We would like to thank Prof. David Somers and Dr. Jeongsik Kim for the luciferase reporter plasmid and initial method development. Prof. Karen Halliday kindly provided all the circadian mutant lines used in this study. This research was supported by Royal Society research grants RS120372 and RS140275. GvO is a Royal Society University Research Fellow (UF110173).

NOT: Bu protokol, tarif edilen reaktifler ve miktarlar test edilir Arabidopsis satıra ifade edilmiştir ve bu genotip altı kopya kuyu neden olur. Birden fazla satır analiz ederken satır sayısı ile malzeme çarpın analiz edilecek. (Ek çizgilerinden Örnek sonuçlar daha sonra verilecektir rağmen) videoda, vahşi tür Arabidopsis sirkadiyen saat değişken sıra ZTL karşılaştırılacaktır. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Enzim çözeltisi </td><td></td></tr><tr><td> selülaz </td><td> % 0.5 (ağırlık / hacim) </td></tr><tr><td> pektinaz R10 </td><td> % 0.25 (ağ / hac) </td></tr><tr><td> D-manitol </td><td> 400 mM </td></tr><tr><td> CaCl2 </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> KCI </td><td> 20 mM </td></tr><tr><td> Sığır serum albumini </td><td> % 0.1 (ağırlık / hacim) </td></tr><tr><td> MES, pH 5.7 </td><td> 20 mM </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> W5 çözümü </td><td></td></tr><tr><td> NaCI </td><td> 150 mM </td></tr><tr><td> CaCl2 </td><td> 125 mM </td></tr><tr><td> KCI </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> MES, pH 5.7 </td><td> 2 mM </td></tr><tr><td> glikoz </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> MMG çözümü </td><td></td></tr><tr><td> MES, pH 5.7 </td><td> 4 mM </td></tr><tr><td> D-manitol </td><td> 400 mM </td></tr><tr><td> MgCI2 </td><td> 15 mM </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> PEG çözeltisi </td><td></td></tr><tr><td> PEG4000 </td><td> % 40 (w / v) </td></tr><tr><td> D-manitol </td><td> 200 mM </td></tr><tr><td> CaCl2 </td&gt; <td> 100 mM </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> Görüntüleme çözümü </td><td></td></tr><tr><td> W5 çözümü </td><td> nihai hacme </td></tr><tr><td> Fetal sığır serumu </td><td> % 5 (h / h) </td></tr><tr><td> luciferin </td><td> 1.2 mM </td></tr><tr><td> ampisilin </td><td> 50 mg / ml </td></tr></tbody></table> Tablo 1: çözümlerin listesi. Malzeme ve Tamponlar hazırlanması 1. <ol><li> bitki Malzemeleri <ol><li> Arabidopsis Col tutmak -0 su içinde tohumları 1.5 ml bir tüp içinde, 4 ° C&#39;de karanlıkta dört gün. Bir tencerede toprak üzerine tohum pipet ve 7 gün süreyle 21 ° C&#39;de uzun gün koşullarında (16 saat ışık 8 saat karanlık) transfer. yüksek nem sağlamak için ilk üç gün boyunca pot bir kapak bırakın. Transplant altı yeni bir 8 cm x 13 cm x 5 cm pota fide ve anoth için aynı koşullar altında büyüyen bitkiler devam21 gün er. Toprak boyunca nemli olduğundan emin olun. </li></ol></li><li> Reporter plazmid <ol><li> Üreticinin talimatlarına göre bir DNA izolasyon kiti kullanılarak önceden bakteriyel kültürden LUC raportör plazmidi 19: CCA1pro saflaştınlır. NOT: 20 ug raportör plazmid bir transfeksiyon için (dH 2 O 2 mcg / ul 10 ul) gereklidir. </li></ol></li><li> Çözümler Not: Bu beş çözelti gerekli protokolü için: Enzim çözeltisi, yıkama 5 (W5) solüsyonu, mannitol-magnezyum (MMG) çözeltisi, polietilen glikol (PEG) çözeltisi ve görüntüleme çözeltisi (Tablo 1). protoplast izolasyon adıma geçmeden önce bu hazırlayın. <ol><li> Tablo 1 &#39;deki gibi, enzim çözeltisi, 10 ml hazırlamak enzimler son ekleme ve filtre 0.22 um&#39;lik bir şırınga filtreden geçirilerek çözelti sterilize edin. </li><li> Aşağıdaki hacimlerde kalan çözümleri hazırlayın: 15 ml W5 çözüm, 10 ml MMG szüm, 1, Tablo 1 gereğince ml PEG çözeltisi ve 1.5 ml görüntüleme çözümü. Not: Bu, PEG çözeltisi PEG tamamen çözünmüş olmasını sağlamak için önce transfeksiyon, bir saat daha az hazırlanmış olması önemlidir. Filtre 0.22 mikron şırınga filtre ile görüntüleme çözümü sterilize edin. </li></ol></li></ol><img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54586/54586fig1.jpg" /> Şekil 1:. Protoplast izolasyonu yetişkin Arabidopsis bitkilerinin (A) yaprakları alt epidermal tabaka (B) yukarı bakacak şekilde otoklav banda sabitlenir. (C) sihirli bantta yavaşça 15 ml konik bir tüp ucu ile alt epidermal tabaka üzerine basılır. (D) magic bant mezofil hücreleri (E) ortaya çıkarmak için kaldırılır. (F) izni ile otoklav bant şeritlerEkli çözeltisinin içine protoplast serbest enzim çözüm içeren selülaz ve pektinaz süzülüyor edilir. (G) iskelet enzimi sindiriminden sonra otoklav bant kalır ve yaprak enzim solüsyonu (H) protoplast bırakarak atılır. (I) Final ortaya çıkan mezofil protoplastlar (Ölçek çubuğu = 50 um). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54586/54586fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> 2. Protoplast İzolasyonu <ol><li> bir petri kabı etiketleyin ve 10 ml filtre ile sterilize edilmiş enzim çözeltisi ekleyin. </li><li> Temiz bir laboratuvar yüzeyinde yapışkan tarafı yukarı ile otoklav bant dört şeritler düzeltmek ve şeritler üzerinde petri boyutunu işaretleyin. </li><li> (4 haftalık bitkilerin (Şekil 1a) yaprakları kesin ve yukarı bakacak şekilde alt epidermal yüzeye yani (otoklav bant üzerine üst epidermis basın <strong&gt; Şekil 1b)). </li><li> Yavaşça 15 ml konik tüp kullanarak alt epidermal yüzeye sihirli bant şeritler basın. Yaprak dokusu (Şekil 1c) ezmek için özen gösterin. Dikkatle alt epidermis şerit sihirli bandı çekip (Şekil 1d) ve mezofil hücreleri (Şekil 1e) maruz kalmaktadır. </li><li> Petri içine bandı taşımak ve enzim solüsyonu (Şekil 1f) üzerinde yüzer, kullanım cımbız petri sığdırmak için otoklav bandı kesti, aşağı bakacak bırakır. protoplastlar çözeltisi içine çıkacak sırasında, 60 dakika için bir platformlu sallayıcı üzerinde 60 rpm&#39;de döndürün. </li><li> 50 ml konik tüp içine protoplast (Şekil 1h) içeren çözüm kaldırmak ve otoklav bandı (Şekil 1g) şeritler atmak ve pipet için cımbız kullanın. Geniş çaplı bir pipet (örneğin P5000 ucu ve sonu olmayan bir P1000 ucu kesilmiş gibi) kullanın. </li><li> 100 x protoplast santrifüj4 ° C&#39;de 3 dakika boyunca g bir pipet ile süpernatantı. pelet çok gevşek olduğu için, dikkat edin. </li><li> tüp hafifçe dönen 10 ml W5 protoplastlar çözüm ve tekrar süspansiyon ekleyin. </li><li> 30-60 dakika boyunca buz üzerinde protoplast bekletin. Bu adım sırasında, bir hemasitometre (Şekil 1i) &#39;de protoplast sayılarak verim değerlendirmek. </li><li> 4 ° C&#39;de 3 dakika boyunca 100 x g&#39;de santrifüj ile protoplast toplamak ve bir pipet ile süpernatantı. pelet çok gevşek olduğu için, dikkat edin. </li><li> Mmg çözeltisi içinde 5 x 10 5 protoplastlar / ml&#39;lik bir konsantrasyona kadar yeniden süspanse protoplast. </li></ol> 3. Protoplast Transfeksiyon <ol><li> 15 ml konik tüp, 10 ul raportör plasmidini (2 ug / ml) eklenir. </li><li> tüpe 400 ul protoplast ekleyin. </li><li> bir hacmi (410 ul) PEG çözeltisi ekleyin ve protoplast transferinde yavaşça 12 kez tersini tüp karıştırın. </li><li> 8-15 dk inc sonraOda sıcaklığında ubation, dört ciltlik (1640 ul) W5 çözeltisi ile protoplast-DNA-PEG karışımı sulandırmak ve yavaşça altı kez ters yüz edilerek karıştırılır. </li><li> Oda sıcaklığında 2 dakika boyunca 100 x g&#39;de santrifüj ile ara enfekte edilmiş protoplastlar toplamak ve bir pipet ile süpernatantı. pelet çok gevşek olduğu gibi bir kez daha, dikkat edin. </li><li> 1250 ul görüntüleme çözelti içinde protoplast yeniden süspanse edin. </li><li> altı içine kısım 200 ul W5 çözeltisi ile boş kuyu doldurun ve lüminesan görüntüleme için uygun bir yapışkan açık bir kapak plakası mühür, 96 kuyulu plakanın kuyularının çoğaltırlar. </li></ol> 4. Görüntüleme <ol><li> Bitki görüntüleme için uygun olan herhangi bir ışıldayan görüntüleme kurulum plaka aktarın. kuyular arasında yoğunlaşma ve basınç farklılıklarını önlemek için transferinden sonra plakalar 10-15 dk yapışkan kapakları değiştirmek, daha sonra görüntüleme başlatın. Plaka, oda sıcaklığında beş gün süre ile her ~ 45 dakika (3 san oyuk başına) okuyun. NOT:plaka frekans okur ve kuyu başına okuma zamanlı görüntüleme kurulumuna bağlı olarak değişebilir. </li></ol> 5. Veri Analizi <ol><li> Herhangi bir analiz yazılımı (örneğin, Biyolojik Ritimleri Analizi Yazılımı Sistemi (PİRİNÇ) 22) kullanarak lüminesans sonuçlarını analiz. sirkadiyen kusurları ortaya çıkarmak için, vahşi tipli kontroller ile değişken sıra Karşılaştırması. </li></ol>

<ol>
	<li>Goodspeed, D., Chehab, E. W., Min-Venditti, A., Braam, J., Covington, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+synchronizes+jasmonate-mediated+defense+with+insect+circadian+behavior.">Arabidopsis synchronizes jasmonate-mediated defense with insect circadian behavior.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (12), 4674-4677 (2012).</li><li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crosstalk+between+the+circadian+clock+and+innate+immunity+in+Arabidopsis.">Crosstalk between the circadian clock and innate immunity in Arabidopsis.</a> PLoS Pathog. 9 (6), 1003370 (2013).</li><li>Hevia, M. A., Canessa, P., M&#252;ller-Esparza, H., Larrondo, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+circadian+oscillator+in+the+fungus+Botrytis+cinerea+regulates+virulence+when+infecting+Arabidopsis+thaliana.">A circadian oscillator in the fungus Botrytis cinerea regulates virulence when infecting Arabidopsis thaliana.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112 (28), 8744-8749 (2015).</li><li>Bhardwaj, V., Meier, S., Petersen, L. N., Ingle, R. A., Roden, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defence+responses+of+Arabidopsis+thaliana+to+infection+by+Pseudomonas+syringae+are+regulated+by+the+circadian+clock.">Defence responses of Arabidopsis thaliana to infection by Pseudomonas syringae are regulated by the circadian clock.</a> PLoS One. 6 (10), 26968 (2011).</li><li>Graf, A., Schlereth, A., Stitt, M., Smith, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+control+of+carbohydrate+availability+for+growth+in+Arabidopsis+plants+at+night.">Circadian control of carbohydrate availability for growth in Arabidopsis plants at night.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 107 (20), 9458-9463 (2010).</li><li>Dodd, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+circadian+clocks+increase+photosynthesis,+growth,+survival,+and+competitive+advantage.">Plant circadian clocks increase photosynthesis, growth, survival, and competitive advantage.</a> Science. 309 (5734), 630-633 (2005).</li><li>Covington, M. F., Maloof, J. N., Straume, M., Kay, S. A., Harmer, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+transcriptome+analysis+reveals+circadian+regulation+of+key+pathways+in+plant+growth+and+development.">Global transcriptome analysis reveals circadian regulation of key pathways in plant growth and development.</a> Genome Biol. 9 (8), 130 (2008).</li><li>Choudhary, M. K., Nomura, Y., Wang, L., Nakagami, H., Somers, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Circadian+Phosphoproteomic+Analysis+of+Arabidopsis+Reveals+Extensive+Clock+Control+of+Key+Components+in+Physiological,+Metabolic,+and+Signaling+Pathways.">Quantitative Circadian Phosphoproteomic Analysis of Arabidopsis Reveals Extensive Clock Control of Key Components in Physiological, Metabolic, and Signaling Pathways.</a> Mol. Cell. Proteomics. 14 (8), 2243-2260 (2015).</li><li>Mizoguchi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LHY+and+CCA1+Are+Partially+Redundant+Genes+Required+to+Maintain+Circadian+Rhythms+in+Arabidopsis.">LHY and CCA1 Are Partially Redundant Genes Required to Maintain Circadian Rhythms in Arabidopsis.</a> Dev. Cell. 2 (5), 629-641 (2002).</li><li>Kikis, E. A., Khanna, R., Quail, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ELF4+is+a+phytochrome-regulated+component+of+a+negative-feedback+loop+involving+the+central+oscillator+components+CCA1+and+LHY.">ELF4 is a phytochrome-regulated component of a negative-feedback loop involving the central oscillator components CCA1 and LHY.</a> Plant J. 44 (2), 300-313 (2005).</li><li>Lu, S. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCA1+and+ELF3+Interact+in+the+Control+of+Hypocotyl+Length+and+Flowering+Time+in+Arabidopsis.">CCA1 and ELF3 Interact in the Control of Hypocotyl Length and Flowering Time in Arabidopsis.</a> Plant Physiol. 158 (2), 1079-1088 (2012).</li><li>Nakamichi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PSEUDO-RESPONSE+REGULATORS+9,+7,+and+5+are+transcriptional+repressors+in+the+Arabidopsis+circadian+clock.">PSEUDO-RESPONSE REGULATORS 9, 7, and 5 are transcriptional repressors in the Arabidopsis circadian clock.</a> Plant Cell. 22 (3), 594-605 (2010).</li><li>Dixon, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+repression+of+core+circadian+genes+is+mediated+through+EARLY+FLOWERING+3+in+Arabidopsis.">Temporal repression of core circadian genes is mediated through EARLY FLOWERING 3 in Arabidopsis.</a> Curr. Biol. 21 (2), 120-125 (2011).</li><li>Gendron, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+circadian+clock+protein,+TOC1,+is+a+DNA-binding+transcription+factor.">Arabidopsis circadian clock protein, TOC1, is a DNA-binding transcription factor.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (8), 3167-3172 (2012).</li><li>Hsu, P. Y., Harmer, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wheels+within+wheels:+the+plant+circadian+system.">Wheels within wheels: the plant circadian system.</a> Trends Plant Sci. 1, 1-10 (2013).</li><li>Daniel, X., Sugano, S., Tobin, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CK2+phosphorylation+of+CCA1+is+necessary+for+its+circadian+oscillator+function+in+Arabidopsis.">CK2 phosphorylation of CCA1 is necessary for its circadian oscillator function in Arabidopsis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101 (9), 3292-3297 (2004).</li><li>Portol&#233;s, S., M&#225;s, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functional+interplay+between+protein+kinase+CK2+and+CCA1+transcriptional+activity+is+essential+for+clock+temperature+compensation+in+Arabidopsis.">The functional interplay between protein kinase CK2 and CCA1 transcriptional activity is essential for clock temperature compensation in Arabidopsis.</a> PLoS Genet. 6 (11), e1001201 (2010).</li><li>Fujiwara, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-translational+regulation+of+the+Arabidopsis+circadian+clock+through+selective+proteolysis+and+phosphorylation+of+pseudo-response+regulator+proteins.">Post-translational regulation of the Arabidopsis circadian clock through selective proteolysis and phosphorylation of pseudo-response regulator proteins.</a> J. Biol. Chem. 283 (34), 23073-23083 (2008).</li><li>Kim, J., Somers, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+assessment+of+gene+function+in+the+circadian+clock+using+artificial+microRNA+in+Arabidopsis+mesophyll+protoplasts.">Rapid assessment of gene function in the circadian clock using artificial microRNA in Arabidopsis mesophyll protoplasts.</a> Plant Physiol. 154 (2), 611-621 (2010).</li><li>Wu, F. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tape-Arabidopsis+Sandwich+-+a+simpler+Arabidopsis+protoplast+isolation+method.">Tape-Arabidopsis Sandwich - a simpler Arabidopsis protoplast isolation method.</a> Plant Methods. 5, 16 (2009).</li><li>Baldwin, T. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Firefly+luciferase:+the+structure+is+known,+but+the+mystery+remains.">Firefly luciferase: the structure is known, but the mystery remains.</a> Structure. 4 (3), 223-228 (1996).</li><li>Edwards, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+regulatory+flexibility+under+changing+environmental+conditions.">Quantitative analysis of regulatory flexibility under changing environmental conditions.</a> Mol. Syst. Biol. 6 (424), 424 (2010).</li><li>Somers, D. E., Schultz, T. F., Milnamow, M., Kay, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ZEITLUPE+Encodes+a+Novel+Clock-Associated+PAS+Protein+from+Arabidopsis.">ZEITLUPE Encodes a Novel Clock-Associated PAS Protein from Arabidopsis.</a> Cell. 101 (3), 319-329 (2000).</li><li>Wang, Z. -. Y., Tobin, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constitutive+Expression+of+the+CIRCADIAN+CLOCK+ASSOCIATED+1+(CCA1)+Gene+Disrupts+Circadian+Rhythms+and+Suppresses+Its+Own+Expression.">Constitutive Expression of the CIRCADIAN CLOCK ASSOCIATED 1 (CCA1) Gene Disrupts Circadian Rhythms and Suppresses Its Own Expression.</a> Cell. 93 (7), 1207-1217 (1998).</li><li>Kim, W. -. Y., Geng, R., Somers, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+phase-specific+degradation+of+the+F-box+protein+ZTL+is+mediated+by+the+proteasome.">Circadian phase-specific degradation of the F-box protein ZTL is mediated by the proteasome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100 (8), 4933-4938 (2003).</li><li>Zhai, Z., Jung, H. -. I., Vatamaniuk, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+protoplasts+from+tissues+of+14-day-old+seedlings+of+Arabidopsis+thaliana.">Isolation of protoplasts from tissues of 14-day-old seedlings of Arabidopsis thaliana.</a> J. Vis. Exp. , e15-e17 (2009).</li><li>Yoo, S. -. D., Cho, Y. -. H., Sheen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+mesophyll+protoplasts:+a+versatile+cell+system+for+transient+gene+expression+analysis.">Arabidopsis mesophyll protoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis.</a> Nat. Protoc. 2 (7), 1565-1572 (2007).</li><li>Damm, B., Schmidt, R., Willmitzer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+transformation+of+Arabidopsis+thaliana+using+direct+gene+transfer+to+protoplasts.">Efficient transformation of Arabidopsis thaliana using direct gene transfer to protoplasts.</a> Mol. Gen. Genet. 217 (1), 6-12 (1989).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+efficient+rice+green+tissue+protoplast+system+for+transient+gene+expression+and+studying+light/chloroplast-related+processes.">A highly efficient rice green tissue protoplast system for transient gene expression and studying light/chloroplast-related processes.</a> Plant Methods. 7 (1), 30 (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Burada, protoplast izolasyonu, transfeksiyon ve luminecent görüntüleme dahil olmak üzere Arabidopsis hatlarında sirkadiyen dönem kusurları, ekrana hızlı bir test sunuyoruz. Yabani tip sirkadiyen süresi Arabidopsis ve saatli mutantları cca1 / Lhy, ZTL ve CCA1 OX bir CCA1pro gelen lüminesan ölçümlerinden hesaplandı: LUC raportörünün daha sürülme süresini kullanarak bütün bitkilerde üretilen yayınlanmış verilerle tutarlı olduğu bulunmuştur tüketen transgenik yaklaşımlar (Tablo 2). Arabidopsis mutantlar taranması için Bu tayin kullanılarak, zaman alıcı ve yalnızca belirli bir mutant yabanı ritimleri sergiler ortaya çıkarabilir transjenik lüminesan hatları oluşturmak için ilk şartı önler. Bu protokolün açık bir avantajı, herhangi bir Arabidopsis hat tesislerinde timekeeping etkileyen daha genlerin belirlenmesini yardımcı olacaktır değişmiş sirkadiyen ritimler transkripsiyon, kısa sürede ekranlı olmasıdır. <p class= &quot;Jove_content&quot;&gt; protoplast izolasyonu mutant hat bodur bir fenotip görüntüler, özellikle zahmetli olabilir. Protoplast üretilmesi için önce bildirilen yöntemlerle enzimler, hücre duvarları 26,27 ulaşmasını sağlamak için enzim solüsyonu ile şeritler infiltre ince şeritler ve vakum yaprakları veya fide kesme içerir. sonraki sindirim enzim çözeltisi içine protoplast serbest bırakmak için karanlıkta en az 3 saat inkübasyon gerektirmektedir. Vakum infiltrasyon uygulanmadığı zaman, 18 saat kadar olan kuluçka süresi tavsiye edilir. enzimlere aşılmaz epidermal hücre tabakası bant çıkarılır, çünkü burada sunulan protokolde, vakum infiltrasyon gereksizdir. bitki materyali keserek protoplast oluştururken sindirim sonra hücre duvarı enkaz ayrı protoplastlar için gereklidir; Bu, genellikle solüsyon filtre veya bir şeker degrade 27,26 üzerinde saflaştırılması yapılır. Burada, herhangi bir sindirilmemiş doku otoklav bandı sonra kalacaksindirim, protoplast filtrasyon ve şeker degrade arıtma atlanabilir böylece. Uzun süreli protoplasting prosedürlerden kaynaklanan stres, hücre canlılığı ve sirkadiyen saat etkileyen bir şans var. Burada görüntülenmiştir bant tabanlı protoplasting yöntemi 20 protoplastlar yüksek sayıda verir; ve sirkadiyen zaman serisi üzerinde hücrelerin canlılığını verildi ve protoplast ve bütün fideleri (Tablo 2) uygun süresi uzunluğu, burada açıklanan yöntem protoplast meydana getirmek için alternatif yöntemleri tercih edilir. protokolün transfeksiyon adımı o protoplast canlılığı üzerindeki etkileri kritik bir adımdır. PEG çözeltisi hücreye taşınması için DNA, ve her iki inkübasyon süresi, bu çözelti içinde (aşama 3.4) ve deneysel olarak tespit edilmelidir PEG yüzdesinin sağlar. standart konsantrasyon dönüşüm verimliliği ve yüksek azaltarak düşük konsantrasyonlarda ile% 20 olduğucanlılığı 28 azaltılması konsantrasyonları. Beş dakika kadar kısa inkübasyon süresi protoplastlar 27 verimli transfeksiyon verim verebilir. protoplastlar herhangi Işıklı görüntüleme platformu üzerinde görüntülenebilir. Bu videoda, biz yüksek verimli tarama ve sık ölçümler için izin verir, (~ 20 μE kombine yoğunluğu sırasıyla kırmızı ve mavi LED&#39;ler, 630 ve 470 nm,) dış ışıkları ile donatılmış bir parlaklık plaka okuyucu kullandık. aydınlatma fotosentez için kullanılabilir gibi bir şarj çiftli aygıt (CCD) kamera etrafında dayalı alternatif plaka okuyucu veya kurulumları olarak lüminesans algılar diğer görüntüleme ekipmanları, sürece eşit şekilde uygulanabilir. kontrol edilebilen bir kabin üzerine monte edilmiş bir CCD kamerası kullanılarak bir avantajı, hafif ve sıcaklık programlanabilir. Bir dezavantaj perturb ek olarak protoplastlar için strese neden olabilir karanlığın uzun süreli dönemleri tanıtan, uzun yakalama zamanıendojen timekeeping ing. Ne olursa olsun seçilmiş deneysel hangi platformu, ayarları, fide ya da olgun bitkiler için ayarlara göre gerekli olması muhtemeldir. Bizim tecrübelerimize göre, görüntüleme tamponunda transfeksiyonu ve / veya luciferase sırasında raportör plazmid artan konsantrasyonları ilk deneylerde oluşabilecek düzensiz veya hızlı nemlendirme ritimleri çözebilir. Gelecekteki deneylerde, burada tarif edilen yönteme göre herhangi bir mutant arabidopsis çizgisinin sirkadiyen fenotip çalışma uygulanabilir. Küçük değişiklikler yapılarak, zaman tutma gibi değişik ilaçların etkisi bu kurulum okudu olabilir. Ayrıca, transfeksiyon daha bu protokolün çok yönlülük genişleyen, 19 susturulması gen için yapay microRNA içerecek şekilde modifiye edilebilir. Pirinç protoplast oluşturmak için Protokoller 29 köklü ve burada sunulan görüntüleme protokolü eşit bizim u ilerletmek için uygulanan olabilirekonomik açıdan önemli monokot mahsul bitkilerinde saatin nderstanding.

Birçok canlı organizma çevreye günlük değişikliklerin etkili müzakere yardımcı olmak için bir endojen hakemi sahiptirler. Bu hakemi, sirkadiyen saat, dış ortamda öngörülebilir değişiklikleri tahmin etmek bir organizmanın metabolizması ve fizyolojisi birçok açıdan düzenler. 4 - örneğin bitkilerde, geçici öngörülebilir patojen veya otobur saldırıları beklentisiyle güçlü genel duyarlılık 1 azaltır. Nişasta metabolizması sıkıca uzun ya da kısa günün şartlarında 5 yetiştirilen olsun sabaha kadar son o nişasta rezervleri sağlamak için sirkadiyen saat düzenlenir. Nitekim, 24 saat çevre gösterisi artan büyüme oranları eşleşen sirkadiyen saatleri ile bitkiler, karbon fiksasyonu oranları ve sağkalım oranları uyumsuz dönemi 6 bir saat çalışan bitkilere kıyasla. Bütün bu süreçlerde sirkadiyen ritim geniş etkisi üçte kadar ritmik düzenlemelerinden büyük ölçüde ortaya çıkarArabidopsis 7 toplam transcriptome. Bu ritmik gen ürünleri metabolik yollar, hormon sinyalizasyon ve stres yanıtları 7 dahil, hücresel süreçlerin geniş bir yelpazede yer alırlar. Bunun üzerine, protein fonksiyonunun doğrudan sirkadiyen düzenleme fosforilasyon 8 sirkadiyen düzenlemesi ve büyük olasılıkla diğer post-translasyonel modifikasyonlar (PTMS) tarafından kurulmuştur. Bu günlük transkripsiyonel yeniden programlamayı sürücüler sirkadiyen saat merkezinde / öteleme geri besleme sabah ifade genler de dahil olmak üzere (TTFLs), döngüler transkripsiyonal bir ağ yatıyor ifade bastırmak sirkadiyen saat ASSOCIATED 1 (CCA1) ve Geç UZATILMIŞ hipokotil (Lhy) - 11 LUX ARRHYTHMO (LUX), erken çiçek açan 3 (ELF3) ve ELF4 9; akşam genleri CAB 1 (TOC1), gigantea (GI) ve akşam kompleksi (EC) üyelerinin zamanlaması. birlikte zekâH Yalancı TEPKİ REGÜLATÖRÜ -genes (PRR3, 5, 7 ve 9) AT pozitif bir regülatörü 12 olarak görev yapar iken, TOC1 CCA1 / Lhy ekspresyonunu bastıran - 14. TTFL ağ bileşenleri, geri besleme mekanizmaları Ek transkripsiyon sonrası ve post-translasyonel regülasyon ayar sirkadiyen ritimler önemli bir rol oynar. Bugüne kadar, sirkadiyen saat proteinleri tespit en bol PTM fosforilasyonu 15&#39;dir. Kazein Kinaz 2 (CK2) tarafından CCA1 fosforilasyonu onun promotörleri 16 hedef bağlanma ve sirkadiyen saat 17 sıcaklık dengelemesi açısından önemlidir etkiler. PRR proteinleri farklı şekilde sirkadiyen döngüsü boyunca fosforile ve TOC1 fosforilasyonu negatif regülatörü ile etkileşimi etkiler vardır, akşam aşamalı saat bileşeni ZEITLUPE (ztl) 18. Bu örnekler kadar 24 saat içinde PTMS ve protein-protein etkileşimleri ayar TTFL ağıtranskripsiyonel osilatör. Transkripsiyonel saat ağı ve düzenlenmesi için daha detaylı bir giriş için mükemmel son yorumları (örneğin referans 15) bulunmaktadır. Ancak, ne daha az açık kalır ritmik düzenlenmiş süreçler ve hücresel metabolizma diğer yönleri geri timekeeping mekanizması kendi içine beslemek için derecesidir. Saat kusurları için Arabidopsis mutantlar geniş tarama mekanizmaları ya da sinyal yolları bir TTFL ağdan 24 saat ritimlerin üretiminde rol oynayan edilebileceği ileri anlayışa olabilir. Bu amaçla, Kim ve Somers önce herhangi bir Arabidopsis çizgisi 19 saat fonksiyonu etkin ve hızlı analiz için bir kırılma yoluyla yöntemi yayınladı. protoplast geçici ekspresyonu kullanımına göre, bu yöntem, stabil transgenik kuşaklar için ihtiyaç aşan ya da lüminesan saat markör hatları geçmektedir. Burada, bir yüksek verimli protoplast, izolasyon görselleştirmekoptimize edilmiş bir protokol ile birlikte n yöntemi 20, 96 oyuklu bir plaka okuyucusunda geçici olarak ifade saat belirteçlerin lüminesan görüntüleme sirkadiyen kusurları ekranlanması için kullanıldı. Biz değişmiş sirkadiyen ritim algılar burada başarılı açıklanan metodoloji onaylamak için iyi karakterize saat mutantlar için yabani tip Koleji&#39;nden 0 Arabidopsis karşılaştırır. LUC 19: CCA1pro; bu hatlar türetilen Protoplastlar sirkadiyen CCA1 promoterinden ateşböceği lusiferazı eksprese eden bir raportör yapısı ile transfekte edilir. Lusiferaz Bu da, bu protoplastlarda genlik, transkripsiyonel ritim faz değerlendirmek için zamanla görüntülendi olan, ışığı 21 yayar oksilusiferin luciferase için elektronik olarak uyarılmış dönüştürüldüğü çok aşamalı reaksiyonu katalize eder. protokol üç ana bölümden oluşmaktadır; haberci plazmid ve lüminesan IM protoplast transfekte edilmesi, protoplast izolasyonyaşlanma. Bu üç parça, her zaman taze hazırlanmış tamponlar ve reaktifler kullanılarak, tek bir günde yapılmalıdır. Bitki büyümesi ve raportör plasmidinin yeterli miktarda saflaştırılması önceden yapılmalıdır ve bu protokolde görselleştirilemediği.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>CELLULYSIN Cellulase, Trichoderma viride&#160;</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>219466</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pectinase R10</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P2401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-mannitol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M4125&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C4901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A4503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>327765000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>327300010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>G/0500/60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol (PEG) 4000</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>434630010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F4135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin, Firefly</td>
			<td>Biosynth AG</td>
			<td>L-8200</td>
			<td>Dissolve luciferin powder in 0.1M trisphosphate buffer pH 8.0 to a concentration of 50mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9618</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Comply Steam Indicator Tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>1222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magic Tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>819-1460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies</td>
			<td>SLS2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate, 96 well, flat bottom, white</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>655075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TopSeal-A, adhesive lids for 96-well plates</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>6050195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 10 ml, w/o needle</td>
			<td>BD Plastipak</td>
			<td>302188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter 0.22 &#181;m</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>SLGP033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological Rhythms Analysis Software System (BRASS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Free download at amillar.org</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAfilter Maxiprep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modified Fuch-Rosenthal counting chamber, double cell</td>
			<td>Hawksley</td>
			<td>AC6000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bright field microscope</td>
			<td>Optika Microscopes</td>
			<td>B-150POL-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB942 TriStar2 multimode reader, with luminescence module</td>
			<td>Berthold Technologies Ltd</td>
			<td>57947/57948</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid analysis of circadian phenotypes in arabidopsis protoplasts transfected with a luminescent clock reporter

The plant circadian clock allows the anticipation of daily changes to the environment. This anticipation aids the responses to temporally predictable biotic and abiotic stress. Conversely, disruption of circadian timekeeping severely compromises plant health and reduces agricultural crop yields. It is therefore imperative that we understand the intricate regulation of circadian rhythms in plants, including the factors that affect motion of the transcriptional clockwork itself.
Testing circadian defects in the model plant Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) traditionally involves crossing specific mutant lines to a line rhythmically expressing firefly luciferase from a circadian clock gene promoter. This approach is laborious, time-consuming, and could be fruitless if a mutant has no circadian phenotype. The methodology presented here allows a rapid initial assessment of circadian phenotypes. Protoplasts derived from mutant and wild-type Arabidopsis are isolated, transfected with a rhythmically expressed luminescent reporter, and imaged under constant light conditions for 5 days. Luminescent traces will directly reveal whether the free-running period of mutant plants is different from wild-type plants. The advantage of the method is that any Arabidopsis line can efficiently be screened, without the need for generating a stably transgenic luminescent clock marker line in that mutant background.

Vahşi tip Arabidopsis protoplastlarını cca1 / Lhy (kısa süreli mutantı 2), ZTL (uzun süreli mutantı 23) ve aşın hattı CCA1 OX (24, ritmik) bilinen saat mutantları ile karşılaştırıldı. Tüm geçici CCA1pro ile transfekte edildi: LUC raportörünün, 5 gün boyunca, bir plaka okuyucusu üzerinde sabit ışık görüntüsü alınmıştır. Burada cca1 / Lhy mutant, sirkadiyen kontrollü gen ekspresyonunun serbest çalışma süresi lüminesan saat stabil transgenik ekspresyon 2,9 belirteçleri ile analiz geçme süresi ile uyumlu olarak, (Şekil 2a) kısaltılır göstermektedir. ZTL mutant protoplastlarını sirkadiyen salınım süresi yabani tip daha uzun (Şekil 2b), fidelerden yayınlarla uygun olarak, hücre süspansiyonu, Cultures ve protoplastlar 19,23,25. CCA1 aşırı ekspresyonu sabah fazda saat kilitler ve küresel transkripsiyon aritmik 24 olur. CCA1 OX protoplastlar (Şekil 2c) &#39;de LUC ifade: Tutarlı, biz CCA1pro hiçbir salınımların gözlemledi. <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54586/54586fig2.jpg" /> Şekil 2: col- 0, cca1 / Lhy, ZTL ve CCA1 ve Protoplast Günlük ritimler Protoplasts OX geçici CCA1pro ile transforme edilmiştir: LUC inşa ve lüminesans sirkadiyen ritimler 5 gün içinde görüntülendi (A - C). (D) Col -0, cca1 / Lhy ve ZTL lüminesans izleri dayalı Sirkadiyen dönem tahminleri (A - B). Ben miBir ± SEM, n = 3-5, belirtilen t-testi p değeri olarak. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54586/54586fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Genotip </td><td> Dönem (protoplastlar) </td><td> Dönem (transgenik) </td><td> Tarafından rapor edildi: </td><td> Referanslar </td></tr><tr><td> col- 0 </td><td> 23.0 ± 0.21 </td><td> 24.4 ± 0.09 </td><td> pCCA1: Col LUC -0 </td><td> (2) </td></tr><tr><td> cca1 / Lhy </td><td> 20.6 ± 0.13 </td><td> 19.9 ± 0.11 </td><td> pCCA1: Col LUC -0 </td><td> (2) </td></tr><tr><td></td><td></td><td> ~ 18 </td><td> L er arka RNA </td><td> (9) </td></tr><tr><td&gt; ZTL </td><td> 25.1 ± 0.12 </td><td> 27.4 ± 0.5 </td><td> CAB2: C24 ekotipindeki LUC </td><td> (22) </td></tr><tr><td> CCA1 OX </td><td> aritmik </td><td> aritmik </td><td> pCCA1: LUC (LD verileri sadece) </td><td> (2) </td></tr><tr><td></td><td></td><td> aritmik </td><td> Col -0 arka RNA ve protein </td><td> (23) </td></tr></tbody></table> Tablo 2: Transgenik fidanı ile karşılaştırıldığında protoplastlan Günlük ritimler pCCA1 sirkadiyen dönemi:. Dönem ilk mutasyon rapor uzunluklarda ve varsa kıyasla protoplastlarda LUC ifadesi pCCA1 ile: Col -0 yılında LUC ifadesi.

Watch this Scientific Journal Video about Rapid Analysis of Circadian Phenotypes in Arabidopsis Protoplasts Transfected with a Luminescent Clock Reporter at JoVE.com

Rapid Analysis of Circadian Phenotypes in Arabidopsis Protoplasts Transfected with a Luminescent Clock Reporter

sirkadiyen saat Arabidopsis transcriptome yaklaşık üçte düzenler, ancak timekeeping içine geri besleme genlerin yüzdesi bilinmemektedir. Burada hızla geçici protoplastlar ifade bir sirkadiyen muhabiri Işıklı görüntüleme kullanarak Arabidopsis herhangi mutant doğrultusunda sirkadiyen fenotipleri değerlendirmek için bir yöntem görselleştirmek.

Bir Lüminesans Saat Reporter ile Arabidopsis Protoplasts transfekte içinde Sirkadiyen fenotipleri Hızlı Analizi

The plant circadian clock allows the anticipation of daily changes to the environment. This anticipation aids the responses to temporally predictable ...

rapid-analysis-circadian-phenotypes-arabidopsis-protoplasts

Research

JoVE Journal

Biology

12.7K Görüntüleme.  University of Edinburgh.  sirkadiyen saat Arabidopsis transcriptome yaklaşık üçte düzenler, ancak timekeeping içine geri besleme genlerin yüzdesi bilinmemektedir. Burada hızla geçici protoplastlar ifade bir sirkadiyen muhabiri Işıklı görüntüleme kullanarak Arabidopsis herhangi mutant doğrultusunda sirkadiyen fenotipleri değerlendirmek için bir yöntem görselleştirmek. 

Video: Rapid Analysis of Circadian Phenotypes in Arabidopsis Protoplasts Transfected with a Luminescent Clock Reporter

Isolation of Protoplasts from Tissues of 14-day-old Seedlings of Arabidopsis thaliana

Protoplasts are plant cells that have had their cell walls enzymatically removed. Isolation of protoplasts from different plant tissues was first reported more than 40 years ago 1 and has since been adapted to study a variety of cellular processes, such as subcellular localization of proteins, isolation of intact organelles and targeted gene-inactivation by double stranded RNA interference (RNAi) 2-5. Most of the protoplast isolation protocols use leaf tissues of mature Arabidopsis (e.g. 35-day-old plants) 2-4. We modified existing protocols by employing 14-day-old Arabidopsis seedlings. In this procedure, one gram of 14-day-old seedlings yielded 5 106-107 protoplasts that remain intact at least 96 hours. The yield of protoplasts from seedlings is comparable with preparations from leaves of mature Arabidopsis, but instead of 35-36 days, isolation of protoplasts is completed in 15 days. This allows decreasing the time and growth chamber space that are required for isolating protoplasts when mature plants are used, and expedites the downstream studies that require intact protoplasts.

Isolation of Protoplasts from Tissues of 14-day-old Seedlings of Arabidopsis thaliana

This video shows a procedure for isolating intact protoplasts from tissues of 14-day-old seedlings of Arabidopsis. Given that the isolated protoplasts remain intact for at least 96h and are isolated from seedlings instead of one-month-old mature plants, this procedure expedites assays requiring intact protoplasts.

14 gün eski Fideler Dokular protoplast izolasyonu Arabidopsis thaliana</em

Protoplasts are plant cells that have had their cell walls enzymatically removed. Isolation of protoplasts  from different plant tissues was first ...

Biyoloji

Floral-dip Transformation of Arabidopsis thaliana to Examine pTSO2::&beta;-glucuronidase Reporter Gene Expression

The ability to introduce foreign genes into an organism is the foundation for modern biology and biotechnology. In the model flowering plant Arabidopsis thaliana, the floral-dip transformation method1-2 has replaced all previous methods because of its simplicity, efficiency, and low cost. Specifically, shoots of young flowering Arabidopsis plants are dipped in a solution of Agrobacterium tumefaciens carrying specific plasmid constructs. After dipping, the plants are returned to normal growth and yield seeds, a small percentage of which are transformed with the foreign gene and can be selected for on medium containing antibiotics. This floral-dip method significantly facilitated Arabidopsis research and contributed greatly to our understanding of plant gene function. In this study, we use the floral-dip method to transform a reporter gene, &beta;-glucuronidase (GUS), under the control of TSO2 promoter. TSO2, coding for the Ribonucleotide Reductase (RNR) small subunit3, is a cell cycle regulated gene essential for dNDP biosynthesis in the S-phase of the cell cycle. Examination of GUS expression in transgenic Arabidopsis seedlings shows that TSO2 is expressed in actively dividing tissues. The reported experimental method and materials can be easily adapted not only for research but also for education at high school and college levels.

Floral-dip Transformation of Arabidopsis thaliana to Examine pTSO2::&#946;-glucuronidase Reporter Gene Expression

This article illustrates the floral-dip method of Agrobacterium tumefaciens -mediated transformation of Arabidopsis thaliana. By introducing a cell-cycle regulated promoter-reporter, pTSO2::&beta;-glucuronidase (GUS), into Arabidopsis, we illustrates how one detects GUS reporter expression in transgenic seedlings.

Floral-daldırma Dönüşüm Arabidopsis thaliana Inceleyin PTSO2: β-glucuronidase Reporter Gen İfadesi

The ability to introduce foreign genes into an organism is the foundation for modern biology and biotechnology. In the model flowering plant Arabidopsis ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated tools and resources for studies in this system are facilitating continued discovery of genes with more subtle phenotypes or roles. 
Here we present a generalized protocol we adapted for identifying C. elegans genes with postembryonic phenotypes of interest using RNAi2. This procedure is easily modified to assay the phenotype of choice, whether by light or fluorescence optics on a dissecting or compound microscope. This screening protocol capitalizes on the physical assets of the organism and molecular tools the C. elegans research community has produced. As an example, we demonstrate the use of an integrated transgene that expresses a fluorescent product in an RNAi screen to identify genes required for the normal localization of this product in late stage larvae and adults. First, we used a commercially available genomic RNAi library with full-length cDNA inserts. This library facilitates the rapid identification of multiple candidates by RNAi reduction of the candidate gene product. Second, we generated an integrated transgene that expresses our fluorecently tagged protein of interest in an RNAi-sensitive background. Third, by exposing hatched animals to RNAi, this screen permits identification of gene products that have a vital embryonic role that would otherwise mask a post-embryonic role in regulating the protein of interest. Lastly, this screen uses a compound microscope equipped for single cell resolution.

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

We describe a sensitized method to identify postembryonic regulators of protein expression and localization in C. elegans using an RNAi-based genomic screen and an integrated transgene that expresses a functional, fluorescently tagged protein.

Içinde Postembryonic Fenotiplerin Belirleme RNAi Tarama C. elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Monitoring Cell-autonomous Circadian Clock Rhythms of Gene Expression Using Luciferase Bioluminescence Reporters

In mammals, many aspects of behavior and physiology such as sleep-wake cycles and liver metabolism are regulated by endogenous circadian clocks (reviewed1,2). The circadian time-keeping system is a hierarchical multi-oscillator network, with the central clock located in the suprachiasmatic nucleus (SCN) synchronizing and coordinating extra-SCN and peripheral clocks elsewhere1,2. Individual cells are the functional units for generation and maintenance of circadian rhythms3,4, and these oscillators of different tissue types in the organism share a remarkably similar biochemical negative feedback mechanism. However, due to interactions at the neuronal network level in the SCN and through rhythmic, systemic cues at the organismal level, circadian rhythms at the organismal level are not necessarily cell-autonomous5-7. Compared to traditional studies of locomotor activity in vivo and SCN explants ex vivo, cell-based in vitro assays allow for discovery of cell-autonomous circadian defects5,8. Strategically, cell-based models are more experimentally tractable for phenotypic characterization and rapid discovery of basic clock mechanisms5,8-13.
Because circadian rhythms are dynamic, longitudinal measurements with high temporal resolution are needed to assess clock function. In recent years, real-time bioluminescence recording using firefly luciferase as a reporter has become a common technique for studying circadian rhythms in mammals14,15, as it allows for examination of the persistence and dynamics of molecular rhythms. To monitor cell-autonomous circadian rhythms of gene expression, luciferase reporters can be introduced into cells via transient transfection13,16,17 or stable transduction5,10,18,19. Here we describe a stable transduction protocol using lentivirus-mediated gene delivery. The lentiviral vector system is superior to traditional methods such as transient transfection and germline transmission because of its efficiency and versatility: it permits efficient delivery and stable integration into the host genome of both dividing and non-dividing cells20. Once a reporter cell line is established, the dynamics of clock function can be examined through bioluminescence recording. We first describe the generation of P(Per2)-dLuc reporter lines, and then present data from this and other circadian reporters. In these assays, 3T3 mouse fibroblasts and U2OS human osteosarcoma cells are used as cellular models. We also discuss various ways of using these clock models in circadian studies. Methods described here can be applied to a great variety of cell types to study the cellular and molecular basis of circadian clocks, and may prove useful in tackling problems in other biological systems.

Circadian clocks function within individual cells, i.e., they are cell-autonomous. Here, we describe methods for generating cell-autonomous clock models using non-invasive, luciferase-based real-time bioluminescence technology. Reporter cells provide tractable, functional model systems for studying circadian biology.

Lusiferaz Biyoparlaklık Gazeteciler kullanma Gen Ekspresyonunun Hücre-özerk Sirkadiyen Saat Ritimleri İzlenmesi

In mammals, many aspects of behavior and physiology such as sleep-wake cycles and liver metabolism are regulated by endogenous circadian clocks ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an attractive model system to study organ development and tissue-specific signaling. Although hair follicle development is genetically tractable, fast and reproducible analysis of factors essential for this process remains a challenge. Here we describe a procedure to generate targeted overexpression or shRNA-mediated knockdown of factors using lentivirus in a tissue-specific manner. Using a modified version of a hair regeneration model 5, 6, 11, we can achieve robust gain- or loss-of-function analysis in primary mouse keratinocytes or dermal cells to facilitate study of epithelial-mesenchymal signaling pathways that lead to hair follicle morphogenesis. We describe how to isolate fresh primary mouse keratinocytes and dermal cells, which contain dermal papilla cells and their precursors, deliver lentivirus containing either shRNA or cDNA to one of the cell populations, and combine the cells to generate fully formed hair follicles on the backs of nude mice. This approach allows analysis of tissue-specific factors required to generate hair follicles within three weeks and provides a fast and convenient companion to existing genetic models.

Tissue-specific analysis of a hair follicle regeneration model using lentivirus to mediate gain- or loss-of-function.

Saç Rejenerasyon sırasında epitelyal-mezenkimal Sinyal Rapid Genetik Analizi

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a consequence, the isolation of plant embryos at early stages (1 cell to globular stage) is technically challenging due to their relative inaccessibility. Efficient manual dissection at early stages is strongly impaired by the small size of young Arabidopsis seeds and the adhesiveness of the embryo to the surrounding tissues. Here, we describe a method that allows the efficient isolation of young Arabidopsis embryos, yielding up to 40 embryos in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. Embryos are released into isolation buffer by slightly crushing 250-750 seeds with a plastic pestle in an Eppendorf tube. A glass microcapillary attached to either a standard laboratory pipette (via a rubber tube) or a hydraulically controlled microinjector is used to collect embryos from droplets placed on a multi-well slide on an inverted light microscope. The technical skills required are simple and easily transferable, and the basic setup does not require costly equipment. Collected embryos are suitable for a variety of downstream applications such as RT-PCR, RNA sequencing, DNA methylation analyses, fluorescence in situ hybridization (FISH), immunostaining, and reporter gene assays.

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

We report an efficient and simple method to isolate embryos at early stages of development from Arabidopsis thaliana seeds. Up to 40 embryos can be isolated in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. The procedure is suitable for transcriptome, DNA methylation, reporter gene expression, immunostaining and fluorescence in situ hybridization analyses.

Erken evre Embriyolar verimli ve hızlı İzolasyon<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Tohumlar

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a ...

Design and Analysis of Temperature Preference Behavior and its Circadian Rhythm in Drosophila

The circadian clock regulates many aspects of life, including sleep, locomotor activity, and body temperature (BTR) rhythms1,2. We recently identified a novel Drosophila circadian output, called the temperature preference rhythm (TPR), in which the preferred temperature in flies rises during the day and falls during the night 3. Surprisingly, the TPR and locomotor activity are controlled through distinct circadian neurons3. Drosophila locomotor activity is a well&#160;known circadian behavioral output and has provided strong contributions to the discovery of many conserved mammalian circadian clock genes and mechanisms4. Therefore, understanding TPR will lead to the identification of hitherto unknown molecular and cellular circadian mechanisms. Here, we describe how to perform and analyze the TPR assay. This technique not only allows for dissecting the molecular and neural mechanisms of TPR, but also provides new insights into the fundamental mechanisms of the brain functions that integrate different environmental signals and regulate animal behaviors. Furthermore, our recently published data suggest that the fly TPR shares features with the mammalian BTR3. Drosophila are ectotherms, in which the body temperature is typically behaviorally regulated. Therefore, TPR is a strategy used to generate a rhythmic body temperature in these flies5-8. We believe that further exploration of Drosophila TPR will facilitate the characterization of the mechanisms underlying body temperature control in animals.

Design and Analysis of Temperature Preference Behavior and its Circadian Rhythm in Drosophila

We recently identified a novel Drosophila circadian output, temperature preference rhythm (TPR), in which the preferred temperature in flies rises during the day and falls during the night. TPR is regulated independently from another circadian output, locomotor activity. Here&#160;we describe the design and analysis of TPR in Drosophila.

Drosophila'da Sıcaklık Tercih Davranışının ve Sirkadiyen Ritminin Tasarımı ve Analizi

The circadian clock regulates many aspects of life, including sleep, locomotor activity, and body temperature (BTR) rhythms1,2. We recently identified a ...

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic tools have been introduced, including multiple strategies for inducing mutations and generating transgenic lines. However, large-scale screening is limited by traditional genotyping methods, which are time-consuming and labor-intensive. Here we describe a technique to analyze zebrafish genotypes by PCR combined with high-resolution melting analysis (HRMA).&#160;This approach is rapid, sensitive, and inexpensive, with lower risk of contamination artifacts.&#160;Genotyping by PCR with HRMA can be used for embryos or adult fish, including in high-throughput screening protocols.

PCR combined with high-resolution melt analysis (HRMA) is demonstrated as a rapid and efficient method to genotype zebrafish.

Yüksek çözünürlüklü Melt Analizi ile PCR kullanarak hızlı ve verimli Zebra Genotiplemesi

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...

Quantification of Orofacial Phenotypes in Xenopus

Xenopus has become an important tool for dissecting the mechanisms governing craniofacial development and defects. A method to quantify orofacial development will allow for more rigorous analysis of orofacial phenotypes upon abrogation with substances that can genetically or molecularly manipulate gene expression or protein function. Using two dimensional images of the embryonic heads, traditional size dimensions-such as orofacial width, height and area- are measured. In addition, a roundness measure of the embryonic mouth opening is used to describe the shape of the mouth. Geometric morphometrics of these two dimensional images is also performed to provide a more sophisticated view of changes in the shape of the orofacial region. Landmarks are assigned to specific points in the orofacial region and coordinates are created. A principle component analysis is used to reduce landmark coordinates to principle components that then discriminate the treatment groups. These results are displayed as a scatter plot in which individuals with similar orofacial shapes cluster together. It is also useful to perform a discriminant function analysis, which statistically compares the positions of the landmarks between two treatment groups. This analysis is displayed on a transformation grid where changes in landmark position are viewed as vectors. A grid is superimposed on these vectors so that a warping pattern is displayed to show where significant landmark positions have changed. Shape changes in the discriminant function analysis are based on a statistical measure, and therefore can be evaluated by a p-value. This analysis is simple and accessible, requiring only a stereoscope and freeware software, and thus will be a valuable research and teaching resource.

Quantification of Orofacial Phenotypes in Xenopus

A method to quantify the orofacial size and shape of Xenopus laevis embryos has been developed. In this protocol, traditional size measurements are combined with geometric morphometrics to allow for more sophisticated analyses of orofacial development and defects.

Orofasial fenotipleri Niceleme<em&gt; Xenopus</em

Xenopus has become an important tool for dissecting the mechanisms governing craniofacial development and defects. A method to quantify orofacial ...

Transfecting RAW264.7 Cells with a Luciferase Reporter Gene

Transfection of desired genetic materials into cells is an inevitable procedure in biomedical research studies. While numerous methods have been described, certain types of cells are resistant to many of these methods and yield low transfection efficiency1, potentially hindering research in those cell types. In this protocol, we present an optimized transfection procedure to introduce luciferase reporter genes as a plasmid DNA into the RAW264.7 macrophage cell line. Two different types of transfection reagents (lipid-based and polyamine-based) are described, and important notes are given throughout the protocol to ensure that the RAW264.7 cells are minimally altered by the transfection procedure and any experimental data obtained are the direct results of the experimental treatment. While transfection efficiency may not be higher compared to other transfection methods, the described procedure is robust enough for detecting luciferase signal in RAW264.7 without changing the physiological response of the cells to stimuli.

Transfection into the macrophage cell line, RAW264.7, is difficult due to the cell&#8217;s natural response against foreign materials. We described here a gentle yet robust procedure for transfecting luciferase reporter genes into RAW264.7 cells.