Bu çalışma NIH GM62999, NIH EB007268, NIH AG15820, B &amp; B Seed Grant tarafından finanse edildi ve NI, FR, BB bursundan CM, CDT bursuna RG&#39;ye bir Yardım Masası ek yardımı ile finanse edildi.

1. Slayt Hazırlama <ol><li> 6 cm&#39;lik hücre kültürü kaplarında 22 mm x 40 mm&#39;lik cam mikroskop lamı koyun, tabağa 1 slayt yerleştirin. </li><li> Steril bir kaputta sterilize etmek için her slaydın her yanını ve 6 cm çanağı ultraviyole (UV) ışığa 15-20 dakika maruz bırakın. </li><li> Parafilm ile içinde slaytlar bulunan bulguları kapatın ve kullanıma hazır olana kadar 4 ° C&#39;de saklayın. </li></ol> 2. Medyanın Hazırlanması, Tamponlar, Çözümler ve Reaktifler <ol><li> Deiyonize suda 1 L Hank dengelenmiş tuz çözeltisi (HBSS) hazırlayın ve 10 mM HEPES, 5 mM NaHCO 3 ve 1 mM EGTA ekleyin. NaOH ile pH 7.2-7.3&#39;e ayarlayın. Otoklavlanmış bir şişeye 0.22 μm&#39;lik bir filtre ile tampon filtre edin. </li><li> Deiyonize suda 900 mL yüksek glikoz Dulbecco Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) hazırlayın. 44 mM NaHC03 ilave edin ve pH&#39;ı HC1 ile 7.2-7.3&#39;e ayarlayın. Medyayı 0,22 μm&#39;lik bir filtre ile otoklavlanmış bir şişeye süzün. 100 mL fetal boviNe serum (FBS) ortamına% 10 FBS konsantrasyonu yapmak için. 4 ° C&#39;de saklayın. </li><li> Deiyonize suda 1 L intraselüler tampon (125 mM KCI, 25 mM NaCl, 10 mM HEPES, 0.2 mM CaCl2, 0.5 mM EGTA, 0.2 mM MgCl2) hazırlayın ve pH&#39;ı 7.25&#39;e ayarlayın. Son [Ca 2+ ] ~ 100 nM olacaktır. Kullanmadan önce 0.5 mM ATP ekleyin. Oda sıcaklığında saklayın. </li><li> Deiyonize suda 1 L Ringer tamponu (121 mM NaCl, 2.4 mM K2HPO4, 0.4 mM KH2PO4, 10 mM HEPES ve 1.2 mM MgCl2) hazırlayın ve pH&#39;ı 7.2&#39;ye ayarlayın. Oda sıcaklığında saklayın. Kullanmak için, 50 mL&#39;lik bir alikot 50 mL tüp içine yerleştirin ve 1.8 mM Ca 2+ ve 10 mM glikoz ekleyin. </li><li> Deiyonize suda 1 L KCl durulama solüsyonu (125 mM KCI, 25 mM NaCl, 10 mM HEPES, 0.2 mM MgCl2) hazırlayın ve pH&#39;ı 7.25&#39;e ayarlayın. </li><li> 5 mg iyonomisin 1 mL dimetil sülfoksid (DMSO) içinde eritilir. Mikrotüpler içine 30 uL&#39;lik kısım ayırın ve -20&#39;de saklayın6 ° C. </li><li> CPA&#39;yı DMSO&#39;ya eriterek siklopiazonik asit (CPA) stokunu hazırlayın. Apoptozu önlemek için hücrelere eklenen CPA için DMSO&#39;nun son yüzdesinin ≤% 1 olduğundan emin olun. Filtrelenmiş H20 içine eritilerek ve bir gece boyunca 37 ° C&#39;de çalkalanarak bırakılarak 20 mM 4-kloro-m-kresol (4 cmc) hazırlayın. Filtrelenmiş H20 içerisinde 100 mM&#39;ye eriterek ATP stokunu hazırlayın. </li><li> İn situ Kd&#39;yi belirlemek için , 100 uL&#39;lik bir KCl tamponu içinde 15 mM&#39;lik 1 mM EGTA, 0.2 mM, 0.6 mM, 2 mM, 5 mM, 10 mM, 20 mM, 50 mM ve 100 mM Ca2 + MM EGTA stok ve deiyonize su içerisinde çözündürülmüş bir 1 M CaCl 2 stokunu içermektedir. </li></ol> 3. Hücre Kültürü <ol><li> Kültür C2C12 miyoblast ve HEK293 hücreleri, steril bir UV kaputunda her biri 10 cm&#39;lik hücre kültürü kapları kullanan ATCC protokollerine göre. NOT: C2C12 hücrelerinin ~ 70% konfluansa oranla daha fazla büyümesine izin verilmemelidir, çünkü miyoblastlar farklılaşmaya başlarMiyotüpler içine te. Hem HEK293 hem de C2C12 hücreleri kolayca büyür ve hücre bütünlüğünü korumak için% 100 konfluenasyondan sonra büyümesine izin verilmemelidir. Buna ek olarak, hücrelerin sağlığını korumak için bir denemede kullanmadan önce hücreler, 10 kereden fazla pasajlanmamalıdır. </li></ol> 4. HEK293 Hücrelerinin Transfeksiyon Edilmesi <ol><li> Tohumlanmış HEK293 hücreleri 6 cm&#39;lik tabaklardaki sterilize edilmiş 22 mm x 40 mm cam mikroskop lamı üzerine yerleştirilir, böylece transfeksiyon gününde ~% 70 konfluent olurlar. </li><li> Ertesi gün, indirgenmiş serum ortamında ( örn. Opti-MEM) 2 μg Catcher + cDNA ve 1: 3 (ağırlık / hacim) DNA: transfeksiyon reaktif oranı kullanarak transfekte reaktifinin üreticinin protokolünü takip edin. </li><li> DMEM ortamını çanaktan boşaltın ve 3 mL düşürülmüş serum ortamı ekleyin. DNA ekleyin: transfeksiyon reaktif karışımı çanak ve 4-6 saat 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> İnkübasyondan sonra hücreleri 5-6 mL HBSS ile yıkayın. HBSS&#39;yi atın fÇanak ve yerine 3 ml taze DMEM ile değiştirin ve GECI ekspresyonuna izin vermek için 48 saat boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> C2C12 miyoblast hücrelerinin transfeksiyonu <ol><li> C2C12 miyoblast hücreleri için, çanak (1-2 mL) altını örtecek kadar tripsin ekleyerek hücreleri tripsinleştirin. Tripsinin tabağın altındaki hücrelerin gevşetilmesine izin vermek için 2-6 dakika 37 ° C inkübatörde çanağı yerleştirin. </li><li> Kuluçka tamamlandıktan sonra tripsin çıkarın ve hücreleri 8 mL DMEM içinde aspire edin. DMEM ile hücreleri iyice pipetleyin ve te hücrelerini tekrar süspanse edin ve yeniden süspanse edin ve 3 cm&#39;lik DMEM içeren 6 cm&#39;lik hücre kültürü kaplarında steril lamellerin üzerine tohumlayın böylece böylece nihai konfluenasyon% 60 olacaktır. </li><li> Adım 4.2-4.3&#39;te özetlendiği gibi hücreleri aynı güne nakledin. 24 saat boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Adım 4.4&#39;ü tekrarlayın. </li></ol></li></ol> 5. Slayt ve Floresan Mikroskop Hazırlama <ol><li> M açınMikroskop ve ışık kaynağına bağlayın, ardından Basit PCI programını açın. Mikroskopun 15-20 dakika boyunca veya şarj kuplajlı cihaz (CCD) kamerası -65 ° C&#39;ye soğuyana kadar ısınmasına izin verin. Odayı hazırlayın ve beklerken hücrelerle birlikte sürün. </li><li> Düşük profilli açık elmas banyosu görüntüleme bölmesinin tabanını, pamuklu çubukla ince bir tabaka yapıştırın. </li><li> İnkübatörden transfekte edilmiş hücreler içeren slayt alın ve 1 mL Ringer tamponu ile 10 mM glikoz ve 1.8 mM Ca 2+ 37 ° C&#39;de önceden ısıtılmış üç kez yavaşça durulayın. </li><li> Hücrelerin kurumasını önlemek için 1 mL Ringer tamponunu çanakta bırakın ve çanağın dışına çıkarmak için forseps kullanın. Aşırı solüsyonun bir laboratuar dokusunda slaytun kenarına dokunarak bir laboratuar dokusunda emilmesine izin verin. Ardından, gres içeren bölmenin yanındaki hücrelerin yağa doğru bakmasını sağlayın ve bir tornavida kullanarak sahne montajına sabitleyin. </li><li> 1 ekleML Ringer tamponu hücrenin sahne üzerine monte edilmesi ve mikroskop kurulumunun geri kalan kısmının tamamlanması sırasında kurutulmasını önlemek için hazneye gelmektedir. Vakum emme hortumu hazneye tutturulduktan sonra hazneyi tutan nihai hacim ~ 450 mcL&#39;dir. </li><li> 40X yağ daldırma objektif mikroskop objektif geçin. </li><li> Amacı temizlemek ve kurutmak için lens kağıdı ve lens temizleme solüsyonunu kullanın. Amacı ovmayın. Yüzey temiz olana kadar yavaşça dikkatle dokundurun. </li><li> Amaçya daldırma yağının bir damla ekleyin. </li><li> Mount mikroskop sahneye yerleştirin ve odasına vakum ucu ekleyin. Vakum emme hortumu hazneye tutturulduktan ve açıldığında, hazneyi tutan nihai hacim ~ 450 mcL&#39;dir. Bu nihai hacim, odanın kenarlarıyla aynı seviyededir. Deney sırasında, aşırı doldurma nedeniyle çözeltinin objektifin içine dökülmesini önlemek için oda çözeltisinin düz olması zorunludur. </li><lI&gt; Nesneyi yükseltin ve objektifteki yağ yansıtılıncaya kadar kaba ayarı kullanın. </li><li> Parlak alan modunu kullanarak kazançları 175&#39;e, pozlama süresini hücreleri odaklamak için 0,03 saniyeye ayarlayın. </li><li> Hücreler odaklandığında, 488 nm uyarılmayı kullanarak floresans moduna geçin. Pozlama süresini 0,07 saniyeye değiştirin. Görüntü için yeterli flüoresan ile sağlıklı olan yeterli hücrelere sahip bir görüş alanını bulun. </li><li> Bir görüş alanı seçildikten sonra, flüoresan ve parlak alan modunda fotoğraf çekin. </li><li> Hücrelerde bir ilgi alanını (ROI) daire içine yerleştirin veya seçilen bölgedeki yoğunluğu kaydetmek için tüm hücrenin etrafını sarın. </li></ol> 6. İlaca bağlı Ca 2+ Geçici ve Yerinde K d Kalibrasyonunun Görüntülenmesi <ol><li> Her 5 saniyede bir ayarlanan kare hızıyla yoğunluk ölçümünü başlatın. </li><li> Baz yoğunluğunun 20-30 çerçeve (100-150 s) boyunca sabit kalmasına izin verin. Gerekirse fr azaltınAmes / s, bu aşamada fotokopelliğin önlenmesi için. </li><li> 200 uM&#39;lik bir nihai konsantrasyon sağlamak için ~ 450 mcL&#39;lik son bölme hacmine dayanan 20 mM&#39;lik bir stoktan gerekli 4 cmc&#39;lik miktarı hesaplayın. Stokların dilüsyonlarını gerektiği gibi yapın. </li><li> Dikkatle bölmeden 60 μL Ringer tamponunu alın ve bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin. Hesaplanan miktarı 4 cmc&#39;ye bu çözeltiyle seyreltin ve görüntülenecek hücrelerden istenen tepkiyi uyandırmak için bölmeye geri ekleyin. </li><li> Hesaplanan miktarı 4 cmc&#39;lik mikrosantrifüj tüpüne ilave edin ve pipetleme ile karıştırın. </li><li> Eşzamanlı olarak yoğunluk ölçüsünde etkinlik işaretleyicisini eklerken, görüş alanına solüsyonu hafifçe ekleyin. </li><li> İlaç reseptöre bağlanma ve ardından sinyal azalması için zaman tanıyın, ardından etkinlik işaretleyicisini eklerken 1.8 mM Ca 2+ ve 10 mM glikoz ile 3-6 mL Ringer tamponu ile yıkayın. Oda hacmi 450 &amp;# 181; L ve bir vakuma bağlı, 3-6 mL tampon eklenerek ilacın bulunduğu eski solüsyonun yıkanması ve yerine yeni eklenen solüsyon ile değiştirilmesi sağlanır. </li><li> Her tahlil için transfekte edilmiş hücrelerin yeni bir slaydı kullanılarak 100 uM ATP ve 15 uM CPA için 6.1-6.7 tekrarlayın. </li><li> Ölçüm tamamlandıktan sonra yoğunluk ölçüm penceresindeki Veri toplama işlemini Basit PCI programında sonlandırın. </li><li> Hücrelerin floresan ve parlak görüntülerini alın. </li><li> Deney için veri dosyasını açın. Burada, gerekirse yoğunluk değerlerini yeniden hesaplamak için ilgili hücreleri veya bölgeleri tekrar daire haline getirin. </li><li> C2C12 miyoblast hücrelerinde in situ K d&#39; yi belirlemek için, bölüm 4.2 ve bölüm 5&#39;de özetlendiği gibi protokolü uygulayın ve bölmede 1 mL, 0 mM Ca 2+ Ringer tamponu koyun. <ol><li> Hücreleri, hücre içi tamponda 0.002-0.005% saponin ile 15-30 saniye boyunca Permeabilize ederek herhangi birinin hücrelerini boşaltın.Catcher + sitosolda olabilir. Hücreleri, 10 uM ionomisin ile KCl tamponu içinde 3-6 mL 1 mL EGTA ile yıkayın. Bir platoya erişinceye kadar yoğunluğun düşmesine izin verin. </li><li> 10 uM ionomisin ile 3-6 mL KCl tamponu ile durulayın ve yoğunluğun dengelenmesine izin verin, ardından adım 2.7&#39;de detaylandırılan her Ca 2+ solüsyonunu ekleyin. Her ilavenin yoğunluğunun bir platoya erişmesine izin verin. </li></ol></li><li> Algılayıcıyı bazal [Ca 2+ ] ölçümü için kalibre etmek için adım 6.12&#39;yi izleyin. Minimum ve maksimum floresans yoğunluğunu elde etmek için adım 2.7&#39;deki EGTA ve 100 mM Ca 2+ tamponunu kullanın. </li></ol> 7. Veri İşleme <ol><li> Yoğunluk ölçüm verilerinin elektronik tablo dosyasını indirin. </li><li> Her bir hücre için verileri taban çizgisi yoğunluğuna (F / F 0 ) göre normalleştirin. Herhangi bir grafik programında zamana karşı normalleştirilmiş verileri çizin. </li><li> % Değişimini hesaplamak için, normalleştirilmiş tepe değerini çıkarınUe&#39;dan 1&#39;e çarpın ve 100 ile çarpın. Birden fazla hücre görüntülendiğinde ortalama ve standart sapmayı hesaplayın. </li><li> SNR sinyalini hesaplamak için, deneyden kaydedilen görüntü dosyasını ImageJ gibi bir görüntü işleme yazılımında açın ve sinyali, transfekte hücreleri ve gürültüyü, arka planı ölçün. SNR = sinyal / gürültü denklemini kullanarak SNR&#39;yi hesaplayın. </li><li> Toplanan floresans görüntüleme verilerinden in situ Kd&#39;yi hesaplamak için, her Ca2 + konsantrasyonunun ve EGTA&#39;nın (0 mM Ca2 + ) ilavesinden sonra yaylaları içeren yoğunluk verisinin ortalamasını alın. Θ, göreli yoğunluk, F, herhangi bir noktadaki flüoresan, F min minimum floresan yoğunluğu olduğu durumda, θ = (F - F min ) / (F max - F min ) kullanılarak kesirli doygunluğun (göreli yoğunluk) hesaplanması ve Fmax, t yoğunluğundaki değişimi görmek için maksimum floresans yoğunluğudurMinimum yoğunluğa kıyasla Ca 2+ ilavesi ile sondaj yapar. Herhangi bir grafik ve eğri uydurma programında [Ca 2+ ] karşı göreli yoğunluk verilerini çizin. K d hesaplamak için herhangi bir grafikleme ve eğri uydurma programı için tercüme edilmiş 1: 1 bağlanma denklemi θ = [M T ] / (K d + [M T ]) kullanın. M T toplam metal konsantrasyonudur. </li><li> 6.13&#39;te özetlenen kalibrasyondan alınan bazal kalsiyumun miktarını belirlemek için, 1 mM EGTA (Fmin) ve 100 mM Ca2 + (Fmaks) ilavesinden sonra yaylaları içeren yoğunluk verilerini ortalaması alın. Bazal kalsiyum hesaplamak için kalibrasyon denklemi [Ca 2+ ] = K d ([F - F min ) / (F max - F)] kullanın. </li></ol>

<ol>
	<li>Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+versatility+and+universality+of+calcium+signalling.">The versatility and universality of calcium signalling.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1 (1), 11-21 (2000).</li><li>Berridge, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signalling+remodelling+and+disease.">Calcium signalling remodelling and disease.</a> Biochem. Soc. Trans. 40, 297-309 (2012).</li><li>Tang, S., Reddish, F., Zhuo, Y., Yang, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+kinetics+of+calcium+signaling+and+sensor.">Fast kinetics of calcium signaling and sensor.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 27, 90-97 (2015).</li><li>Rizzuto, R., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microdomains+of+intracellular+Ca2+:+Molecular+determinants+and+functional+consequences.">Microdomains of intracellular Ca2+: Molecular determinants and functional consequences.</a> Physiol. Rev. 86 (1), 369-408 (2006).</li><li>Berridge, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endoplasmic+reticulum:+a+multifunctional+signaling+organelle.">The endoplasmic reticulum: a multifunctional signaling organelle.</a> Cell Calcium. 32 (5-6), 235-249 (2002).</li><li>Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+Signaling.">Calcium Signaling.</a> Cell. 131 (6), 1047-1058 (2007).</li><li>HerrmannFrank, A., Richter, M., Sarkozi, S., Mohr, U., LehmannHorn, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4-chloro-m-cresol,+a+potent+and+specific+activator+of+the+skeletal+muscle+ryanodine+receptor.">4-chloro-m-cresol, a potent and specific activator of the skeletal muscle ryanodine receptor.</a> Biochimica Et Biophysica Acta-General Subjects. 1289 (1), 31-40 (1996).</li><li>Ferris, C. D., Huganir, R. L., Bredt, D. S., Cameron, A. M., Snyder, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inositol+trisphosphate+receptor:+phosphorylation+by+protein+kinase+C+and+calcium+calmodulin-dependent+protein+kinases+in+reconstituted+lipid+vesicles.">Inositol trisphosphate receptor: phosphorylation by protein kinase C and calcium calmodulin-dependent protein kinases in reconstituted lipid vesicles.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 88 (6), 2232-2235 (1991).</li><li>Dubyak, G. R., el-Moatassim, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+transduction+via+P2-purinergic+receptors+for+extracellular+ATP+and+other+nucleotides.">Signal transduction via P2-purinergic receptors for extracellular ATP and other nucleotides.</a> Am. J. Physiol., Cell Physiol. 265 (3 Pt 1), C577-C606 (1993).</li><li>Song, Z., Vijayaraghavan, S., Sladek, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP+increases+intracellular+calcium+in+supraoptic+neurons+by+activation+of+both+P2X+and+P2Y+purinergic+receptors.">ATP increases intracellular calcium in supraoptic neurons by activation of both P2X and P2Y purinergic receptors.</a> Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 292 (1), R423-R431 (2007).</li><li>Brini, M., Carafoli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+Pumps+in+Health+and+Disease.">Calcium Pumps in Health and Disease.</a> Physiol. Rev. 89 (4), 1341-1378 (2009).</li><li>Michelangeli, F., East, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+diversity+of+SERCA+Ca2++pump+inhibitors.">A diversity of SERCA Ca2+ pump inhibitors.</a> Biochem. Soc. Trans. 39 (3), 789-797 (2011).</li><li>Hofer, A. M., Landolfi, B., Debellis, L., Pozzan, T., Free Curci, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++dynamics+measured+in+agonist-sensitive+stores+of+single+living+intact+cells:+a+new+look+at+the+refilling+process.">Ca2+ dynamics measured in agonist-sensitive stores of single living intact cells: a new look at the refilling process.</a> Embo J. 17 (7), 1986-1995 (1998).</li><li>Hofer, A. M., Machen, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technique+For+InSitu+Measurement+of+Calcium+in+Intracellular+Inositol+1,4,5-Trisphosphate-Sensitive+Stores+Using+The+Fluorescent+Indicator+Mag-Fura-2.">Technique For InSitu Measurement of Calcium in Intracellular Inositol 1,4,5-Trisphosphate-Sensitive Stores Using The Fluorescent Indicator Mag-Fura-2.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90 (7), 2598-2602 (1993).</li><li>Raju, B., Murphy, E., Levy, L. A., Hall, R. D., London, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorescent+indicator+for+measuring+cytosolic+free+magnesium.">A fluorescent indicator for measuring cytosolic free magnesium.</a> Am J Physiol. 256, (1989).</li><li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+green+fluorescent+protein.">The green fluorescent protein.</a> Annu. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).</li><li>Miyawaki, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+indicators+for+Ca2++based+on+green+fluorescent+proteins+and+calmodulin.">Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin.</a> Nature. 388 (6645), 882-887 (1997).</li><li>Palmer, A. E., Jin, C., Reed, J. C., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bcl-2-mediated+alterations+in+endoplasmic+reticulum+Ca2++analyzed+with+an+improved+genetically+encoded+fluorescent+sensor.">Bcl-2-mediated alterations in endoplasmic reticulum Ca2+ analyzed with an improved genetically encoded fluorescent sensor.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101 (50), 17404-17409 (2004).</li><li>Heim, N., Griesbeck, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+Encoded+Indicators+of+Cellular+Calcium+Dynamics+Based+on+Troponin+C+and+Green+Fluorescent+Protein.">Genetically Encoded Indicators of Cellular Calcium Dynamics Based on Troponin C and Green Fluorescent Protein.</a> J. Biol. Chem. 279 (14), 14280-14286 (2004).</li><li>Mank, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+FRET-based+calcium+biosensor+with+fast+signal+kinetics+and+high+fluorescence+change.">A FRET-based calcium biosensor with fast signal kinetics and high fluorescence change.</a> Biophys. J. 90 (5), 1790-1796 (2006).</li><li>Garaschuk, O., Griesbeck, O., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Troponin+C-based+biosensors:+A+new+family+of+genetically+encoded+indicators+for+in+vivo+calcium+imaging+in+the+nervous+system.">Troponin C-based biosensors: A new family of genetically encoded indicators for in vivo calcium imaging in the nervous system.</a> Cell Calcium. 42 (4-5), 351-361 (2007).</li><li>Carlson, H. J., Campbell, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutational+Analysis+of+a+Red+Fluorescent+Protein-Based+Calcium+Ion+Indicator.">Mutational Analysis of a Red Fluorescent Protein-Based Calcium Ion Indicator.</a> Sensors. 13 (9), 11507-11521 (2013).</li><li>Wang, Q., Shui, B., Kotlikoff, M. I., Sondermann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Basis+for+Calcium+Sensing+by+GCaMP2.">Structural Basis for Calcium Sensing by GCaMP2.</a> Structure. 16 (12), 1817-1827 (2008).</li><li>Koldenkova, V. P., Nagai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+Ca2++indicators:+Properties+and+evaluation.">Genetically encoded Ca2+ indicators: Properties and evaluation.</a> Biochim. Biophys. Acta-Mol. Cell Res. 1833 (7), 1787-1797 (2013).</li><li>Tang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+application+of+a+class+of+sensors+to+monitor+Ca2++dynamics+in+high+Ca2++concentration+cellular+compartments.">Design and application of a class of sensors to monitor Ca2+ dynamics in high Ca2+ concentration cellular compartments.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108 (39), 16265-16270 (2011).</li><li>Zou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+sensors+for+real-time+measurement+of+high+Ca2++concentrations.">Developing sensors for real-time measurement of high Ca2+ concentrations.</a> Biochemistry. 46 (43), 12275-12288 (2007).</li><li>Wang, Z. -. M., Tang, S., Messi, M. L., Yang, J. J., Delbono, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Residual+sarcoplasmic+reticulum+Ca2++concentration+after+Ca2++release+in+skeletal+myofibers+from+young+adult+and+old+mice.">Residual sarcoplasmic reticulum Ca2+ concentration after Ca2+ release in skeletal myofibers from young adult and old mice.</a> Pflugers Arch., EJP. 463 (4), 615-624 (2012).</li><li>Pedelacq, J. D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+and+characterization+of+a+superfolder+green+fluorescent+protein.">Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein.</a> Nat. Biotechnol. 24 (1), 79-88 (2006).</li><li>Siemering, K. R., Golbik, R., Sever, R., Haseloff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+that+suppress+the+thermosensitivity+of+green+fluorescent+protein.">Mutations that suppress the thermosensitivity of green fluorescent protein.</a> Current Biology. 6 (12), 1653-1663 (1996).</li><li>Reddish, F. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Design Of Genetically-Encoded Ca2+ Probes With Rapid Kinetics for Sub-Cellular Application [dissertation]. , (2016).</li><li>Seo, M. D., Enomoto, M., Ishiyama, N., Stathopulos, P. B., Ikura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+endoplasmic+reticulum+stored+calcium+regulation+by+inositol+1,4,5-trisphosphate+and+ryanodine+receptors.">Structural insights into endoplasmic reticulum stored calcium regulation by inositol 1,4,5-trisphosphate and ryanodine receptors.</a> Biochim. Biophys. Acta-Mol. Cell Res. 1853 (9), 1980-1991 (2015).</li><li>Lambert, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Calcium signaling protocols. , (1999).</li><li>Stephens, D. J., Allan, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+microscopy+techniques+for+live+cell+imaging.">Light microscopy techniques for live cell imaging.</a> Science. 300 (5616), 82-86 (2003).</li><li>Bootman, M. D., Rietdorf, K., Collins, T., Walker, S., Sanderson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2+-sensitive+fluorescent+dyes+and+intracellular+Ca2++imaging.">Ca2+-sensitive fluorescent dyes and intracellular Ca2+ imaging.</a> Cold Spring Harb. 2013 (2), 83-99 (2013).</li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Catcher + gibi flüoresan probların canlı tek hücreli görüntülemesi, reseptör agonistlerine veya antagonistlerine yanıt olarak her bir hücredeki karmaşık ER / SR Ca 2+ sinyalleme süreçlerini analiz etmek için etkili bir tekniktir. Bu teknik, sırasıyla hem ER hem de sitozolik kalsiyum değişikliklerini izlemek için birlikte Fura-2 için veya Catcher + ve Rhod-2 görüntüsü için gerekli olan gibi, aynı anda birden çok dalga boyunu kullanan görüntüleme için de yararlıdır. Bu protokolde birkaç kritik adım vardır; Hücre transfeksiyonunun görüntüleme canlılığı üzerinde büyük etkisi olabilir. Düşük transfeksiyon oranları, kalsiyum yanıtlarını izlemek için GECI&#39;nin yetersiz ekspresyonuna neden olabilir. Öte yandan, Catcher + &#39;yı aşırı ifade etmek, sentetik kalsiyum boyaları ile ilgili bir sorun olan ER / ER Ca 2+ üzerinde bir tamponlama etkisi oluşturmaz. Ca 2+ sondalarının tamponlayıcı etkileri, organelle&#39;deki [Ca 2+ ], p&#39;nin K d&#39; inden etkilenirElbise ve ölçüm için gerekli olan prob konsantrasyonu. Sitosolik [Ca 2+ ], tipik olarak düşük nanomolar aralıktadır, ancak gerekli prob konsantrasyonu karşılaştırılabilir bir aralıktadır. Bu durumda, sitosolik kalsiyumu tamponlamada boya konsantrasyonunun ve bunun kabiliyetinin miktarı hücresel görüntüleme için büyük bir endişe kaynağıydı ve bu da büyük bir endişe kaynağıydı. Aksine, farklı memeli hücre soyları 25 için belirlendiği üzere, ER / SR [Ca 2+ ] 100 mikromolar ila milimolar aralığı 31&#39;dedir. Catcher + &#39;ın 0.1-1 μM ekspresyonu, ER kalsiyumunun tespit edilmesini sağlamak için yeterlidir, Catcher&#39;in tamponlama etkisi önemsizdir. Böylece Catcher + , Ca 2+ akığını yüksek [Ca 2+ ] ortamlarda luminal ER / SR Ca 2+ 32 üzerinde tamponlama etkisi olmadan izleyebilir. GECI&#39;nin transfeksiyon verimliliğini etkileyebilecek birkaç faktör, inkübasyon süresi,E transfeksiyon reaktifi, kuluçka sıcaklığı ve hücre konfluansı. Hücreleri slaytta tohumlarken hücre konflueni görüntüleme kalitesini önemli ölçüde etkileyebilir. Düşük konfluyon düşük hücre sayısına (n) ve daha az istatistiksel doğruluka neden olurken yüksek konfluen seviyeler görüntülemede büyük değişkenler üreten hücrelerin üst üste binmesine yol açar. Transfeksiyon için zaman ve sıcaklık, hücre türüne göre optimize edilmelidir. Buna ek olarak, azaltılmış serum ortamı ile DMEM eklenmesi, apoptozu önlemek için daha uzun transfeksiyon süreleri için optimaldir. Memeli hücrelerde orijinal GECI Catcher floresansı, kültürlendiğinde ve transfekte edildiğinde sadece 30 ° C idi. Catcher&#39;in flüoresansı, 37 ° C&#39;de ekspresyon için başarıyla optimize edildi ve geliştirildi, sonuçta yeni geliştirilmiş Catcher + geliştirmesi sağlandı. EGFP&#39;ye karşı bir antikor kullanan bir batı leke, Ca2 + sondasının ekspresyonunu teyit etmek için gerçekleştirilebilir. Üstelik beniReaktif teslimatının tutarlılığı ve önemi kritiktir. Reaktifler odaya perfüzyon, küçük hacimli difüzyon veya mekanik pompalar ile eklenebilir, bunların hepsi farklı tepkiler verebilir. Çözüm haznesinin, haznenin dibinde, slaydın üzerine yerleştirilecek bir sızdırmazlık macunu gres örtüsü uygulayarak düzgün şekilde kapatılmış olması zorunludur. Prob için doğru dalga boyları seçilmelidir. Catcher + için uyarma ve emisyon dalga boyları sırasıyla 395/488 nm ve 510 nm&#39;dir. Hücre görüntüleme için, UV ışığının hücreler üzerindeki zararlı etkisini önlemek için uyarılma için sadece 488 nm kullanılır. Bu nedenle, 488 nm&#39;de uyaran ve 510 nm&#39;de emisyonu toplamayan herhangi bir optik filtreyi kullanmak, Catcher + ile görüntü oluşturmak için kabul edilebilir olacaktır. Fotobirik oluşumunu önlemek için ışık yoğunluğunu ve çerçeve / s 33 gibi ışık hassasiyetini optimize etmek için yoğun çaba sarf edilebilir. Bu protokol, etkinliği analiz etmek için ideal olsa daER / SR değişiklikleri, Catcher + Ca 2+ ER / SR floresan probu kullanılarak değiştirildiğinde, herhangi bir deneyde beklendiği gibi sınırlamalar vardır. Tek hücreli canlı görüntüleme yalnızca küçük bir hücre kümesini analiz ettiğinden, hücrelerin sayısı (n) ortalama 1-100 hücre arasında değişebilir, ancak daha büyük hücre hatları için daha düşük olabilir. Bu, hücre sayısının azalmasına ve birden fazla denemeden istatistiksel olarak farklı sonuçlara yol açar. İstatistiksel doğruluk için bir n&gt; 6 gereklidir. Daha büyük bir n elde etmek için, birçok yemekler görüntülenecek veya diğer teknikler aynı anda kullanılmalıdır. Ayrıca, Catcher + , tek bir dalga boyu ER / SR Ca 2+ probudur, bu sinyali nicelemek mümkün olmayan diğer tek dalga boyundaki sondalar ve boyalar ile ilgili sorunlara yol açar, hücrenin bozulmasına karşı sinyalin doğru olup olmadığını bilmemektedir Artifaktı ve ratiyometrik sistemlere nazaran daha büyük gürültüye sahip 34 . Bu çalışma, bu optimize Ca 2+ sondaların,Reseptör aracılı ER / SR Ca 2+ salınımını izlemek için farklı hücre tiplerinde veya doku tiplerinde uygulanabilir. Catcher + , tek bir dalga boyundaki ER / SR Ca 2+ probudur. Bu nedenle, deneysel parametrelerin ve ayarların niceliksel ölçüm için tutarlı olması önemlidir. Kalsiyum konsantrasyonunun ve K d kalsiyum sensörünün hücre çizgilerinde ayrıntılı bir kalibrasyonu niceliksel analiz için ek önemli ölçümlerdir. Bu gelişmiş kalsiyum sensörleri, çeşitli biyolojik ve patolojik koşullardaki küresel Ca 2+ değişimlerine kıyasla var olan, büyük ölçüde farklı Ca 2+ geçişlerini izlemek için ER / SR&#39;deki belirli lokasyonlara da hedef olabilir. Bu bulgular, Ca 2+ ile ilişkili hastalıkların teşhisinde gelecek araçları sağlamak için Ca 2+ görüntüleme ve sonda tarama alanlarını ilerletmeye devam edecektir. Bildirilen protokoller ve gelişmiş sensör ilaç d için de uyarlanabilirKalsiyum sinyaliyle ilişkili hastalıklara karşı korunma.

Hücre içi kalsiyum (Ca 2+ ) geçici maddelerinin uzay-zamansal özellikleri, çeşitli biyolojik fonksiyonları aktive eder 1 . Bu Ca 2+ sinyal olayları hücre dışı olarak farklı uyarılarla tetiklenir ve hücre içi olarak büyük Ca 2+ depolama organelleri ve sayısız Ca 2+ pompalar, kanallar ve Ca 2+ bağlayıcı proteinler tarafından kontrol edilir. Ca 2+ transientleri, sinyal modülasyonlu kusurların bir sonucu olarak farklı hastalıklara yol açarak önemli ölçüde değişebilir 2 . Merkezde endo (ER) ve sarkoplazmik retikül (SR) bulunan Ca 2+ sinyal sisteminin hızı ve karmaşıklığı nedeniyle, hızlı kinetik ile memelilerin ekspresyonu için optimize edilmiş genetik olarak kodlanmış Ca 2+ probları gereklidir Farklı hücrelerdeki küresel ve yerel Ca 2+ değişimlerini gözlemlemek 3 . ER ve SR, Kas hücrelerindeki muadili, büyük intraselüler Ca 2+ depolama organelleri olup Ca 2+ sinyallerinin amplifiye edilmesine yardımcı olan Ca 2+ lavabo gibi hareket eder. ER / SR, Ca 2+ sinyallerinin ayrılmaz bir parçasıdır ve sinyaller 5 vericisi ve alıcısı olarak ikili rolleri vardır. Riyanodin reseptörü (RyR) ve inositol 1,4,5-trifosfat reseptörü (IP 3 R), Ca 2+ 6 ile regüle edilen ER / SR membranlarında bulunan Ca 2+ serbest reseptörleridir. Diğer ajanlar doğrudan veya dolaylı olarak bu reseptörlerin işlevini uyarır. 4-kloro-m-kresol (4-cmc), her ikisi de düzenli olarak RyR aracılı Ca 2+ salınımını incelemek için kullanıldığında, SR Ca 2+ salınımını tetiklemek için kafeinden 10 kat daha yüksek bir hassasiyete sahip olan, RyR&#39;nin güçlü bir agonistidir Sağlıklı ve hastalıklı hücreler 7 . ATP, IP 3 aracılı Ca 2+ reIP 3 R 8 üzerinden kiralayın . ATP, bir G-proteine ​​bağlı reseptör (GPCR) olan purinergik reseptör P2YR&#39;ye bağlanır ve IP 3 R&#39;ye bağlanan IP 3 üretimini tetikleyerek Ca 2+ &#39;yı ER 9 , 10&#39;dan salınır. Sarkoz endoplazmik retikulum kalsiyum ATPaz (SERCA) pompası, aynı zamanda ER / SR zarında bulunan ve sitosolik Ca 2+ miktarını azaltan ve iyonu ER / SR lümenine aktif olarak pompalayarak ER / SR&#39;yi tekrar dolduran bir P tipi ATPaz pompasıdır 11 . SERCA pompasının spesifik önleyicileri, Thapsia garganica&#39;ndan thapsigargin ve Aspergillus ve Penicillium&#39;dan siklopiazonik asit (CPA) içerir . CPA, pompa için düşük afiniteye sahiptir ve Ca 2+ erişim noktasını 12 tersine çevrilebilir şekilde bloke eder. Thapsigargin, diğer yandan, nanomol ile M3 helezonunda F256 kalıntısında Ca 2+ serbest pompaya geri döndürülemez şekilde bağlanırAf affinity 11 . Ca 2+ uyarılmış olaylarla ilgili değişiklikleri analiz etmek ve nicelleştirmek bir sorun olmuştur ve halen bir meydan okuma olmaya devam etmektedir. ER / SR, Ca 2+ sinyalinin yayılımında merkez işlevli ana hücre içi Ca 2+ ihtiva eden kompartıman olduğundan, ER / SR Ca 2+ sinyalizasyonunu anlama konusunda çok çalışılmıştır. Sentetik Ca 2 + boyalarının oluşturulması, Ca 2+ görüntülemenin tarla ve uygulamasına yardımcı olmuştur. Mag-Fura-2 gibi boyalar, farklı hücrelerdeki bölümlü Ca 2+ miktarını ölçmek için yaygın olarak kullanılmasına rağmen, 13 , 14 , 15 düzensiz boya yüklemesi, foto-ağartma ve belirli organelleri hedef alamama gibi sınırlamaları vardır . Yeşil floresan protein (GFP) keşfi ve floresan protein-Tabanlı Ca 2+ sondaları Ca 2+ görüntüleme alanını ilerletti 16 . Mevcut GECI&#39;lerin bazıları sarı floresan protein (YFP), camgöbeği flüoresan proteini (CFP), kalmodulin ve M13 bağlayıcı peptid 17 , 18 içeren Förster rezonans enerji transferi (FRET) çiftleri. Troponin C tabanlı GECI&#39;ler, FRET&#39;in CFP ve Sitrin çiftleri olarak ve tekli florofor probları 19 , 20 , 21 olarak da mevcuttur. GCaMP2 ve R-GECO gibi diğerleri, kalmodulin 22 , 23 içeren tekli florofor sensörleridir. Ca2 + bağlanma alanlarında 24 bulunan çoklu Ca2 + bağlanma yerleri ile ilişkili Kd ve kooperatif bağlamanın dar ayarlamanın sınırlamalarını aşmak için yeni bir kalsiyum sınıfı sınıfıSors, ​​gelişmiş yeşil flüoresan protein (EGFP) 25 , 26&#39;nın kromofor duyarlı bir konumunda beta varilin yüzeyinde Ca2 + bağlama sitesi tasarlanarak oluşturuldu. CatchER olarak adlandırılan bu yüksek duyarlıklı sensör, ~ 0,18 mM&#39;lik bir Kd&#39;ye, difüzyon sınırının yakınında ak&#39;a ve 700 s&#39;lik bir ak&#39;a sahiptir. Catcher, HeLa, HEK293 ve C2C12 25 gibi farklı memeli hücre dizilerinde reseptör aracılı ER / SR kalsiyum salımını izlemek için kullanılmıştır. Hızlı kinetiklerinden dolayı Catcher, genç ve yaşlı Friend Virüs B NIH Jackson (FVB) farelerinin flexor digitorum brevis (FDB) kas liflerinde FDB&#39;de 2 s depolarizasyon sonrasında SR&#39;de daha fazla Ca 2+ kalmış olduğunu göstermek için kullanıldı Eski farelerin elyafları genç farelerinkine kıyasla 27 . Memelinin kalsiyum görüntülemedeki uygulamalarını engelleyen, 37 ° C&#39;de düşük flüoresansının üstesinden gelmek içinCatcher + denilen Catcher&#39;ın geliştirilmiş bir versiyonunu geliştirdik. Catcher + , memeli hücrelerinde daha iyi uygulama için 37 ° C&#39;de gelişmiş floresan sergilemektedir. 37 ° C&#39;de 28 , 29 ° C&#39;de termostabilite ve flüoresanı iyileştirmek için Catcher + &#39; e ek mutasyon eklendi. Catcher + , Sinyal-gürültü oranına (SNR) Catcher 30&#39;a göre altı kat arttı. Burada, Catcher + ile HEK293 ve C2C12 hücrelerinin kültürlenmesi ve transfeksiyonu için protokoller ve ER / SR reseptör aracılı kalsiyum geçişlerini izlemek için uygulanması sunulmuştur. Temsilci sonuçlar, 4 cmc, CPA ve ATP ile muamele edilmiş HEK293 hücrelerinde ifade edilen Catcher + için gösterilmiştir. C2C12 miyoblast hücrelerinde Catcher + in situ K d&#39; sini belirlemek için bir protokol de sunuyoruzBazal [Ca 2+ ] ntifikasyonu.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4-Chloro-3-methylphenol (4-CmC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C55402</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>515DCXR dichroic mirror</td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td>NC338059</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8242;-triphosphate disodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A26209</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>102382</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning tissue-culture treated culture dishes (100 mm)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS430167</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning tissue-culture treated culture dishes (60 mm)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS430166</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclopiazonic Acid (CPA)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>239805</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-Glucose</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td>41095-0010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dow Corning 111 Valve Lubricant &#38; Sealant</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0275</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium (DMEM)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D7777</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenebis(oxyethylenenitrilo) 
			tetraacetic Acid (EGTA)</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td>409911000&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>26140087</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Cover Glasses 22x40 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;12-544B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#8217; Balanced Salts (HBSS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4891</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES, Free Acid, Molecular Biology Grade</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>391340</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion Oil without autofluorescence</td>
			<td>Leica</td>
			<td>11513859</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionomycin, Free Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-230-5804</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DM6100B inverted microscope with a cooled EM-CCD camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C9100-13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000 Transfection Reagent</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11668019</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000 Transfection Reagent</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>L3000015</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Profile Open Diamond Bath Imaging Chamber</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>RC-26GLP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride Hexahydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M33-500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>51985034</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>PX1405</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate, Dibasic</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>PX1570</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate, Monobasic</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>PX1565</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>47036</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SimplePCI Image Analysis Software</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S233-3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterivex-GV 0.22 &#181;m filter</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SVGVB1010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Till Polychrome V Xenon lamp</td>
			<td>Till Photonics</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin (2.5%), no phenol red (10X)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15090046</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring er/sr calcium release with the targeted ca2+ sensor catcher+

Hücre dıĢı uyaranlar tarafından uyarılan hücre içi kalsiyum (Ca2 + ) geçicileri canlılarda çok sayıda biyolojik proses başlatır. Hücre içi kalsiyum salınımının merkezinde, kas hücrelerinde büyük hücreiçi kalsiyum depolama organelleri, endoplazmik retikulum (ER) ve daha özelleşmiş sarkoplazmik retikulum (SR) bulunur. Bu organellerden kalsiyumun dinamik olarak salınması, sarko / endoplasmik retikulum kalsiyum ATPaz (SERCA) pompası vasıtasıyla yeniden doldurma ile birlikte riyano-nodin reseptörü (RyR) ve inositol 1,4,5-trifosfat reseptörü (IP 3 R) aracılığı ile sağlanır. ER / SR&#39;den hızlı kalsiyum salımını izlemek için, Catcher adı verilen, genetik olarak kodlanmış bir kalsiyum sensörü (GECI) oluşturuldu. Burada, HEK293 ve C2C12 hücrelerinde gelişmiş ER / SR hedef GECI Catcher + &#39;ın transfeksiyonu ve ekspresyonu için ayrıntılı protokoller ve IP 3 R, RyR ve SERCA pompa aracılıklı kalsiyum geçiciHEK293 hücrelerinde floresan mikroskobu kullanılarak özetlenmiştir. Seçilen reseptör agonisti veya inhibitörü oda çözeltisine dağıtılır ve yoğunluk değişiklikleri gerçek zamanlı olarak kaydedilir. Bu yöntemle, ER kalsiyumunda bir azalma, 4-kloro-m-kresol (4-cmc), adenosin trifosfat (ATP) ile dolaylı olarak IP 3 R&#39;yi aktive eden RyR aktivasyonu ve siklopiazonik SERCA pompasının inhibisyonu ile görülür Asit (CPA). Ayrıca in situ K d&#39; yi belirlemek ve C2C12 hücrelerinde bazal [Ca 2+ ] miktarını belirlemek için protokolleri tartışıyoruz. Özetle, Catcher + ile birlikte kullanılan bu protokoller ER / SR kalsiyum ile ilgili patolojilerin incelenmesinde gelecekte uygulanacak olan ER&#39;den reseptör aracılı kalsiyum salımını ortaya çıkarabilir.

Bu bölüm, ER / SR Ca 2+ değişikliklerini farklı reseptör aracılı yollarla izlemek için optimize edilmiş ER / SR hedef GECI Catcher + kullanılarak önceden açıklanan yöntemleri kullanarak elde edilen sonuçları gösterecektir. Şekil 1 , 200 uM 4 cmc ile uyarılan RyR boyunca boşaltılmayı göstermektedir. 4 cmc, RyR&#39;nin bir agonistidir. İlacın ilavesi, Catcher + floresan yoğunluğundaki azalma ile ölçülen ER kalsiyumunda bir düşüşe neden olur. İşaretlendiği gibi, burada özetlenen protokol, ER Ca 2+ &#39; daki değişiklikler hakkında bilgi sağlayan Catcher + &#39; ı kullanarak reseptör aracılı Ca 2+ transientlerin görselleştirilmesini ve ölçülmesini sağlar. Şekil 2&#39;de gösterildiği gibi, 1SERCA pompasını tersine bloke etmek için 5 uM CPA, bir plato oluşturan floresan yoğunluğunda büyük bir azalma meydana getirir. SERCA pompasının fonksiyonu engellendiğinde, ER Ca 2+ serbest bırakma kanalları hala Ca 2+ &#39;yı sitoplazmaya aktif olarak salmaktadır ve floresan yoğunluğunun azalmasına neden olmaktadır. Hücreler CPA&#39;yı 1.8 mM Ca2 + ve 10 mM glukoz içeren Ringer tamponuyla yıkadıktan sonra iyileşirler. Bu sonuçlar, Catcher + &#39;nın SERCA pompasına özgü Ca2 + geçişlerini izleyebilme kabiliyetini teyit eder. Şekil 3 , Catcher + ile transfekte edilmiş HEK293 hücrelerinde IP 3 R&#39;nin 200 uM ATP ile dolaylı olarak aktive edilmesi için temsili verileri göstermektedir. ATP, IP 3 R yoluyla Ca 2+ salınımını aktive eden IP 3 üreten bir G-proteini eşlenmiş reseptör olan P2Y reseptörüne bağlanır.Küçük olsa da, 200 μM ATP ilavesi, sinyal yoğunluğunda görünür bir azalma meydana getirir. Hücrelerin 1.8 mM Ca 2+ ve 10 mM glikoz içeren Ringer tamponu ile yıkanması, ER&#39;ye yeniden doldurulmasını ve sinyalin taban çizgisine dönmesini sağlar. Bu sonuçlar, Catcher + &#39;nın dolaylı uyarılma yoluyla IP 3 R aracılı kalsiyum salınımını izleyebilme yeteneğini vurgulamaktadır. Şekil 4&#39;te , Catcher + , in situ Kd&#39;yi belirlemek için C2C12 miyoblast hücrelerine nakledildi. Veriler protokolde belirtildiği gibi toplandı. C2C12 miyoblast hücreleri 15-30 sn boyunca% 0.005 saponin ile permeabilize edildi, sonra 10 uM ionomisin içeren KCl tamponu içerisinde 1 mM EGTA ile yıkandı. Çeşitli Ca2 + konsantrasyonları 10 uM iyonomisin ihtiva eden KCl tamponu içinde hazırlandı ve kademeli olarak ilave edildi. Veriler normalleştirildi ve 1: 1 bağlama kullanılarak takıldıIng denklemi. 7 hücre için ortalama Kd, 3.1 ± 1.4 mM idi. Catcher + &#39;un zayıf afinitesi, ER veya SR gibi yüksek Ca 2+ organellerinde Ca 2+&#39; yu hissetmesini sağlar. SR&#39;de bazal [Ca 2+ ] &#39;yi belirlemek için, C2C12 hücreleri 15-30 sn boyunca% 0.005 saponin ile permeabilize edildi, KCl tamponu ile yıkandı ve daha sonra F mıkanasını elde etmek için 10 uM iyonomisin içeren KCl tamponu içerisinde 1 mM EGTA ile yıkandı . EGTA&#39;yı KCl tamponu ile yıkadıktan sonra, 10 uM iyonomisin ile 100 mM Ca 2+ maksimum bir Fmax ilave edildi. Bazal Ca 2+ 0.4 ± 0.2 mM olarak hesaplandı. <img alt="Şekil 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55822/55822fig1.jpg" /> Şekil 1: HEK293 hücrelerinde 4 cmc kullanılarak RyR&#39;nin uyarılması. ( A ) RyR&#39;nin 4 cmc ile aktivasyonunun tasvir edilmesi. ( B ) HEK293 hücrelerinin yoğunluk kaydıER&#39;de lokalize Catcher + ile transfekte edilmiş, 200 uM 4 cmc ile muamele edilmiştir. RyR&#39;nin 4 cmc ile stimüle edilmesi, normalize flüoresan yoğunluğunda, [Ca 2+ ] ER&#39;deki bir azalmayla direkt olarak korelasyona neden olan bir azalmaya neden olur. N, görüntülendiği hücrelerin sayısını belirtir. Ortalama sinyal azalması% 12.0 ± 2.2 idi. Ringer tamponunda 1.8 mM Ca 2+ bulunması, yoğunluğun toparlanma düzeyine yansıyan ER&#39;yi yeniden doldurmayı kolaylaştırdı. Çizilmiş resimler, hücreleri 4-cmc ile tedavi öncesi ve sonrası göstermektedir. SNR, 4.3 ± 0.8 olarak hesaplandı. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55822/55822fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55822/55822fig2.jpg" /> Şekil 2: Tersinir SERCA p&#39;yi kullanarak [Ca 2+ ] ER&#39;de azalmaHEK293 hücrelerinde ump inhibitörü CPA. ( A ) CPA ile SERCA pompasının inhibisyonu. ( B ) 15 μM CPA ile tedavi edilen ER&#39;de lokalize Catcher + ile transfekte edilmiş HEK293 hücrelerinin canlı görüntülemesi. Ca 2+ hala IP 3 R ve RyR&#39;den akabildiğinden, SERCA pompasını CPA ile bloke etmek, normalize floresan yoğunluğunda bir azalmaya neden olur ve bu da doğrudan [Ca 2+ ] ER&#39;de bir azalmaya karşılık gelir. N, görüntülendiği hücrelerin sayısını belirtir. Çizilmiş resimler, tedavi öncesi ve sonrası Catcher + ile transfekte edilmiş HEK293 hücreleridir. Ortalama sinyal azalması% 21.0 ± 0.3&#39;tü. Ringer tamponunda 1.8 mM Ca 2+ bulunması, yoğunluğun toparlanma düzeyine yansıyan ER&#39;yi yeniden doldurmayı kolaylaştırdı. SNR, 5.5 ± 0.8 olarak hesaplandı. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55822/55822fig2large.jpg" target="_blank">Daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a>bu figür. <img alt="Şekil 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55822/55822fig3.jpg" /> Şekil 3: ATP, HEK293 hücrelerinde [Ca 2+ ] ER&#39;yi azaltır. ( A ) IP 3 R&#39;nin ATP ile P2YR purinerjik reseptörü aracılığıyla dolaylı olarak aktivasyonunun şeması. P2YR, ATP&#39;ye bağlandığında IP 3 üreten bir GPCR&#39;dir. IP 3 , ER&#39;den kalsiyum salınmasını uyaran IP 3 R&#39;yi aktive eder. ( B ) 200 uM ATP ile tedavi edilen ER&#39;de lokalize Catcher + ile transfekte edilmiş HEK293 hücrelerinin gerçek zamanlı görüntülemesi. ATP ile P2Y reseptörü aracılığıyla IP 3 R&#39;nin dolaylı uyarımı, normalize edilmiş floresan yoğunluğunda, doğrudan [Ca 2+ ] ER&#39;de bir düşüşle bağlantılı olan bir azalmaya neden olur. N, görüntülendiği hücrelerin sayısını belirtir. Ortalama sinyal azalması% 6.0 ± 3.0&#39;dır. SNR c6,7 ± 2,7 olarak hesaplandı. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55822/55822fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55822/55822fig4.jpg" /> Şekil 4: C2C12 miyoblast hücrelerinde Catcher + in situ K d&#39; si. Catcher + ile transfekte edilmiş permeabilize edilmiş C2C12 miyoblast hücrelerinden toplanan normalize yoğunluğun temsili izi. Hücreler, hücre içi tamponda% 0,005&#39;lik saponin ile 15-30 s süreyle permeabilize edildi. EGTA ve Ca 2+ solüsyonları KCl tamponu içerisinde hazırlanmış, n, görüntülemiş hücre sayısını belirtir. ( A ) Gelen floresan görüntüleri, tedaviden önce ve sonra hücrelerin temsilcisidir. 10 uM varlığında permeabilize C2C12 miyoblast hücrelerine 0.3, 0.6, 2, 5, 10, 20, 50 ve 100 mM Ca2 +3.1 ± 1.4 mM bir Kd elde etmek için İyonomisin kullanılmıştır. ( B ) Inzet flüoresans görüntüleri sırasıyla 10 uM ionomisin ile 1 mM EGTA ve 100 mM Ca 2+ eklendikten sonra, minimum ve maksimum değerlerde hücrelerin temsilcisidir. Bazal Ca 2+ 0.4 ± 0.2 mM olarak hesaplandı. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55822/55822fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring ER/SR Calcium Release with the Targeted Ca2+ Sensor CatchER+ at JoVE.com

Monitoring ER/SR Calcium Release with the Targeted Ca2+ Sensor CatchER+

HEK293&#39;ün endoplazmik / sarkoplazmik retikulumdaki (ER / SR) hızlı kalsiyum geçişlerini ve gerçek zamanlı floresan mikroskopisi kullanarak iskelet kası C2C12 hücrelerini izlemek için hedeflenmiş genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergesi (GECI) Catcher + &#39;ün uygulanması için protokoller sunuyoruz. Yerinde K d ölçümü ve kalibrasyonu için bir protokol de tartışılmıştır.

Hedeflenen Ca ile ER / SR Kalsiyum Salınımının İzlenmesi<sup&gt; 2+</sup&gt; Sensör Catcher<sup&gt; +</sup

Intracellular calcium (Ca2+) transients evoked by extracellular stimuli initiate a multitude of biological processes in living organisms. At the center of ...

monitoring-ersr-calcium-release-with-the-targeted-ca2-sensor-catcher

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Monitoring ER/SR Calcium Release with the Targeted Ca2+ Sensor CatchER+

14.8K Görüntüleme.  Georgia State University.  HEK293'ün endoplazmik / sarkoplazmik retikulumdaki (ER / SR) hızlı kalsiyum geçişlerini ve gerçek zamanlı floresan mikroskopisi kullanarak iskelet kası C2C12 hücrelerini izlemek için hedeflenmiş genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergesi (GECI) Catcher + 'ün uygulanması için protokoller sunuyoruz. Yerinde K d ölçümü ve kalibrasyonu için bir protokol de tartışılmıştır. 

Video: Monitoring ER/SR Calcium Release with the Targeted Ca2+ Sensor CatchER+

Monitoring Actin Disassembly with Time-lapse Microscopy

Okay, so what I'd like to do today is to show you how to construct a flow chamber, a fusion chamber for imaging on an upright microscope. What then I then do is I create two spaces using film. So what I do is I take the para film, I cut it into small strips.Next I'm going to, this will basically form the channels for the, the walls, and I dry them with a tilted air. I put the cover slip on top of the para, And here's the finished. Then I heat it on a heat block to melt the param and basically create a seal.So what this is, is the, the cover glass here, and then on top of the cover glass is two layers of phim as you see right here. And then on top of this, again, there's a, it's a 22 by two two mil meter cover slip. This one right here, which I pressed against the param to fall the seal.Okay, so the liquid goes in in one direction here and I can suck it out with a filter paper here in this direction. And I'll show you how to do that in a bit. So what I like to do is I like to put it in a humidified chamber, which is very simple.Take two kind of elevated strips and have a filter of paper underneath. And to keep it noisy as I, I put the cover, cover slip on the flow chamber on. Now the way you introduce a solution to the chamber is that you just put the pipet tip at the entrance of the chamber and you just split.Now what I do is I incubate the chamber with the lid closed for 10 minutes. What I usually do to suck the liquid out from the other side is to use it, get a filter paper and cut it into thin strips like this. And I take one of these thin strips and I simultaneously apply the solution into the entrance while putting the filter paper at the exit to suck the exchange, the solution.So you'll see the liquid flowing through the solution. And then I wait for five minutes for the mid close. Now what I'm ready to do is to actually put that the actin it and the actin, I actually have to polymerize, I polymerize inside the flow chamber and it's just the same procedures before.So because like this, and then now that the action is polymerized, I wash out all the un excess un polymerized action using a large volume of just buffer. So here I have about a hundred microliters and it's a few reaction chamber volumes worth of buffer. Just, you know, when the filter paper becomes saturated, I have to change the direction.Okay?And so I'm ready to do imaging with this. So perfusion chamber with actin attached to it. Now I take the slide, mount it under the microscope, and since I'm imaging with an oil objective, I'm gonna put some immersion oil on the top surface of the cover, grass touch, such so assess solution or protein or anything on acting inside.So what I do is I can actually exchange the solution side while I'm doing the time lapse imaging. As such.

Zaman atlamalı Mikroskopi Sökme Aktin İzlenmesi

Biyoloji

Loading Drosophila Nerve Terminals with Calcium Indicators

Calcium plays many roles in the nervous system but none more impressive than as the trigger for neurotransmitter release, and none more profound than as the messenger essential for the synaptic plasticity that supports learning and memory. To further elucidate the molecular underpinnings of Ca2+-dependent synaptic mechanisms, a model system is required that is both genetically malleable and physiologically accessible. Drosophila melanogaster provides such a model. In this system, genetically-encoded fluorescent indicators are available to detect Ca2+ changes in nerve terminals. However, these indicators have limited sensitivity to Ca2+ and often show a non-linear response. Synthetic fluorescent indicators are better suited for measuring the rapid Ca2+ changes associated with nerve activity. Here we demonstrate a technique for loading dextran-conjugated synthetic Ca2+ indicators into live nerve terminals in Drosophila larvae. Particular emphasis is placed on those aspects of the protocol most critical to the technique's success, such as how to avoid static electricity discharges along the isolated nerves, maintaining the health of the preparation during extended loading periods, and ensuring axon survival by providing Ca2+ to promote sealing of severed axon endings. Low affinity dextran-conjugated Ca2+-indicators, such as fluo-4 and rhod, are available which show a high signal-to-noise ratio while minimally disrupting presynaptic Ca2+ dynamics. Dextran-conjugation helps prevent Ca2+ indicators being sequestered into organelles such as mitochondria. The loading technique can be applied equally to larvae, embryos and adults.

Calcium is a ubiquitous messenger in the nervous system, essential for triggering neurotransmitter release and changes in synaptic strength. Here we demonstrate a technique for loading Ca2+-indicators into Drosophila nerve terminals. We also demonstrate fabrication of the required apparatus and emphasize points critical for the technique's success.

Kalsiyum Göstergeleri ile yükleme Drosophila Sinir Terminalleri

Calcium plays many roles in the nervous system but none more impressive than as the trigger for neurotransmitter release, and none more profound than as ...

Functional Imaging with Reinforcement, Eyetracking, and Physiological Monitoring

We use functional brain imaging (fMRI) to study neural circuits that underlie decision-making.  To understand how outcomes affect decision processes, simple perceptual tasks are combined with appetitive and aversive reinforcement.  However, the use of reinforcers such as juice and airpuffs can create challenges for fMRI.  Reinforcer delivery can cause head movement, which creates artifacts in the fMRI signal.  Reinforcement can also lead to changes in heart rate and respiration that are mediated by autonomic pathways.  Changes in heart rate and respiration can directly affect the fMRI (BOLD) signal in the brain and can be confounded with signal changes that are due to neural activity.  In this presentation, we demonstrate methods for administering reinforcers in a controlled manner, for stabilizing the head, and for measuring pulse and respiration.

This presentation demonstrates the use of fMRI to study neural circuits that underlie decision-making. Simple perceptual tasks are combined with appetitive and aversive reinforcements to investigate how outcomes affect decision processes.

Takviye, Eyetracking ve Fizyolojik İzleme Fonksiyonel Görüntüleme

We use functional brain imaging (fMRI) to study neural circuits that underlie decision-making.  To understand how outcomes affect decision processes, ...

Dopamine Release at Individual Presynaptic Terminals Visualized with FFNs

The nervous system transmits signals between neurons via neurotransmitter release during synaptic vesicle fusion. To observe neurotransmitter uptake and release from individual presynaptic terminals directly, we designed fluorescent false neurotransmitters as substrates for the synaptic vesicle monoamine transporter. Using these probes to image dopamine release in the striatum, we made several observations pertinent to synaptic plasticity. We found that the fraction of synaptic vesicles releasing neurotransmitter per stimulus was dependent on the stimulus frequency. A kinetically distinct "reserve" synaptic vesicle population was not observed under these experimental conditions. A frequency-dependent heterogeneity of presynaptic terminals was revealed that was dependent in part on D2 dopamine receptors, indicating a mechanism for frequency-dependent coding of presynaptic selection.

Hui Zhang and Niko G. Gubernator contributed equally to this work.

A new means to measure neurotransmission optically using fluorescent dopamine analogs.

Bireysel Presinaptik Terminalleri Dopamin Yayın FFNs ile görüntülendi

The nervous system transmits signals between neurons via neurotransmitter release during synaptic vesicle fusion. To observe neurotransmitter uptake and ...

Whole-Cell Recording of Calcium Release-Activated Calcium (CRAC) Currents in Human T Lymphocytes

In T lymphocytes, depletion of Ca2+ from the intracellular Ca2+ store leads to activation of plasmalemmal Ca2+ channels, called Calcium Release-Activated Calcium (CRAC) channels. CRAC channels play important role in regulation of T cell proliferation and gene expression. Abnormal CRAC channel function in T cells has been linked to severe combined immunodeficiency and autoimmune diseases 1, 2 . Studying CRAC channel function in human T cells may uncover new molecular mechanisms regulating normal immune responses and unravel the causes of related human diseases. Electrophysiological recordings of membrane currents provide the most accurate assessment of functional channel properties and their regulation. Electrophysiological assessment of CRAC channel currents in Jurkat T cells, a human leukemia T cell line, was first performed more than 20 years ago 3, however, CRAC current measurements in normal human T cells remains a challenging task. The difficulties in recording CRAC channel currents in normal T cells are compounded by the fact that blood-derived T lymphocytes are much smaller in size than Jurkat T cells and, therefore, the endogenous whole-cell CRAC currents are very low in amplitude. Here, we give a step-by-step procedure that we routinely use to record the Ca2+ or Na+ currents via CRAC channels in resting human T cells isolated from the peripheral blood of healthy volunteers. The method described here was adopted from the procedures used for recording the CRAC currents in Jurkat T cells and activated human T cells 4-8.

Whole-Cell Recording of Calcium Release-Activated Calcium CRAC Currents in Human T Lymphocytes

We provide a step-by-step protocol for whole-cell patch clamp recording of Calcium Release-Activated Calcium (CRAC) currents in peripheral blood mononuclear cell-derived human T lymphocytes.

İnsan T lenfositleri, Kalsiyum-Film Aktive Kalsiyum Tüm Hücre Kayıt (Kerek) Akımlar

In T lymphocytes, depletion of Ca2+ from the intracellular Ca2+ store leads to activation of plasmalemmal Ca2+ channels, called Calcium Release-Activated ...

Monitoring Dynamic Changes In Mitochondrial Calcium Levels During Apoptosis Using A Genetically Encoded Calcium Sensor

Dynamic changes in intracellular calcium concentration in response to various stimuli regulates many cellular processes such as proliferation, differentiation, and apoptosis1. During apoptosis, calcium accumulation in mitochondria promotes the release of pro-apoptotic factors from the mitochondria into the cytosol2. It is therefore of interest to directly measure mitochondrial calcium in living cells in situ during apoptosis. High-resolution fluorescent imaging of cells loaded with dual-excitation ratiometric and non-ratiometric synthetic calcium indicator dyes has been proven to be a reliable and versatile tool to study various aspects of intracellular calcium signaling. Measuring cytosolic calcium fluxes using these techniques is relatively straightforward. However, measuring intramitochondrial calcium levels in intact cells using synthetic calcium indicators such as rhod-2 and rhod-FF is more challenging. Synthetic indicators targeted to mitochondria have blunted responses to repetitive increases in mitochondrial calcium, and disrupt mitochondrial morphology3. Additionally, synthetic indicators tend to leak out of mitochondria over several hours which makes them unsuitable for long-term experiments. Thus, genetically encoded calcium indicators based upon green fluorescent protein (GFP)4 or aequorin5 targeted to mitochondria have greatly facilitated measurement of mitochondrial calcium dynamics. Here, we describe a simple method for real-time measurement of mitochondrial calcium fluxes in response to different stimuli. The method is based on fluorescence microscopy of 'ratiometric-pericam' which is selectively targeted to mitochondria. Ratiometric pericam is a calcium indicator based on a fusion of circularly permuted yellow fluorescent protein and calmodulin4. Binding of calcium to ratiometric pericam causes a shift of its excitation peak from 415 nm to 494 nm, while the emission spectrum, which peaks around 515 nm, remains unchanged. Ratiometric pericam binds a single calcium ion with a dissociation constant in vitro of ~1.7 &mu;M4. These properties of ratiometric pericam allow the quantification of rapid and long-term changes in mitochondrial calcium concentration. Furthermore, we describe adaptation of this methodology to a standard wide-field calcium imaging microscope with commonly available filter sets. Using two distinct agonists, the purinergic agonist ATP and apoptosis-inducing drug staurosporine, we demonstrate that this method is appropriate for monitoring changes in mitochondrial calcium concentration with a temporal resolution of seconds to hours. Furthermore, we also demonstrate that ratiometric pericam is also useful for measuring mitochondrial fission/fragmentation during apoptosis. Thus, ratiometric pericam is particularly well suited for continuous long-term measurement of mitochondrial calcium dynamics during apoptosis.

This protocol describes a method for real-time measurement of mitochondrial calcium fluxes by fluorescent imaging. The method takes advantage of a circularly permutated YFP-based dual-excitation ratiometric calcium sensor (ratiometric pericam-mt) selectively expressed in mitochondria.

Apoptozis sırasında Mitokondrial Kalsiyum Düzeyleri Dinamik değişiklikler izlenmesi Genetiği Kodlanmış Kalsiyum Sensor Kullanımı

Dynamic changes in intracellular calcium concentration in response to various stimuli regulates many cellular processes such as proliferation, ...

Live Cell Calcium Imaging Combined with siRNA Mediated Gene Silencing Identifies Ca2+ Leak Channels in the ER Membrane and their Regulatory Mechanisms

In mammalian cells, the endoplasmic reticulum (ER) plays a key role in protein biogenesis as well as in calcium signalling1. The heterotrimeric Sec61 complex in the ER membrane provides an aqueous path for newly-synthesized polypeptides into the lumen of the ER. Recent work from various laboratories suggested that this heterotrimeric complex may also form transient Ca2+ leak channels2-8. The key observation for this notion was that release of nascent polypeptides from the ribosome and Sec61 complex by puromycin leads to transient release of Ca2+ from the ER. Furthermore, it had been observed in vitro that the ER luminal protein BiP is involved in preventing ion permeability at the level of the Sec61 complex9,10. We have established an experimental system that allows us to directly address the role of the Sec61 complex as potential Ca2+ leak channel and to characterize its putative regulatory mechanisms11-13. This system combines siRNA mediated gene silencing and live cell Ca2+ imaging13. Cells are treated with siRNAs that are directed against the coding and untranslated region (UTR), respectively, of the SEC61A1 gene or a negative control siRNA. In complementation analysis, the cells are co-transfected with an IRES-GFP vector that allows the siRNA-resistant expression of the wildtype SEC61A1 gene. Then the cells are loaded with the ratiometric Ca2+-indicator FURA-2 to monitor simultaneously changes in the cytosolic Ca2+ concentration in a number of cells via a fluorescence microscope. The continuous measurement of cytosolic Ca2+ also allows the evaluation of the impact of various agents, such as puromycin, small molecule inhibitors, and thapsigargin on Ca2+ leakage. This experimental system gives us the unique opportunities to i) evaluate the contribution of different ER membrane proteins to passive Ca2+ efflux from the ER in various cell types, ii) characterize the proteins and mechanisms that limit this passive Ca2+ efflux, and iii) study the effects of disease linked mutations in the relevant components.

Live Cell Calcium Imaging Combined with siRNA Mediated Gene Silencing Identifies Ca2+ Leak Channels in the ER Membrane and their Regulatory Mechanisms

The endoplasmic reticulum plays a key role in protein biogenesis and in calcium homeostasis. We have established an experimental system that allows us to address the role of Ca2+ leak channels and to characterize their putative regulatory mechanisms. This system involves siRNA mediated gene silencing and live cell Ca2+ imaging.

Canlı Hücre Kalsiyum Görüntüleme siRNA aracılığı ile gen susturma ile birlikte Ca tanımlar 2 + ER Membran Kaçak Kanallar ve Düzenleme Mekanizmaları

In mammalian cells, the endoplasmic reticulum (ER) plays a key role in protein biogenesis as well as in calcium signalling1. The heterotrimeric Sec61 ...

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish water and sediment. The choice of biological indicators must be based on reliable scientific knowledge and, possibly, on the availability of standardized procedures. In this article, we present a standardized protocol that used the marine crustacean Artemia to evaluate the toxicity of chemicals and/or of marine environmental matrices. Scientists propose that the brine shrimp (Artemia) is a suitable candidate for the development of a standard bioassay for worldwide utilization. A number of papers have been published on the toxic effects of various chemicals and toxicants on brine shrimp (Artemia). The major advantage of this crustacean for toxicity studies is the overall availability of the dry cysts; these can be immediately used in testing and difficult cultivation is not demanded1,2. Cyst-based toxicity assays are cheap, continuously available, simple and reliable and are thus an important answer to routine needs of toxicity screening, for industrial monitoring requirements or for regulatory purposes3. The proposed method involves the mortality as an endpoint. The numbers of survivors were counted and percentage of deaths were calculated. Larvae were considered dead if they did not exhibit any internal or external movement during several seconds of observation4. This procedure was standardized testing a reference substance (Sodium Dodecyl Sulfate); some results are reported in this work. This article accompanies a video that describes the performance of procedural toxicity testing, showing all the steps related to the protocol.

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

This study concerns the development and standardization of a valuable methodological protocol to determine long-term (14 days) lethal toxicity exerted by chemical substances, industrial wastewater or sewage and liquid environmental samples on the saltwater crustacean, Artemia franciscana.

Kabuklu uzun vadeli Lethal Toksisite Testi Artemia Franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

Direct Imaging of ER Calcium with Targeted-Esterase Induced Dye Loading (TED)

Visualization of calcium dynamics is important to understand the role of calcium in cell physiology. To examine calcium dynamics, synthetic fluorescent Ca2+ indictors have become popular. Here we demonstrate TED (= targeted-esterase induced dye loading), a method to improve the release of Ca2+ indicator dyes in the ER lumen of different cell types. To date, TED was used in cell lines, glial cells, and neurons in vitro. TED bases on efficient, recombinant targeting of a high carboxylesterase activity to the ER lumen using vector-constructs that express Carboxylesterases (CES). The latest TED vectors contain a core element of CES2 fused to a red fluorescent protein, thus enabling simultaneous two-color imaging. The dynamics of free calcium in the ER are imaged in one color, while the corresponding ER structure appears in red. At the beginning of the procedure, cells are transduced with a lentivirus. Subsequently, the infected cells are seeded on coverslips to finally enable live cell imaging. Then, living cells are incubated with the acetoxymethyl ester (AM-ester) form of low-affinity Ca2+ indicators, for instance Fluo5N-AM, Mag-Fluo4-AM, or Mag-Fura2-AM. The esterase activity in the ER cleaves off hydrophobic side chains from the AM form of the Ca2+ indicator and a hydrophilic fluorescent dye/Ca2+ complex is formed and trapped in the ER lumen. After dye loading, the cells are analyzed at an inverted confocal laser scanning microscope. Cells are continuously perfused with Ringer-like solutions and the ER calcium dynamics are directly visualized by time-lapse imaging. Calcium release from the ER is identified by a decrease in fluorescence intensity in regions of interest, whereas the refilling of the ER calcium store produces an increase in fluorescence intensity. Finally, the change in fluorescent intensity over time is determined by calculation of &Delta;F/F0.

Direct Imaging of ER Calcium with Targeted-Esterase Induced Dye Loading TED

Targeted-esterase induced dye loading (TED) supports the analysis of intracellular calcium store dynamics by fluorescence imaging. The method bases on targeting of a recombinant Carboxylesterase to the endoplasmic reticulum (ER), where it improves the local unmasking of synthetic low-affinity Ca2+ indicator dyes in the ER lumen.

Hedefli-esteraz ile ER Kalsiyum Doğrudan Görüntüleme Kaynaklı Boya Yükleme (TED)

Visualization of calcium dynamics is important to understand the role of calcium in cell physiology. To examine calcium dynamics, synthetic fluorescent ...

Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in the striated muscle fibers that appear as highly localized Ca2+ release events mediated by ryanodine receptor (RyR) Ca2+ release channels on the sarcoplasmic reticulum (SR) membrane. Proper assessment of muscle Ca2+ sparks could provide information on the intracellular Ca2+&#160;handling properties of healthy and diseased striated muscles. Although Ca2+ sparks events are commonly seen in resting cardiomyocytes, they are rarely observed in resting skeletal muscle fibers; thus there is a need for methods to generate and analyze sparks in skeletal muscle fibers.
Detailed here is an experimental protocol for measuring Ca2+ sparks in isolated flexor digitorm brevis (FDB) muscle fibers using fluorescent Ca2+ indictors and laser scanning confocal microscopy. In this approach, isolated FDB fibers are exposed to transient hypoosmotic stress followed by a return to isotonic physiological solution. Under these conditions, a robust Ca2+ sparks response is detected adjacent to the sarcolemmal membrane in young healthy FDB muscle fibers. Altered Ca2+ sparks response is detected in dystrophic or aged skeletal muscle fibers. This approach has recently demonstrated that membrane-delimited signaling involving cross-talk between inositol (1,4,5)-triphosphate receptor (IP3R) and RyR contributes to Ca2+ spark activation in skeletal muscle. In summary, our studies using osmotic stress induced Ca2+ sparks showed that this intracellular response reflects a muscle signaling mechanism in physiology and aging/disease states, including mouse models of muscle dystrophy (mdx mice) or amyotrophic lateral sclerosis (ALS model).

Described here is a method to directly measure calcium sparks, the elementary units of Ca2+ release from sarcoplasmic reticulum&#160;in intact skeletal muscle fibers. This method utilizes osmotic-stress-mediated triggering of Ca2+ release from ryanodine receptor in isolated muscle fibers. The dynamics and homeostatic capacity of intracellular Ca2+ signaling can be employed to assess muscle function in health and disease.

Kalsiyum değerlendirilmesi Bozulmamış İskelet kas liflerinin içinde Sparks

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...

Hedeflenen Ca ile ER / SR Kalsiyum Salınımının İzlenmesi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler