Los autores agradecen a Leif Oxburgh y Derek Adams por compartir generosamente sus conocimientos, Leif Oxburgh por los útiles comentarios sobre el manuscrito, y Stefan Wölfl y Ulrike Müller por su apoyo técnico y Saskia Schmitteckert, Julia Gobbert, Sascha Weyer y Viola Mayer por su ayuda en el laboratorio. Este trabajo fue apoyado por Desarrollo, La Empresa de Biólogos (a CP).

Los ratones se mantuvieron de acuerdo con la normativa sueca y la legislación de la Unión Europea (2010/63 / UE). Todos los procedimientos se realizaron siguiendo las directrices del Comité Sueco de Ética (permisos C79 / 9, C248 / 11, y C135 / 14). El Regierungspräsidium Karlsruhe y los Oficiales de Bienestar Animal de la Universidad de Heidelberg han aprobado procedimientos en la Universidad de Heidelberg sobre animales. 1. Preparación de reactivos y materiales para la cultura NOTA: Use una campana de flujo laminar para minimizar la contaminación. <ol><li> En el día de la disección, la Fc humana previa a la agrupación o la proteína de efrina quimérica recombinante se fusionaron a Fc humano mezclándola con anticuerpos de cabra Fc antihumanos en una proporción molar de 1: 5 en solución salina tamponada con fosfato estéril (PBS). Incubar durante 1 h a 37 ° C 5 . </li><li> Preparar el medio de cultivo suplementando Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium: NutrientMezcla F-12 (DMEM / F12) con 1% de penicilina / estreptomicina (v / v), 1% de glutamina (v / v), 1% de insulina-transferrina-selenio (v / v) Transferrina y 1,5 μg / ml de anfotericina. NOTA: 10 ml de medio son suficientes para 16 embriones. </li><li> Añada una solución concentrada de efrina recombinante a una concentración final de 20 μg / ml al medio de cultivo. Utilice Fc humano agrupado como control. </li><li> Preparar las placas de cultivo añadiendo 500 μl de medio de cultivo a cada pocillo de una placa estéril de 4 pocillos de poliestireno de fondo plano sin recubrimiento. </li><li> Usando fórceps estériles, coloque cuidadosamente un filtro de membrana de policarbonato con un tamaño de poro de 5 μm por pocillo en la parte superior del medio. Transferir la placa preparada a la incubadora (37 ° C / 5% CO 2 ). Asegúrese de que el filtro permanezca seco en la superficie superior y flote. NOTA: Un filtro es suficiente para dos anlagen de riñón. </li><li> Utilizando una cuchilla de afeitar, corte aproximadamente 30 puntas de pipeta (volumen: 100 μl) aprox.Y 1 mm de la punta para dar lugar a una abertura más amplia. Coloque las puntas de nuevo en un rack pipette-tip. </li></ol> 2. Disección de Rudimentos Metanefricos en E11.5 <ol><li> Sacrifique a un ratón embarazado cronometrado en E11.5 por dislocación cervical (o usando un método aprobado por el comité de ética local). </li><li> Retirar el útero y los embriones, según lo descrito por Brown et al 6 . A partir de este punto, trabajar bajo un microscopio de disección. </li><li> Usando la pinza de relojería No. 5, corte el embrión directamente debajo de las patas delanteras. Utilice un plato de petri fresco para cada embrión. Quitar las piernas y la cola del embrión. Para ello, agarra el tejido que se va a quitar con un par de fórceps relojero nº 5 y usa las puntas de un segundo par para cortar. </li><li> Para retirar la masa del órgano ventral, use las puntas de un par de pinzas para abrir lateralmente la pared del cuerpo del embrión en una dirección rostral a caudal. <ol><li> Corte superficialmente, paralelo a tLa aorta dorsal. Utilice la aorta dorsal llena de sangre y por lo tanto visible para la orientación. Separar cuidadosamente la parte ventral de la pared del cuerpo de la parte dorsal usando las puntas de la pinza cerrada y voltear el embrión. Corte la pared del cuerpo lateralmente en una dirección rostral a caudal y usando la aorta dorsal para la orientación, como para el lado anterior. </li></ol></li><li> Una vez que la pared del cuerpo ventral se ha separado del cuerpo dorsal, agárralo con un par de fórceps y tire con cuidado para quitarlo, junto con la masa del órgano. NOTA: El metanéfrico anlagen suele permanecer unido a la pared del cuerpo dorsal. Son estructuras ovales de ~ 200 μm de largo situadas al nivel de las extremidades posteriores. </li><li> Sujete la pared del cuerpo dorsal con un par de fórceps, con el lado ventral hacia arriba. Utilizando el otro par de pinzas, agarrar la aorta dorsal en su extremo rostral y cuidadosamente pelar la aorta dorsal de la pared del cuerpo dorsal. NOTA: Ambos riñones metanefricos generalmente se mantienen unidosA la aorta dorsal. </li><li> Usando un par de fórceps, corte rostralmente al riñón anlagen para eliminar la aorta. Luego, cuidadosamente separar los dos anlagen renal utilizando las puntas de la pinza. </li><li> Cuidadosamente quitar el tejido no deseado del riñón anlagen con las puntas de la pinza. Tenga cuidado de no dañar el mesénquima, ya que el daño puede resultar en un pobre crecimiento y la exclusión del explante de un análisis posterior. </li><li> Transferir el anlagen renal por separado con una pipeta de microlitros y una punta de pipeta abierta en 10 μL de PBS al filtro de membrana de policarbonato en una placa de 4 pocillos. NOTA: Debido a la tensión superficial, el explante se cubrirá con una fina capa de medio. Un filtro es suficiente para dos anlagen renal. <ol><li> Coloque cada uno de los dos anlagen renal en el centro de cada mitad respectiva del filtro. Transferir la placa de nuevo a la incubadora a 37 ° C / 5% de CO 2 . Dejar la placa en la incubadora hasta que el ron metanefricImentes del siguiente embrión están listos para ser colocados en el filtro. </li></ol></li><li> Repita los pasos 2.3-2.9.1 para cada embrión. NOTA: Con cierta práctica, el procedimiento de disección tomará aproximadamente 5 min por embrión. </li><li> Incubar el riñón anlagen durante 3 días a 37 ° C / 5% de CO 2 . </li></ol> 3. Preparación de reactivos para fijación y tinción <ol><li> Para preparar paraformaldehído (PFA) al 4% en PBS sin calcio y magnesio (p / v), disolver el PFA a 60 ° C en PBS, agitando continuamente. Enfriar a temperatura ambiente y utilizar un filtro de papel para eliminar las partículas restantes. Alícuota y mantener a 4 ° C para su uso inmediato o congelar para el almacenamiento a largo plazo. PRECAUCIÓN: La PFA es tóxica. Use el equipo de protección personal especificado en las normas de seguridad locales y trabaje en una campana extractora de humos. Deseche los desechos siguiendo las pautas institucionales y usando contenedores de desecho designados. </li><li> Para preparar la solución de permeabilización, diluir Triton X-100En PBS sin calcio y magnesio hasta 0,3% (v / v). </li><li> Para preparar la solución de bloqueo, añadir 5% (v / v) de suero de cabra y 0,1% Triton X-100 a PBS sin calcio y magnesio. Añadir azida sódica hasta una concentración final de 0,02% (p / v). Almacenar a 4 ° C. PRECAUCIÓN: La azida sódica es tóxica. Manipular la azida sódica de acuerdo con las normas locales de seguridad y protección del medio ambiente. NOTA: Cuando se usan anticuerpos para la tinción, use suero al 5% de la especie de la que se derivó el anticuerpo secundario para hacer la solución de bloqueo. </li><li> Diluir la aglutinina de Dolichorus biflorus biotinilada 1: 200 en solución de bloqueo. Diluir Alexa488-streptavidin conjugado 1: 200 en solución de bloqueo. </li><li> Para preparar un medio de incrustación listo para usar (véase la tabla de materiales), añadir 0,1 g de mucoadhesivo / ml a base de alcohol polivinílico soluble en agua a glicerol al 25% (p / v) en Tris-HCl 0,1 M (pH 8,5) . Calentar a 50 ° C bajo agitación continua durante 1 h, enfriar y ajustar el pH a 8,0-8,5 usando 1M de NaOH. Evitar mayores concentraciones de NaOH. Añadir 100 μg / ml de N-propilgalato y timerosal hasta una concentración final de 0,02% (p / v). Se agita durante 30 minutos a temperatura ambiente. PRECAUCIÓN: El timerosal es tóxico. Manipularlo de acuerdo con las normas locales de seguridad y protección del medio ambiente. <ol><li> Llenar el medio de inclusión en tubos de 50 ml, equilibrar el rotor y centrifugar a 3.200 xg ya temperatura ambiente durante 10 min. Decantar la solución transparente en tubos de 15 mL y desechar el gránulo. Alícuota y almacenar a -20 ° C durante varias semanas. Una vez descongelado, mantener la solución a 4 ° C. Caliente a ~ 30 ° C inmediatamente antes de usar. </li></ol></li><li> Prepare tantos portaobjetos de vidrio como los filtros con explantes deben montarse. Para ello, pegue dos pequeños cubreobjetos, 18 x 18 mm, a cada lado de la diapositiva de vidrio con adhesivo instantáneo, Deje un espacio de ~ 15 mm para el filtro entre. </li></ol> 4. Fijación y tinción <ol><li> Después de un período de cultivo de 3Días in vitro (div), retirar las placas de la incubadora y aspirar cuidadosamente el medio de cultivo de cada pocillo usando una micropipeta. Asegúrese de no tocar el filtro y mantenga la punta abierta hacia la pared del pozo. </li><li> Añadir 500 μl de PFA al 4% / PBS a cada pocillo. Los filtros flotarán sobre el fijador. Usando una micropipeta, agregue cuidadosamente el fijador PFA gota a gota para sumergir los filtros. Incubar a temperatura ambiente durante 30 min. NOTA: Para todos los pasos siguientes, se debe tener cuidado de no lavar los explantes del filtro. Mantenga la abertura de la punta de la pipeta hacia la pared del pozo. </li><li> Retire el PFA y enjuague dos veces con 500 μl de PBS, sumergiendo el filtro. Añadir 500 μl de solución de permeabilización a cada pocillo e incubar a temperatura ambiente durante 1 h. </li><li> Enjuagar dos veces con 500 μL de PBS y añadir 500 μL de solución de bloqueo a cada pocillo. Incubar a temperatura ambiente durante 1 h. </li><li> Reemplace la solución de bloqueo por250 μl de aglutinina biotinilada Dolichorus biflorus diluida 1: 200 en solución de bloqueo e incubar a 4 ° C durante 24 h. </li><li> Retire la solución de aglutinina de Dolichorus biflorus y enjuague dos veces con 500 μl de PBS por pocillo. </li><li> Añadir 250 μL de estreptavidina conjugada con Alexa488 diluida 1: 200 en solución de bloqueo e incubar a 4 ° C durante 24 h. Alternativamente, incubar a temperatura ambiente durante 2 h. NOTA: Se consigue una mejor relación señal / ruido cuando se incuba a 4 ° C. </li><li> Enjuague dos veces con 500 μl de PBS por pocillo. Usando fórceps, transfiera los filtros a las diapositivas de vidrio preparadas, con los explantes hacia arriba. Montar con ~ 50-100 μl de medio de incrustación. Cubrir con cubreobjetos No. 1.5 de 60 mm de largo. Dejar que la solución del medio de incrustación se solidifique durante 2 h a temperatura ambiente en la oscuridad. Proceda a la formación de imágenes o almacene las diapositivas, envueltas en papel de aluminio, a 4 ° C hasta que esté listo para la imagen. </li><li> Imagen con un microscopio de epifluorescencia de campo ancho 7 &lt;/ Sup&gt; acoplado a una lámpara de Hg y utilizar una unidad de espejo para la excitación azul (paso de banda de excitación, 460 - 495 nm, espejo dicromático, 505 nm y paso de banda de emisión, 510 - 550 nm) y 20X Plan - Apochromat, 0,75 numérico abertura. </li></ol>

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Los autores no tienen nada que revelar.

Este manuscrito describe un método para aislar el desarrollo de metanfric anlagen del embrión de ratón y para cultivar los órganos rudiments. Este método es una técnica estándar, desarrollada por Grobstein 8 y Saxén 9 , 10 , y fue adaptada y modificada por muchos otros 11 , 12 . El éxito del método depende principalmente de la duración de la disección, ya que la supervivencia del explante y el potencial inductivo disminuyen con el tiempo de disección prolongado. También se debe tener cuidado de no dañar el mesénquima cuando se limpia el rudimento del riñón del tejido circundante. El daño del mesénquima metanéfrico es a menudo la razón para el crecimiento pobre de los explantes. Sin embargo, la velocidad de disección y las habilidades motoras finas mejoran enormemente con la práctica. El medio químicamente definido en el protocolo presentado se utiliza comúnmente para reemplazar elConteniendo suero en células primarias y cultivo de órganos in vitro y contiene una mezcla 1: 1 (v / v) de DMEM y F-12 de Ham, suplementada con insulina-transferrina-selenio para apoyar el crecimiento y la supervivencia de los explantes. La absorción de glucosa y aminoácidos, la lipogénesis y el transporte intracelular son facilitados por la insulina. El selenio, un cofactor para la glutatión peroxidasa, funciona como antioxidante. La transferrina es un soporte de hierro y ayuda a proteger contra los radicales de oxígeno. En el cultivo de riñón embrionario, la adición de transferrina al medio aumenta la diferenciación de los túbulos y la incorporación de timidina de una manera dependiente de la dosis, con un efecto máximo alrededor de 50 μg / mL 13 . Por lo tanto, la holo-transferrina humana se suplementa adicionalmente en el medio, dando como resultado una concentración final de transferrina de aproximadamente 55 μg / ml. Muchos protocolos, que utilizan una composición más simple, pero químicamente menos definida, con el medio esencial mínimo de Eagle(MEM) o DMEM y suero al 10% ( es decir, suero bovino fetal, FBS) también dan resultados muy satisfactorios 12 , 13 , 14 , 15 . Sin embargo, pueden producirse variaciones entre diferentes lotes de FBS. Para evitar tales variaciones y excluir la posible interferencia de los factores de crecimiento presentes en el suero con señalización Eph, se eligió el medio exento de suero. La decisión de utilizar un medio exento de suero depende de la configuración experimental y de la cuestión científica. Las condiciones de cultivo libres de suero serían particularmente necesarias cuando el objetivo final es la aplicación terapéutica. La anfotericina B, el agente antifúngico incluido en este protocolo, puede omitirse. El período de cultivo en el ejemplo presentado fue de 3 días, pero los rudimentos metanéfricos de riñón se pueden cultivar hasta 10 días 15 . En cultivos superiores a 3 días, el medio debe ser cambiado cada 48 h. El desarrollo de kidnLos rudimentos in vitro recapitulan in vitro la secuencia in vivo de agregados pre-tubulares, vesículas renales y cuerpos con forma de coma y S. Después de 3 días in vitro , se han formado estructuras tipo glomerular 15 , 16 . En cultivos más largos, el área del explante aumenta aún más debido a la ramificación continuada de la yema ureteral. Alrededor de 5 días de cultivo, los nefrones se han segregado en segmentos distal, medio y proximal 16 . A pesar de la relativa facilidad y rentabilidad de la técnica, que permite aplicaciones versátiles, algunas consideraciones deben tenerse en cuenta al planificar los experimentos e interpretar los resultados. Debido a la matriz extracelular y membrana basal presente en los órganos cultivados, la difusión de agentes exógenos y partículas es limitada [ 17] . Además, las condiciones de cultivo artificial y las manipulaciones pueden causar cambios en el metabolismoIsmo del tejido, y comportamiento celular que difiere de la situación in vivo 15 , 18 . Más notablemente, los explantes carecen de suministro de sangre, y los glomérulos son avasculares; Aunque los nefrones se segmentan, la zonación y la formación de una médula y lazos de Henle faltan 14 , 19 . Por lo tanto, el espectro de aplicación del cultivo de riñón embrionario se limita a las estructuras tubulares, su morfología de ramificación, y las interacciones mesenquimales-epiteliales. En consecuencia, no se pueden abordar las cuestiones científicas dirigidas a la función renal. Las modificaciones recientes del método de cultivo en el que se desarrollan rudimentos renales en vidrio revestido en un desarrollo organotípico de bajo volumen habilitado incluso hasta zonación cortico-medular con bucles extendidos de Henle 15 . También vale la pena señalar que, recientemente, un método para almacenar y preservarRiñones embrionarios. Este método permite el transporte de rudimentos embrionarios de riñón a E11.5 durante varios días y permite que se cultiven más tarde. Esto es especialmente de interés en las colaboraciones [ 20] . La naturaleza de la cultura de rudimiento de riñón entero permite una variedad de adaptaciones metodológicas, incluyendo técnicas avanzadas de formación de imágenes. Para evitar movimientos perturbadores durante la imagen en vivo, se recomienda reemplazar el flotante con un filtro fijo, como una inserción transwell. La tecnología presentada incluso se ha expandido para cultivar bloques de tejido que contienen todo el tracto urogenital. Usando este cultivo expandido, la inserción de uréter en la vejiga puede ser investigado [ 21] .

The mammalian kidney is derived from two primordial structures with mesodermal origin: the tubular epithelial ureteric bud and the metanephric mesenchyme. During nephrogenesis, the ureteric bud invades the metanephric mesenchyme and branches to form the collecting system. The metanephric mesenchyme gives rise to the epithelial elements of the nephrons. These processes occur in a precisely timed and spatially coordinated manner and are initiated by reciprocal inductive mechanisms. Both tissue components communicate and affect the other's cell morphogenesis. 
In the 1920s, it was Boyden who performed the in vivo obstruction of the mesonephric duct in chicken, providing the first indication of inductive interactions as separated nephric blastema fail to differentiate1. At about the same time, the first successful attempts to culture chicken nephric rudiments in a hanging drop were published. Subsequently, the organ culture was developed to study tissue interactions in mammalian organogenesis. In the 1950s, Grobstein developed a technique in which metanephric rudiments could be cultured on a filter. This technique was modified by Sax&#233;n, who placed the filter on a Trowell-type screen in a culture dish1. Over the years, many modifications and applications for organ culture have emerged. The method described here is based on Sax&#233;n's technique but is simplified, as the filters float free on the medium and the diameter of the culture well only slightly exceeds the diameter of the filter, limiting unwanted movement of the filter.
Whole-organ culture is a classical, cheap, and simple but powerful tool to investigate cellular processes and intercellular communication during organogenesis. Organ culture allows for treatment with biological agents, such as growth factors, antibodies, antisense oligonucleotides, viruses, and peptides, as well as with pharmaceutical compounds and other chemicals. Also, gene function may be studied using explants derived from genetically modified mice or using inducible gene inactivation technology, such as the Cre-loxP system. This allows for the study of genetic mutations that cause embryonic lethality prior to the development of the kidney. Organ culture can also be combined with fluorescent tagging for gene function or lineage tracing and modern imaging techniques, which enable real-time monitoring of cell behavior2.
In the specific example provided here, the effect of EphrinB2-activated Eph-receptor signaling on the branching morphology of the ureteric bud was investigated. The morphology of the EphA4/EphB2 double-knockout mice suggested several severe defects in kidney development, which were detectable as early as embryonic day 11 (E11) and involved the ureteric bud, the ureter, and the common nephric duct3. Signaling via Eph receptors requires the clustering of the ligand-receptor dimer4. To over-activate Eph signaling, the kidney rudiments from E11.5 mouse embryos were cultured in the presence of clustered recombinant EphrinB2-Fc. EphrinB2 is a known ligand for the EphA4 receptor, which is expressed in the ureteric bud tips3.

<table><tbody><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21331020</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140148</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX Supplement</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, calcium, magnesium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14040117</td><td>use for dissection</td></tr><tr><td>holo-Transferrin human</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0665</td><td></td></tr><tr><td>Insulin-Transferrin-Selenium (ITS -G) (100x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>41400045</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Amphotericin B solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2942</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Sodium azide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8032</td><td></td></tr><tr><td>Thimerosal</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5125</td><td></td></tr><tr><td>Propyl gallate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>2370</td><td></td></tr><tr><td>Mowiol 4-88</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81381</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Biotinylated Dolichorus Biflorus Agglutinin</td><td>Vector Laboratories</td><td>B-1035</td><td></td></tr><tr><td>Alexa488 conjugated Streptavidin</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>016-540-084</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Mouse Ephrin-B2 Fc Chimera Protein, CF</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>496-EB</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Human IgG1 Fc, CF</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>110-HG-100</td><td></td></tr><tr><td>Goat Anti-Human IgG Fc Antibody</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>G-102-C</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline tablets</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td>use for fixation and immunostaining</td></tr><tr><td>Dumont #5, biologie&lt;br/&gt; tips, INOX, 11 cm</td><td>agnthos.se</td><td>0208-5-PS</td><td>2 pairs of forceps are needed</td></tr><tr><td>Iris scissors, straight, 12 cm</td><td>agnthos.se</td><td>03-320-120</td><td></td></tr><tr><td>Dressing Forceps,&lt;br/&gt; straight, delicate, 13 cm</td><td>agnthos.se</td><td>08-032-130</td><td></td></tr><tr><td>Petri dishes Nunclo Delta treated</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>150679</td><td></td></tr><tr><td>TMTP01300 Isopore Membrane Filter, polycarbonate, Hydrophilic, 5.0 &amp;micro;m, 13 mm, white, plain</td><td>MerckMillipore</td><td>TMTP01300</td><td></td></tr><tr><td>Nunclon Multidishes&lt;br/&gt; 4 wells, flat bottom</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6789-1CS</td><td></td></tr><tr><td>Microscope cover glass 24 x 50 mm thickn. No.1.5H 0.17+/-0.005 mm</td><td>nordicbiolabs</td><td>107222</td><td></td></tr><tr><td>Cover glasses No.1.5, 18 mm x 18 mm</td><td>nordicbiolabs</td><td>102032</td><td></td></tr><tr><td>Slides ~76 x 26 x 1, 1/2-w. ground plain</td><td>nordicbiolabs</td><td>1030418</td><td></td></tr><tr><td>VWR Razor Blades</td><td>VWR</td><td>55411-055</td><td></td></tr><tr><td>50 mL centrifuge tubes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430828</td><td></td></tr><tr><td>15 mL centrifuge tubes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430055</td><td></td></tr><tr><td>Whatman prepleated qualitative filter paper, Grade 113V, creped</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WHA1213125</td><td></td></tr><tr><td>Fixed stage research mircoscope</td><td>Olympus</td><td>BX61WI</td><td></td></tr><tr><td>Black 6 inbred mice, male, C57BL/6NTac</td><td>Taconic</td><td>B6-M</td><td></td></tr><tr><td>Black 6 inbred mice,female, C57BL/6NTac</td><td>Taconic</td><td>B6-F</td><td></td></tr><tr><td>Greenough Stereo Microscope</td><td>Leica</td><td>Leica S6 E</td><td></td></tr></tbody></table>

dissection and culture of mouse embryonic kidney

El objetivo de este protocolo es describir un método para la disección, aislamiento y cultivo de rutinas metanefricas de ratón. Durante el desarrollo del riñón de los mamíferos, los dos tejidos progenitores, el brote ureteral y el mesénquima metanéfrico, se comunican y inducen recíprocamente mecanismos celulares para formar eventualmente el sistema colector y los nefrones del riñón. A medida que los embriones de mamíferos crecen intrauterinos y por lo tanto son inaccesibles para el observador, se ha desarrollado un cultivo de órganos. Con este método, es posible estudiar las interacciones epiteliales-mesenquimales y el comportamiento celular durante la organogénesis renal. Además, se puede investigar el origen de las malformaciones congénitas del riñón y del tracto urogenital. Después de una disección cuidadosa, los rudimentos metanefricos se transfieren a un filtro que flota sobre el medio de cultivo y puede mantenerse en una incubadora de cultivo celular durante varios días. Sin embargo, hay que tener en cuenta que las condiciones sonArtificial y podría influir en el metabolismo en el tejido. Además, la penetración de sustancias de ensayo podría estar limitada debido a la matriz extracelular y la membrana basal presentes en el explante. Una ventaja principal de la cultura de órganos es que el experimentador puede obtener acceso directo al órgano. Esta tecnología es barata, sencilla y permite un gran número de modificaciones, como la adición de sustancias biológicamente activas, el estudio de variantes genéticas y la aplicación de técnicas de imagen avanzada.

El anlagen renal metanéfrico se obtuvo a partir de ratones endocrinos Black-6 preñados a E11.5 y se cultivaron. Después de 3 días, la yema ureterica se había ramificado hasta 5 veces, dando como resultado una ramificación de la yema ureterica inicialmente en forma de T. Se fotografió cada explante y se cuantificaron los números de segmentos y puntos finales para determinar las generaciones de ramificación y para calcular el número de puntos finales por rama ( Figura 1 ). ( Figura 1b ), con lo que se redujo el número de endpoints por rama y los puntos finales por mm 2 en la muestra Explantes tratados con Ephrin B2 en racimo.Además, un tercio de los explantes tenían una morfología inusual en las puntas de la yema ureteral ( Figura 1 ) Estos resultados sugieren que EphrinB2 podría tener un efecto restrictivoEn el proceso de ramificación del brote ureteric, muy probablemente activando EphA4 y señalización delantera de EphB2. Para un experimento exitoso, es crítico que el mesénquima metanéfrico no se dañe durante la disección. Cualquier lesión del mesénquima disminuye el potencial inductivo, conduce a la reducción o ausencia de la ramificación del brote ureteral, y podría ser una fuente de sesgo. El ejemplo de la figura 2A muestra un explante donde el mesénquima está casi desaparecido. El brote ureteral no se ramifica más allá de la etapa T. La Figura 2B muestra un ejemplo en el que el daño del mesénquima metanéfrico condujo a un crecimiento y ramificación deficientes. Ambos explantes deben ser excluidos del análisis. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55715/55715fig1.jpg" /> Figura 1: Anlagen de riñón metanefrico E11.5 cultivado para 3 div y tratado con EphrinB2 recombinante agrupada o ClustLa Fc humana como control. ( A ) Se diseccionaron anafetas de riñón metanefricos a E11.5, se cultivaron durante 3 div, y se tiñeron con aglutinina biotinilada de Dolichorus biflorus y estreptavidina conjugada con Alexa488. Los explantes se fotografiaron con un microscopio de epifluorescencia de campo ancho con un paso de banda de excitación de 460-495 nm, un espejo dicromatico de 505 nm, un paso de banda de 510-550 nm y lentes 20x Plan-Apochromat. La aplicación de cluster EphrinB2 recombinante (clEphrinB2) dio lugar a la reducción de la complejidad de ramificación y la malformación de las puntas de uretero brote (punta de flecha). ( B ) El gráfico de la izquierda muestra las generaciones de ramificación en clEphrinB2-tratados y explantes de control. La 4 ª generación de ramificación se alcanzó en sólo el 8% de los explantes tratados, en comparación con el 35% de los explantes de control. Se redujo el número de puntos finales por rama (gráfico medio) y puntos finales por área (gráfico de la derecha) (puntos finales por rama CNT, 2,1 ± 0,09, clEphrinB2, 1,7 Pm 0,08, P = 0,007 **; Puntos finales por milímetro cuadrado: CNT, 31 ± 0,01; ClEphrinB2, 27 pm 0,02; P = 0,04 *; N = 23). Los datos se presentan como la media ± SEM y se usó una prueba t de Student no emparejada. Barra de escala = 100 μm. Esta figura se ha modificado de Peuckert et al. , 2016 3 . <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55715/55715fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55715/55715fig2.jpg" /> Figura 2: Ejemplos de dos anlágenos de riñón metanefricos E11.5 que se dañaron durante la disección, se cultivaron durante 3 div, y se tiñeron con aglutinina biotinilada de Dolichorus Biflorus y estreptavidina conjugada con Alexa488. ( A y B ) El daño del mesénquima dio como resultado un crecimiento pobre o ausente y una ramificación del brote ureteral,Descalificando los explantes de un análisis posterior. ( A ) explante de riñón metanéfrico después de 3 div, con ausencia de ramificación del brote ureteral. Sólo la primera rama en T es visible. ( B ) explante de riñón metanéfrico después de 3 div, con mala ramificación del brote ureteral. Barra de escala = 60 μm. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55715/55715fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Dissection and Culture of Mouse Embryonic Kidney

Este protocolo describe un método para aislar y cultivar rudimentos metanefricos de embriones de ratón.

Disección y cultivo de riñón embrionario de ratón

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection, isolation, and culture of mouse metanephric rudiments. 
During mammalian kidney ...

dissection-and-culture-of-mouse-embryonic-kidney

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

11.9K vistas.  Uppsala University.  Este protocolo describe un método para aislar y cultivar rudimentos metanefricos de embriones de ratón. 

Video: Dissection and Culture of Mouse Embryonic Kidney

Neural Tube Closure in Mouse Whole Embryo Culture

Genetic mouse models are an important tool in the study of mammalian neural tube closure (Gray &amp; Ross, 2009; Ross, 2010). However, the study of mouse embryos in utero is limited by our inability to directly pharmacologically manipulate the embryos in isolation from the effects of maternal metabolism on the reagent of interest. Whether using a small molecule, recombinant protein, or siRNA, delivery of these substances to the mother, through the diet or by injection will subject these unstable compounds to a variety of bodily defenses that could prevent them from reaching the embryo. Investigations in cultures of whole embryos can be used to separate maternal from intrinsic fetal effects on development.
Here, we present a method for culturing mouse embryos using highly enriched media in a roller incubator apparatus that allows for normal neural tube closure after dissection (Crockett, 1990). Once in culture, embryos can be manipulated using conventional in vitro techniques that would not otherwise be possible if the embryos were still in utero. Embryo siblings can be collected at various time points to study different aspects of neurulation, occurring from E7-7.5 (neural plate formation, just prior to the initiation of neurulation) to E9.5-10 (at the conclusion of cranial fold and caudal neuropore closure, Kaufman, 1992). In this protocol, we demonstrate our method for dissecting embryos at timepoints that are optimal for the study of cranial neurulation. Embryos will be dissected at E8.5 (approx. 10-12 somities), after the initiation of neural tube closure but prior to embryo turning and cranial neural fold closure, and maintained in culture till E10 (26-28 somities), when cranial neurulation should be complete.

A method allowing for direct pharmacological manipulation of mouse embryos during neurulation that bypasses maternal metabolism is described. The technique can be adapted to study different aspects of neurulation by varying the time point and pharmacological agent.

Cierre del tubo neural en el cultivo de embriones de ratón entero

Genetic mouse models are an important tool in the study of mammalian neural tube closure (Gray &amp; Ross, 2009; Ross, 2010).  However, the study of mouse ...

Investigación

Neurociencias

Organ Culture and Whole Mount Immunofluorescence Staining of Mouse Wolffian Ducts

Tubal morphogenesis is a fundamental requirement for the development of most mammalian organs, including the male reproductive system. The epididymis, an integral part of the male reproductive tract, is responsible for sperm storage, maturation, and transport. The adult epididymis is a highly coiled tube that develops from a simple and straight embryonic precursor known as Wolffian duct (WD). Proper coiling of the epididymis is essential for male fertility, as sperm in the testis are unable to fertilize an oocyte. However, the mechanism responsible for epididymal development and coiling remains unclear, partially due to the lack of whole organ culture and imaging methods. In this study, we describe an in vitro culture system and whole mount immunofluorescence protocol to better visualize the process of WD coiling and development, which may also be applied to study other tubular organs.

We present a method for isolation and culture of the mouse Wolffian duct (WD). We also demonstrate a detailed procedure for whole mount immunostaining of cultured/freshly isolated WDs with fluorescently tagged antibodies. Together, these techniques enable the study of WD development, coiling, and differentiation.

Cultura de órganos y todo el montaje Inmunofluorescencia La tinción de mouse de Wolff Conductos

Tubal morphogenesis is a fundamental requirement for the development of most mammalian organs, including the male reproductive system. The epididymis, an ...

Biología del Desarrollo

Optimization of Renal Organoid and Organotypic Culture for Vascularization, Extended Development, and Improved Microscopy Imaging

Embryonic kidney organotypic cultures, and especially pluripotent stem cell-derived kidney organoids, are excellent tools for following developmental processes and modelling kidney disease. However, the models are limited by a lack of vascularization and functionality. To address this, an improved protocol for the method of xenografting cells and tissues to the chorioallantoic membrane (CAM) of an avian embryo to gain vascularization and restoration of blood flow was developed. The grafts are overlaid with custom-made minireservoirs that fix the samples to the CAM and supply them with culture medium that protects the grafts from drying. The improved culture method allows xenografts to grow for up to 9 days. The manuscript also describes how to provide optimal conditions for long-term confocal imaging of renal organoids and organotypic cultures using the previously published Fixed Z-Direction (FiZD) method. This method gently compresses an embryonic organ or organoid between a glass coverslip and membrane in a large amount of medium and provides excellent conditions for imaging for up to 12 days. Together, these methods allow vascularization and blood flow to renal organoids and organotypic kidney cultures with improved confocal imaging. The methods described here are highly beneficial for studying fundamental and applied functions of kidneys ex vivo. Both methods are applicable to various types of tissues and organoids.

This work describes two methods for studying organ development, an improved xenotransplantation setup on chorioallantoic membrane (CAM) from avian embryos that allows for vascularization of cultured embryonic organs and organoids and a novel fixed z-direction organ culture method with modified experimental conditions that allows for high-resolution time-lapse confocal imaging.

Optimización del cultivo organoide renal y organatípico para la vascularización, el desarrollo extendido y la imagen mejorada de microscopía

Embryonic kidney organotypic cultures, and especially pluripotent stem cell-derived kidney organoids, are excellent tools for following developmental ...

Mouse Embryonic Lung Culture, A System to Evaluate the Molecular Mechanisms of Branching

Lung primordial specification as well as branching morphogenesis, and the formation of various pulmonary cell lineages requires a specific interaction of the lung endoderm with its surrounding mesenchyme and mesothelium. Lung mesenchyme has been shown to be the source of inductive signals for lung branching morphogenesis. Epithelial-mesenchymal-mesothelial interactions are also critical to embryonic lung morphogenesis. Early embryonic lung organ culture is a very useful system to study epithelial-mesenchymal interactions. Both epithelial and mesenchymal morphogenesis proceeds under specific conditions that can be readily manipulated in this system (in the absence of maternal influence and blood flow). More importantly this technique can be readily done in a serumless, chemically defined culture media. Gain and loss of function can be achieved using expressed proteins, recombinant viral vectors and/or analysis of transgenic mouse strains, antisense RNA, as well as RNA interference gene knockdown.

Early embryonic lung organ culture is a very useful system to study epithelial-mesenchymal interactions. Both epithelial and mesenchymal morphogenesis proceeds under specific conditions that can be readily manipulated in this system.

Cultura de embriones de ratón de pulmón, un sistema para evaluar los mecanismos moleculares de la ramificación

Lung primordial specification as well as branching morphogenesis, and the formation of various pulmonary cell lineages requires a specific interaction of ...

Biología

Microdissection of Primary Renal Tissue Segments and Incorporation with Novel Scaffold-free Construct Technology

Kidney transplantation is now a mainstream therapy for end-stage renal disease. However, with approximately 96,000 people on the waiting list and only one-fourth of these patients achieving transplantation, there is a dire need for alternatives for those with failing organs. In order to decrease the harmful consequences of dialysis along with the overall healthcare costs it incurs, active investigation is ongoing in search of alternative solutions to organ transplantation. Implantable tissue-engineered renal cellular constructs are one such feasible approach to replacing lost renal functionality. Here, described for the first time, is the microdissection of murine kidneys for isolation of living corticomedullary renal segments. These segments are capable of rapid incorporation within scaffold-free endothelial-fibroblast constructs which may enable rapid connection with host vasculature once implanted. Adult mouse kidneys were procured from living donors, followed by stereoscope microdissection to obtain renal segments 200 - 300 &#181;m in diameter. Multiple renal constructs were fabricated using primary renal segments harvested from only one kidney. This method demonstrates a procedure which could salvage functional renal tissue from organs that would otherwise be discarded.

Tissue-engineered renal constructs provide a solution for the organ shortage and deleterious effects of dialysis. Here, we describe a protocol to micro dissect murine kidneys for isolation of cortico-medullary segments. These segments are implanted into scaffold-free cellular constructs, forming renal organoids.

Microdisección de segmentos de tejido Renal primaria y la incorporación con la tecnología de construcción de andamio-libre nuevo

Kidney transplantation is now a mainstream therapy for end-stage renal disease. However, with approximately 96,000 people on the waiting list and only ...

Bioingeniería

Isolation and Culture of Cells from the Nephrogenic Zone of the Embryonic Mouse Kidney

Embryonic development of the kidney has been extensively studied both as a model for epithelial-mesenchymal interaction in organogenesis and to gain understanding of the origins of congenital kidney disease. More recently, the possibility of steering na&iuml;ve embryonic stem cells toward nephrogenic fates has been explored in the emerging field of regenerative medicine. Genetic studies in the mouse have identified several pathways required for kidney development, and a global catalog of gene transcription in the organ has recently been generated <a href="http://www.gudmap.org/">http://www.gudmap.org/</a>, providing numerous candidate regulators of essential developmental functions. Organogenesis of the rodent kidney can be studied in organ culture, and many reports have used this approach to analyze outcomes of either applying candidate proteins or knocking down the expression of candidate genes using siRNA or morpholinos. However, the applicability of organ culture to the study of signaling that regulates stem/progenitor cell differentiation versus renewal in the developing kidney is limited as cultured organs contain a compact extracellular matrix limiting diffusion of macromolecules and virus particles. To study the cell signaling events that influence the stem/progenitor cell niche in the kidney we have developed a primary cell system that establishes the nephrogenic zone or progenitor cell niche of the developing kidney ex vivo in isolation from the epithelial inducer of differentiation. Using limited enzymatic digestion, nephrogenic zone cells can be selectively liberated from developing kidneys at E17.5. Following filtration, these cells can be cultured as an irregular monolayer using optimized conditions. Marker gene analysis demonstrates that these cultures contain a distribution of cell types characteristic of the nephrogenic zone in vivo, and that they maintain appropriate marker gene expression during the culture period. These cells are highly accessible to small molecule and recombinant protein treatment, and importantly also to viral transduction, which greatly facilitates the study of candidate stem/progenitor cell regulator effects. Basic cell biological parameters such as proliferation and cell death as well as changes in expression of molecular markers characteristic of nephron stem/progenitor cells in vivo can be successfully used as experimental outcomes. Ongoing work in our laboratory using this novel primary cell technique aims to uncover basic mechanisms governing the regulation of self-renewal versus differentiation in nephron stem/progenitor cells.

In this report we describe a method for the isolation and culture of the progenitor cell niche from the embryonic mouse kidney that can be used to study signaling pathways regulating stem/progenitor cells of the developing kidney. These cultured cells are highly accessible to small molecule and recombinant protein treatment, and importantly also to viral transduction, which allows efficient manipulation of candidate pathways.

Aislamiento y cultivo de células de la zona nefrogénica del riñón de embriones de ratón

Embryonic development of the kidney has been extensively studied both as a model for epithelial-mesenchymal interaction in organogenesis and  to gain ...

Isolation and Culture of Embryonic Mouse Neural Stem Cells

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and expansion of NSCs provide a suitable source of cells for neuroscientists to study the function of neurons and glial cells along with their interactions. There are several reported techniques for the isolation of neural stem cells from adult or embryo mammalian brains. During the microsurgical operation to isolate NSCs from different regions of the embryonic CNS, it is very important to reduce the damage to the brain cells to obtain the highest ratio of live and expandable stem cells. A possible technique for stress reduction during isolation of these cells from the mouse embryo brain is the reduction of surgical time. Here, we demonstrate a developed technique for rapid isolation of these cells from the E13 mouse embryo ganglionic eminence. Surgical procedures include harvesting E13 mouse embryos from the uterus, cutting the frontal fontanelle of the embryo with a bent needle tip, extracting the brain from the skull, microdissection of the isolated brain to harvest the ganglionic eminence, dissociation of the harvested tissue in NSC medium to gain a single cell suspension, and finally plating cells in suspension culture to generate neurospheres.

Here, we introduce a novel microsurgical technique for the isolation of neural stem cells from the E13 mouse embryo ganglionic eminence.

Aislamiento y cultivo de las células madre neurales embrionarias de ratón

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and ...

Mouse Embryonic Development in a Serum-free Whole Embryo Culture System

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in an oxygenated rolling bottle culture system. Mouse embryos at E10.5 were carefully isolated from the uterus with intact yolk sac and in a process involving precise surgical maneuver the embryos were gently exteriorized from the yolk sac while maintaining the vascular continuity of the embryo with the yolk sac. Compared to embryos prepared with intact yolk sac or with the yolk sac removed, these embryos exhibited superior survival rate and developmental progression when cultured under similar conditions. We show that these mouse embryos, when cultured in a defined medium in an atmosphere of 95% O2 / 5% CO2 in a rolling bottle culture apparatus at 37 &#176;&#8203;C for 16-40 hr, exhibit morphological growth and development comparable to the embryos developing in utero. We believe this method will be useful for investigators needing to utilize whole embryo culture to study signaling interactions important in embryonic organogenesis.

Serum utilized in embryo cultures contains unknown components that can affect the outcome of experiments especially in studies involving signaling interactions. Here we utilized a serum-free oxygenated culture system and show that mid-gestation mouse embryos cultured for 16-40 hr&#160;exhibit morphological development comparable to embryos developing in utero.

Embriones de ratón con el desarrollo en todo un sistema de cultivo de embriones sin suero

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in ...

Glomerular Outgrowth as an Ex Vivo Assay to Analyze Pathways Involved in Parietal Epithelial Cell Activation

Parietal epithelial cell (PEC) activation is one of the key factors involved in the development and progression of glomerulosclerosis. Inhibition of pathways involved in parietal epithelial cell activation could therefore be a tool to attenuate the progression of glomerular diseases. This article describes a method to culture and analyze parietal epithelial cell outgrowth of encapsulated glomeruli isolated from mouse kidney. After dissecting isolated mouse kidneys, the tissue is minced, and glomeruli are isolated by sieving. Encapsulated glomeruli are collected, and single glomeruli are cultured for 6 days to obtain glomerular outgrowth of parietal epithelial cells. During this period, parietal epithelial cell proliferation and migration can be analyzed by determining the cell number or the surface area of outgrowing cells. This assay can therefore be used as a tool to study the effects of an altered gene expression in transgenic- or knockout-mice or the effects of culture conditions on parietal epithelial cell growth characteristics and signaling. Using this method, important pathways involved in the process of parietal epithelial cell activation and consequently in glomerulosclerosis can be studied.

This article describes a method for culturing and analyzing glomerular parietal epithelial cell outgrowths of encapsulated glomeruli isolated from mouse kidney. This method can be used to study pathways involved in parietal epithelial cell proliferation and migration.

Crecimiento glomerular como ensayo ex vivo para analizar las rutas involucradas en la activación de células epiteliales parietales

Parietal epithelial cell (PEC) activation is one of the key factors involved in the development and progression of glomerulosclerosis. Inhibition of ...

Efficient Dissection and Culture of Primary Mouse Retinal Pigment Epithelial Cells

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to understand the pathophysiology of ocular diseases because of their similarities with human anatomy and physiology. Alterations in the retinal pigment epithelium (RPE), including changes in morphology and function, are common features shared by many ocular disorders. However, successful isolation and culture of primary mouse RPE cells is very challenging. This paper is an updated audiovisual version of the protocol previously published by Fernandez-Godino et al. in 2016 to efficiently isolate and culture primary mouse RPE cells. This method is highly reproducible and results in robust cultures of highly polarized and pigmented RPE monolayers that can be maintained for several weeks on Transwells. This model opens new avenues for the study of the molecular and cellular mechanisms underlying eye diseases. Moreover, it provides a platform to test therapeutic approaches that can be used to treat important eye diseases with unmet medical needs, including inherited retinal disorders and macular degenerations.

This protocol, which was originally reported by Fernandez-Godino et al. in 20161, describes a method to efficiently isolate and culture mouse RPE cells, which form a functional and polarized RPE monolayer within one week on Transwell plates. The procedure takes approximately 3 hours.

Disección eficiente y cultivo de células epiteliales de pigmento retiniano de ratón primario

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to ...