スペースの不足は、我々 はほとんどレビュー記事を引用し、その元作品が引用された私たちの同僚に申し訳。仮想研究所の仕事は、仮想に BSF、バード、米国農務省/NIFA NSF NIH からの補助金によってサポートされ、S.G.L. 研究所 NIH と S.G.L. に植物微生物学植物病理学の部門からの資金でサポートされて

1. 植物材料
<ol><li>植物の選択</li>
	<li>関心、すなわち、内因性のタンパク質のこのタンパク質をエンコード、またはウイルス蛋白質の病原体の自然宿主を表す 1 つの蛋白質へのネイティブ植物種を使用します。さらに、選択した植物種は選択した一過性形質転換法に従う必要があります。 注: 研究日常的に採用ベンサミアーナ タバコ、TMV の良いホストを表しますし、アグロバクテリウム形質転換技術、すなわち、agroinfiltration によって効率的に変換されます (手順 3 を参照)。(名) 形質転換植物はまた容易に育つ、アグロバクテリウムを簡単に接種され、共焦点顕微鏡を用いて簡単に大型の葉を持っています。</li>
	<li>
植物の成長
	<ol>
<li>高密度でぬれた土で(名) ベンサミアーナ種子を植物します。20-25 ° C ~ 75 µmol 光子 m-2の-1での光の下で 16 時間と闇の 8 h で環境試験室でそれらを保ちます。Euphyll の直径は、0.5 cm に達した後慎重に大きいポットに苗を転送し、同じ条件下で同じ部屋で成長を続けます。</li>
		<li>4 週間に最大葉がでは、直径 4-6 cm 以内 4 8 葉期になるまでの植物を維持します。この時、彼らは、agroinfiltration を使用できます (手順 3 を参照)。 注: 重要なは、決して植物を使用、彼らは花のため、この発達の段階で葉アーキテクチャ ステッピング24,25、時々 矛盾した結果につながるようになった場合。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 発現用ベクター構築
<ol><li>
発現系の選択
	<ol>
<li>式システム、すなわちベクトル、ベクトル配信方法、植物研究の興味の蛋白質の表現に最適なを選択します。 注: 時折、テスト蛋白質/植物の種のような特定の組み合わせ可能性があります特定のベクトルを必要として最適な表現と興味の蛋白質の機能の配信方法をベクトルします。最も双子葉植物でただし、表現のベクトルおよび配信システムとして agroinfiltration としてバイナリ プラスミドを選択します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
タンパク質蛍光タグ
	<ol>
<li>蛍光タグの各表現された蛋白質細胞内分布の22、Pd などの分析のため。 注: CFP、DsRed2 などの蛍光タンパク質をタグとして採用。CFP とテスト蛋白質のタグは、無料 DsRed2 と coexpress。CFP 機能タグとウイルス関連のない貨物分子の両方。一過性発現の全体的な効率を調整する DsRed2 機能、それは最初に変換されたセルを識別するために、セル自律この後者の機能は、可能性のある非-セル-自律テストされた蛋白質の細胞間移動を評価する際に重要です。また細胞自律的である、PDCB1、Pd マーカーとの共発現の CFP と DsRed2 と PDCB1 テスト蛋白質をタグします。</li>
		<li>親指のルールとして発現蛋白のカルボキシル末端を蛍光タグを融合します。ただし、Pd をターゲットしてタグ付きのフルレングス テスト蛋白質展示が侵害された場合は、タンパク質のアミノ末端にタグを転送します。</li>
		<li>適した植物発現ベクターにテストする蛋白質のコード配列のクローンを作成します。 注: 蛍光タグ付けを許可する多くの異なった植物発現ベクターがあります。我々 は pSAT プラスミド26のシリーズやアミノ酸の両方に推奨されるタグ (2.2.1 の手順を参照してください) フレーム内で直接興味のシーケンスのクローニングのために適している、誘導体27,28のいくつかを使用- とカルボキシル基末端方向。</li>
		<li>アグロバクテリウム バイナリ ベクトルに各式カセットを転送します。 注: pSAT ベースの構成が agroinfiltration、植物の組織に直接 biolistic 配信に適したは変換メソッド (手順 3 を参照)、ここで推奨されている必要があります T DNA の間に位置する式カセットバイナリのボーダーはベクトル29をです。 注: すべての pSAT ベクトル私 CeuI-SceI、から珍しい切削核酸アスキーを使用してクローン作成シングル ステップで pPZP RCS2 多重遺伝子発現ベクター26,30このような転送を許可する設計されています PI PspI と PI TliI26. 研究者 recombinatorial のクローンを活用することを好むなど、異種loxサイト31を使用して pSAT ベクトル変形26,27を使用できます。</li>
		<li>共発現、両方式カセットを転送、例えば、テスト蛋白質 CFP DsRed2 またはテスト蛋白質 CFP と PDCB1 DsRed2 (参照ステップ 2.1)、同じ pPZP RCS2 バイナリ ベクトルに。 注: また、アグロバクテリウム文化の個々 のバイナリ構造をかくまっていることが一緒に混合する(名) ベンサミアーナ浸潤の (ステップ 3.1 参照)。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Agroinfiltration
<ol><li>
アグロバクテリウムひずみ EHA105 または GV3101 として記述されている32の有能なセルのステップ 2.2.5 に 100 μ L の文化からの pPZP ベース RCS2 プラスミド 1 μ g を追加、氷上で 30 分間インキュベート、1 分の液体窒素で急速凍結し、15 分の 28 ° C の孵化させなさい。
	<ol>
<li>その後、有能なセルの混合物に 1 mL の LB 培地 (10 g/L トリプトン、5 グラム/L の酵母エキスと 10 g/L の NaCl) を追加 2, スピン 1 分 3,000 × g で細胞を 28 ° C で孵化させなさい、再 0.2 mL の lb にそれらを中断、それらを (例えば、100 mg/L スペクチノマイシン、ベクトルの pPZP ベース RSC226,3050 mg/L リファンピシン) 適切な抗生物質を添加した LB 寒天プレート。個々 のコロニーが表示されるまで 48 時間 28 ° C で成長します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ピックアップし、新鮮な LB 寒天培地プレート上にいくつかの個々 のコロニーをプレート (ステップ 3.1 を参照)、48 h、28 ° C で成長し、コロニー PCR33特定のバイナリ構造の存在を確認する分析のための細菌の少量を取る。</li>
	<li>
(手順 3.1.1 参照) 適切な抗生物質を添加した LB 培地 5 mL に 28 ° C で一晩関心の構築と各アグロバクテリウム コロニーを成長します。3,000 × g で細胞を遠心し、再外径600それらを一時停止 = 0.5 agroinfiltration バッファー (10 mM MgCl2、10 mM MES (pH 5.6)、150 μ M の acetosyringone)。2 時間室温で孵化させなさい。
	<ol>
<li>タンパク質の共発現の単一の多重遺伝子発現プラスミドではなくバイナリ プラスミドの混合物を使用している場合は、浸透する前に 1:1 v/v 比で対応する細胞培養をミックスします。その後、2 h 28 ° C でセルを孵化させなさい。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
完全に成熟した(名) ベンサミアーナの下 (裏面) 表皮に対して注射器 (針なし) のノズルの葉 1 mL プラスチック注射器押しに接種をロードします。手袋をはめた指で葉を向軸面34,35にしがみつきます。
	<ol>
<li>低速注入による浸透中アグロバクテリウムをご紹介します。統計的な有意性、それぞれの植物の葉をいくつかに潜入します。 注意: 彼らは一貫性のある表現のレベルを得られないよう古い葉に使用されないこと。</li>
		<li>すべての葉原を接種します。前述のステップ 1.2 観測まで浸透した植物を維持します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 共焦点顕微鏡
<ol><li>静脈間のフラグメントに各葉をカットする刃を使用して (に応じて特定のテストされたタンパク質の一過性発現の効率); 浸潤後 24-48 h各組織スライスのサイズは、スライスは顕微鏡用カバーガラス (22 mm × 40 mm) で完全に覆われているようなことをする必要があります。</li>
	<li>場所オブジェクトの葉片スライド、米粒葉面葉スライスに水の滴を配置、カバーガラスでそれをカバーします。それぞれの側にテープの小片とカバーガラスを固定します。</li>
	<li>
レーザー共焦点顕微鏡の下 agroinfiltrated の組織を観察し、結果の画像を記録します。
	<ol>
<li>まず、10 X 対物レンズを使用して信号の細胞を特定しより詳細な観測のため 63 x 対物レンズを使用します。</li>
		<li>CFP と 543 を励起するアルゴン イオン レーザーから使用、458 nm 波長 nm DsRed2 を刺激します。画像の獲得、すなわち、レーザー強度と実験間の光電子増倍管 (PMT) 設定のすべての設定を保持します。平均では、実験条件ごとに 100-120 細胞を検査します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>5 の同定 PLS
<ol><li>共焦点顕微鏡 (セクション 4) を使用してテストされた蛋白質の局在を診断します。テスト蛋白質に特徴的な末梢点状パターン ・25,36,37,38,39,40,41かどうかに、colocalizes をチェックします。Pd マーカー PDCB123。これは、テスト対象のタンパク質が最も可能性の高い PLS シーケンスに含まれていることを示します。</li>
	<li>テスト蛋白質の PLS の活動の確認は徐々 により小さいフラグメント、autofluorescently、(例えばCFP、) にそのオープンリーディング フレーム (ORF) (genbank 受入番号 BAF93925.1) を分割した後、それぞれのタグし、分析、内局の手順 4 に記載されています。当初は、細分化されたフラグメントごとに 100 アミノ酸残基のサイズをお勧めします。</li>
	<li>切り捨てられたフラグメントを PLS の活動があるし、まだ Pd に局在する最小フラグメントまで前述の手順 4 で、内局をチェックをさらに細分化、すなわち蛍光タグ貨物を輸送するのに十分です。Pd には識別されます。このフラグメントは、PLS のシーケンスを表すと推定されます。</li>
	<li>蛍光タグに推定 PLS なしテスト蛋白質の残りの部分を実物大のテスト蛋白質、すなわちヒューズから推定 PLS を削除し、手順で説明するように結果変異体タンパク質の細胞内局在を決定4. 推定 PLS を欠いているが、この変異タンパク質が Pd に合わせてローカライズする失敗した場合特定 PLS ではないことだけ十分な (を参照してくださいステップ 5.3)、テスト蛋白質の Pd 輸送にも必要なが、これがわかります。</li>
	<li>Agroinfiltrate の PLS の CFP タグし、無料 DsRed2 (ステップ 3.3 を参照) 式をかくまっているアグロバクテリウム文化の混合物と葉を構築します。10 ステップ 4.3 と同じ設定を使用して倍の対物レンズを用いた共焦点顕微鏡浸潤組織を観察します。</li>
	<li>細胞初期浸潤細胞と CFP と DsRed2 の両方の信号が含まれて、その展示運動と CFP 信号のみを含まれている隣接するセルのスコアを獲得します。 注: この手順を調べその潜在的な細胞間移動能力の識別された PLSこれ Pd (含むほとんどの植物ウイルスの MPs) を対象とする多くの蛋白質はまた隣接セルに Pd を移動するためです。アグロバクテリウムの浸透のために使用の濃度はそれぞれ異なる構造の発現効率に依存します。Agroinfiltration の確実に変形されてないセルを残し、単一のセルの変換 (i)、(ii) 式のような効率を実現する細胞文化希釈を使用することを確認します。たとえば、我々 の実験はそれぞれ外径600 0.01 と CFP タグ PLS の無料 DsRed2 式の 0.005 を利用します。</li>
</ol>6. アラニン スキャン42を使用して残基キー PLS の同定
<ol><li>標準 PCR のプロトコルを使用して、望ましい突然変異、すなわちアラニン、各プライマーの中央部の周りにターゲットのアミノ酸残基の置換が含まれて説明するように設計したプライマーのペアを用いたシーケンスを符号化 PLSを増幅するには21. プライマー設計や製造元の指示に従ってサイト指示された突然変異誘発用サイト指示された突然変異誘発キットを運ぶ。</li>
	<li>任意標準 DNA 精製キットを使用して結果 PCR の製品の浄化し、保護者による制限をなくす DpnI 37 ° C にそれらを消化 (すなわち、非変異) メチル化と hemimethylated DNA。(氷) ではなく室温で 5 分間これをクールダウンします。エシェリヒア属大腸菌の有能なセル43, 混合物に直接変換し、ステップ 3.2 で説明されているように目的の突然変異体の構造に植民地を識別します。</li>
	<li>2.2.4 の手順で説明するようバイナリのベクトルに突然変異体の構造を導入、手順 3 で説明されているように、agroinfiltration を実行、Pd ターゲットに前述の手順 4 で 5.1 を評価します。</li>
</ol>

利害の対立が宣言されていません。

このプロトコルは 4 つのコア成分: が必要であり、Pd、興味の蛋白質のフラグメントの長さは、徐々 に小さく分割体系的なテストの融合へ十分なシーケンスを識別する概念フラグメントとしても役立つタグとして高分子貨物と Pd が生活の中でターゲット機能試金される蛋白質を植物の次のテストの融合タンパク質の一過性発現組織。一過性発現のアグロバクテリウム仲介されたがの時間、すなわち数日間、類似の研究15でよく使用される遺伝子組換え植物の生産に必要な数ヶ月に比べて比較的短い期間内にデータを生成することに注意してください。
共発現細胞内局在性マーカーと興味の蛋白質の例えば、PDCB1 または無料 DsRed2 通常が行われる多重遺伝子発現ベクターから。ただし、1 つのベクトルへのいくつかの式のカセットの転送が技術的に問題がある場合、共発現も行える液体文化の同等のボリュームを組み合わせることにより、各カセットを転送する別のバイナリ構造に、agroinfiltration の結果として得られるアグロバクテリウム菌株。このプロトコルは、一過性発現を利用するためのバイナリのベクトルは必要が彼らの存在は、発現効率に悪影響ではないものの安定した変換の選択マーカーに運ばない。
このプロトコルは蛋白質の表現のために最適化された、 (名) ベンサミアーナ; のターゲットただし、シロイヌナズナ45,46, アグロバクテリウムによる形質転換に従順を含む他の植物種に使用できます。他の植物種の場合それ以外の場合、このプロトコルは biolistic 配信41式カセットをバイナリのベクトルに転送する必要がある、pSAT ベースのベクトルから直接一過性発現を利用する合わせることができるか。
このプロトコルの重要なポイントは、植物材料の一貫性のある生理学条件です。具体的には、すべての植物は全体の実験を通して、健康である必要があり、agroinfiltration の(名) 形質転換植物を 4 週間未満にする必要があります古いものと最大の葉は直径 4-6 cm と 4 8 葉期で。植物が若すぎる、agroinfiltration の効果は厳しすぎる、タグ付きタンパク質の発現や局在を妨げることになります。その一方で、古い植物はしばしば Pd24,25, また Pd ターゲット パターンの一貫性に影響を与える変数のアーキテクチャを展示します。
それでも、全体として植物とその変換された細胞の生理学的条件を特に変化 Pd は、各実験ではターゲットの効率やや異なります。したがって、細胞の比較的大きい数を分析することが重要だ (> 100) 実験につき各実験の少なくとも 3 つの生物学的複製を行い。一般的に、我々 は変換された細胞の少なくとも 70% に Pd 局在が見られる場合はターゲット アクティビティ、Pd を含むテスト フラグメントを検討します。スチューデントの t 検定と p 値によって各フラグメント、例えば、Pd 固有の点状の蓄積パターンを示す変形細胞のパーセントの効率を対象と Pd の違いを分析し、< 0.05 0.01 に対応する、統計的確率 95-99% 以上です。
もう一つの重要な問題は、融合分子の蛍光タグ/貨物の位置です。いくつか Pd ターゲット蛋白質はまた小胞体 (ER) に関連付けるし、この協会は、遮るもののないアミノ末端配列を必要があります。これらの場合、アミノ末端融合、興味の蛋白質のフラグメントのカルボキシル末端が蛍光タグのアミノ末端に溶かされる例えば、CFP または DsRed2、使用してください。タグのこの既定の配置は、次の場合に変更できます。(i) アミノ末端融合が-使用可能なない場合つまり、そうでない意味のある細胞内局在パターンを展示、悪い表現、または蛍光信号の十分な信頼性の高い検出-を生成しない興味の蛋白質の場合、アミノ末端シグナル配列またはカルボキシル基末端融合タグのカルボキシル末端にテストされたフラグメントのアミノ末端が溶かされるが含まれていない、彼らがしようとする必要があります。(興味の蛋白質のカルボキシル末端のシグナル配列が含まれる場合 ii) カルボキシル基末端融合も使用する必要があります。(iii) 興味の蛋白質が GPI アンカー型タンパク質で見られるよう、両方のアミノおよび carboxyl ターミナル信号かアミノ末端のシグナルペプチドが含まれている場合まだそのアミノ末端融合は使えません、タグする必要があります配置されます内部では、(または下流アミノ ターミナル信号のカルボキシル末端シグナルの上流)。タンパク質の蛍光タグの内部にいくつかの有用な方法は、私たち以前の出版物47,48のとおりです。
現時点では、PLS の知られているコンセンサス シーケンスはありません。などの手順で 5.2 をお勧めします、100-200 残基長片連続~の蛋白質に最初に細分化します。これらことができますその後、なります徐々 に短く観測された Pd ターゲット アクティビティまたはその欠如に基づいて。1 つは、他の潜在的なターゲット信号 (例えばNLS、信号ペプチド等) のタンパク質に存在意識するべき。しかし、PLS シーケンスでこのようなシーケンスの潜在的なオーバー ラップは知られている、これらの蛋白質の地域はこの変異の解析に含める必要があります。
ところ、このプロトコルは蛋白質分子21単一 PLS を識別するために使用されました。タンパク質がただし、複数信号シーケンスに含めることができます可能性があります、確かに複数 NLSs GATA 転写因子49を含む多くの核蛋白質で記載されています。したがって、Pd のターゲットのテスト蛋白質のさまざまな断片を分析する際はこのような 1 つ以上のフラグメントが識別し、単独で、あるいは相乗的になる可能性があります複数の PLSs の存在を示すこと。
このプロトコルの主な制限は、一過性の細胞内局在性の可視化 agroinfiltration に続く関心の表現された蛋白質は最高の達成表皮細胞や比較的狭い成長段階です。必要に応じて、この制限は安定して各組織、細胞の種類のほとんどのテストされた蛋白質を表現する遺伝子組換え植物を生産することによって克服できます。また、このプロトコルは、ウイルス MPs または一過性形質転換に従順ではない植物種でのみ機能他の Pd ターゲット蛋白質の研究の役に立たないでしょう。
TMV MP の PLS のためのこの手法を開発、他に PLSs の発見植物ウイルスの MPs、または一時的または永久に、pd、ローカライズ植物内在性タンパク質は使用できます。さらに、適切な細胞内局在マーカー47と組み合わせると、このプロトコルは植物に興味の蛋白質の中で他の多くのターゲット信号の同定に最適です。

原形質 (Pd) は、植物の成長と形態形成、転写因子 mRNA と小さな RNA 分子に至るまでの主調整装置の細胞間輸送のための導管として機能します。さらに、Pd のこの高分子輸送能力を用いてほとんどの植物ウイルスの細胞間伝播感染;具体的に Pd1,2,3,4,5,6にターゲット移行タンパク質 (Mp) と呼ばれる特殊な蛋白質を進化してきた植物ウイルス Pd を通過するには,7. Pd 輸送の分子経路が最も可能性の高いこれらの経路に運ばれたタンパク質を対象とする特定のシーケンスと密接に相互接続されました。したがって、これらの Pd のローカリゼーションのシグナル (PLSs) の識別は、対応する Pd 輸送経路の診断可能性があります。これは Pd 輸送8、類推によって異なる核輸入道に、異なる核局在化信号 (NLS) シーケンス9,10のために特定することができますたとえば。概念的には、NLSs と PLSs は、必要かつ十分な対象は、非分解の細胞内ターゲット シーケンスを表します。ただし、NLSs11とは異なり、シーケンスについては、PLSs は厳しく制限されています。具体的には、Pd をターゲットに関与する唯一の 4 つのタンパク質配列は、内因性の植物タンパク質から派生したそれらのすべての報告されています。最初の 1 つは、KN112 -内側の細胞層から植物葉13の表皮に移動する転写因子-そのノックス同族体14のホメオ ドメインによって表されます。また、2 つ目は、モチーフ15を転写因子、Dof、これは細胞間人身売買 (IT) として記載されている推定 PLS が含まれているからです。3 番目のシーケンス PDLP1 1 原形質常駐型膜タンパク質から、膜貫通ドメイン16によって表されます。最後に、シーケンスをターゲット 4 Pd の一種 (GPI) の報告された最近の固定された蛋白質、それは一種 (GPI) 変更信号17で表されます。
興味深いことに、ごく最近まで PLSs が報告されていないウイルスの MPs のため。以前の研究に植物ウイルス MPs18,19、すなわち、必要と Pd を無関係な貨物分子 (ターゲットに十分な最小限のアミノ酸配列などない真 PLS で推定 PLS シーケンスの存在が示されています。例えば。、CFP) ウイルスの MP で確認されました。まだこれらの蛋白質は、タバコ モザイク ウイルス(TMV) の MP の Pd の局在と輸送が実証20されている最初でした。
このギャップに対処する私たちは TMV MP PLS を識別する実験的戦略を開発しました。この戦略は、3 つの概念に基づいていた。(i) 我々 は必要かつ Pd21に標的蛋白質の十分な最小限アミノ酸として PLS を定義しました。(ii) ため、TMV MP をまず Pd をターゲットからこれらのチャンネル22移行し、これらの 2 つのアクティビティの連結を解くことと、善意の PLS は、Pd がターゲットだけとないため以降のトランスポート機能を識別するを目指した。(iii) は、Pd かどうか、構造的または機能的活動をターゲットに重要なアミノ酸残基の同定された PLS を分析しました。このアプローチを使用すると、我々 を善意の PLS として TMV MP のアミノ末端の 50 アミノ酸残基のシーケンスで区切られました。これは蛋白質の全体の長さを飽和 TMV MP フラグメントのシリーズを生産、CFP と彼らのカルボキシル末端のタグ付け、一過性植物組織でそれらを表現することによって行われました。各テストのフラグメントの Pd ローカリゼーションは、Pd マーカー蛋白質、PDCB1 (Pd カロース結合蛋白質 1)23でそれらを coexpressing によって決定されました。まだ pd、ローカライズが Pd を通過した最小フラグメントは、PLS を表すと考えられていた。最後に、PLS は、その構造や機能に必要な重要なアミノ酸残基を決定するアラニン スキャンでした。
ここで TMV MP PLS の同定を記述することによってこのアプローチを説明、一方それ使用されるかもしれない他の Pd 対象のタンパク質で PLSs を発見する植物病原菌、植物自体をエンコードするかどうかこれは本手法は Pd にターゲットする能力に関してウイルス MPs の固有の機能の利点を取らないので。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1086">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:293px;">Confocal laser scanning microscope (CLSM)</td>
			<td style="width:176px;">Zeiss</td>
			<td style="width:268px;">LSM5</td>
			<td style="width:349px;">Any CLSM with similar capabilities is appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Zen software for confocal microscope imaging</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>2009 version</td>
			<td>The software should be compatible with the CLSM used</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Quickchange II site-directed mutagenesis kit&#160;</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>200523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acetosyringone</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>D134406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MES</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>69892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringes without needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">MgCl2</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>M33-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Spectinomycin&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Rifampicin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R3501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ampicillin&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A0166</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of plasmodesmal localization sequences in proteins in planta

原形質 (Pd) は、小規模および大規模な分子は植物細胞間輸送されるゲートウェイとして機能する細胞間の接続です。生体高分子、このようなタンパク質の細胞間輸送がほとんどの特定ターゲット信号を含むアクティブなメカニズムを介して発生しますイオンと水などの小分子の Pd トランスポートは、受動的に発生すると推定されているに対し、分子を輸送しました。識別された原形質 (Pd) のローカリゼーションのシグナル (PLSs) の希少性蛋白質の並べ替えについて厳しく制限している経路に関与する植物細胞間高分子輸送と通信します。植物の富から Pd は、通過するトラフィックに知られている内因性やウイルスの蛋白質のみ 3 PLSs 報告されているまでに、内因性の植物タンパク質からそれらのすべて。したがって、それは、必要かつ十分な生活の中で直接、Pd のターゲット機能 PLS のシーケンスを識別するために信頼性の高いかつ体系的な実験的戦略を策定する重要な植物細胞。ここでは、私たちはパラダイムとしてタバコ モザイク ウイルス(TMV) の細胞間移行タンパク質 (MP) を使用して 1 つのような戦略をについて説明します。これらの実験は、識別され、最初の特徴は、植物の PLS のウイルス、最も Pd ターゲット蛋白質の PLS シーケンスの発見のために適応することができます。

忠実に記述されていたプロトコルから期待される結果を説明し、TMV MP PLS を識別する、代表的なデータは元らから適応されます。21.図 1 aは最初フルレングス TMV MP (1-268) TMV MP PLS (蛋白 1 50 最初 50 アミノ酸残基から成る) を表現する主要な構造を要約し、CFP (として生成するスキャン V4A 誘導体、アラニンが融合しました。手順 2.2 5.2 および 6 で説明されている) 一方、図 1 bを要約し、これらのタグ付きタンパク質の細胞内局在を定量化します。図 1特性周辺点状 Pd 局在観察されるパターン TMV MP-CFP との TMV MP PLS-CFP 同様 PDCB1 DsRed2 coexpressed Pd マーカーに関してを示しています (ステップ 5.1 を参照してください)。図 2 aは、Pd ターゲットの TMV MP-CFP、TMV MP PLS CFP と核-細胞質内無料 DeRed2 の分布を示しています (ステップ 5.1 を参照してください)。最後に、図 2 bは両方 TMV MP と TMV MP PLS 単一アラニン置換 V4A、この残基が PLS の構造や機能のために重要であることを示すをターゲットに Pd の損失を示しています同じ細胞の PDCB1 はまだ Pd に局在する coexpressed Pd マーカー (手順 6 を参照)。
これらのデータを示す蛋白質のフラグメント、蛍光マーカー貨物蛋白質、融合および Pd に合わせてローカライズする能力のテストの組織的生産のこの概念と技術的に簡単な手順が最小限のタンパク質配列を識別できること必要かつ十分な Pd ターゲット、すなわち、PLS の。知られている Pd 蛋白質、例えば、PDLP または PDCB の家族16,23または植物の 1 つとの共存の実験を行うことが重要ですこれらのローカリゼーション データの正しい解釈は、Pd44 にウイルスの MPs.明らかに、すべてではない P ローカライズ蛋白質同じ Pd に標的になりうるが、Pd マーカー蛋白質の少なくとも 1 つとの共存の統計的に有意な程度は PLS 活動を定義するために必要な完全であるため、共存はありません。
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/55301/55301fig1.jpg"> 図 1: TMV MP の同定 PLS.(A) TMV MP PLS. TMV MP 系列、グリーン ボックスを識別するために使用されるメインの CFP 融合構造の概要CFP、ブルー ボックス。P、プロモーター。T、ターミネーター。左側の数字は、それぞれ TMV MP フラグメントに含まれているアミノ酸残基を示します。(B) (A) に示すように融合蛋白質の細胞内局在化の概要です。Pd のローカリゼーションまたは核ローカリゼーションは、それぞれ対応する細胞マーカー、PDCB1 DsRed2、無料 DsRed2 の局在に基づき決定されました。各局在パターンを示す細胞のパーセンテージが 100 の表現する細胞 3 つの独立実験の構成要素ごとの得点に基づいて表示されます。データは、平均 ± 標準誤差 (SE) です。(C) Pd は Pd マーカー PDCB1 DsRed2、TMV MP PLS-CFP、TMV MP CFP のターゲット。CFP の信号が青ではDsRed2 信号は紫です。色素蛍光は除外されました。画像は、共焦点セクションの一つです。スケール バー = 10 μ m. DIC、微分干渉コントラスト顕微鏡写真。この図は元らから適応21.<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55301/55301fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/55301/55301fig2.jpg"> 図 2: Pd 対象化 TMV MP、TMV MP PLS およびアラニン変異します。(A) TMV MP CFP、TMV MP PLS-CFP と核-細胞質マーカー DsRed2 の内局。(B) 損失 Pd の TMV MP CFP の TMV MP PLS CFP V4A アラニン突然変異体の能力を対象とします。Pd は Pd マーカー PDCB1 DsRed2 の共発現による視覚化されました。CFP の信号が青ではDsRed2 信号は紫です。色素蛍光は除外されました。画像は、共焦点セクションの一つです。スケール バー = 10 μ m. DIC、微分干渉コントラスト顕微鏡写真。この図は元らから適応21.<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55301/55301fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta at JoVE.com

Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta

植物の細胞間の接続、原形質 (Pd)、生理学と植物ウイルスの相互作用工場で中心的な役割を果たしてください。Pd 輸送に重要なは、Pd にタンパク質を直接信号を並べ替えています。しかし、これらのシーケンスに関する知識はまだ始まったばかりで。Pd Pd ターゲット蛋白質のローカリゼーションのシグナルを識別するための戦略について述べる。

タンパク質Planta Plasmodesmal ローカリゼーション シーケンスの同定

Plasmodesmata (Pd) are cell-to-cell connections that function as gateways through which small and large molecules are transported between plant cells. ...

identification-plasmodesmal-localization-sequences-proteins

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta

8.2K ビュー.  State University of New York. 植物の細胞間の接続、原形質 (Pd)、生理学と植物ウイルスの相互作用工場で中心的な役割を果たしてください。Pd 輸送に重要なは、Pd にタンパク質を直接信号を並べ替えています。しかし、これらのシーケンスに関する知識はまだ始まったばかりで。Pd Pd ターゲット蛋白質のローカリゼーションのシグナルを識別するための戦略について述べる。

ビデオ: Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her viral population uses the CCR5 coreceptor for cellular entry, and not an alternative coreceptor. One approach to tropism testing is to examine the sequence of the V3 region of the HIV envelope, which interacts with the coreceptor.
Methods: Viral RNA is extracted from blood plasma. The V3 region is amplified in triplicate with nested reverse transcriptase-PCR. The amplifications are then sequenced and analyzed using the software, RE_Call. Sequences are then submitted to a bioinformatic algorithm such as geno2pheno to infer viral tropism from the V3 region. Sequences are inferred to be non-R5 if their geno2pheno false positive rate falls below 5.75%. If any one of the three sequences from a sample is inferred to be non-R5, the patient is unlikely to respond to a CCR5-antagonist.

HIV tropism can be inferred from the V3 region of the viral envelope. V3 is PCR amplified in triplicate using nested RT-PCR, sequenced, and interpreted using bioinformatic software. Samples with with 1 or more sequence(s) with low g2P scores are classified as non-R5 virus.

V3の人口ベースのシーケンシングを用いたHIV - 1トロピズムの遺伝子型推論

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

免疫・感染学

Visualizing Dengue Virus through Alexa Fluor Labeling

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that influence this interaction could lead to improved understanding of disease pathogenesis and thus influence vaccine or therapeutic design. Hence, the development 
of methods to probe this interaction would be useful. Recent advancements in fluorophores development1-3 and imaging technology4 can be exploited to 
improve our current knowledge on dengue pathogenesis and thus pave the way to reduce the millions of dengue infections occurring annually.

The enveloped dengue virus has an external scaffold consisting of 90 envelope glycoprotein (E) dimers protecting the nucleocapsid shell, 
which contains a single positive strand RNA genome5. The identical protein subunits on the virus surface can thus be labeled with an amine reactive dye and visualized 
through immunofluorescent microscopy. Here, we present a simple method of labeling of dengue virus with Alexa Fluor succinimidyl ester dye dissolved directly in a sodium 
bicarbonate buffer that yielded highly viable virus after labeling. There is no standardized procedure for the labeling of live virus and existing manufacturer&#x2019;s protocol 
for protein labeling usually requires the reconstitution of dye in dimethyl sulfoxide. The presence of dimethyl sulfoxide, even in minute quantities, can block 
productive infection of virus and also induce cell cytotoxicity6. The exclusion of the use of dimethyl sulfoxide in this protocol thus reduced this possibility. 
Alexa Fluor dyes have superior photostability and are less pH-sensitive than the common dyes, such as fluorescein and rhodamine2, making them ideal for 
studies on cellular uptake and endosomal transport of the virus. The conjugation of Alexa Fluor dye did not affect the recognition of labeled dengue 
virus by virus-specific antibody and its putative receptors in host cells7. This method could have useful applications in virological studies.

Taking advantage of the advancements in fluorophore development and imaging technology, a simple method of Alexa Fluor labeling of dengue virus was devised to visualize the early interactions between virus and cell.

のAlexa Fluor ®標識を通じてデング熱ウイルスの可視化

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that ...

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and pathological processes such as CNS maturation in development, multiple sclerosis, and spinal cord injury. Microglia can be activated and recruited to action by neuronal injury or stimulation, such as axonal damage seen in MS or ischemic brain trauma resulting from stroke. These immunocompetent members of the CNS are also thought to have roles in synaptic plasticity under non-pathological conditions. We employ protocols for culturing microglia from the neonatal and adult tissues that are aimed to maximize the viable cell numbers while minimizing confounding variables, such as the presence of other CNS cell types and cell culture debris. We utilize large and easily discernable CNS components (e.g. cortex, spinal cord segments), which makes the entire process feasible and reproducible. The use of adult cells is a suitable alternative to the use of neonatal brain microglia, as many pathologies studied mainly affect the postnatal spinal cord. These culture systems are also useful for directly testing the effect of compounds that may either inhibit or promote microglial activation. Since microglial activation can shape the outcomes of disease in the adult CNS, there is a need for in vitro systems in which neonatal and adult microglia can be cultured and studied.

We outline methods for the efficient and quick isolation/culture of viable microglia from the neonatal cerebral cortex and adult spinal cord. The dissection and plating of cortical microglia can be accomplished within 90 minutes, with the subsequent microglial harvest taking place ~ 10 days following the initial dissection.

新生児と大人の中枢神経系から培養ミクログリア

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

Fluorescence in situ Hybridizations (FISH) for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a name given to a variety of techniques commonly used for visualizing gene transcripts in eukaryotic cells and can be further modified to visualize other components in the cell such as infection with viruses and bacteria. Spatial localization and visualization of viruses and bacteria during the infection process is an essential step that complements expression profiling experiments such as microarrays and RNAseq in response to different stimuli. Understanding the spatiotemporal infections with these agents complements biological experiments aimed at understanding their interaction with cellular components. Several techniques for visualizing viruses and bacteria such as reporter gene systems or immunohistochemical methods are time-consuming, and some are limited to work with model organisms&#160;and involve complex methodologies. FISH that targets RNA or DNA species in the cell is a relatively easy and fast method for studying spatiotemporal localization of genes and for diagnostic purposes. This method can be robust and relatively easy to implement when the protocols employ short hybridizing, commercially-purchased probes, which are not expensive. This is particularly robust when sample preparation, fixation, hybridization, and microscopic visualization do not involve complex steps. Here we describe a protocol for localization of bacteria and viruses in insect and plant tissues. The method is based on simple preparation, fixation, and hybridization of insect whole mounts and dissected organs or hand-made plant sections, with 20 base pairs short DNA probes conjugated to fluorescent dyes on their 5&#39; or 3&#39; ends. This protocol has been successfully applied to a number of insect and plant tissues, and can be used to analyze expression of mRNAs or other RNA or DNA species in the cell.

Fluorescence in situ Hybridizations FISH for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues

We describe here a simple fluorescence in situ hybridization (FISH) method for the localization of viruses and bacteria in insect and plant tissues. This protocol can be extended for the visualization of mRNA in whole mount and microscopic sections.

蛍光<em&gt;その場での</emウイルスと植物及び昆虫組織における共生細菌の局在化のための&gt;ハイブリダイゼーション（FISH）

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a name given to a variety of techniques commonly used for visualizing gene transcripts in eukaryotic cells ...

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of sexually transmitted infection and also the primary cause of preventable blindness in the world. An essential determinant for successful infection of host cells by Chlamydia is the bacterium's ability to manipulate host cell signaling from within a novel, vacuolar compartment called the inclusion. From within the inclusion, Chlamydia acquire nutrients required for their 2-3 day developmental growth, and they additionally secrete a panel of effector proteins onto the cytosolic face of the vacuole membrane and into the host cytosol. Gaps in our understanding of Chlamydia biology, however, present significant challenges for visualizing and analyzing this intracellular compartment. Recently, a reverse-imaging strategy for visualizing the inclusion using GFP expressing host cells was described. This approach rationally exploits the intrinsic impermeability of the inclusion membrane to large molecules such as GFP. In this work, we describe how GFP- or mCherry-expressing host cells are generated for subsequent visualization of chlamydial inclusions. Furthermore, this method is shown to effectively substitute for costly antibody-based enumeration methods, can be used in tandem with other fluorescent labels, such as GFP-expressing Chlamydia, and can be exploited to derive key quantitative data about inclusion membrane growth from a range of Chlamydia species and strains.

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

A live cell fluorescent protein based method for illuminating cellular vacuoles (inclusions) containing Chlamydia is described. This strategy enables rapid, automated determination of Chlamydia infectivity in samples and can be used to quantitatively investigate inclusion growth dynamics.

視覚化し、定量化するために蛍光タンパク質を使用しました<em&gt;クラミジア</em生細胞内&gt;液胞の成長ダイナミクス

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of ...

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional identification requires the sub-culture of signaled blood culture broth with identification available only after colonies on solid agar have matured. MALDI-TOF MS is a reliable, rapid method for identification of the majority of clinically relevant bacteria when applied to colonies on solid media. The application of MALDI-TOF MS directly to blood culture broth is an attractive approach as it has potential to accelerate species identification of bacteria and improve clinical management. However, an important problem to overcome is the pre-analysis removal of interfering resins, proteins and hemoglobin&#160;contained in blood culture specimens which, if not removed, interfere with the MS spectra and can result in insufficient or low discrimination identification scores. In addition it is necessary to concentrate bacteria to develop spectra of sufficient quality. The presented method describes the concentration, purification, and extraction of Gram negative bacteria allowing for the early identification of bacteria from a signaled blood culture broth.

The application of matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight (MALDI-TOF) mass spectrometry (MS) directly to blood culture broth expedites the identification of bacteria. The presented method is a rapid and reliable method for identification of Gram negative bacteria directly from blood culture broth.

MALDI-TOF質量分析法を使用した血液培養ブロスからのグラム陰性菌の迅速な同定

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

治療薬にリンパ腫細胞の感度での役割を決定するために、好中球の単離と解析

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Purification of Viral DNA for the Identification of Associated Viral and Cellular Proteins

The goal of this protocol is to isolate herpes simplex virus type 1 (HSV-1) DNA from infected cells for the identification of associated viral and cellular proteins by mass spectrometry. Although proteins that interact with viral genomes play major roles in determining the outcome of infection, a comprehensive analysis of viral genome associated proteins was not previously feasible. Here we demonstrate a method that enables the direct purification of HSV-1 genomes from infected cells. Replicating viral DNA is selectively labeled with modified nucleotides that contain an alkyne functional group. Labeled DNA is then specifically and irreversibly tagged via the covalent attachment of biotin azide via a copper(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition or click reaction. Biotin-tagged DNA is purified on streptavidin-coated beads and associated proteins are eluted and identified by mass spectrometry. This method enables the selective targeting and isolation of HSV-1 replication forks or whole genomes from complex biological environments. Furthermore, adaptation of this approach will allow for the investigation of various aspects of herpesviral infection, as well as the examination of the genomes of other DNA viruses.

The goal of this protocol is to specifically tag and selectively isolate viral DNA from infected cells for the characterization of viral genome associated proteins.

The goal of this protocol is to isolate herpes simplex virus type 1 (HSV-1) DNA from infected cells for the identification of associated viral and ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. typhimurium bacteria are quickly detected and phagocytized by macrophages, and contained in vesicles known as phagosomes in order to be degraded. Isolation of S. typhimurium-containing phagosomes have been widely used to study how S. typhimurium infection alters the process of phagosome maturation to prevent bacterial degradation. Classically, the isolation of bacteria-containing phagosomes has been performed by sucrose gradient centrifugation. However, this process is time-consuming, and requires specialized equipment and a certain degree of dexterity. Described here is a simple and quick method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin-streptavidin-conjugated magnetic beads. Phagosomes obtained by this method can be suspended in any buffer of choice, allowing the utilization of isolated phagosomes for a broad range of assays, such as protein, metabolite, and lipid analysis. In summary, this method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes is specific, efficient, rapid, requires minimum equipment, and is more versatile than the classical method of isolation by sucrose gradient-ultracentrifugation.

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

We describe here a simple and quick method for the isolation of Salmonella typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin and streptavidin.

サルモネラの分離-大食細胞のファゴゾームを含む

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

TurboID-Based Proximity Labeling for In Planta Identification of Protein-Protein Interaction Networks

Proximity labeling (PL) techniques using engineered ascorbate peroxidase (APEX) or Escherichia coli biotin ligase BirA (known as BioID) have been successfully used for identification of protein-protein interactions (PPIs) in mammalian cells. However, requirements of toxic hydrogen peroxide (H2O2) in APEX-based PL, longer incubation time with biotin (16&#8211;24 h), and higher incubation temperature (37 &#176;C) in BioID-based PL severely limit their applications in plants. The recently described TurboID-based PL addresses many limitations of BioID and APEX. TurboID allows rapid proximity labeling of proteins in just 10&#8201;min under room temperature (RT) conditions. Although the utility of TurboID has been demonstrated in animal models, we recently showed that TurboID-based PL performs better in plants compared to BioID for labeling of proteins that are proximal to a protein of interest. Provided here is a step-by-step protocol for the identification of protein interaction partners using the N-terminal Toll/interleukin-1 receptor (TIR) domain of the nucleotide-binding leucine-rich repeat (NLR) protein family as a model. The method describes vector construction, agroinfiltration of protein expression constructs, biotin treatment, protein extraction and desalting, quantification, and enrichment of the biotinylated proteins by affinity purification. The protocol described here can be easily adapted to study other proteins of interest in Nicotiana and other plant species.

Described here is a proximity labeling method for identification of interaction partners of the TIR domain of the NLR immune receptor in Nicotiana benthamiana leaf tissue. Also provided is a detailed protocol for the identification of interactions between other proteins of interest using this technique in Nicotiana and other plant species.

タンパク質Planta Plasmodesmal ローカリゼーション シーケンスの同定

タンパク質Planta Plasmodesmal ローカリゼーションシーケンスの同定