Royal British Legion Merkezi finansal destek için patlama yaralanma çalışmalar HA ve tıbbi araştırma Konseyi (M01858X/1) kah için finansman için kabul etmek istiyoruz.

1. hücre kültürü ve numune hazırlama <ol><li>elde bir uygun hücre kültürünü (örneğin, dermal papilla hücreleri). 
	Not: Geçerli protokol yapışık hücreleri için bir model olarak kullanılan vibrissae dan izole sıçan dermal papilla fibroblastlar tasarlanmıştır.</li>
	<li>En az gerekli orta (MEM) α % 10 fetal sığır serum ve % 1 penisilin streptomisin ile desteklenmiş içeren bir T-75 şişesi hücrelerde kültür. Onlar % 80 izdiham ulaşana kadar hücreleri oksijen bir ortamda 37 ° C ve % 5 CO 2 standart kültür koşulları tutun.</li>
	<li>Orta Aspire edin ve Dulbecco iki kez hücrelerde yıkama &#39; s fosfat tamponlu tuz (PBS). Onları tripsin/EDTA, standart kültürüne koşulları 5 dakika süreyle kısaca hücreleri başarıyla ışık/faz kontrast mikroskop (ile 10 X objektif lens kullanarak balonun üzerinden ayrışmış emin olun 2 ml kuluçka şişeye hücrelerden ayırmak ).</li>
	<li>Kültür trypsinization reaksiyon nötralize etmek için orta 4 mL ekleyin. Hücre süspansiyon 15 mL santrifüj tüpü transfer.</li>
	<li>Santrifüj 200 x g hücreleri cips için 4 dakika için. Yavaş yavaş Pelet çıkarmak değil için dikkat çekici süpernatant, Aspire edin. Pelet 5 mL orta yeniden askıya alma.</li>
	<li>20 µL aliquot hücre süspansiyon için temiz bir hemasitometre aktarmak ve 10 X objektif lens ile donatılmış bir mikroskop kullanarak hücreleri saymak.</li>
	<li>Hücreleri için patlama 90 mm çanak içinde üç 35 mm yemekleri koyarak hazırlamak. Onları uygun şekilde etiketleyin. Orta 2 mL her 35 mm çanak ekleyin ve 5 x 10 4 hücre, çanak, hücrelerin eşit etrafında yemek dağıtma başına toplam tohum. Gecede standart kültür koşulları için yeterli hücre eki şok dalgası pozlama önce izin vermek için deneysel örneklerinde kuluçkaya. 
	Not: floresan görüntüleme için hücreleri steril cam coverslips numaralı seribaşı gerekir.</li>
</ol> 2. Boru montaj şok <img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55618/55618fig2.jpg" /> Şekil 2 : EVOC teçhizat ve şok tüp derleme. (A) görüntü EVOC teçhizat. (B) şeması şok tüpü cihaz. Şok tüp boyutları dahil et 59 mm ve 4.13 m EVOC teçhizat dahil olmak üzere toplam uzunluğu, bir iç çapı. Tahrik tüp ve EVOC teçhizat toplamları 2,71 m. uzunluğu <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55618/55618fig2large.jpg" target="_blank"> Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<ol><li>Derleme yordamları sırasında çelik toe iş ayakkabıları ve laboratuvar ceket giymek.</li>
	<li>Ekle iki hizalama çubukları iki cıvata deliklerden Çıkış flanş yatay düzlemde buldum. Çıkış flanş ve ex vivo organ kültür (EVOC) teçhizat arasında oturur sonuna hizalama çubukları üzerinde Nitril kauçuk conta örtü yerleştirin. 
	Not: EVOC teçhizat 35 mm Petri yemekler ( şekil 2A) ile kullanılmak üzere özel olarak tasarlanmış bir fikstür mı.</li>
	<li>EVOC teçhizat şok tüpü Çıkış flanş petri kabına tutar bölümüne kendi tabanında yer alır böylece düzgün odaklı olduğunu sağlanması hizalama çubukları üzerinde fikstür kaydırarak takın.</li>
	<li>Dört M24 civatalar ve contalar kalan deliklere yerleştirin. Flanş dokundukları fındık konumlandırın.</li>
	<li>Sıkıca somun ve civata sırayla çapraz olarak simetrik bir şekilde görsel olarak EVOC teçhizat ve şok tüpü başarılı bir şekilde hizalanmış var. kontrol ederken tutturmak.</li>
	<li>EVOC teçhizat için bir basınç detektörler eklemek ve bir sensör kablo kullanarak geçerli kaynak bağlayın. Sonra bir BNC kablo kullanarak bağlan geçerli kaynak için osiloskop.</li>
	<li>Tüm vanalar yayın ve şok Tube akıșı emin olun kapalı. Yapılı-içinde dış basınçlı hava satırı açın ve el ile basınç regülatörü solenoid 2.5 bara için şarj etmek için saat yönünde çevir</li>
	<li>180 ° saat yönünün tersine çevirerek sıkıştırılmış gaz şişesi üzerinde emniyet valfi açın.</li>
	<li>Yavaş yavaş gaz şişesi üzerinde yaklaşık 15 bar basınç artmaya saat yönünde bulunan basınç regülatörü açmak 
	Not: Bu regülatör ayar noktası biraz yüksek deneyde kullanılacak en kalın diyafram baskısı patlama olması.</li>
	<li>Plastik bir tabaka 0,125 mm kalınlığında 10 cm x 10 cm kareler halinde keserek Diyaframlar hazırlayın. 
	Not: Diyafram kalınlığı (daha kalın bir diyafram ile daha büyük bir pik basınç; bir şok dalgası neden olur Yani, şok dalgasının en yüksek basınç değiştirmeyi patlama basınç ile ilişkili Tablo 1).</li>
</ol> < masa fo:keep-together.within-sayfa = "1" > <tbody><tr><td>Mylar diyafram boyutları (cm)</td> <td>patlama basıncı (bar)</td> <td>sensör 3 basınç aralığı (kPa)</td></tr> <tr><td>10 x 10 x 0.023</td> <td>2 ± 0.2</td> <td>47 ± 7.5</td></tr> <tr><td>10 x 10 x 0.050</td> <td>4 ± 0.2</td> <td>72 ± 7,5</td></tr> <tr><td>10 x 10 x 0.125</td> <td>9.5 ± 0.5</td> <td>127 ± 12,5</td></tr></tbody> < /t mümkün > Tablo 1: Patlama basınç ilgili diyafram kalınlığı ve en yüksek basınç.
<ol start="11"> <li>oluşturmak kolları bant dışında onları üst ve alt kısımlarında diyafram saptamak ve onları dikkatle makat odası tarafından diyafram açık küçük flanş yanında konumlandırmak için kullanın. Diyafram makat kapatmadan önce düz ve doğru şekilde yerleştirilmiş olduğundan emin olun.</li>
	<li>Bu dört M24 somunlar kullanarak güvenli. Sıkıca somun ve civata sırayla çapraz olarak simetrik bir biçimde tutturmak.</li>
</ol> 3. Sadece hücreleri şok dalgası pozlama için önceden hazırlanması <ol><li>hazırla ultraviyole sterilizasyon gerçekleştirerek bir doku laminar akış hood. Dezenfektan bir çözüm ve % 70 etanol ile temizleyin. Tüm öğeleri işleme önceki için/post-shock hücreleri için gerekli dalga pozlama ve yer onları içinde steril hood toplamak. 
	Not: Bu taze orta, yapışkanlı gaz geçirgen membranlar, steril makas, Pipetler ve pipet içerir ipuçları.</li>
	<li>Bir 90 mm Petri kabına steril hood için kuluçka makinesi üç deneysel örnekleri içeren transfer.</li>
	<li>Yapışkan bir gaz geçirgen membran sac (Tablo reçetesi görmek) altı kareler halinde, öyle ki her bir 35 mm Petri kabına üst kapak kadar büyük kesim.</li>
	<li>35 mm Petri kabına ortamından Aspire edin, kapağı bir tarafına yerleştirin ve kapağı membran çanağı kenarı arasındaki sıkı bir mühür olduğunu kontrol ettikten iki yapıştırıcı gaz geçirgen membranlar bölümleri ile.</li>
	<li>Örnek EVOC teçhizat için transfer ve çanak üst şok tüpü iç tabanı ile hizalanacak biçimde fikstür tabanına güvenli.</li>
</ol> 4. Şok tüpü işlem <ol><li>kulak savunucuları, göz gözlük, Emanet çizme ve laboratuvar ceket giymek ne zaman şok tüp sistemi basınçlandırma.</li>
	<li>Akış kontrol düğmesi regülatör üzerinde saat yönünde, gaz basınçlı hava silindir şok tüp bağlama esnek hortum içine akmasına izin çevir.</li>
	<li>Kontrol panelinin alt kısmında, ya seçin &#34; Çift Kişilik makat &#34; giriş için bir kısa süreli şok wave veya &#34; sürücü tüp &#34; giriş için bir yüksek dalga süre.</li>
	<li>DC güç kaynağı ve osiloskop dalga formu verisini almak için geçiş. Nokta kayıt uzunluğu 1 m s/osiloskop örnekleme hızı 50.0 MS için ayarlanır. 50 aralığını ayarlamak için ateş 2 bar ve 100 mV 4 bara yukarıda için mV</li>
	Denetim Masası karşısındaki duvarda anahtarını kullanarak güvenlik ışıkları açmak <li>. 
	Not: Bu şok tüpü şarj ederken odaya girmek için diğer araştırmacılar söyler.</li>
	Solenoid kapatmak için solenoid kontrol kutusunu açmak açmak <li>. 
	Not: Bu güvenlik özelliği sistemi tahsil çift makat odası üzerinde bulunan bir vana kapatır.</li>
	<li>Kontrol panelinde, yavaş yavaş açık akış denetimi topuzu yavaş yavaş sıkıştırma odası içindeki basıncı artırmak için saat yönünün tersine çevirerek. Denetim Masası görüntü kullanarak basınç izlemek.</li>
	Diyafram Basınçı bir kez <li>ulaşıldığında, diyafram rüptürü ve bir &#34; bang &#34; duymuş olacak. Hızlı Akış denetimi düğmeyi çevirerek kapatın. 
	Not: Hücre örnek üzerinde ve tüp sonu dışarı aşağı tüp şok dalgası seyahat edecek.</li>
	<li>Bobini solenoid kontrol kutusunu kapama çevirerek açın ve (Denetim Masası'nı karşısında duvardaki anahtarını kullanarak) Emanet ışığı kapatın.</li>
	<li>Hücre örnek steril hood transfer, yapışkanlı gaz geçirgen membranlar kaldırmak ve çanak taze büyüme orta 2 mL ile doldurulması. Hücreleri hemen değerlendirme için adım 5'te açıklandığı gibi kullanılabilir veya daha uzun vadeli çalışmalar için kuluçka döndü.</li>
</ol> 5. Hücre canlılığı şok dalgası pozlama bir Redoks göstergesi tahlil ve floresan görüntüleme canlı ve ölü hücrelerin birleşimini kullanarak takip <ol><li>değerlendirin hücre canlılığı. 
	Not: floresan görüntüleme için hücreleri steril cam coverslips 1 kısmı sırasında numaralı seribaşı gerekir: hücre kültürü ve örnek hazırlama. Bunlar-ebilmek var olmak konulmak içinde 35-mm petri yemekler.</li>
	<li>Transfer 200 µL Redoks indictor reaktif (Tablo reçetesi görmek) doğrudan sonra onları orta sonrası şok 2 mL ile dolum deneysel için her yemeğin dalga pozlama. 4 h için standart kültür koşulları, kuluçkaya</li>
	<li>Her yemek için transfer (bir karanlık steril mahallede) 2 x 100 µL aliquots ya da bir siyah veya floresan veya Absorbans viability değerlendirmek için kullanılıp kullanılmayacağı bağlı olarak 96-şey plaka temizleyin.</li>
	<li>Ve doğru filtre ile donatılmış bir uygun plaka okuyucu 96-şey plaka transfer floresan veya 570 için uyarma bantları 530ex/590em kullanılarak okunan Absorbans için 600 nm başvuru ile birlikte, nm. İhracat yapmak ve verileri kurtarmak.</li>
	Bu hücre canlılığı içinde bir damla göstergesi olabilir gibi <li>şok dalgası maruz örnekleri ve denetimleri, Sigara maruz arasında herhangi bir fark tanımlamak için veri analiz. 
	Not: Bir negatif kontrol de deneysel tasarım dahil edilmelidir. Ayrıca, standart bir eğri ilişkilendirme hücre sayıları hesaplamak için kullanılabilir.</li>
	<li>Redoks göstergesi reaktif içeren orta Aspire edin. Eski yerine koymak o ile 2 mL taze orta ve hücreleri 24 h için standart kültür koşulları, kuluçkaya</li>
	<li>Gerektiği gibi ikinci bir canlılık süresi noktası elde etmek için yukarıdaki adımları tekrarlayın.</li>
	<li>İçin canlı ve ölü hücreleri floresan düşsel, orta Aspire edin ve PBS 1 mL hücrelerde iki kez yıkayın. Transfer 100 µL tam reaktif görüntülemede bulundu (Tablo reçetesi görmek) her örnek için kit ve 15 dakika süreyle ışık korunuyorsunuz oda sıcaklığında kuluçkaya</li>
	<li>Reaktif Aspire edin ve 1 mL PBS kullanarak bir kez yıkayın. İyi noktası forseps kullanarak, dikkatle coverslip 35 mm çanak çıkarın ve aşağı doğru bir cam mikroskobu slayt üzerine yerleştirin.</li>
	<li>Edinme görüntüler (10 X objektif lens, 0.50 sayısal diyafram) floresan mikroskop kullanarak her örnek için doğru uyarma ve emisyon filtreleri ile donatılmış (ex / em 488 nm/515 nm ve 570 nm/602 nm). 
	Not: Canlı hücreleri yoğun, üniforma, yeşil Floresans yayarlar. Ölü ya da ölen hücreleri güvenliği aşılan bir hücresel membran ile will alımını ölü kiti bileşeni, kırmızı Floresans emisyon sonuçlanan, ağırlıklı olarak hücre nükleer bölgede bulundu.</li>
	<li>Görüntü analizi yazılımı ya el ile veya otomatik olarak saymak canlı ve ölü hücreleri her görüntüden kullanın.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Proud, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physical+basis+of+explosion+and+blast+injury+processes.">The physical basis of explosion and blast injury processes.</a> J R Army Med Corps. 159, 4-9 (2013).</li><li>Born, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blast+Trauma:+The+Fourth+Weapon+of+Mass+Destruction.">Blast Trauma: The Fourth Weapon of Mass Destruction.</a> Scand J of Surg. 94 (4), 279-285 (2005).</li><li>Kocsis, J. D., Tessler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathology+of+blast-related+brain+injury.">Pathology of blast-related brain injury.</a> J Rehabil Res Dev. 46 (6), 667-671 (2009).</li><li>Bass, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+Injuries+from+Blast.">Brain Injuries from Blast.</a> Ann Biomed Eng. 40 (1), 185-202 (2012).</li><li>Cernak, I., Kobeissy, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+Neurotrauma:+Molecular,+Neuropsychological,+and+Rehabilitation+Aspects.">Brain Neurotrauma: Molecular, Neuropsychological, and Rehabilitation Aspects.</a> Frontiers in Neuroengineering. , (2015).</li><li>Alfieri, K. A., Forsberg, J. A., Potter, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blast+injuries+and+heterotopic+ossification.">Blast injuries and heterotopic ossification.</a> Bone Joint Res. 1 (8), 174-179 (2012).</li><li>Potter, B. K., Burns, T. C., Lacap, A. P., Granville, R. R., Gajewski, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterotopic+Ossification+Following+Traumatic+and+Combat-Related+Amputations.+Prevalence,+Risk+Factors,+and+Preliminary+Results+of+Excision.">Heterotopic Ossification Following Traumatic and Combat-Related Amputations. Prevalence, Risk Factors, and Preliminary Results of Excision.</a> J Bone Joint Surg Am. 89 (3), 476-486 (2007).</li><li>Sasser, S. M., Sattin, R. W., Hunt, R. C., Krohmer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blast+Lung+Injury.">Blast Lung Injury.</a> Prehosp Emerg Care. 10 (2), 165-172 (2006).</li><li>Cho, S. -. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+Hearing+Loss+after+Blast+Injury+to+the+Ear.">Mechanisms of Hearing Loss after Blast Injury to the Ear.</a> PLoS ONE. 8 (7), 67618 (2013).</li><li>Bull, M. A., Clasper, J., Mahoney, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Blast Injury Science and Engineering: A Guide for Clinicians and Researchers. , (2016).</li><li>Arun, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+blast+traumatic+brain+injury+using+in-vitro+model+with+shock+tube.">Studies on blast traumatic brain injury using in-vitro model with shock tube.</a> Neuroreport. 22 (8), 379-384 (2011).</li><li>Ahlers, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+the+effects+of+acute+and+repeated+exposure+to+blast+overpressure+in+rodents:+toward+a+greater+understanding+of+blast+and+the+potential+ramifications+for+injury+in+humans+exposed+to+blast.">Assessment of the effects of acute and repeated exposure to blast overpressure in rodents: toward a greater understanding of blast and the potential ramifications for injury in humans exposed to blast.</a> Front Neurol. 3, 32 (2012).</li><li>Polfer, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+a+rat+model+to+investigate+the+formation+of+blast-related+post-traumatic+heterotopic+ossification.">The development of a rat model to investigate the formation of blast-related post-traumatic heterotopic ossification.</a> Bone Joint J. 97 (4), 572-576 (2015).</li><li>Miller, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Blast+Overpressure+on+Neurons+and+Glial+Cells+in+Rat+Organotypic+Hippocampal+Slice+Cultures.">Effects of Blast Overpressure on Neurons and Glial Cells in Rat Organotypic Hippocampal Slice Cultures.</a> Front Neurol. 6, 20 (2015).</li><li>Chandra, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+blast+wave+profiles+in+simulated+air+blasts:+experiment+and+computational+modeling.">Evolution of blast wave profiles in simulated air blasts: experiment and computational modeling.</a> Shock Waves. 22 (5), 403-415 (2012).</li><li>Kuriakose, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tailoring+the+Blast+Exposure+Conditions+in+the+Shock+Tube+for+Generating+Pure,+Primary+Shock+Waves:+The+End+Plate+Facilitates+Elimination+of+Secondary+Loading+of+the+Specimen.">Tailoring the Blast Exposure Conditions in the Shock Tube for Generating Pure, Primary Shock Waves: The End Plate Facilitates Elimination of Secondary Loading of the Specimen.</a> PLoS ONE. 11 (9), 0161597 (2016).</li><li>Reneer, D. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Multi-Mode+Shock+Tube+for+Investigation+of+Blast-Induced+Traumatic+Brain+Injury.">A Multi-Mode Shock Tube for Investigation of Blast-Induced Traumatic Brain Injury.</a> J Neurotrauma. 28 (1), 95-104 (2011).</li><li>VandeVord, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Up-regulation+of+reactivity+and+survival+genes+in+astrocytes+after+exposure+to+short+duration+overpressure.">Up-regulation of reactivity and survival genes in astrocytes after exposure to short duration overpressure.</a> Neurosci Lett. 434 (3), 247-252 (2008).</li><li>Kane, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+gene+expression+in+cultured+microglia+in+response+to+simulated+blast+overpressure:+Possible+role+of+pulse+duration.">Altered gene expression in cultured microglia in response to simulated blast overpressure: Possible role of pulse duration.</a> Neurosci Lett. 522 (1), 47-51 (2012).</li><li>Nienaber, M., Lee, J. S., Feng, R., Lim, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impulsive+pressurization+of+neuronal+cells+for+traumatic+brain+injury+study.">Impulsive pressurization of neuronal cells for traumatic brain injury study.</a> J Vis Exp. (56), (2011).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+Profiling+in+Rat+Hair+Follicles+following+Simulated+Blast+Insult:+A+New+Diagnostic+Tool+for+Traumatic+Brain+Injury.">Transcriptional Profiling in Rat Hair Follicles following Simulated Blast Insult: A New Diagnostic Tool for Traumatic Brain Injury.</a> PLoS ONE. 9 (8), 104518 (2014).</li><li>Bo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+characterization+of+compression-induceddamage+in+live+biological+samples.">Cellular characterization of compression-induceddamage in live biological samples.</a> AIP Conf Proc. 1426 (1), 153-156 (2012).</li><li>Tannous, O., Griffith, C., O'Toole, R. V., Pellegrini, V. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterotopic+ossification+after+extremity+blast+amputation+in+a+Sprague-Dawley+rat+animal+model.">Heterotopic ossification after extremity blast amputation in a Sprague-Dawley rat animal model.</a> J Orthop Trauma. 25 (8), 506-510 (2011).</li><li>Chen, Y. C., Smith, D. H., Meaney, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-Vitro+Approaches+for+Studying+Blast-Induced+Traumatic+Brain+Injury.">In-Vitro Approaches for Studying Blast-Induced Traumatic Brain Injury.</a> J Neurotrauma. 26 (6), 861-876 (2009).</li><li>Nguyen, T. T. N., Wilgeroth, J. M., Proud, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+blast+wave+generation+in+a+shock+tube+for+biological+applications.">Controlling blast wave generation in a shock tube for biological applications.</a> JPCS. 500 (14), 142025 (2014).</li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali ilgi alanlarına sahip.

Birincil yaralanmaları patlama olaylara maruz elde henüz tam olarak anlaşılır değil. Belirlenmesi ve travmatik beyin hasarı3,gibi patlama kaynaklı yaralanmaları tetiklemek mekanizmaları anlama4 ve heterotopik ossifikasyon6,7, geliştirmek için önemli ilk adım vardır profilaksi etkili yöntemleri. Bu hedefe ulaşmak yardımcı olmak için deneysel sistemleri bir dizi patlama olay maruz kalma11,12,13,14,18,19 çoğaltmak için geliştirilmiştir . Açıklanan teknik burada şok tüpü donatımı (Şekil 2) şok dalgaları baskıların tüm vücut (Yani, kemirgen), doku veya hücre örnekleri bir mesafeden atış yeteneğine sahip kullanır. Hasar mekanizmaları1,2bir dizi ile aynı anda ortaya çıkabilir gibi tüm dokular yerine tek tek hücre tipleri yüklemek için ayrı hücresel yanıt ayrıştırma yeteneği sağlıyor. Örneğin, travmatik modellemek için beyin hasarı, sinir hücreleri ve astrocytes, tek hücre türleri değerlendirilmesi hücre özgü yaralanma tanımlanması için izin verebilirsiniz. Ayrıca, Bütün organ yanıt beyin dokusu kullanarak tespit edilebilir. Tek hücre türleri ve doku örnekleri değere sahip ve farklı bilgiler verebilir. Çift-yarık veya sürücü-tüp giriş seçerek şok oluşturmak için basınçlı hava miktarını değiştirmek mümkündür. Bu şok dalgası süresi denetler. Diyafram malzeme ve kalınlık en yüksek basınç25değiştirmek için değiştirmek için başka bir olasılık olabilir.
Başka bir faktör dikkate ne zaman örnek konut mevcut sistemi açıklanan EVOC sondaj platformu üzerinde bulduğu gibi şok tüpü çıkış yakınında mevcut olabilir müdahale sonunda etkileri vardır. Chandra vd. sıkıştırma tahrik şok tüpü farklı konumlarda bulunan ve bir yerde içinde şok tüpü15derin Friedlander dalga formu en iyi temsil edildi bulundu patlama dalgası profilleri baktı. Kuriakose vd. Ayrıca ikincil örnek yüklenmesini okudu ve şok tüpü sonunda sonuna plaka yerleşimini istenmeyen yansıyan dalgalar16ortadan kaldırmak mümkün olduğunu fark etti. Verileri dikkate alınarak, bu yayınları15,16' da, bu makalede açıklanan şok tüp sistemi geliştirmek için gelecekteki değişiklikler tahrik tüp içinde daha derin bir yerde EVOC teçhizat yerleşimini dahil bulundu veya, Alternatif olarak, bir bitiş plaka üzerinde şok tüpü dahil. Açıklanan yöntemi sınırlamaları nispeten düşük akış verimi, örnekler içerebilir. Tek bir kullanıcı şok tüp bir çıktısını, güvenli bir şekilde çalışabilir saat başına 6-8 örnek. Şu anda, sistem çapında tek 35-mm petri yemekler kullanılan tasarlanmıştır. Bu nedenle, birden çok grubu ve biyolojik çoğaltır içeren daha büyük deneyler elde etmek zor olabilir.
Bu yöntemleri makale nasıl canlılığı yapisan dermal papilla hücre tek bir şok dalgası maruz etkilendi gösterir. Bir kısa süreli şok dalgası (&#60; 10 ms) ≤72 kPa (şekil 3 ve şekil 4) denetimine göre canlılığı etkilemedi. Buna ek olarak, bir şok dalgası 127 kPa, önemli bir düşüş canlılığı, 24 saat sonrası patlama, içinde bir Redoks göstergesi tahlil (şekil 3) ve floresan görüntü analizi (şekil 4) tarafından gösterildiği gibi teşvik. Miller vd. rapor benzer bir azalma hücre canlılığı sıçan organotypic Hipokampal dilim kültürlerde ne zaman hücreleri bir ya da maruz kaldılar bir 147 kPa veya 278 kPa şok dalgası bir açık uçlu, helyum odaklı şok tüpü14kullanarak. Buna ek olarak, VandeVord ve ark. fare astrocytes için bir kısa süreli aşırı basınç-maruz canlılığı üzerinde bir etkisi olduğunu bildirdiler &#62; 200 kPa, her ne kadar bir barochamber ziyade bir şok tüpü18kullanıldı. Bu karmaşık stres dalgalar bünyesinde, bu nedenle yükleme doğası doku veya hücre mekanik özelliklerini son derece bağımlı hale oluşturur, ancak dış basınç patlama dalgası üzerinde bağımlı olduğunu belirtmek. Hücresel olaylarına yanıt olarak patlama ek karakterizasyon çalışmaları gereklidir. Ayrıca, şok dalgası pozlama hücresel düzeyde Bu teknikte gösterildiği tarafından değerlendirilmesi, biyolojik yanıt yolları veya epigenetik değişiklikleri, sinyal pertürbasyon gibi yaralanmalara karşı tetiklenen olabilir tespit ve daha da araştırdı.
Sonuç olarak, bu iş bir paslanmaz çelik şok tüpü ve birincil hücre kültürleri dahil etmek için değiştirilmiş bir EVOC teçhizat kullanımını açıklar. Şok dalgaları baskıların bir mesafeden oluşturulan ve bir patlama dalgası maruz etkileri çoğaltmak için canlı hücreleri üzerine yayılır. Bu iletişim kuralı hücre canlılığı değerlendirmek gösterilmiştir, ama daha uzun vadeli değişiklikleri tek tek hücre tipleri için de okudu. İleriye, biz karmaşık şok dalgaları, farklı hücre tipleri, birincil yaralanmaları patlama kaynaklı anlayışımızı sürdürmek amacıyla temin fark etkilerini değerlendirmek için plan.

Modern savaş ve terör eylemleri sivillere doğaçlama patlayıcı cihazların kullanımı doğru son eğilim ile insan vücudunda patlayıcı olaylar etkilerini anlama açısından önemlidir. Patlama olaylara maruz kalma yoluyla elde yaralanmalar ölümcül ve ölümcül yaralanma dört kategoriye bölünmüş fiziksel süreçleri ile olabilir. Yerel olarak vücut ile basınç ve daha sonra geniş bir şekilde etkileşime girer, patlama dalgası doğrudan maruz birincil yaralanmalar sonucu membran ve yumuşak dokular1bozulma neden. İkincil yaralanma künt travma veya nüfuz edici yaralar yüksek hızda patlama dalgası tarafından tahrikli düşük kütle nesnelerle etkisi tarafından neden içerir. Patlama dalgası yüksek kitle ya da bireyler nesneleri karşı nesnelerini atmak için yeterli enerji Tersiyer yaralanmalar meydana gelir. Son olarak, Kuvaterner patlama yaralanmaları flash burns2gibi diğer kategorilere sığmayan diğer çeşitli yaralanma tarafından tanımlanır. Tür patlama olaylara maruz, birincil yaralanmaları dahil travmatik beyin hasarı3,4,5, heterotopik ossifikasyon6,7, patlama akciğer hasarı8, işitme kaybı 9ve diğerleri10.
Yaygın olarak gözlenen bir dalga patlama olaylardan Friedlander dalgadır, ücretsiz alan, bir kapalı alanı, aksine patlama temsil eden. Dalga biçimi pozitif basınç keskin ve hızlı artış olarak tanımlanabilir bir patlama açık oluşur. Bu hemen hava yüksek hız ve basınç atmosferik seviyenin altında azaltır bir yayın dalga hareketli bir patlama rüzgarı izler. Kısmi bir vakum, bölgenin hava yavaş geri tepme sonuç ilk patlamanın yaptı. Dalga (şekil 1A) pozitif ve negatif aşamalarını patlama dalgası1itme-çekme hareketi neden. Arkasında birincil patlama yaralanma mekanizmaları aydınlatmak amacıyla, deneysel modeller gibi hücre ve dokuların gerçek patlama olayına maruz kaldığında karşılaşacağı Friedlander dalga dalga biçimleri üretmek için oluşturulmuştur. Mevcut sistemleri literatürde listelenen şok tüpleri11,12,13,14,15,16,17dahil, barochambers18,19, Kolsky bar20, Gelişmiş patlama simülatörleri21, Split Hopkinson basınç çubuğu22ve kontrollü ortam kullanarak alternatif patlama olayların rekreasyon pentaerythritol tetranitrate23. Çeşitli modeller rağmen patlama dalgaları, uygulanan öncesi stres de dahil olmak üzere ve mekanik özelliklerini, tek hücre türleri veya değerlendirme24altındaki dokuları elde edilen yaralanma fazla değişken etkiler. Çalışma doku veya organ doku deformasyon ve Brüt morfolojik değişiklikler patlama olaylar sonucu olarak sürekli ışık tutabilir iken, hücresel düzeyde analiz şok dalgası tarafından etkilenmiş transkripsiyon ve epigenetik değişikliklerin ortaya çıkarmak.
Bu yöntemleri makalede bir monolayer canlı hücreleri üzerinde baskıların bir mesafeden şok dalgaları yaymak için bir teknik anlatılmaktadır. Bu hücre canlılığı potansiyel hasar eşikleri şok dalgaları üzerinden elucidating, hemen karakterizasyonu için sağlar. Ayrıca, hücrelerin standart kültür koşulları için döndürülebilir ve uzun vadeli biyolojik etkileri patlama olaydan tespit edilebilir. İletişim kuralı aşağıdaki kültüründe hücreleri üzerinde kullanılan iki hücre canlılığı teknikleri açıklar.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55618/55618fig1.jpg"> 
Şekil 1: Yaklaşım Friedlander dalgasının. (A) sensör 3 şok tüpü üzerinde gözlenen bir Friedlander dalga yaklaşık. (B) temsilcisi veri farklı basınç profilleri gösterilen sensörler 1, 2 ve 3 şok tüpü üzerinde gözlenen. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55618/55618fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1124">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td>MEM &#945;, nucleosides</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>22571020</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Fetal Bovine Serum, certified, US origin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>16000044</td>
			<td>Supplement to create complete growth media.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Penicillin-Streptomycin&#160;</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15070-063</td>
			<td>Supplement to create complete growth media.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15400-054</td>
			<td>Dilute 1 in 10 before use.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>CytoOne T-75 Flask, TC-Treated, vented</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>CC7682-4875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>TC Dish (PS) 35mm, 8.5 cm2</td>
			<td>Triple Red</td>
			<td>TCD010035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Petri dish (PS) 90x14.2mm no vent</td>
			<td>VWR UK</td>
			<td>391-0453&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Gas Permeable Adhesive Plate Seals</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AB-0718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>LIVE/DEAD Cell Imaging Kit (488/570)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>R37601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Alamarblue cell viability reagent</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13494309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Virkon tablets</td>
			<td>VWR UK</td>
			<td>115-0020</td>
			<td>Use to create 2% solution as viability control reagent.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Dumont forceps</td>
			<td>SurgicalTools</td>
			<td>11295-10</td>
			<td>Use to remove coverslips from petri dish.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Cover glass, square</td>
			<td>VWR UK</td>
			<td>631-0125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Microscope slides</td>
			<td>VWR UK</td>
			<td>631-1553</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>96 Well plate, solid black</td>
			<td>AppletonWoods</td>
			<td>CC760</td>
			<td>Plate to be used for fluorescence measurements.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>96 Well plate, clear, (PS)</td>
			<td>VWR UK</td>
			<td>734-1799</td>
			<td>Plate to be used for absorbance measurments.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Leica DMi1 Camera stand outfit</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td>Optical microscope used for cell culture.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Zeiss PALM MicroBeam Laser Capture Microdisseciton</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Fluorescence microsope used for LIVE/DEAD imaging.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>EnVision Multilabel Reader</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>2104-0010A</td>
			<td>Plate reader to be used for fluorescence/absorbance readings.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td>Mylar Electrical &#38; Chemical Insulating Film, 304mm x 200mm x 0.023mm&#160;</td>
			<td>RS Components</td>
			<td>785-0782</td>
			<td>Use to create shock tube diaphragm.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td>Mylar Electrical &#38; Chemical Insulating Film, 304mm x 200mm x 0.05mm&#160;</td>
			<td>RS Components</td>
			<td>785-0786</td>
			<td>Use to creatw shock tube diaphragm.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td>Mylar Electrical &#38; Chemical Insulating Film, 304mm x 200mm x 0.125mm&#160;</td>
			<td>RS Components</td>
			<td>785-0798</td>
			<td>Use to create shock tube diaphragm.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Current source power unit</td>
			<td>Dytran Intruments Inc.</td>
			<td>4103C</td>
			<td>Power source for 2300V1 sensor.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>IEPE Pressure Sensor</td>
			<td>Dytran Intruments Inc.</td>
			<td>2300V1</td>
			<td>Pressure sensor located on shock tube.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Digital Phosphor Oscilloscope</td>
			<td>Tektronix</td>
			<td>DPO 4104B</td>
			<td>Use to gather and save sensor 2300V1 data.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluating primary blast effects in vitro

Patlama olaylara maruz akciğerler, kulak ve beyin gibi hayati organlara ağır travma neden olabilir. Böyle patlama kaynaklı yaralanmaları arkasında mekanizmaları anlama patlayıcı kullanımı yönünde son eğilim modern warfare ve terörist ile ilgili olaylar dikkate alınarak büyük önem taşıyor. Patlama kaynaklı yaralanma tamamen anlamak için biz ilk tür patlama olaylara tekrarlanabilir bir yöntemle kontrollü bir ortamda çoğaltmak gerekir. 2D olarak yetiştirilen canlı hücreleri üzerinde şok dalgaları baskıların bir mesafeden türetilebilecek şok tüpü donanımları kullanarak bu tekniği ve işaretleri hücre canlılık hemen bir Redoks göstergesi tahlil ve canlı ve ölü hücreleri floresan görüntüleme kullanılarak analiz edilebilir. Bu yöntem en yüksek patlama aşırı basınç 127 kPa için artan önemli bir düşüş ne zaman tedavi edilmezse kontrollere göre hücre canlılığı içinde teşvik edebilirsiniz olduğunu gösterdi. Test örnekleri yapisan hücrelere sınırlı değildir, ancak hücre süspansiyonlar, ekleyebilirsiniz şok tüp kurulum küçük değişiklikler ile tüm vücut ve doku örnekleri. Doku ve hücreleri bir gerçek patlama olayına maruz kaldığında deneyim kesin şartlar çoğaltılıyor zordur. Bu makalede sunulan bir gibi teknikleri hasar eşikler tanımlayabilir ve şok dalgası maruz ortaya hücrelerde transkripsiyon ve epigenetik değişiklikleri belirlemek için yardımcı olabilir.

Yukarıda açıklanan yöntemi kullanarak, bir monolayer yetiştirilen hücrelerin nüsha şok şok tüpü (şekil 2B) kullanılarak oluşturulan dalgalarına maruz bırakıldı. İşaretleyicileri hücre canlılık değerlendirildi. Redoks göstergesi tahlil kullanarak, uygulama 127 kPa şok dalgasının canlılığı dermal papilla hücre kültürü (şekil 3) 24 saat sonra kontrollere göre önemli ölçüde azaltmak mümkün bulundu. Bir şok dalgası ≤72 kPa uygulanması canlılığı azaltmak değil. Bu gözlemler desteklemek için bir floresan görüntü tahlil fluorescently kırmızı ya da yeşil fluorophores, canlı veya ölü hücrelerle sırasıyla, etiketleme yetenekli kullanıldı. Biyolojik REPLICATE başına 13 floresan görüntü canlı ve ölü hücrelerden miktar hücre canlılığı o zaman kontrolü (şekil 4) göre 127 kPa şok dalgası maruz bir azalma gösterdi. İstatistiksel analiz Tukey'nın birden fazla karşılaştırma testi, p ile ardından bir tek yönlü ANOVA kullanarak gerçekleştirildiği &#60; 0,05 istatistiksel olarak anlamlı sayılır. Örnek boyutu grubu başına 9 redox göstergesi tahlil için ve 39 kantitatif floresan görüntüleme analizi için toplamı.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55618/55618fig3.jpg"> 
Şekil 3 : Redoks göstergesi tahlil veriler zaman tabii gösteren hücre canlılığı şok dalgası maruz kaldıktan sonra. Önemli ölçüde daha az sayıda hücre grubunda tedavi edilmezse denetimine göre 127-kPa şok dalgası maruz 24 saat sonra tespit edildi. %2 30-s tedaviyle oluşan negatif kontrol dezenfektan T0 ve 24 h diğer gruplara göre önemli ölçüde daha az hücreleri gösterdi (tablo malzemeleri görmek). Her çubuk 1 ortalama ± standart sapma (SD); temsil eder. biyolojik çoğaltır, N = 3; Teknik çoğaltır, n = 3. p = &#60; 0,0001. * p = &#60; 0,05. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55618/55618fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55618/55618fig4.jpg"> 
Şekil 4 : Floresan görüntüleme. (A)nicel veriler 24 saat sonrası şok dalgası pozlama floresan mikroskop kullanarak yakalanan canlı ve ölü hücrelerin floresan görüntülerden toplandı. Önemli ölçüde daha az hücrelerin 127 kPa gözlendi (demek 93.42 =) şok dalgası maruz örnek 47 kPa karşılaştırıldığında (demek 98.18 =), 72 kPa (demek 98.87 =) ve kontrol grupları (yani 99.10 =). Hiçbir hücrelerin negatif kontrol grubu 24 saat sonra tespit edildi (yani = 0). (B) temsilcisi Floresans görüntüler. Kırmızı ölü hücreleri gösterir iken yeşil canlı hücreleri gösterir. Her kutu arsa Tukey bıyık ile alt ve üst Dörttebirlikler gösterir; biyolojik çoğaltır, N = 3; Teknik çoğaltır, n = 13. p = &#60; 0,0001. Ölçek çubuğu 300 µm. = <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55618/55618fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Evaluating Primary Blast Effects In Vitro at JoVE.com

Evaluating Primary Blast Effects In Vitro

Nasıl hücreleri tarafından şok dalgalarıyla modüle anlama gelen patlama olayları tetikleyen yaralanmaları arkasında mekanizmaları belirlemenize yardımcı olabilir. Bu iletişim kuralı özel olarak oluşturulmuş şok tüpü ekipman hücre monolayers için şok dalgaları baskıların bir mesafeden uygulamak ve hücre canlılığı üzerinde sonraki etkileri tanımlamak için kullanır.

Değerlendirirken birincil patlama efektleri Vitro

Exposure to blast events can cause severe trauma to vital organs such as the lungs, ears, and brain. Understanding the mechanisms behind such ...

evaluating-primary-blast-effects-in-vitro

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Evaluating Primary Blast Effects In Vitro

7.9K Görüntüleme.  Imperial College London. Nasıl hücreleri tarafından şok dalgalarıyla modüle anlama gelen patlama olayları tetikleyen yaralanmaları arkasında mekanizmaları belirlemenize yardımcı olabilir. Bu iletişim kuralı özel olarak oluşturulmuş şok tüpü ekipman hücre monolayers için şok dalgaları baskıların bir mesafeden uygulamak ve hücre canlılığı üzerinde sonraki etkileri tanımlamak için kullanır.

Video: Evaluating Primary Blast Effects In Vitro

Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro

We have developed a microfluidic device that mimics the delivery and systemic clearance of drugs to heterogeneous three-dimensional tumor tissues in vitro. Nutrients delivered by vasculature fail to reach all parts of tumors, giving rise to heterogeneous microenvironments consisting of viable, quiescent and necrotic cell types. Many cancer drugs fail to effectively penetrate and treat all types of cells because of this heterogeneity. Monolayers of cancer cells do not mimic this heterogeneity, making it difficult to test cancer drugs with a suitable in vitro model. Our microfluidic devices were fabricated out of PDMS using soft lithography. Multicellular tumor spheroids, formed by the hanging drop method, were inserted and constrained into rectangular chambers on the device and maintained with continuous medium perfusion on one side. The rectangular shape of chambers on the device created linear gradients within tissue. Fluorescent stains were used to quantify the variability in apoptosis within tissue. Tumors on the device were treated with the fluorescent chemotherapeutic drug doxorubicin, time-lapse microscopy was used to monitor its diffusion into tissue, and the effective diffusion coefficient was estimated. The hanging drop method allowed quick formation of uniform spheroids from several cancer cell lines. The device enabled growth of spheroids for up to 3 days. Cells in proximity of flowing medium were minimally apoptotic and those far from the channel were more apoptotic, thereby accurately mimicking regions in tumors adjacent to blood vessels. The estimated value of the doxorubicin diffusion coefficient agreed with a previously reported value in human breast cancer. Because the penetration and retention of drugs in solid tumors affects their efficacy, we believe that this device is an important tool in understanding the behavior of drugs, and developing new cancer therapeutics.

Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro

We present the procedure for fabrication and operation of a microfluidic device that recreates heterogeneous tumor microenvironments in vitro. The variability in apoptosis within tumor tissue was quantified using fluorescent stains and the effective diffusion coefficient of the chemotherapeutic drug doxorubicin into tumor tissue was evaluated.

Bir Tümör Mikroçevre yeniden oluşturmak için mikroakışkan Cihazı<em&gt; In vitro</em

We have developed a microfluidic device that mimics the delivery and systemic clearance of drugs to heterogeneous three-dimensional tumor tissues in ...

Biyomühendislik

Low Molecular Weight Protein Enrichment on Mesoporous Silica Thin Films for Biomarker Discovery

The identification of circulating biomarkers holds great potential for non invasive approaches in early diagnosis and prognosis, as well as for the monitoring of therapeutic efficiency.1-3 The circulating low molecular weight proteome (LMWP) composed of small proteins shed from tissues and cells or peptide fragments derived from the proteolytic degradation of larger proteins, has been associated with the pathological condition in patients and likely reflects the state of disease.4,5 Despite these potential clinical applications, the use of Mass Spectrometry (MS) to profile the LMWP from biological fluids has proven to be very challenging due to the large dynamic range of protein and peptide concentrations in serum.6 Without sample pre-treatment, some of the more highly abundant proteins obscure the detection of low-abundance species in serum/plasma. Current proteomic-based approaches, such as two-dimensional polyacrylamide gel-electrophoresis (2D-PAGE) and shotgun proteomics methods are labor-intensive, low throughput and offer limited suitability for clinical applications.7-9 Therefore, a more effective strategy is needed to isolate LMWP from blood and allow the high throughput screening of clinical samples. 
Here, we present a fast, efficient and reliable multi-fractionation system based on mesoporous silica chips to specifically target and enrich LMWP.10,11 Mesoporous silica (MPS) thin films with tunable features at the nanoscale were fabricated using the triblock copolymer template pathway. Using different polymer templates and polymer concentrations in the precursor solution, various pore size distributions, pore structures, connectivity and surface properties were determined and applied for selective recovery of low mass proteins. The selective parsing of the enriched peptides into different subclasses according to their physicochemical properties will enhance the efficiency of recovery and detection of low abundance species. In combination with mass spectrometry and statistic analysis, we demonstrated the correlation between the nanophase characteristics of the mesoporous silica thin films and the specificity and efficacy of low mass proteome harvesting. The results presented herein reveal the potential of the nanotechnology-based technology to provide a powerful alternative to conventional methods for LMWP harvesting from complex biological fluids. Because of the ability to tune the material properties, the capability for low-cost production, the simplicity and rapidity of sample collection, and the greatly reduced sample requirements for analysis, this novel nanotechnology will substantially impact the field of proteomic biomarker research and clinical proteomic assessment.

We developed a technology based on mesoporous silica thin film for the selective recovery of low molecular weight proteins and peptides from human serum. The physico-chemical properties of our mesoporous chips were finely tuned to provide substantial control in peptide enrichment and consequently profile the serum proteome for diagnostic purposes.

Biyomarker Discovery için Mezogözenekli Silika İnce Filmler üzerine düşük molekül ağırlıklı Protein Zenginleştirme

The identification of circulating biomarkers holds great potential for non invasive approaches in early diagnosis and prognosis, as well as for the ...

Harvesting Murine Alveolar Macrophages and Evaluating Cellular Activation Induced by Polyanhydride Nanoparticles

Biodegradable nanoparticles have emerged as a versatile platform for the design and implementation of new intranasal vaccines against respiratory infectious diseases. Specifically, polyanhydride nanoparticles composed of the aliphatic sebacic acid (SA), the aromatic 1,6-bis(p-carboxyphenoxy)hexane (CPH), or the amphiphilic 1,8-bis(p-carboxyphenoxy)-3,6-dioxaoctane (CPTEG) display unique bulk and surface erosion kinetics1,2 and can be exploited to slowly release functional biomolecules (e.g., protein antigens, immunoglobulins, etc.) in vivo3,4,5. These nanoparticles also possess intrinsic adjuvant activity, making them an excellent choice for a vaccine delivery platform6,7,8.
	In order to elucidate the mechanisms governing the activation of innate immunity following intranasal mucosal vaccination, one must evaluate the molecular and cellular responses of the antigen presenting cells (APCs) responsible for initiating immune responses. Dendritic cells are the principal APCs found in conducting airways, while alveolar macrophages (AM&#632;) predominate in the lung parenchyma9,10,11. AM&#632; are highly efficient in clearing the lungs of microbial pathogens and cell debris12,13. In addition, this cell type plays a valuable role in the transport of microbial antigens to the draining lymph nodes, which is an important first step in the initiation of an adaptive immune response9. AM&#632; also express elevated levels of innate pattern recognition and scavenger receptors, secrete pro-inflammatory mediators, and prime na&iuml;ve T cells12,14. A relatively pure population of AM&#632; (e.g., greater than 80%) can easily be obtained via lung lavage for study in the laboratory. Resident AM&#632; harvested from immune competent animals provide a representative phenotype of the macrophages that will encounter the particle-based vaccine in vivo. Herein, we describe the protocols used to harvest and culture AM&#632; from mice and examine the activation phenotype of the macrophages following treatment with polyanhydride nanoparticles in vitro.

Herein, we describe protocols for harvesting murine alveolar macrophages, which are resident innate immune cells in the lung, and examining their activation in response to co-culture with polyanhydride nanoparticles.

Polianhidrid Nanopartiküller Bağlı Mürin Alveoler Makrofajlar Hasat ve Değerlendirme Hücresel Etkinleştirme

Biodegradable nanoparticles have emerged as a  versatile platform for the design and implementation of new intranasal vaccines  against respiratory ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and accurate assessment of ocular toxicity in man are needed. To address this need, we have developed an eye irritation test (EIT) which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model that is based on normal human cells. The EIT is able to separate ocular&#160;irritants and corrosives (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category). The test utilizes two separate protocols, one designed for liquid chemicals and a second, similar protocol for solid test articles. The EIT prediction model uses a single exposure period (30 min for liquids, 6 hr for solids) and a single tissue viability cut-off (60.0% as determined by the MTT assay). Based on the results for 83 chemicals (44 liquids and 39 solids) EIT achieved 95.5/68.2/ and 81.8% sensitivity/specificity and accuracy (SS&#38;A) for liquids, 100.0/68.4/ and 84.6% SS&#38;A for solids, and 97.6/68.3/ and 83.1% for overall SS&#38;A. The EIT will contribute significantly to classifying the ocular irritation potential of a wide range of liquid and solid chemicals without the use of animals to meet regulatory testing requirements. The EpiOcular EIT method was implemented in 2015 into the OECD Test Guidelines as TG 492.

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

We have developed an eye irritation test which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model. The test is able to discriminate between ocular irritant and corrosive materials (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category).

Yeniden İnşa İnsan Kornea gibi Epitelyal (RHCE) Doku Modeli kullanılarak Göz tahriş Kimyasalların Tehlike Tanımlaması Göz tahrişi Testi (EIT)

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of (indirect) in vitro experiments, but none of these is as comprehensive as microfluidic flow chambers. In this protocol, the reconstitution of thrombocytopenic fresh blood with stored blood bank platelets is used to simulate platelet transfusion. Next, the reconstituted sample is perfused in microfluidic flow chambers which mimic hemostasis on exposed subendothelial matrix proteins. Effects of blood donation, transport, component separation, storage and pathogen inactivation can be measured in paired experimental designs. This allows reliable comparison of the impact every manipulation in blood component preparation has on hemostasis. Our results demonstrate the impact of temperature cycling, shear rates, platelet concentration and storage duration on platelet function. In conclusion, this protocol analyzes the function of blood bank platelets and this ultimately aids in optimization of the processing chain including phlebotomy, transport, component preparation, storage and transfusion.

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Platelet transfusion and hemostasis was modeled using blood reconstitution and microfluidic flow chambers to investigate the function of blood banking platelets. The data demonstrate the consequences of platelet storage lesion on hemostasis, in vitro.

Mikroakışkan Akış Chambers Hemostaz ve Trombosit Transfüzyon Model Sulandırılarak Kan kullanma<em&gt; İn Vitro</em

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of ...

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

Despite the regenerative capacity of skeletal muscle, permanent functional and/or cosmetic deficits (e.g., volumetric muscle loss (VML) resulting from traumatic injury, disease and various congenital, genetic and acquired conditions are quite common. Tissue engineering and regenerative medicine technologies have enormous potential to provide a therapeutic solution. However, utilization of biologically relevant animal models in combination with longitudinal assessments of pertinent functional measures are critical to the development of improved regenerative therapeutics for treatment of VML-like injuries. In that regard, a commercial muscle lever system can be used to measure length, tension, force and velocity parameters in skeletal muscle. We used this system, in conjunction with a high power, bi-phase stimulator, to measure in vivo force production in response to activation of the anterior crural compartment of the rat hindlimb. We have previously used this equipment to assess the functional impact of VML injury on the tibialis anterior (TA) muscle, as well as the extent of functional recovery following treatment of the injured TA muscle with our tissue engineered muscle repair (TEMR) technology. For such studies, the left foot of an anaesthetized rat is securely anchored to a footplate linked to a servomotor, and the common peroneal nerve is stimulated by two percutaneous needle electrodes to elicit muscle contraction and dorsiflexion of the foot. The peroneal nerve stimulation-induced muscle contraction is measured over a range of stimulation frequencies (1-200 Hz), to ensure an eventual plateau in force production that allows for an accurate determination of peak tetanic force. In addition to evaluation of the extent of VML injury as well as the degree of functional recovery following treatment, this methodology can be easily applied to study diverse aspects of muscle physiology and pathophysiology. Such an approach should assist with the more rational development of improved therapeutics for muscle repair and regeneration.

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

We describe an in vivo protocol to measure dorsiflexion of the foot following stimulation of the peroneal nerve and contraction of the anterior crural compartment of the rat hindlimb. Such measurements are an indispensable translational tool for evaluating skeletal muscle pathology and tissue engineering approaches to muscle repair and regeneration.

Uygulamaları<em&gt; İn Vivo</em&gt; Doku değerlendirilmesi için Rat Tibialis Anterior Fonksiyonel Test İskelet Kası Onarım Engineered

Despite the regenerative capacity of skeletal muscle, permanent functional and/or cosmetic deficits (e.g., volumetric muscle loss (VML) resulting from ...

A Microfluidic Flow Chamber Model for Platelet Transfusion and Hemostasis Measures Platelet Deposition and Fibrin Formation in Real-time

Microfluidic models of hemostasis assess platelet function under conditions of hydrodynamic shear, but in the presence of anticoagulants, this analysis is restricted to platelet deposition only. The intricate relationship between Ca2+-dependent coagulation and platelet function requires careful and controlled recalcification of blood prior to analysis. Our setup uses a Y-shaped mixing channel, which supplies concentrated Ca2+/Mg2+ buffer to flowing blood just prior to perfusion, enabling rapid recalcification without sample stasis. A ten-fold difference in flow velocity between both reservoirs minimizes dilution. The recalcified blood is then perfused in a collagen-coated analysis chamber, and differential labeling permits real-time imaging of both platelet and fibrin deposition using fluorescence video microscopy. The system uses only commercially available tools, increasing the chances of standardization. Reconstitution of thrombocytopenic blood with platelets from banked concentrates furthermore models platelet transfusion, proving its use in this research domain. Exemplary data demonstrated that coagulation onset and fibrin deposition were linearly dependent on the platelet concentration, confirming the relationship between primary and secondary hemostasis in our model. In a timeframe of 16 perfusion min, contact activation did not take place, despite recalcification to normal Ca2+ and Mg2+ levels. When coagulation factor XIIa was inhibited by corn trypsin inhibitor, this time frame was even longer, indicating a considerable dynamic range in which the changes in the procoagulant nature of the platelets can be assessed. Co-immobilization of tissue factor with collagen significantly reduced the time to onset of coagulation, but not its rate. The option to study the tissue factor and/or the contact pathway increases the versatility and utility of the assay.

This paper describes an experimental model of hemostasis that simultaneously measures platelet function and coagulation. Platelet and fibrin fluorescence is measured in real-time, and platelet adhesion rate, coagulation rate, and onset of coagulation are determined. The model is used to determine platelet procoagulant properties under flow in concentrates for transfusion.

Trombosit Transfüzyon ve Hemostaz için bir mikroakışkan Akış Odası Modeli Gerçek zamanlı Trombosit Birikimi ve Fibrin oluşumu Tedbirleri

Microfluidic models of hemostasis assess platelet function under conditions of hydrodynamic shear, but in the presence of anticoagulants, this analysis is ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and dampen loads in the spine. The IVD consists of a proteoglycan-rich nucleus pulposus (NP) and a collagen-rich annulus fibrosis (AF) sandwiched by cartilaginous end-plates. Together with the adjacent vertebrae, the vertebrae-IVD structure forms a functional spine unit (FSU). These microstructures contain unique cell types as well as unique extracellular matrices. Whole organ culture of the FSU preserves the native extracellular matrix, cell differentiation phenotypes, and cellular-matrix interactions. Thus, organ culture techniques are particularly useful for investigating the complex biological mechanisms of the IVD. Here, we describe a high-throughput approach for culturing whole lumbar mouse FSUs that provides an ideal platform for studying disease mechanisms and therapies for the IVD. Furthermore, we describe several applications that utilize this organ culture method to conduct further studies including contrast-enhanced microCT imaging and three-dimensional high-resolution finite element modeling of the IVD.

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Whole organ culture of the intervertebral disc (IVD) preserves the native extracellular matrix, cell phenotypes, and cellular-matrix interactions. Here we describe an IVD culture system using mouse lumbar and caudal IVDs in their functional spinal units and several applications utilizing this system.

bir<em&gt; İn Vitro</emKemirgen İntervertebral Disk&gt; Organ Kültürü Modeli

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

In the central nervous system, numerous acute injuries and neurodegenerative disorders, as well as implanted devices or biomaterials engineered to enhance function result in the same outcome: excess inflammation leads to gliosis, cytotoxicity, and/or formation of a glial scar that collectively exacerbate injury or prevent healthy recovery. With the intent of creating a system to model glial scar formation and study inflammatory processes, we have generated a 3D cell scaffold capable of housing primary cultured glial cells: microglia that regulate the foreign body response and initiate the inflammatory event, astrocytes that respond to form a fibrous scar, and oligodendrocytes that are typically vulnerable to inflammatory injury. The present work provides a detailed step-by-step method for the fabrication, culture, and microscopic characterization of a hyaluronic acid-based 3D hydrogel scaffold with encapsulated rat brain-derived glial cells. Further, protocols for characterization of cell encapsulation and the hydrogel scaffold by confocal immunofluorescence and scanning electron microscopy are demonstrated, as well as the capacity to modify the scaffold with bioactive substrates, with incorporation of a commercial basal lamina mixture to improved cell integration.

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

Herein, we present a protocol for the 3D culture of rat brain-derived glia cells, including astrocytes, microglia, and oligodendrocytes. We demonstrate primary cell culture, methacrylated hyaluronic acid (HAMA) hydrogel synthesis, HAMAphoto-polymerization and cell encapsulation, and sample processing for confocal and scanning electron microscopic imaging.

Geliştirilmiş 3D hidrojel Neuroinflammation Vitro modelleme için birincil gliyal hücreler kültürleri

In the central nervous system, numerous acute injuries and neurodegenerative disorders, as well as implanted devices or biomaterials engineered to enhance ...

Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart

The hemodynamic forces experienced by the heart influence cardiac development, especially trabeculation, which forms a network of branching outgrowths from the myocardium. Genetic program defects in the Notch signaling cascade are involved in ventricular defects such as Left Ventricular Non-Compaction Cardiomyopathy or Hypoplastic Left Heart Syndrome. Using this protocol, it can be determined that shear stress driven trabeculation and Notch signaling are related to one another. Using Light-sheet Fluorescence Microscopy, visualization of the developing zebrafish heart was possible. In this manuscript, it was assessed whether hemodynamic forces modulate the initiation of trabeculation via Notch signaling and thus, influence contractile function occurs. For qualitative and quantitative shear stress analysis, 4-D (3-D+time) images were acquired during zebrafish cardiac morphogenesis, and integrated light-sheet fluorescence microscopy with 4-D synchronization captured the ventricular motion. Blood viscosity was reduced via gata1a-morpholino oligonucleotides (MO) micro-injection to decrease shear stress, thereby, down-regulating Notch signaling and attenuating trabeculation. Co-injection of Nrg1 mRNA with gata1a MO rescued Notch-related genes to restore trabeculation. To confirm shear stress driven Notch signaling influences trabeculation, cardiomyocyte contraction was further arrested via tnnt2a-MO to reduce hemodynamic forces, thereby, down-regulating Notch target genes to develop a non-trabeculated myocardium. Finally, corroboration of the expression patterns of shear stress-responsive Notch genes was conducted by subjecting endothelial cells to pulsatile flow. Thus, the 4-D light-sheet microscopy uncovered hemodynamic forces underlying Notch signaling and trabeculation with clinical relevance to non-compaction cardiomyopathy.

Here, we present a protocol to visualize developing hearts in zebrafish in 4-Dimensions (4-D). 4-D imaging, via light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), takes 3-Dimensional (3-D) images over time, to reconstruct developing hearts. We show qualitatively and quantitatively that shear stress activates endocardial Notch signaling during chamber development, which promotes cardiac trabeculation.

Yamultma stres gelişmekte olan zebra balığı kalp oransal etkileri 4 boyutlu görüntülerini yakalamak için ışık sayfalık floresans mikroskobu

The hemodynamic forces experienced by the heart influence cardiac development, especially trabeculation, which forms a network of branching outgrowths ...