (animal immobilization) and image analysis. Finally, we present results from two experiments: 1) Using GCaMP to measure the sensory response of a specific neuron to an external electrical field and 2) Using cameleon to measure the physiological calcium response of a neuron to traumatic laser damage. Calcium imaging techniques such as these are used extensively in C. elegans and have been extended to measurements in freely moving animals, multiple neurons simultaneously and comparison across genetic backgrounds. C. elegans presents a robust and flexible system for in vivo neuronal imaging with advantages over other model systems in technical simplicity and cost.

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

With its small transparent body, well-documented neuroanatomy and a host of amenable genetic techniques and reagents, C. elegans makes an ideal model organism for in vivo neuronal imaging using relatively simple, low-cost techniques. Here we describe single neuron imaging within intact adult animals using genetically encoded fluorescent calcium indicators.

Na imagem cálcio vivo Neuronal em C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Live Cell Calcium Imaging Combined with siRNA Mediated Gene Silencing Identifies Ca2+ Leak Channels in the ER Membrane and their Regulatory Mechanisms

In mammalian cells, the endoplasmic reticulum (ER) plays a key role in protein biogenesis as well as in calcium signalling1. The heterotrimeric Sec61 complex in the ER membrane provides an aqueous path for newly-synthesized polypeptides into the lumen of the ER. Recent work from various laboratories suggested that this heterotrimeric complex may also form transient Ca2+ leak channels2-8. The key observation for this notion was that release of nascent polypeptides from the ribosome and Sec61 complex by puromycin leads to transient release of Ca2+ from the ER. Furthermore, it had been observed in vitro that the ER luminal protein BiP is involved in preventing ion permeability at the level of the Sec61 complex9,10. We have established an experimental system that allows us to directly address the role of the Sec61 complex as potential Ca2+ leak channel and to characterize its putative regulatory mechanisms11-13. This system combines siRNA mediated gene silencing and live cell Ca2+ imaging13. Cells are treated with siRNAs that are directed against the coding and untranslated region (UTR), respectively, of the SEC61A1 gene or a negative control siRNA. In complementation analysis, the cells are co-transfected with an IRES-GFP vector that allows the siRNA-resistant expression of the wildtype SEC61A1 gene. Then the cells are loaded with the ratiometric Ca2+-indicator FURA-2 to monitor simultaneously changes in the cytosolic Ca2+ concentration in a number of cells via a fluorescence microscope. The continuous measurement of cytosolic Ca2+ also allows the evaluation of the impact of various agents, such as puromycin, small molecule inhibitors, and thapsigargin on Ca2+ leakage. This experimental system gives us the unique opportunities to i) evaluate the contribution of different ER membrane proteins to passive Ca2+ efflux from the ER in various cell types, ii) characterize the proteins and mechanisms that limit this passive Ca2+ efflux, and iii) study the effects of disease linked mutations in the relevant components.

Live Cell Calcium Imaging Combined with siRNA Mediated Gene Silencing Identifies Ca2+ Leak Channels in the ER Membrane and their Regulatory Mechanisms

The endoplasmic reticulum plays a key role in protein biogenesis and in calcium homeostasis. We have established an experimental system that allows us to address the role of Ca2+ leak channels and to characterize their putative regulatory mechanisms. This system involves siRNA mediated gene silencing and live cell Ca2+ imaging.

Imagens ao vivo de cálcio celular Combinado com siRNA silenciamento gênico mediado Identifica Ca 2 + Canais de vazamento na membrana ER e seus mecanismos de regulação

In mammalian cells, the endoplasmic reticulum (ER) plays a key role in protein biogenesis as well as in calcium signalling1. The heterotrimeric Sec61 ...

Biologia

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized animals. Highly sensitive, genetically encoded fluorescent reporters of Ca2+ have revolutionized the recording of cell and synaptic activity using non-invasive optical approaches in behaving animals. When combined with genetic and optogenetic techniques, the molecular mechanisms that modulate cell and circuit activity during different behavior states can be identified.
Here we describe methods for ratiometric Ca2+ imaging of single neurons in freely behaving Caenorhabditis elegans worms. We demonstrate a simple mounting technique that gently overlays worms growing on a standard Nematode Growth Media (NGM) agar block with a glass coverslip, permitting animals to be recorded at high-resolution during unrestricted movement and behavior. With this technique, we use the sensitive Ca2+ reporter GCaMP5 to record changes in intracellular Ca2+ in the serotonergic Hermaphrodite Specific Neurons (HSNs) as they drive egg-laying behavior. By co-expressing mCherry, a Ca2+-insensitive fluorescent protein, we can track the position of the HSN within ~ 1 &#181;m and correct for fluctuations in fluorescence caused by changes in focus or movement. Simultaneous, infrared brightfield imaging allows for behavior recording and animal tracking using a motorized stage. By integrating these microscopic techniques and data streams, we can record Ca2+ activity in the C. elegans egg-laying circuit as it progresses between inactive and active behavior states over tens of minutes.

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

This protocol describes the use of genetically encoded Ca2+ reporters to record changes in neural activity in behaving Caenorhabditis elegans worms. &#8195;

Imagem de cálcio Ratiometric de neurônios individuais se comportando Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized ...

Dissection of Local Ca2+ Signals in Cultured Cells by Membrane-targeted Ca2+ Indicators

Calcium ion (Ca2+) is a universal intracellular messenger molecule that drives multiple signaling pathways, leading to diverse biological outputs. The coordination of two Ca2+ signal sources&#8212;&#8220;Ca2+ influx&#8221; from outside the cell and &#8220;Ca2+ release&#8221; from the intracellular Ca2+ store endoplasmic reticulum (ER)&#8212;is considered to underlie the diverse spatio-temporal patterns of Ca2+ signals that cause multiple biological functions in cells. The purpose of this protocol is to describe a new Ca2+ imaging method that enables monitoring of the very moment of &#8220;Ca2+ influx&#8221; and &#8220;Ca2+ release&#8221;. OER-GCaMP6f is a genetically encoded Ca2+ indicator (GECI) comprising GCaMP6f, which is targeted to the ER outer membrane. OER-GCaMP6f can monitor Ca2+ release at a higher temporal resolution than conventional GCaMP6f. Combined with plasma membrane-targeted GECIs, the spatio-temporal Ca2+ signal pattern can be described at a subcellular resolution. The subcellular-targeted Ca2+ indicators described here are, in principle, available for all cell types, even for the in vivo imaging of Caenorhabditis elegans neurons. In this protocol, we introduce Ca2+ imaging in cells from cell lines, neurons, and glial cells in dissociated primary cultures, and describe the preparation of frozen stock of rat cortical neurons.

Dissection of Local Ca2+ Signals in Cultured Cells by Membrane-targeted Ca2+ Indicators

Here we present a protocol for Ca2+ imaging in neurons and glial cells, which enables the dissection of Ca2+ signals at subcellular resolution. This process is applicable to all cell types that allow the expression of genetically encoded Ca2+ indicators.

Dissecação de locais de Ca2 + sinais em pilhas cultivadas pelos indicadores de membrana-alvo Ca2 +

Calcium ion (Ca2+) is a universal intracellular messenger molecule that drives multiple signaling pathways, leading to diverse biological outputs. The ...

Direct Imaging of ER Calcium with Targeted-Esterase Induced Dye Loading (TED)

Visualization of calcium dynamics is important to understand the role of calcium in cell physiology. To examine calcium dynamics, synthetic fluorescent Ca2+ indictors have become popular. Here we demonstrate TED (= targeted-esterase induced dye loading), a method to improve the release of Ca2+ indicator dyes in the ER lumen of different cell types. To date, TED was used in cell lines, glial cells, and neurons in vitro. TED bases on efficient, recombinant targeting of a high carboxylesterase activity to the ER lumen using vector-constructs that express Carboxylesterases (CES). The latest TED vectors contain a core element of CES2 fused to a red fluorescent protein, thus enabling simultaneous two-color imaging. The dynamics of free calcium in the ER are imaged in one color, while the corresponding ER structure appears in red. At the beginning of the procedure, cells are transduced with a lentivirus. Subsequently, the infected cells are seeded on coverslips to finally enable live cell imaging. Then, living cells are incubated with the acetoxymethyl ester (AM-ester) form of low-affinity Ca2+ indicators, for instance Fluo5N-AM, Mag-Fluo4-AM, or Mag-Fura2-AM. The esterase activity in the ER cleaves off hydrophobic side chains from the AM form of the Ca2+ indicator and a hydrophilic fluorescent dye/Ca2+ complex is formed and trapped in the ER lumen. After dye loading, the cells are analyzed at an inverted confocal laser scanning microscope. Cells are continuously perfused with Ringer-like solutions and the ER calcium dynamics are directly visualized by time-lapse imaging. Calcium release from the ER is identified by a decrease in fluorescence intensity in regions of interest, whereas the refilling of the ER calcium store produces an increase in fluorescence intensity. Finally, the change in fluorescent intensity over time is determined by calculation of &Delta;F/F0.

Direct Imaging of ER Calcium with Targeted-Esterase Induced Dye Loading TED

Targeted-esterase induced dye loading (TED) supports the analysis of intracellular calcium store dynamics by fluorescence imaging. The method bases on targeting of a recombinant Carboxylesterase to the endoplasmic reticulum (ER), where it improves the local unmasking of synthetic low-affinity Ca2+ indicator dyes in the ER lumen.

Imagem direta de cálcio ER com Targeted-Esterase Induzida Dye Loading (TED)

Visualization of calcium dynamics is important to understand the role of calcium in cell physiology. To examine calcium dynamics, synthetic fluorescent ...

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, electrical excitability and cell proliferation. The diversity and specificity of Ca2+ signaling derives from mechanisms by which Ca2+ signals are generated to act over different time and spatial scales, ranging from cell-wide oscillations and waves occurring over the periods of minutes to local transient Ca2+ microdomains (Ca2+ puffs) lasting milliseconds. Recent advances in electron multiplied CCD (EMCCD) cameras now allow for imaging of local Ca2+ signals with a 128 x 128 pixel spatial resolution at rates of &#62;500 frames sec-1 (fps). This approach is highly parallel and enables the simultaneous monitoring of hundreds of channels or puff sites in a single experiment. However, the vast amounts of data generated (ca. 1 Gb per min) render visual identification and analysis of local Ca2+ events impracticable. Here we describe and demonstrate the procedures for the acquisition, detection, and analysis of local IP3-mediated Ca2+ signals in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators using both wide-field epi-fluorescence (WF) and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Furthermore, we describe an algorithm developed within the open-source software environment Python that automates the identification and analysis of these local Ca2+ signals. The algorithm localizes sites of Ca2+ release with sub-pixel resolution; allows user review of data; and outputs time sequences of fluorescence ratio signals together with amplitude and kinetic data in an Excel-compatible table.

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Here we present techniques for imaging local IP3-mediated Ca2+ events using fluorescence microscopy in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators together with an algorithm that automates identification and analysis of these events.

Imagem local Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Sinais em células de mamíferos em cultura

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, ...

Monitoring Endoplasmic Reticulum Calcium Homeostasis Using a Gaussia Luciferase SERCaMP

The endoplasmic reticulum (ER) contains the highest level of intracellular calcium, with concentrations approximately 5,000-fold greater than cytoplasmic levels. Tight control over ER calcium is imperative for protein folding, modification and trafficking. Perturbations to ER calcium can result in the activation of the unfolded protein response, a three-prong ER stress response mechanism, and contribute to pathogenesis in a variety of diseases. The ability to monitor ER calcium alterations during disease onset and progression is important in principle, yet challenging in practice. Currently available methods for monitoring ER calcium, such as calcium-dependent fluorescent dyes and proteins, have provided insight into ER calcium dynamics in cells, however these tools are not well suited for in vivo studies. Our lab has demonstrated that a modification to the carboxy-terminus of Gaussia luciferase confers secretion of the reporter in response to ER calcium depletion. The methods for using a luciferase based, secreted ER calcium monitoring protein (SERCaMP) for in vitro and in vivo applications are described herein. This video highlights hepatic injections, pharmacological manipulation of GLuc-SERCaMP, blood collection and processing, and assay parameters for longitudinal monitoring of ER calcium.

Monitoring Endoplasmic Reticulum Calcium Homeostasis Using a Gaussia Luciferase SERCaMP

Endoplasmic reticulum calcium homeostasis is disrupted in diverse pathologies. A secreted ER calcium monitoring protein (SERCaMP) reporter can be used to detect disruptions in the ER calcium store. This protocol describes the use of a Gaussia luciferase SERCaMP to examine ER calcium homeostasis in vitro and in vivo.

Monitoramento retículo endoplasmático homeostase do cálcio Usando um<em&gt; Gaussia</em&gt; Luciferase SERCaMP

The endoplasmic reticulum (ER) contains the highest level of intracellular calcium, with concentrations approximately 5,000-fold greater than cytoplasmic ...

High-Throughput Optical Controlling and Recording Calcium Signal in iPSC-Derived Cardiomyocytes for Toxicity Testing and Phenotypic Drug Screening

Understanding how excitable cells work in health and disease and how that behavior can be altered by small molecules or genetic manipulation is important. Genetically encoded calcium indicators (GECIs) with multiple emission windows can be combined (e.g., for simultaneous observation of distinct subcellular events) or used in extended applications with other light-dependent actuators in excitable cells (e.g., combining genetically encoded optogenetic control with spectrally compatible calcium indicators). Such approaches have been used in primary or stem cell-derived neurons, cardiomyocytes, and pancreatic beta-cells. However, it has been challenging to increase the throughput, or duration of observation, of such approaches due to limitations of the instruments, analysis software, indicator performance, and gene delivery efficiency. Here, a high-performance green GECI, mNeonGreen-GECO (mNG-GECO), and red-shifted GECI, K-GECO, is combined with optogenetic control to achieve all-optical control and visualization of cellular activity in a high-throughput imaging format using a High-Content Imaging System. Applications demonstrating cardiotoxicity testing and phenotypic drug screening with healthy and patient-derived iPSC-CMs are shown. In addition, multi-parametric assessments using combinations of spectral and calcium affinity indicator variants (NIR-GECO, LAR-GECO, and mtGCEPIA or Orai1-G-GECO) are restricted to different cellular compartments are also demonstrated in the iPSC-CM model.

The present protocol describes all-optical control and observation of triggered cellular activity in iPSC-derived cardiomyocytes (iPSC-CMs) for high throughput drug screening and toxicity testing. Multi-parametric quantification of phenotypic patterns in time, and space, are shown. Long-term effects of drugs over hours, or sequential measurements over days, are demonstrated.

Controle óptico de alto rendimento e registro do sinal de cálcio em cardiomiócitos derivados de iPSC para testes de toxicidade e triagem fenotípica de drogas

Understanding how excitable cells work in health and disease and how that behavior can be altered by small molecules or genetic manipulation is important. ...

Medicina

Measurement of Calcium Fluctuations Within the Sarcoplasmic Reticulum of Cultured Smooth Muscle Cells Using FRET-based Confocal Imaging

Maintenance of steady-state calcium (Ca2+) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall health. A significant portion of intracellular Ca2+ content is found within the SR stores in VSMCs. As the only intracellular organelle with a close association to the surrounding extracellular space through plasma membrane-SR junctions, the SR can be considered to constitute the first line of response to any irregularity in Ca2+ transients, or stress experienced by the cell. Among its many functions, one of the most important is its role in the transmission of Ca2+-regulated signals throughout the cell to induce further cell-wide reactions downstream. The more common use of cytoplasmic Ca2+ indicators in this regard is overall insufficient for research into the highly dynamic changes to the intraluminal SR Ca2+ store that have yet to be fully characterized. Here, we provide a detailed protocol for the direct and clear measurement of luminal SR Ca2+. This tool is useful for investigation into the nuanced changes in SR Ca2+ that have significant subsequent effects on the normal function and health of the cell. Fluctuations in SR Ca2+ content specifically can provide us with a significant amount of information pertaining to cellular responses to disease or stress conditions experienced by the cell. In this method, a modified version of a SR-targeted Ca2+ indicator, D1SR, is used to detect Ca2+ fluctuations in response to the introduction of agents to cultured rat aortic smooth muscle cells (SMCs). Following incubation with the D1SR indicator, confocal fluorescence microscopy and fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based imaging are used to directly observe changes to intraluminal SR Ca2+ levels under control conditions and with the addition of agonist agents that function to induce intracellular Ca2+ movement.

Currently, most available calcium indicators are used to quantify cytoplasmic calcium transients as indirect measures of calcium released from the sarcoplasmic reticulum in cultured smooth muscle cells. This protocol describes the use of a specific FRET-based indicator that allows direct measurement of calcium signals within the sarcoplasmic reticulum lumen.

Medição das flutuações cálcio dentro do Sarcoplasmic retículo de células musculares lisas cultivadas utilizando FRET baseado em imagem confocal

Maintenance of steady-state calcium (Ca2+) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall ...

Monitorização da libertação de cálcio ER / SR com o Ca

Resumo

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Alterações de monitoramento da concentração de cálcio intracelular e eficácia sináptica no Molusco

Na imagem cálcio vivo Neuronal em C. elegans

Imagens ao vivo de cálcio celular Combinado com siRNA silenciamento gênico mediado Identifica Ca^{2 +} Canais de vazamento na membrana ER e seus mecanismos de regulação

Imagem de cálcio Ratiometric de neurônios individuais se comportando Caenorhabditis Elegans

Dissecação de locais de Ca^{2 +} sinais em pilhas cultivadas pelos indicadores de membrana-alvo Ca^{2 +}

Imagem direta de cálcio ER com Targeted-Esterase Induzida Dye Loading (TED)

Imagem local Ca

Monitoramento retículo endoplasmático homeostase do cálcio Usando um

Controle óptico de alto rendimento e registro do sinal de cálcio em cardiomiócitos derivados de iPSC para testes de toxicidade e triagem fenotípica de drogas

Medição das flutuações cálcio dentro do Sarcoplasmic retículo de células musculares lisas cultivadas utilizando FRET baseado em imagem confocal