Fuji ImageJ Saat Tarama eklentisinin kendi versiyonunu bizimle paylaştığımız ve programın bu sürümünü geliştirmemiz için bize ilham verdiğiniz için Dr. Tanja Maritzen&#39;e ve Dr. Fabian Feutlinske&#39;ye (Berlin, Almanya, Leibniz Moleküler Farmakoloji Enstitüsü) teşekkür ediyoruz. Ayrıca eklentiyi test etmek ve geliştirmek amacıyla bölümünün veri tabanındaki görüntüleri kullanmak için kendi izninizle Dr. Fritz Melchers&#39;a (Lymphocyte Development Departmanı, Max Planck Enfeksiyon Biyolojisi Enstitüsü) teşekkür ediyoruz. Destek: Translasyonel Sinirbilim Merkezi; NIH hibe: P30-GM110702-03.

1. Yazılım Kurulumu <ol><li> Paketlenmiş Java ve ImageJ veya Fiji ImageJ&#39;in ilgili web sitelerinde önerilen en son sürümlerini yükleyin (ilgili web sitelerine bağlantılar için malzeme tablosuna bakın). Aşağıdaki metinde her iki programa &quot;ImageJ&quot; denir. </li><li> Malzeme tablosunda verilen bağlantıyı kullanarak &quot;Clock_Scan-1.0.1. Jar&quot; ve &quot;Multi_Clock_Scan-1.0.1.jar&quot; eklenti dosyalarını kopyalayıp bunları ImageJ eklenti dizinine yapıştırın. Alternatif olarak, bu dosyalar bilgisayarın sabit disk sürücüsüne kaydedildikten sonra yüklemek için &quot;Eklentiler | Yükleme eklentisi&quot; menü seçeneğini kullanın. </li></ol> 2. Saat Tarama analizi <ol><li> Standart Saat Tarama eklentisi ( Şekil 1 ): <ol><li> İlgi çekici bir resmi açmak için ImageJ &quot;Dosya | Aç&quot; menü komutunu kullanın. </li><li> &#39;Çokgen&#39; aracını veya &#39;bölümlü çizgi seçimi&#39;ni tıklayınAracı seçin ve ardından ROI&#39;nin tamamını veya bu bölgenin bir bölümünü anahatlamak için görüntüyü çizin. Çokgen seçimi örneği (iç kesikli çizgi) için bkz. Şekil 1A. NOT: Yazılımda bulunan diğer seçim araçları (dikdörtgen, oval ve serbest el çizgisi seçimi) de kullanılabilir. </li><li> Standart saat tarama protokolü açılır pencere seçenek penceresini açmak için menüden &quot;Eklentiler | Saat Taraması&quot; nı seçin. Bu komutun ROI Yöneticisi penceresini otomatik olarak eklenen anahatla birlikte açacağını unutmayın. </li><li> Aşağıdakileri yapmak için eklenti seçenek penceresini kullanın. <ol><li> Kaydırma çubuklarını kullanarak veya ilgili giriş kutularındaki değerleri değiştirerek ROI merkezinin X ve Y koordinatlarını gözden geçirin ve değiştirin (fiziksel kütle merkezinin koordinatları olarak otomatik olarak hesaplanır). Şekil 1 B&#39;ye bakın. </li><li> Nesne dışındaki arka plan bölgesinin ne kadarına bağlı olarakTarama kapsamına girmek için &quot;tarama limiti&quot; kaydırma çubuğunu kullanarak tarama sınırlarını ayarlayın. Bakınız Şekil 1 A. NOT: Tarama sınırı, taramanın belirli bir yönde nesne sınırının ötesine ne kadar ilerleyeceğini gösteren kesirli sayıdır; Varsayılan değer 1.20 olup tarama uzunluğu tarama yönünde nesne yarıçapından% 20 daha uzun olacağını belirtir; Bakınız Şekil 1A, dışa kesik çizgi). </li><li> &quot;Gerçek yarıçap&quot;, &quot;arka plan çıkar&quot;, &quot;kutup dönüşümü&quot; ve / veya &quot;standart sapma ile çizim&quot; onay kutularını kullanarak eklentinin çıktısını değiştirin. </li><li> Eklentiyi çalıştırmak için &quot;Tamam&quot; ı tıklayın. Bakınız Şekil 1 C-H . NOT: &quot;Standart sapma ile çizim&quot; ve &quot;kutupsal dönüşüm&quot; ya da &quot;gerçek yarıçap&quot; ve &quot;kutupsal transfüzyon&quot; protokollerinin çıktı örnekleriOrm &quot;seçenekleri seçildiğinde, sırasıyla Şekil 1C ve 1D ve Şekil 1E ve 1F&#39;de gösterilmiştir Hesaplanan standart sapma (SD) değerleri, nesnenin radyal piksel yoğunluk taramaları arasındaki değişimi göstermektedir Not Ayrıca&quot; ROI seçimi Piksel olarak ölçülen ROI anahat uzunluğu hakkındaki bilgileri görüntüleyen eklenti penceresinde &quot;uzunluk&quot; satırı içerir. </li></ol></li><li> Oluşturulan &quot;Saat Tarama Profili Çizimi&quot; nde, Gri tonlama görüntüleri için iki, X ve Y veri sütunlarında ve RGB görüntüler için X ve dört Y veri sütununda gösterilen değerleri çizmek için &quot;Liste&quot; komutunu kullanın; bunlardan Y0, Y1, Y2 ve Y3 sütunları, integral ve bireysel (kırmızı, yeşil ve mavi) renk kanalı piksel yoğunluk değerleri ile doldurulacaktır. </li></ol></li><li> Çoklu ROI Saat Tarama eklentisi - birden fazla ROI ile çalışma ( <strongClass = &quot;xfig&quot;&gt; Şekil 2 ): <ol><li> Birden fazla ROI içeren bir resim açın. </li><li> &quot;Çözümle | Araçlar | ROI Yöneticisi&quot; yi tıklayarak ROI Yöneticisi&#39;ni açın. </li><li> Ardışık olarak özetleyin (adım 2.1.2&#39;ye bakın) ve ROI Yöneticisi penceresine &quot;Ekle&quot; düğmesini tıklatarak ROI Yöneticisine her bir ROI&#39;yi ekleyin; Bunu görüntüdeki tüm ROI&#39;ler için yapın. ROI metrikleri ilgileniyorsa, &quot;Analyze | Measure&quot; komutunu kullanın. <ol><li> Birden çok parçalı çizgi seçimi örneği için Şekil 2A&#39;ya ve çoklu çokgen seçimlerine örnek olarak Şekil 2E&#39;ye bakınız. </li></ol></li><li> Protokol seçenekleri açılır penceresini açmak için &quot;Eklentiler&quot; menüsünden &quot;Çoklu Saat Taraması&quot; nı seçin. </li><li> Aşağıdakileri yapmak için protokol seçenek penceresini kullanın. <ol><li> Gerekirse, tarama sınırını adım 2.1.4.2&#39;ye göre sıfırlayın; Varsayılan değer 1.20&#39;dir. </li><li> Gerekirse opt&#39;ı seçinStandart sapma ile çiz &quot;kutusunu işaretleyerek SD çubuklarıyla ortalama saat tarama profilini çizmek için kullanın. Bakınız Şekil 2 C ve D. NOT: Hesaplanan SD değerleri, farklı nesnelerin ayrılmaz saat tarama profilleri arasındaki değişimi temsil edecektir. Ayrıca eklenti penceresindeki &quot;seçilen ROI&#39;lerin sayısı&quot; ile ilgili bilgileri gösteren satırı unutmayın. </li><li> Protokolü çalıştırmak için &quot;Tamam&quot; ı tıklayın. </li></ol></li><li> Oluşturulan &quot;Saat Tarama Profili Plotu&quot; nda, &quot;Plot Values&quot; penceresinde görüntülenen değerleri çizmek için &quot;List&quot; komutunu kullanın. Renk kanalına göre sütun atanması için &quot;Multi Clock Scan Profile Plot&quot; penceresi göstergesine bakın. </li><li> ROI&#39;lerin numaralandırıldığına ve belirli bir renk kanalı için saat tarama profillerinin, ROI&#39;lerin ana hatlarıyla çizildiği ve &quot;ROI Yöneticisi&quot; ne eklendiği sırayla çizildiğine dikkat edin. </li></ol></li><li> MulTiple ROI Saat Tarama eklentisi - bir görüntü yığınıyla çalışmak ( Şekil 3 ): <ol><li> İlgilenilen bir görüntü yığını açın. </li><li> &quot;Çözümle | Araçlar | ROI Yöneticisi&quot; yi tıklayarak ROI Yöneticisi&#39;ni açın. </li><li> 2.1.2 ve 2.2.3 adımlarında açıklandığı gibi, yığın içindeki görüntülerin ROI&#39;sini özetleyip ROI yöneticisine ekleyin. ROI metrikleri ilgileniyorsa, &quot;Analyze | Measure&quot; komutunu kullanın. </li><li> Protokol seçenekleri açılır penceresini açmak için &quot;Eklentiler&quot; menüsünden &quot;Çoklu Saat Taraması&quot; nı seçin. </li><li> Aşağıdakileri yapmak için protokol seçenek penceresini kullanın. <ol><li> Tarama sınırını adım 2.1.4.2&#39;de açıklandığı gibi sıfırlayın; Varsayılan değer 1.20&#39;dir. </li><li> &#39;Ortalama sapma ile çizim&#39; kutusunu işaretleyerek, SD tarama çubuklarıyla ortalama saat tarama profilini çizme seçeneğini seçin. NOT: Hesaplanmış SD değerleri, görüntü stanasında seçilen nesnenin farklı örnekleri arasındaki değişimi temsil edecektirck. Ayrıca, eklenti penceresindeki &quot;sayıdaki yığın sayısı&quot; ile ilgili bilgileri gösteren satırı unutmayın. </li><li> Protokolü çalıştırmak için &quot;Tamam&quot; ı tıklayın. </li></ol></li><li> &quot;Saat Tarama Profili Çizimi&quot; penceresinde, &quot;Çizim Değerleri&quot; penceresinde görüntülenen değerleri (Y sütun numarasının yığın içindeki görüntü konumunu temsil ettiği - 1) gösteren değerleri görüntülemek için &quot;Liste&quot; yi tıklayın. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Dobretsov, M., Romanovsky, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="Clock-scan"+protocol+for+image+analysis.">"Clock-scan" protocol for image analysis.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 291, 869-879 (2006).</li><li>Feutlinske, F., Browarski, M., Ku, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stonin1+mediates+endocytosis+of+the+proteoglycan+NG2+and+regulates+focal+adhesion+dynamics+and+cell+motility.">Stonin1 mediates endocytosis of the proteoglycan NG2 and regulates focal adhesion dynamics and cell motility.</a> Nat Commun. 6, 8535 (2015).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9, 671-675 (2012).</li><li>Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., Frise, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9, 676-682 (2012).</li><li>Dobretsov, M., Hastings, S. L., Stimers, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-uniform+expression+of+alpha+subunit+isoforms+of+the+Na+/K++pump+in+rat+dorsal+root+ganglia+neurons.">Non-uniform expression of alpha subunit isoforms of the Na+/K+ pump in rat dorsal root ganglia neurons.</a> Brain Res. 821, 212-217 (1999).</li><li>Hayar, A., Gu, C., Al-Chaer, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+for+patch+clamp+recording+and+calcium+imaging+of+neurons+in+the+intact+dorsal+root+ganglion+in+rats.">An improved method for patch clamp recording and calcium imaging of neurons in the intact dorsal root ganglion in rats.</a> J Neurosci Methods. 173, 74-82 (2008).</li><li>Dobretsov, M., Pierce, D., Light, K. E., Kockara, N. T., Kozhemyakin, M., Wight, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+mouse+model+to+selectively+identify+alpha3+Na,K-ATPase+expressing+cells+in+the+nervous+system.">Transgenic mouse model to selectively identify alpha3 Na,K-ATPase expressing cells in the nervous system.</a> Society for Neuroscience. , 1 (2015).</li><li>Lein, E. S., Hawrylycz, M. J., Ao, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+atlas+of+gene+expression+in+the+adult+mouse+brain.">Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain.</a> Nature. 445, 168-176 (2007).</li><li>Romanovsky, D., Mrak, R. E., Dobretsov, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-dependent+decline+in+density+of+human+nerve+and+spinal+ganglia+neurons+expressing+the+alpha3+isoform+of+Na/K-ATPase.">Age-dependent decline in density of human nerve and spinal ganglia neurons expressing the alpha3 isoform of Na/K-ATPase.</a> Neuroscience. 310, 342-353 (2015).</li><li>Campbell, J., Singh, D., Hollett, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+selective+photoconductive+stimulation+of+live+neurons.">Spatially selective photoconductive stimulation of live neurons.</a> Front Cell Neurosci. 8, 142 (2014).</li><li>Yuryev, M., Pellegrino, C., Jokinen, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+Calcium+Imaging+of+Evoked+Calcium+Waves+in+the+Embryonic+Cortex.">In vivo Calcium Imaging of Evoked Calcium Waves in the Embryonic Cortex.</a> Front Cell Neurosci. 9, 500 (2015).</li><li>Qiao, M., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Method+for+Labeling+Electrically+Coupled+Cells:+Application+to+Retina.">Genetic Method for Labeling Electrically Coupled Cells: Application to Retina.</a> Front Mol Neurosci. 8, 81 (2015).</li></ol>

Yazarlar rakip mali çıkarları veya başka çıkar çatışması olmadıklarını beyan ettiler.

Saat Tarama Protokolü: Saat Tarama protokolü hızlı ve basit bir görüntü analizi aracıdır. Bu protokolün avantajları, görüntü analizinin mevcut yaygın yaklaşımları (doğrusal piksel yoğunluğu taramaları veya ROI&#39;nin ortalama piksel yoğunluğunun hesaplanması gibi) ile karşılaştırıldığında önceki yayınlar 1 , 9&#39;da ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Kısaca, bu protokol, nesnenin kenarlığı gibi ROI merkezinden farklı uzaklıklarda bulunan piksellerin yoğunluğunu veya nesnenin dışındaki önceden belirlenmiş bir yeri (arka plan) ölçerek tam radyal piksel yoğunluğu profillerinin oluşturulmasına izin verir. Bu nedenle, her ROI&#39;nin saat tarama profilleri, (biyolojik uygulamalarda) bu profili lokal, örnek içi veya örnek-örnek arasındaki düzensizliklere daha az bağımlı hale getiren hemen arka planı için düzeltilebilir. Etiketleme / boyama yanı sıraMikroskop ışık kaynağının yoğunluğu veya floresan ışığa maruz kalma süreleri. Saat tarama profillerinin nesne boyutu ve şekli bağımsızlığı, bu protokolün uygulama alanını, farklı nesnelerin karşılaştırmalarına olanak tanıyarak ve ayrıca &quot;pozitif&quot; ve &quot;negatif&quot; kontrol profillerinin noktadan noktaya çıkarılması ile düzeltmektedir nesneler. Saat Tarama Eklentileri: Orijinal protokolü dağıtma ve paylaşma konusundaki en büyük sınırlama, Visual Basic 6.0 (VB) 1 , 9 ile geliştirilen kodun platform bağımlılığıydı. Bu sorun yakın bir tarihte, benzer bir Fuji ImageJ Saat Tarama eklentisi geliştirerek, Almanya, Leibniz Moleküler Farmakoloji Enstitüsündeki araştırma gruplarından biri tarafından ele alınmıştır 2 . Leibniz Enstitüsünün eklentisi orijinal saat taramasını, temel işlevselliği inteKapalı dış bükey şekil ROI için gral radyal tarama profilleri ve ek olarak dış çizgilerin bölümlerini işleyebilir. Bununla birlikte, eklentileri tarafından oluşturulan profilin tarama sınırı yalnızca% 100&#39;e (nesne sınırı) ayarlanabilir; yani, arka plan piksel yoğunluğunun nicelleştirilemediği anlamına gelir. Üstelik kutupsal dönüşümler üretmek, RGB görüntülerindeki farklı renk kanallarıyla çalışmak veya görüntü yığınlarıyla çalışmak ve çoklu ROI&#39;leri işlemek için hiçbir kapasiteye sahip değildir. Karşılaştırıldığında, burada açıklanan iki yeni eklenti, orijinal VB kodunun yeteneğini tamamen üretir ( diğer bir deyişle , isteğe bağlı ekran SD&#39;leri ve / veya arka çıkarma ile integral saat tarama piksel yoğunluğu profillerinin yanı sıra RGB görüntüleri). Ek olarak, bir segment / yay şeklindeki ROI&#39;yi (Leibniz Enstitüsü, Moleküler Farmakoloji 2&#39;de geliştirilen Fuji ImageJ eklentisinde sunulan işlevselliği) analiz edebilirler. AyrıcaEse eklentileri, görüntü kayıt gerektiren uygulamalarda kullanılabilen ROI boyutu ve şekil bağımsız polar ROI görüntü dönüşümleri üreterek önceki programların yararını artırır. Son olarak, çok saatli tarama eklentisi aynı görüntüye veya bir görüntü yığında bulunan çok sayıda ROI&#39;nin saat taramasını etkili bir şekilde kolaylaştırır. Programın yeni özelliği, zaman ve konumla ilgili değişiklikleri belirlemek için önemli olan uygulamalarda özellikle yararlıdır. Sınırlamalar ve sorun giderme: Saat Tarama yönteminin başlıca kısıtlılığı konveks şeklinde bir ROI seçme gereksinimidir. Saat tarama profili, radyal tarardan herhangi birinin ROI anahattını bir kereden fazla geçtiği durumlarda anlamsız olur. Bu, merkezden ROI sınırına olan mesafeye göre bu radyal taramanın uzunluğunun normalleştirilmesini imkansız hale getirecektir. Bir diğer kısıtlama, saat tarama profili bilgilerinin progres olmasıdırRadyal simetri bulunmayan ROI&#39;de şiddetle azalmıştır. Bununla birlikte, en azından kısmen, bu iki sınırlama, kompleks şekilli ve asimetrik ROI&#39;lerin seçilen bölümlerinin (arklarının) analizi ile üstesinden gelinebilir. Arka plan çıkarma prosedürünü etkileyebilecek arka plan bölümlerinin bölümleri etiketlenmiş özellikler içeriyorsa, segment taramasının kullanılması da önerilir (diğer etiketlenmiş hücrelere bakmayan hücrelerin segmentlerinin analizi için bir örnek için Şekil 2A&#39;ya bakın). Son olarak, eğer 3&#39;den fazla renk kanalı içeren kompozit görüntülerin analizi gerekiyorsa, bu görüntülerin renk kanalları eklentiyi çalıştırmadan önce bölünmelidir. Gelecekteki yönergeler: Bu eklentilerin işlevselliğinde gelecekteki iyileştirmeler, bunlarla sınırlı olmamak üzere, saat tarama ve çok saatli tarama eklentilerinin işlevselliğini bir eklentiye birleştirmek için kodu güncelleme içerir. Renk ko-yerelleştirme algoritmaları (algoritmalar basPearson korelasyonunun hesaplamaları veya Manders bölünmüş katsayıları) ve bir görüntü yığındaki farklı görüntülerde veya farklı dilimlerde seçilen çoklu ROI&#39;lerle çalışabilecek eklentinin geliştirilmesi (eklentilerin mevcut sürümü, çeşitli Bir görüntüde seçilen ROI&#39;lar veya yığın içindeki tüm görüntüler için seçilen bir ROI) uygulanacaktır. Yazarlar ayrıca, eklenti kullanıcılarından gelen tüm önerileri ve mevcut eklentilerin kullanımı sırasında karşılaşılan sorunların raporlarını takdir edeceklerdir. Sonuç: Saat tarama analizi, çeşitli işaretleyicilerle statik hücre etiketlemesinin analizinden, Na + veya Ca ++ yayılımı çalışmalarına kadar tek bir hücrede olduğu gibi, biyolojinin birçok alanında görüntüleme çalışmalarında umut vaat eden bir araçtır. Sinaptik olarak bağlı hücrelerin popülasyonlarında yayılma aktivitesinin analizi ( ör . Ca ++ dalgaları) 10 </( 11) veya aralık birleşim birleşimli hücreler ( 12) içerir . Saat tarama analizinin uygulanabilir diğer potansiyel alanları, tıbbi görüntü analizi (kan damarlarının ultrason görüntüleri, CT-tarama görüntüleri ve kemik kesitleri), astronomi (spiral ve radyal galaksi görüntüleme), kimya (nokta kaynağından difüzyon) Fizik (kırınım deseni analizi), ormancılık (ağacın yaşını belirlemek için ağaç kök halkası analizi ve kuru hava ve zayıf gübreleme dönemleri), mühendislik (metal boru korozyonu) ve iklimbilim (hava radarı görüntü analizi).

Bu çalışmanın amacı, bu tür bir görüntü analiziyle ilgilenen herhangi bir araştırmacıya platformdan bağımsız ve serbestçe erişilebilen bir Saat Tarama protokolü sunmaktır. Saat Tarama protokolü, daha iyi bütünleştirici kapasiteye ve gelişmiş mekansal çözünürlüğe sahip bir yöntem olan, konveks biçimli ilgi alanı (ROI) içindeki mevcut piksel yoğunluğu niceleme yöntemlerini geliştirmeyi amaçlayan, orijinal olarak 2006&#39;da geliştirildi. Satın alma işlemi sırasında, protokol, &quot;arka plan&quot; piksel yoğunluğunu ölçmek amacıyla ROI merkezinden kenara veya taramalı ROI dışındaki önceden belirlenmiş bir mesafeye taranan ardışık radyal piksel yoğunluğu profillerini toplar. Protokol, tarama yönünde ölçülen hücre yarıçapına göre bu profilleri ölçeklendirir. Böylece, merkezden her bir radyal taramanın ROI sınırına olan uzaklığı daima X ölçeğinin% 100&#39;üdür. Son olarak, program bu kişileri ortalama olarakAl profillerini tek bir radyal piksel yoğunluğu profiline dönüştürür. Ölçekleme nedeniyle, &quot;Saat Tarama&quot; protokolü tarafından üretilen ortalama piksel yoğunluğu profili, ne ROI boyutu ne de makul sınırlar içinde ROI şekline bağlı değildir. Bu yöntem, doğrudan ROI&#39;lerin profillerinin doğrudan karşılaştırılmasını veya gerekirse ortalamasını veya çıkarılmasını sağlar. Protokol, nesnenin dışında bulunan piksellerin ortalama yoğunluğunun basit bir çıkarılmasıyla arka plan gürültüsü için herhangi bir nesnenin integral piksel yoğunluğu profillerinin düzeltilmesine de olanak tanır. Sadece biyolojik örneklerde test edilmiş olsa da, protokolümüz orijinal bir noktanın etrafında düzenlenmiş fiziksel veya kimyasal süreç görüntüleri çalışmalarında kullanılan diğer mevcut görüntü analiz araçlarına değerli bir katkı sağlar (maddelerin bir nokta kaynaktan difüzyonu ) 1 . Bununla birlikte, orijinal görüntü analiz yönteminin en büyük kısıtlılığı protokolün devBir Visual Basic 6 (VB6) (kod ve bu nedenle, platforma bağımlı ve dağıtmak zordu (VB6 gerektiren) idi.) Bu soruna hitap etmek ve diğer araştırmacılar tarafından benzer yeni çabalara katılmak için 2 , VB6 Saat Taramasını Program kodunu NIH destekli ve serbestçe temin edilebilir açık kaynak ve platformdan bağımsız görüntü analiz programlarıyla uyumlu ImageJ 3 ve Fiji ImageJ 4&#39;e sahip iki Java tabanlı eklentiye dönüştürür.Ayrıca bu eklentiler, Birden fazla ROI ve görüntü yığınını işlemek için orijinal protokolün birçoğu.Birçok görüntü analizi uygulaması, birden çok nesnenin istatistiksel analizini gerçekleştirmek açısından kullanıcı dostu değildir ve bu nedenle genellikle sadece temsili veriler gösterilmektedir .. Çok Saatli Tarama ImageJ eklentisi ile, Aynı anda birden çok nesnenin analizini kolaylaştırmak mümkündür Mikroskopi verilerinin sağlam istatistiksel değerlendirmesi,Tekli hücreler / nesnelerdeki sinyal yoğunluğu dağılımı ile ilgili olarak, artık bu eklenti uzantısı ile mümkündür. Burada, Saat Tarama eklentilerini açıklıyor ve görüntü analizindeki uygulamalarının örneklerini gösteriyoruz.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="896">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Computer</td>
			<td style="width:71px;">Any</td>
			<td style="width:289px;"></td>
			<td style="width:320px;">compatible with software listed below</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ImageJ or Fiji ImageJ</td>
			<td style="width:71px;">NIH</td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/ or https://fiji.sc/</td>
			<td>bundled with Java 1.8 or higher</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Clock-scan plugins</td>
			<td style="width:71px;">freeware</td>
			<td>https://sourceforge.net/projects/clockscan/</td>
			<td>Clock_Scan-1.0.1 jar and Multi_Clock_Scan-1.0.1/ jar</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Origin 9.0</td>
			<td>OriginLab</td>
			<td style="width:289px;">Northampton, MA, USA</td>
			<td style="width:320px;">This program was used to generate some graphs of the original Clock Scan data. Any other graphic software can be used to perform this function</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

clock scan protocol for image analysis: imagej plugins

Görüntü analizi için saat tarama protokolü, sınırdaki ve dışındaki (arka plan) kapalı veya bölmeli dışbükey biçimli bir bölge içindeki ortalama piksel yoğunluğunu ölçmek için etkili bir araçtır ve bu da ortalama bir radyal piksel- Yoğunluk profili. Bu protokol aslen 2006&#39;da görsel bir temel 6 senaryo olarak geliştirildi, ancak öyle olduğu gibi dağılımı sınırlıydı. Bu soruna hitap etmek ve başkaları tarafından benzer yeni çabalara katılmak için orijinal saat tarama protokol kodunu, NIH sponsorluğunda ve ImageJ veya Fiji ImageJ gibi özgürce mevcut görüntü analiz programlarıyla uyumlu olan iki Java tabanlı eklentiye dönüştürdük. Ayrıca, bu eklentilerin, birkaç farklı bölgenin analizi gibi orijinal protokolün yeteneklerini daha da genişleten birkaç yeni işlevi vardır. Programın ikinci özelliği, özellikle ilgili değişiklikleri belirlemenin önemli olduğu uygulamalarda yararlıdır.Zamana ve yere. Bu nedenle, biyolojik görüntü yığınlarının saat tarama analizi, tek bir hücre içerisinde Na + veya Ca ++ &#39; nin yayılmasının yanı sıra, sinaptik popülasyonlarda yayılma aktivitesinin ( örn. , Ca ++ dalgaları) analizine de uygulanabilir Bağlantılı veya boşluk birleşim bağlantılı hücreler. Burada, bu yeni saat tarama eklentilerini açıklıyor ve görüntü analizindeki uygulamalarının bazı örneklerini gösteriyoruz.

Buraya illüstrasyon amacıyla kullanılan resimler, önceki hücre ve doku biyolojik çalışmalarımızda 5 , 6 , 7 ve Allen Mouse Brain Atlas 8&#39;de oluşturulan veritabanlarından alınmıştır. Her iki eklenti de ImageJ 1.50i / Java 1.8.0_77, ImageJ 2.0.0-rc-44 / 1.50e / Java 1.8.9_66 ve Fiji ImageJ 2.0.0-rc54 / 1.51g / Java 1.8.0_66 program ortamı kullanılarak başarıyla test edildi. Şekil 1 , standart bir Saat Taraması eklentisi ile görüntü analizinin temsili sonuçlarını göstermektedir. Her iki eklenti için, saat tarama prosedürünün temel kodu ve ana adımları asıl protokol 1&#39;de açıklandığı gibi esasen aynıdır. Kısaca, ROI&#39;dan veya ROI&#39;nın bir bölümünün resim üzerinde açıklandıktan sonra ( Şekil 1 A , iç sarı dış çizgi) ve anahat merkezi belirlenir (eklenti seçenek penceresiyle ( Şekil 1 B ) otomatik veya manuel olarak belirlenir, piksel yoğunluğunun radyal taraması merkezin ilk piksele yönünde başlar Tüm ROI yarıçapları taranana kadar, anahat boyunca ( Şekil 1A; sırasıyla düz vektör ve kavisli ok) piksel-pikselle saat yönünde devam eder. ROI arka plan yoğunluğunu ölçmek için, her radyal taramanın uzunluğu taramanın yönündeki ROI yarıçapını önceden belirlenmiş bir kesirli sayıya (Saat Taraması eklentisinin varsayılan değeri olan yarıçapın% 0.2 veya% 20&#39;si kadar) kadar ayarlayabilir , Şekil 1 A&#39;da dış sarı çizgi). Toplanan radyal profiller daha sonra ilgili yarıçaplara ölçeklendirilerek hizalanır ve 2&#39;de integral saat tarama yoğunluğu profili elde etmek için ortalaması alınır56 gri tonlama birimi şiddeti seviyeleri ( Şekil 1 C ). RGB görüntüleri için her iki eklenti, kombine bir renk profiline ek olarak otomatik olarak her bir renk kanalı için bağımsız integral radyal piksel yoğunluğu profilleri (kırmızı, yeşil ve mavi renklerin 256 yoğunluk seviyesi) üretir. Varsayılan olarak, saat tarama piksel yoğunluğu profilinin x ölçeği normalleştirilmiş ROI yarıçapını temsil eder ve ölçek% 100&#39;ü ROI sınırında bulunan pikselleri temsil eder ( Şekil 1 C ). Şekil 1 C&#39;de gösterilen profil &quot;standart sapma ile çizim&quot; seçeneği seçilerek oluşturulmuştur ve bu nedenle grafik, profilin X ölçeği boyunca her veri noktası için hesaplanan SD&#39;yi de görüntüler. &quot;Arka planı çıkar&quot; seçeneği seçildiğinde, tüm yoğunluk profili, arka plan no için düzeltilirROI sınırı ile tarama sınırı sınırı ( Şekil 1 A&#39;daki dış sarı çizgi; gösterilmemiş veriler) arasında yer alan ortalama piksel yoğunluğunun noktadan noktaya çıkarılması ile ölçülür. &quot;Kutup dönüşümü&quot; seçeneği seçilirse, saat tarama eklentisi ek bir çıkış penceresi oluşturur. Seçilen bölgenin, tarama sınır bölgesi dahilinde görüntüsünün kutupsal bir dönüşümü vardır; burada, görüntü her radyal tarama yönünde merkezden nesneye sınırla her zaman 100&#39;e normalize olacak şekilde değiştirilir. % Ve 100 piksel ile temsil edilmektedir. Nesnenin gerçek boyutundan bağımsız olarak kutupsal dönüşüm resminin dikey ve yatay boyutları, piksel cinsinden taramanın iki katına (Şekil 1D&#39;de gösterilen örnekte 240 piksel x 240 piksel) sahiptir. Son olarak, &quot;gerçek yarıçap&quot; seçeneğini belirlemek, saat tarama prNesnenin gerçek yarıçapı yarıçapı ve orijinal görüntünün mekansal kalibrasyon birimleri cinsinden ölçeklendirilmiş bir polar dönüşüm görüntüsü (sırasıyla Şekil 1E ve F ). Şekiller 1G ve H , nesne boyutu ve şekil bağımsız polar dönüştürme ve entegre ImageJ komutları ve araçları kullanarak ek görüntü analiz seçeneklerini göstermektedir. Belirli görüntü analizi türleri için yararlı sayılan komutların örnekleri, bölümlü çizgi aracı ve &quot;Analiz Et Plot Profili&quot; komutu ( Şekil 1 G ) ve &quot;Analiz Et | Yüzey Plotu&quot; komutudur ( Şekil 1 H ). Şekil 2 ve 3 , Çok Saatli Tarama eklentisi ile görüntü analizinin temsili sonuçlarını göstermektedir. ÇıktısıÇoklu saat taraması eklentisi iki grafikten oluşur: ilk grafik seçilen nesnelerin tek tek saat tarama profillerini gösterir ( Şekil 2C) ve ikinci grafik bu tek tek saat tarama profillerinin ortalamasını gösterir (isteğe bağlı olarak ± SD, isteğe bağlı; Şekil 2D ) . RGB görüntüleri için ( Şekil 2 E ) her bir renk kanalı için hesaplanan saat tarama profili, seçilen her ROI için de görüntülenir ( Şekil 2 F ) ve ortalama, seçilen tüm nesneler için belirli bir kanal içinde hesaplanır ( Şekil 2G ) . Benzer şekilde, görüntü yığındaki nesneler için bireysel ve ortalama saat tarama profilleri, yığının saat taraması analizini yaptıktan sonra görüntülenir ( Şekil 3A-3D , ortalama saat tarama profili gösterilmemektedir). Daha önce belirtildiği gibi, sayısal&quot;List&quot; komutu uygulanarak bu arsaların üretilmesi için al veri kullanılır. Şekil 4 , Saat Tarama eklentisindeki polar dönüşüm seçeneğinin bir ek uygulamasını göstermektedir: görüntü kaydı ve bindirme işlemleri için uygunluğu. Bu şekilde, farklı fare korteks bölgelerindeki a3 sodyum / potasyum-ATPaz pompa eksprese eden nöronların flüoresan etiketlemesinin dağılımını karşılaştırmak için ROI boyutu ve şekilden bağımsız kutupsal dönüşümler kullanıldı, atlas görüntüsü sınırları ve anatomik organizasyonu gösterdi. Bu bölgeler ( Şekiller 4A-4B ). Bir saat tarama protokolüyle, referans (atlas) kaydı ve bu karşılaştırma için gereken gerçek görüntüler, görüntüleri hizalamak, her iki görüntüye ilgi yapısını gösteren basit bir prosedür ile sınırlıdır ve daha sonra ROI boyutu ve şekli üretir; Bağımsız kutupsal dönüşümler.Şekil 4&#39;te gösterilen örnekte, kutupsal dönüşümlerin karşılaştırılması neticesinde, fare beyin korteksindeki etiketli hücrelerin dağınık olmayan dağılımı açıkça gösterilir; yoğunluğu, motor korteksin 2 / 3&#39;üncü tabakalarının yüzeysel bölgelerinde özellikle yüksektir, dorsal kısım Agranular insular korteksin, lateral orbital korteksin ve motor korteksin derin tabakalarında ( Şekil 4C-4D ). <img alt="Şekil 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55819/55819fig1.jpg" /> Şekil 1 : Resim Analizi için Saat Tarama Eklentisinin Uygulanmasına İlişkin Temsilci Örnek. ( A ) Na + / K + - ATPaz&#39;ın α3 izoformu (α3 NKA; doku işleme ve boyama ayrıntıları için bkz. Schneider ve ark.3) için immünostained bir fare dorsal kök gangliyonunun bir bölümünün flüoresan ışığı görüntüsü.Sınırları α3 NKA (beyaz) olarak etiketlenmiş nöronal profillerden biri, çokgen çizgi aracı (iç sarı çizgi) kullanılarak özetlenmiştir. Panel B&#39;de (tarama limiti kaydırma çubuğu) gösterildiği gibi, radyal tarama (beyaz ok) sınırları (dış sarı çizgi) nesne yarıçapının% 120&#39;sine nesne merkezinden (beyaz nokta) ana hattın ilk pikseline ayarlandı. ( B ) Saat Tarama eklentisinin ana seçenek penceresinin ekran görüntüsü. ( C ) Panel A&#39;da gösterilen hücrenin integral piksel yoğunluğu profili (706 radyal tarama profilinin ortalaması, B&#39;deki anahat uzunluğu; dikey çubuklar SD çubuklarıdır). ( D ) - Çalışılan hücre profilinin kutupsal dönüşümü imgesi. ( E ) &quot;Gerçek yarıçap&quot; seçeneği seçilerek elde edilen aynı hücrenin saat tarama profili. C&#39;de gösterilen profilin aksine, bu profilin x ölçeği gerçek mekansal kalibrasyon birimlerini (μm) görüntüler. ( F ) Elde edilen aynı hücrenin kutupsal dönüşümü<html> &quot;Gerçek yarıçap&quot; seçeneği seçildi. Bu dönüşümün ölçeğinin artık gerçek uzaysal kalibrasyon birimlerinde (μm) olduğunu unutmayın. ( G ) D olarak gösterilen polar dönüşümün sınırı, bölümlü çizgi aracı (çizgi kalınlığı 10 piksele veya radyal tarama uzunluğunun% 10&#39;una ayarlandı) kullanılarak özetlendi ve analiz edildi. Nesnenin kenarı boyunca ortalama etiketleme yoğunluğundaki değişiklikleri ölçmek için &quot;Analiz Et Plot Profili&quot; komutu uygulandı (grafiğin her veri noktası, seçim satırı genişliğindeki tüm piksellerin ortalama yoğunluğunu temsil eder). ( H ) Nesnenin etiketleme yoğunluğunun 3-D gösterimini oluşturmak için D panelinde gösterilen kutupsal dönüşüm görüntüsüne &quot;Analize | Surface Plot&quot; komutu uygulandı. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55819/55819fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> E 2 &quot;class =&quot; xfigimg &quot;src =&quot; / dosyalar / ftp_upload / 55819 / 55819fig2.jpg &quot;/&gt; Şekil 2 : Temsilci Örnek Resim Analizi için Çok Saatli Tarama Eklentisi Kullanma uygulaması. ( A ) α3 NKA için immünolojik olarak sıçan dorsal kök gangliyonunun kesitinde dört görüş alanı ele geçirildi (bkz. Şekil 1 A efsaneye bakınız). Çok saatli tarama eklentisinin kullanımını basitleştirmek için bu görüntüler bir yığın içine yerleştirildi ve daha sonra &quot;Görüntü | Yığınlar | Montaj Yap&quot; komutu kullanılarak tek bir görüntüye dönüştürüldü. Kırmızı çizgiler ve sayılar, bu resimdeki beş bölgenin parçalanmış bir satır seçimlerine işaret etmektedir. ( B ) Çok Saatli Tarama penceresinin bir ekran görüntüsü, eklenti bir gri ölçekli görüntüyü analiz etmek için kullanıldığında gösterilir. ( C ) Panelde A&#39;da gösterilen beş ROI&#39;ün bireysel saat tarama profilleri. ( D ) Seçilen ROI&#39;ler için ortalama saat tarama profili (panelA) SD çubuklarla (&quot;standart sapma ile çizelge&quot; seçildi). ( E ) 4,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI, çekirdek lekesi, mavi) ve floresanla işaretlenmiş antikorlar ile etiketlenmiş kültürlenmiş fare preBI-lenfositlerinin RGB görüntüsü β1-integrin (yeşil) ve F-aktin (kırmızı Hücre kültürü tekniği için Dobretsov ve diğerleri 7&#39;ye ve boyama ayrıntıları için Yuryev ve diğerleri 11&#39;e bakınız). On bir hücre (bkz. Sayı etiketleri) ImageJ çokgen seçme aracı kullanılarak özetlendi. Sağdaki paneller &quot;Resim | Renk | Bölünmüş Kanallar&quot; menü işlevi yürütüldükten sonra hücre # 7&#39;nin yeşil ve kırmızı kanal görünümünü (sol paneldeki dikdörtgen seçki) gösterir. ( F ) Bireysel hücre saat tarama profilleri (kompozit ve kırmızı, yeşil ve mavi renk kanal profilleri sırasıyla siyah, kırmızı, yeşil ve mavi çizgilerle gösterilir). ( G ) Panelde seçilen onbir tüm ROI&#39;ler için ortalama saat tarama profilleriE. Panel G&#39;deki gibi renk tanımlamaları (Çok Saatli Tarama prosedürü sırasında standart sapma seçeneğine sahip herhangi bir grafik kullanılmamıştır). <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55819/55819fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55819/55819fig3.jpg" /> Şekil 3 : Çok Saatli Tarama Eklentisi ve Görüntü Yığınlarının Analizi. ( A ) Seçili ve &quot;yığın olarak kaydedilmiş&quot; görüntü çerçevelerinin montajı. İlk karede, diferansiyel interferans kontrastlı (DIC) mikroskopi ile yakalanan bir dorsal kök gangliyon nöronunun bir görüntüsü gösterilmektedir. Sonraki çerçeve, hücrenin elektriksel uyarımı öncesinde ve sonrasında farklı zaman aralıklarında hücre içi kalsiyum konsantrasyonunun izlenmesi için epi-aydınlatma flüoresan mikroskobu kullanılarak elde edildi. Saygının yanındaki numaralarE resim saati ms cinsinden gösterir 6 . Hücrenin kenarlığı, yığının DIC görüntüsü (sol üst çerçeve; yıldız işareti, hücrenin kalsiyuma duyarlı boya Oregon Green BAPTA-1 (OGB-1) ile doldurulması ve doldurulması için kullanılan patch-clamp pipetini belirtir) ) Ve daha sonra kalan görüntülerde Çok Saatli Tarama prosedürünü çalıştırmak için kullanılır. ( B ) Çoklu Saat Tarama penceresinin ekran görüntüsü, program bir yığın görüntü üzerinde çalıştırıldığında. ( C ) OGB-1 flüoresan sinyalinin hücre merkezinden (yarıçapın% &#39;si) farklı mesafelerde ve elektriksel uyarılmadan önce ve sonra farklı zamanlarda saatlik tarama profilleri (gösterge, ms cinsinden). Bu grafikleri hazırlamak için profesyonel grafik yazılımı kullanıldı. ( D ) Alt membran ve daha derin sitoplazmik hücre bölgelerinde zamanla OGB-1 sinyalinin yoğunluğundaki değişiklikler (sırasıyla kırmızı ve siyah daireler ve çizgiler). Bu verileri elde etmek için, her veri noktası yeri için ortalama ve SD hesaplandıC panelinde (gölgeli alanlar) gösterilen her saat tarama profilinin x ölçeğinin% 20-40&#39;ı ve% 70-90&#39;ı arasındadır. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55819/55819fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55819/55819fig4.jpg" /> Şekil 4 : Resim Kaydı ve Yer Paylaşımı&#39;nda Saat Tarama Eklentisini kullanma örneği. ( A ve B ) Koronal bölümden (Allen Mouse Brain Atlas) alınan plakanın 29 ekran görüntüleri ve atlas görüntüsü ile hemen hemen aynı seviyede kesilmiş jelatin gömülü fare beyininden 200 μm kalınlığında bir vibratome bölümü. Bu örnekte kullanılan transgenik fare α3NKA ifade eden nöronları tanımlamak için α3NKA&#39;nın promotoru altında ZsGreen-flüoresan proteini ifade etmiştir 2 . Belirlemek içinBu nöronlarla zenginleştirilmiş korteks bölgelerinde (panel B&#39;deki görüntü üzerinde parlak noktalar), aynı referans noktasına sahip her iki görüntüden (korteks ve koku arasındaki orta sınırdan başlayarak) tüm kortikal alan çizildi (sarı kesikli çizgiler) Ampul; oklar). ( C ) Paneller (soldan sağa): Saat Tarama polar, fare beyin bölümünün (panel B) görüntüsündeki atlas görüntüsünde (panel A) seçilen ROI&#39;yi ve bu iki dönüşüm imgesinin üst üste bindirilmesini (&quot;Görüntü |% 50 donukluk ayarı ile Yer Paylaşımı | Resim Ekle &quot;komutu). ( D ) Panel C&#39;deki ile aynı görüntüler ancak ImageJ çokgenini, bölümlü çizgi seçim araçlarını ve &quot;Çözümle Araçlar | Windows&#39;u Senkronize Et&quot; i kullanarak diğer iki dönüşüm görüntüsünde ana kortikal bölgelerin sınırları (atlasda gösterildiği gibi) komut. Kısaltmalar, orijinal beyin atlas görüntüsündeki gibidir: Motor primer ve sekonder (MOp, MOs), agranular adular, dorOrbital lateral, ventro-lateral ve medial (ORBI, ORBvl, ORBm), prelimbik (PL), anterior singulat, dorsal kısım (ACAd) korteks. MO alanında bulunan sayılar, uygun koronal beyin seviyesinde fare motor korteksinde ayırt edilebilen ana korteks tabakalarını ifade eder. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55819/55819fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Clock Scan Protocol for Image Analysis: ImageJ Plugins at JoVE.com

Clock Scan Protocol for Image Analysis: ImageJ Plugins

Bu yazı, &#39;Saat Tarama&#39; görüntü analizi için iki yeni ImageJ eklentisini açıklamaktadır. Bu eklentiler orijinal görsel temel 6 programının işlevselliğini genişletir ve daha da önemlisi, programı büyük bir araştırma topluluğunda ImageJ ücretsiz resim analizi yazılım paketi ile paketleyerek kullanılabilir hale getirir.

Görüntü Analizi için Saat Tarama Protokolü: ImageJ Eklentileri

The clock scan protocol for image analysis is an efficient tool to quantify the average pixel intensity within, at the border, and outside (background) a ...

clock-scan-protocol-for-image-analysis-imagej-plugins

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

17.3K Görüntüleme.  University of Arkansas for Medical Sciences.  Bu yazı, 'Saat Tarama' görüntü analizi için iki yeni ImageJ eklentisini açıklamaktadır. Bu eklentiler orijinal görsel temel 6 programının işlevselliğini genişletir ve daha da önemlisi, programı büyük bir araştırma topluluğunda ImageJ ücretsiz resim analizi yazılım paketi ile paketleyerek kullanılabilir hale getirir. 

Video: Clock Scan Protocol for Image Analysis: ImageJ Plugins

Protocol for Mosquito Rearing (A. gambiae)

This protocol describes mosquito rearing in the insectary. The insectary rooms are maintained at 28&deg;C and ~80% humidity, with a 12 hr. day/night cycle. For this procedure, you'll need mosquito cages, 10% sterile sucrose solution, paper towels, beaker, whatman filter paper, glass feeders, human blood and serum, water bath, parafilm, distilled water, clean plastic trays, mosquito food (described below), mosquito net to cover the trays, vacuum, and a collection chamber to collect adults.

Protocol for Mosquito Rearing A. gambiae

This video illustrates the general techniques used to rear Anopheles gambiae in the laboratory. The methods for caring for laboratory mosquitoes are demonstrated through all stages of the organism's life cycle from larvae to pupae to blood-feeding adults.

Sivrisinek Yetiştirme Protokolü (A. gambiae)

This protocol describes mosquito rearing in the insectary. The insectary rooms are maintained at 28&deg;C and ~80% humidity, with a 12 hr. day/night ...

Biyoloji

Neutrophil Isolation Protocol

Neutrophil polymorphonuclear granulocytes (PMN) are the most abundant leukocytes in humans and among the first cells to arrive on the site of inflammatory immune response. Due to their key role in inflammation, neutrophil functions such as locomotion, cytokine production, phagocytosis, and tumor cell combat are extensively studied. To characterize the specific functions of neutrophils, a clean, fast, and reliable method of separating them from other blood cells is desirable for in vitro studies, especially since neutrophils are short-lived and should be used within 2-4 hours of collection. Here, we demonstrate a standard density gradient separation method to isolate human neutrophils from whole blood using commercially available separation media that is a mixture of sodium metrizoate and Dextran 500. The procedure consists of layering whole blood over the density gradient medium, centrifugation, separation of neutrophil layer, and lysis of residual erythrocytes. Cells are then washed, counted, and resuspended in buffer to desired concentration. When performed correctly, this method has been shown to yield samples of >95% neutrophils with >95% viability.

Neutrophils are among the first cells to arrive on the site of inflammatory immune response, and their functions and mechanisms have been studied extensively in vitro. We demonstrate a standard density gradient separation method to isolate human neutrophils from whole blood using commercially available separation media.

Nötrofil İzolasyon Protokolü

Neutrophil polymorphonuclear granulocytes (PMN) are the most abundant leukocytes in humans and among the first cells to arrive on the site of inflammatory ...

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

Nörotoksisite Yüksek İçerik Analizi Nöronal ve Astrosit Hücre Co-Kültür Testi

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Robotics and Dynamic Image Analysis for Studies of Gene Expression in Plant Tissues

Gene expression in plant tissues is typically studied by destructive extraction of compounds from plant tissues for in vitro analyses. The methods presented here utilize the green fluorescent protein (gfp) gene for continual monitoring of gene expression in the same pieces of tissues, over time. The gfp gene was placed under regulatory control of different promoters and introduced into lima bean cotyledonary tissues via particle bombardment. Cotyledons were then placed on a robotic image collection system, which consisted of a fluorescence dissecting microscope with a digital camera and a 2-dimensional robotics platform custom-designed to allow secure attachment of culture dishes. Images were collected from cotyledonary tissues every hour for 100 hours to generate expression profiles for each promoter. Each collected series of 100 images was first subjected to manual image alignment using ImageReady to make certain that GFP-expressing foci were consistently retained within selected fields of analysis. Specific regions of the series measuring 300 x 400 pixels, were then selected for further analysis to provide GFP Intensity measurements using ImageJ software. Batch images were separated into the red, green and blue channels and GFP-expressing areas were identified using the threshold feature of ImageJ. After subtracting the background fluorescence (subtraction of gray values of non-expressing pixels from every pixel) in the respective red and green channels, GFP intensity was calculated by multiplying the mean grayscale value per pixel by the total number of GFP-expressing pixels in each channel, and then adding those values for both the red and green channels. GFP Intensity values were collected for all 100 time points to yield expression profiles. Variations in GFP expression profiles resulted from differences in factors such as promoter strength, presence of a silencing suppressor, or nature of the promoter. In addition to quantification of GFP intensity, the image series were also used to generate time-lapse animations using ImageReady. Time-lapse animations revealed that the clear majority of cells displayed a relatively rapid increase in GFP expression, followed by a slow decline. Some cells occasionally displayed a sudden loss of fluorescence, which may be associated with rapid cell death. Apparent transport of GFP across the membrane and cell wall to adjacent cells was also observed. Time lapse animations provided additional information that could not otherwise be obtained using GFP Intensity profiles or single time point image collections.

We report a method for introduction, tracking and quantitative analysis of GFP expression in plant cells. This method utilizes a custom-designed robotics system for semi-continuous image collection from large numbers of samples, over time. We also demonstrate the use of ImageJ and ImageReady for analysis of image series.

Bitkisel Dokular Gen İfade Araştırmalar Robotik ve Dinamik Görüntü Analizi

Gene expression in plant tissues is typically studied by destructive extraction of compounds from plant tissues for in vitro analyses. The methods ...

ReAsH/FlAsH Labeling and Image Analysis of Tetracysteine Sensor Proteins in Cells

Fluorescent proteins and dyes are essential tools for the study of protein trafficking, localization and function in cells. While fluorescent 
proteins such as green fluorescence protein (GFP) have been extensively used as fusion partners to proteins to track the properties of a protein of interest1, recent 
developments with smaller tags enable new functionalities of proteins to be examined in cells such as conformational change and protein-association 2, 3. One small 
tag system involves a tetracysteine motif (CCXXCC) genetically inserted into a target protein, which binds to biarsenical dyes, ReAsH (red fluorescent) and FlAsH 
(green fluorescent), with high specificity even in live cells 2. The TC/biarsenical dye system offers far less steric constraints to the host protein than 
fluorescent proteins which has enabled several new approaches to measure conformational change and protein-protein interactions 4-7. We recently developed 
a novel application of TC tags as sensors of oligomerization in cells expressing mutant huntingtin, which when mutated aggregates in neurons in Huntington 
disease 7. Huntingtin was tagged with two fluorescent dyes, one a fluorescent protein to track protein location, and the second a TC tag which only 
binds biarsenical dyes in monomers. Hence, changes in colocalization between protein and biarsenical dye reactivity enabled submicroscopic oligomer 
content to be spatially mapped within cells. Here, we describe how to label TC-tagged proteins fused to a fluorescent protein (Cherry, GFP or CFP) 
with FlAsH or ReAsH in live mammalian cells and how to quantify the two color fluorescence (Cherry/FlAsH, CFP/FlAsH or GFP/ReAsH combinations).

The biarsenical dyes FlAsH and ReAsH bind specifically to tetracysteine motifs in proteins and can selectively label proteins in live cells. Recently this labeling strategy has been used to develop sensors for different protein conformations or oligomeric states. We describe the labeling approach and methods to quantitatively analyze binding.

ReAsH / Flash Etiketleme ve Hücreler Tetracysteine ​​Sensör Proteinlerin Görüntü Analizi

Fluorescent proteins and dyes are essential tools for the study of protein trafficking, localization and function in cells.  While fluorescent 
proteins ...

LeafJ: An ImageJ Plugin for Semi-automated Leaf Shape Measurement

High throughput phenotyping (phenomics) is a powerful tool for linking genes to their functions (see review1 and recent examples2-4). Leaves are the primary photosynthetic organ, and their size and shape vary developmentally and environmentally within a plant. For these reasons studies on leaf morphology require measurement of multiple parameters from numerous leaves, which is best done by semi-automated phenomics tools5,6. Canopy shade is an important environmental cue that affects plant architecture and life history; the suite of responses is collectively called the shade avoidance syndrome (SAS)7. Among SAS responses, shade induced leaf petiole elongation and changes in blade area are particularly useful as indices8. To date, leaf shape programs (e.g. SHAPE9, LAMINA10, LeafAnalyzer11, LEAFPROCESSOR12) can measure leaf outlines and categorize leaf shapes, but can not output petiole length. Lack of large-scale measurement systems of leaf petioles has inhibited phenomics approaches to SAS research. In this paper, we describe a newly developed ImageJ plugin, called LeafJ, which can rapidly measure petiole length and leaf blade parameters of the model plant Arabidopsis thaliana. For the occasional leaf that required manual correction of the petiole/leaf blade boundary we used a touch-screen tablet. Further, leaf cell shape and leaf cell numbers are important determinants of leaf size13. Separate from LeafJ we also present a protocol for using a touch-screen tablet for measuring cell shape, area, and size. Our leaf trait measurement system is not limited to shade-avoidance research and will accelerate leaf phenotyping of many mutants and screening plants by leaf phenotyping.

Demonstration of key methods for high throughput leaf measurements. These methods can be used to accelerate leaf phenotyping when studying many plant mutants or otherwise screening plants by leaf phenotype.

LeafJ: Yarı otomatik Yaprak Shape Ölçüm için bir ImageJ Plugin

High throughput phenotyping (phenomics) is a powerful tool for linking genes to their functions (see review1 and recent examples2-4). Leaves are the ...

Automated Analysis of Dynamic Ca2+ Signals in Image Sequences

Intracellular Ca2+ signals are commonly studied with fluorescent Ca2+ indicator dyes and microscopy techniques. However, quantitative analysis of Ca2+ imaging data is time consuming and subject to bias. Automated signal analysis algorithms based on region of interest (ROI) detection have been implemented for one-dimensional line scan measurements, but there is no current algorithm which integrates optimized identification and analysis of ROIs in two-dimensional image sequences. Here an algorithm for rapid acquisition and analysis of ROIs in image sequences is described. It utilizes ellipses fit to noise filtered signals in order to determine optimal ROI placement, and computes Ca2+ signal parameters of amplitude, duration and spatial spread. This algorithm was implemented as a freely available plugin for ImageJ (NIH) software. Together with analysis scripts written for the open source statistical processing software R, this approach provides a high-capacity pipeline for performing quick statistical analysis of experimental output. The authors suggest that use of this analysis protocol will lead to a more complete and unbiased characterization of physiologic Ca2+ signaling.

Automated Analysis of Dynamic Ca2+ Signals in Image Sequences

Here a novel region of interest analysis protocol based on sorting best-fit ellipses assigned to regions of positive signal within two-dimensional time lapse image sequences is demonstrated. This algorithm may enable investigators to comprehensively analyze physiological Ca2+ signals with minimal user input and bias.

Dinamik Ca Otomatik Analizi<sup&gt; 2 +</supGörüntü Dizilerinde&gt; Sinyaller

Intracellular Ca2+ signals are commonly studied with fluorescent Ca2+ indicator dyes and microscopy techniques. However, quantitative analysis of Ca2+ ...

High-throughput Image Analysis of Tumor Spheroids: A User-friendly Software Application to Measure the Size of Spheroids Automatically and Accurately

The increasing number of applications of three-dimensional (3D) tumor spheroids as an in vitro model for drug discovery requires their adaptation to large-scale screening formats in every step of a drug screen, including large-scale image analysis. Currently there is no ready-to-use and free image analysis software to meet this large-scale format. Most existing methods involve manually drawing the length and width of the imaged 3D spheroids, which is a tedious and time-consuming process. This study presents a high-throughput image analysis software application &#8211; SpheroidSizer, which measures the major and minor axial length of the imaged 3D tumor spheroids automatically and accurately; calculates the volume of each individual 3D tumor spheroid; then outputs the results in two different forms in spreadsheets for easy manipulations in the subsequent data analysis. The main advantage of this software is its powerful image analysis application that is adapted for large numbers of images. It provides high-throughput computation and quality-control workflow. The estimated time to process 1,000 images is about 15 min&#160;on a minimally configured laptop, or around 1 min&#160;on a multi-core performance workstation. The graphical user interface (GUI) is also designed for easy quality control, and users can manually override the computer results. The key method used in this software is adapted from the active contour algorithm, also known as Snakes, which is especially suitable for images with uneven illumination and noisy background that often plagues automated imaging processing in high-throughput screens. The complimentary &#8220;Manual Initialize&#8221; and &#8220;Hand Draw&#8221; tools provide the flexibility to SpheroidSizer in dealing with various types of spheroids and diverse quality images. This high-throughput image analysis software remarkably reduces labor and speeds up the analysis process. Implementing this software is beneficial for 3D tumor spheroids to become a routine in vitro model for drug screens in industry and academia.

We present a high-throughput image analysis software application to measure the size of three-dimensional tumor spheroids imaged with bright-field microscopy. This application provides a fast and effective way to examine the effects of therapeutic drugs on spheroids, which is beneficial for researchers who wish to use spheroids in drug screens.

Tümör sferoidlerin Yüksek throughput Görüntü Analizi: Otomatik ve Doğru küremsiler boyutunu ölçmek için kullanıcı-dostu Yazılım Uygulama

The increasing number of applications of three-dimensional (3D) tumor spheroids as an in vitro model for drug discovery requires their adaptation to ...

A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth factors. Since organoids are highly similar to the original tissue in terms of homeostatic stem cell differentiation, cell polarity and presence of all terminally differentiated cell types known to the adult intestinal epithelium, they serve as an essential resource in experimental research on the epithelium. The possibility to express transgenes or interfering RNA using lentiviral or retroviral vectors in organoids has increased opportunities for functional analysis of the intestinal epithelium and intestinal stem cells, surpassing traditional mouse transgenics in speed and cost. In the current video protocol we show how to utilize transduction of small intestinal organoids with lentiviral vectors illustrated by use of doxycylin inducible transgenes, or IPTG inducible short hairpin RNA for overexpression or gene knockdown. Furthermore, considering organoid culture yields minute cell counts that may even be reduced by experimental treatment, we explain how to process organoids for downstream analysis aimed at quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry. Techniques that enable transgene expression and gene knock down in intestinal organoids contribute to the research potential that these intestinal epithelial structures hold, establishing organoid culture as a new standard in cell culture.

In this video protocol we give a step by step explanation of lentiviral transduction in organoids of primary intestinal epithelium and of processing and downstream analysis of these cultures by quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry.

Lentiviral İletim ve Bağırsak Organoids Mansabında Analizi için Protokol

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth ...

Rapid Analysis of Circadian Phenotypes in Arabidopsis Protoplasts Transfected with a Luminescent Clock Reporter

The plant circadian clock allows the anticipation of daily changes to the environment. This anticipation aids the responses to temporally predictable biotic and abiotic stress. Conversely, disruption of circadian timekeeping severely compromises plant health and reduces agricultural crop yields. It is therefore imperative that we understand the intricate regulation of circadian rhythms in plants, including the factors that affect motion of the transcriptional clockwork itself.
Testing circadian defects in the model plant Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) traditionally involves crossing specific mutant lines to a line rhythmically expressing firefly luciferase from a circadian clock gene promoter. This approach is laborious, time-consuming, and could be fruitless if a mutant has no circadian phenotype. The methodology presented here allows a rapid initial assessment of circadian phenotypes. Protoplasts derived from mutant and wild-type Arabidopsis are isolated, transfected with a rhythmically expressed luminescent reporter, and imaged under constant light conditions for 5 days. Luminescent traces will directly reveal whether the free-running period of mutant plants is different from wild-type plants. The advantage of the method is that any Arabidopsis line can efficiently be screened, without the need for generating a stably transgenic luminescent clock marker line in that mutant background.

The circadian clock regulates about a third of the Arabidopsis transcriptome, but the percentage of genes that feed back into timekeeping remains unknown. Here we visualize a method to rapidly assess circadian phenotypes in any mutant line of Arabidopsis using luminescent imaging of a circadian reporter transiently expressed in protoplasts.

Bir Lüminesans Saat Reporter ile Arabidopsis Protoplasts transfekte içinde Sirkadiyen fenotipleri Hızlı Analizi

The plant circadian clock allows the anticipation of daily changes to the environment. This anticipation aids the responses to temporally predictable ...

Görüntü Analizi için Saat Tarama Protokolü: ImageJ Eklentileri

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Sivrisinek Yetiştirme Protokolü (A. gambiae)

Nötrofil İzolasyon Protokolü

Nörotoksisite Yüksek İçerik Analizi Nöronal ve Astrosit Hücre Co-Kültür Testi

Bitkisel Dokular Gen İfade Araştırmalar Robotik ve Dinamik Görüntü Analizi

ReAsH / Flash Etiketleme ve Hücreler Tetracysteine Sensör Proteinlerin Görüntü Analizi

LeafJ: Yarı otomatik Yaprak Shape Ölçüm için bir ImageJ Plugin

Dinamik Ca Otomatik Analizi

Tümör sferoidlerin Yüksek throughput Görüntü Analizi: Otomatik ve Doğru küremsiler boyutunu ölçmek için kullanıcı-dostu Yazılım Uygulama

Lentiviral İletim ve Bağırsak Organoids Mansabında Analizi için Protokol

Bir Lüminesans Saat Reporter ile Arabidopsis Protoplasts transfekte içinde Sirkadiyen fenotipleri Hızlı Analizi

Görüntü Analizi için Saat Tarama Protokolü: ImageJ Eklentileri

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Sivrisinek Yetiştirme Protokolü (A. gambiae)

Nötrofil İzolasyon Protokolü

Nörotoksisite Yüksek İçerik Analizi Nöronal ve Astrosit Hücre Co-Kültür Testi

Bitkisel Dokular Gen İfade Araştırmalar Robotik ve Dinamik Görüntü Analizi

ReAsH / Flash Etiketleme ve Hücreler Tetracysteine ​​Sensör Proteinlerin Görüntü Analizi

LeafJ: Yarı otomatik Yaprak Shape Ölçüm için bir ImageJ Plugin

Dinamik Ca Otomatik Analizi

Tümör sferoidlerin Yüksek throughput Görüntü Analizi: Otomatik ve Doğru küremsiler boyutunu ölçmek için kullanıcı-dostu Yazılım Uygulama

Lentiviral İletim ve Bağırsak Organoids Mansabında Analizi için Protokol

Bir Lüminesans Saat Reporter ile Arabidopsis Protoplasts transfekte içinde Sirkadiyen fenotipleri Hızlı Analizi

ReAsH / Flash Etiketleme ve Hücreler Tetracysteine Sensör Proteinlerin Görüntü Analizi