The authors acknowledge the help from the staff of Laboratory Animal Medicine, University of Nevada, Reno. MM received funding from Nevada INBRE.

aşağıda özetlenen protokolü (Sayı-00682) Nevada Reno Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmış ve Nevada, Reno hayvan araştırma etik komitesi Üniversitesi kurallarına uygun olduğundan. Kısaca, fareler izofluran ile anestezi uygulandı ve burunluk 20 dakika süre ile devamlı izofluran düzeylerini muhafaza için kullanılmıştır. Bir veteriner merhem anestezi altında gözlerin kurumasını önlemek için kullanılmıştır. Ayak tutam anestezi seviyesini tespit etmek için kullanıldı ve nefes alma hızı prosedürü boyunca ölçüldü. Fareler ayrı kafeslerde tutulur ve bilinç kazanmış kadar takip edildi. Fareler kene beslemek için sadece bir kez kullanıldı ve post kene kurtarma ötenazi uygulandı. Ötenazi Hayvan Tıp personeli personelin Laboratuvarı tarafından gerçekleştirilmiştir. CO2 ve servikal dislokasyon hayvanlar ötenazi kullanılmıştır. NOT: keneler üzerinde çalışmak tam bir kişisel koruyucu eq kullanımını gerektiriruipment. Olgunlaşmamış keneleri saymak için, beyaz laboratuar önlüğü giyin, lastik bantlarla kaplı laboratuar kaplamasının manşonu açıklığını örten uzun nitril eldivenler ve kapalı ayakkabı kullanın. Fareleri kenelerle enfeste öldürmek için saç ağını, tek kullanımlık tulumları, kolları üzerine uzun kollu eldivenleri ve ayaklıkları kullanın. Yanlış kene tespiti için beyaz veya açık renkli tulum kullanın. Eldiven ve kılıfları periyodik olarak kontrol edin. 1. Hayvan Barınağına Hazırlanma Odası <ol><li> Kenelerle bulaşmış fareleri eve ayırmak için ayrı bir oda belirleyin. Kazara kene kaçışını önlemek için, yapışkan bir hasır veya iki taraflı halı bantını kapının dışında ve içinde yerleştirin. </li></ol> 2. Fare Infestation için Keneler Sayma <ol><li> Çift taraflı bantları 7 &quot;x 5&quot; x 14 &quot;plastik kapların üst kenarlarına koyun ve yaklaşık 2 cm su ile doldurun. </li><li> Kabın ortasına başka bir küçük kutu veya Petri kabı koyun ve 1 cm su ile doldurun,# 34; Bu kapsayıcı etrafına hendek&quot; </li><li> Petri kabı içinde larva veya perileri içeren flakon saklayın. </li><li> şişeden larvaları ya da nymphs çıkarın ve mikroskop altında saymak için iyi bir boya fırçası kullanın. 50 larva veya ayrı ayrı sintilasyon şişelerine 25 nymphs sayın. naylon mesh veya organze kumaş ekran ve lastik bantlar ile yakın hemen şişeleri örtün. </li></ol> Olgunlaşmamış Keneler 3. İstila Fareler <ol><li> beyaz veya açık renkli çalışma tezgahı kullanın ve çalışma alanının çevresinde çift taraflı bant yapıştırın. </li><li> izofluran ile fare anestezisi. Ayak tutam tarafından anestezi seviyesini kontrol edin. Bir kez anestezi, kağıt havlu ile örtülü bir ısıtma pedi fare aktarmak ve sürekli izofluran temini için bir burun konisi eklemek. </li><li> kuruluğu önlemek için vazelin esaslı göz merhemi uygulanır. Min normal başına 230 nefes br halinde izofluran seviyesini azaltmak -. Izofluran seviyesi (80 ayarlamak için fare solunum desen NotHayvanı öldürmekten kaçınmak için eating oranı dakikada 80 nefesin altındadır). </li><li> Bir şişe 50 larva veya 25 nimf alın ve kulakların arasında kürkün altına kene takozları bir boya fırçası ile yerleştirin ( Şekil 1 ). Kenların iliştirilmesi için yeterli zaman tanımak için 20 dakika boyunca fare ile anestezi altında tutun. </li><li> Fareyi, statik kapaklar ve beyaz yatak takımı ile standart, plastik bir ayakkabı kutusu tipi tek kullanımlık fare kafesine taşıyın. Normal fare bakımı uyarınca oyuncaklar , su ve yiyecekleri ad libitum olarak verin. </li><li> Fare kafesini, üst kenarlar etrafında çift taraflı yapışkan bant ile kaplı daha büyük bir fare veya gerbil kafesi içinde saklayın. Dış kafese 3 cm su doldurun ( Şekil 2 ). </li></ol> 4. Farelerden Kene Toplama <ol><li> Olgunlaşmamış keneler, beslenmenin 3. ve 6. günleri arasında ayrılır. Kafesleri ve su hendeklerini 3. günden sonra her gün tıkanmış keneler için kontrol edin. </li><li> 4. ve 6. günler arasında kafesden müstakil keneler toplayın. Bir ağrı kullanınT fırça veya yumuşak forseps ile tıkanmış kene tutun ve naylon örgü kumaş lastik bantlarla sabitlenmiş temiz sintilasyon şişeleri içinde saklayın. </li><li> Kalan kenarlar için 7. günde anestezi uygulayın ve fare kontrol edin. </li><li> 7. günde engellenmiş keneler için yatak takımları, yiyecek yemi ve su şişesini kontrol edin. Yukarıda açıklandığı gibi prosedürü takiben fareleri euthanize edin. Tek kullanımlık kafesleri, yatak takımları, su şişesi ve yiyecek yalakçısı otoklav ederek, kaçmayan kaynaksız kenelerden kaçınınız. </li></ol> 5. Fed Kenarlarının Depolanması <ol><li> % 90 nemde tıkanmış kene koruyun, 20 ° C ve 12:12 ışık: koyu renk döngüsü, nem ve sıcaklık kontrolü altındaki inkübatör oluşuncaya kadar. Bu işlemin yaklaşık 12 ila 18 hafta sürebilir. </li><li> Yüksek nem, kene sağkalımını arttırırken, kenelerin mantar büyümesine eğilimli olmasını sağlar. Kalıp için haftada en az bir kere mikroskop altında beslenen keneleri kontrol edin. Saptanırsa, hayatta kalanları% 5 etanol içinde 5Dak., Suda durulayın, kuru bir filtre kağıdına aktarın ve yeni, temiz tüplere aktarın. </li></ol>

<ol>
	<li>Gleim, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+associated+with+tick+bites+and+pathogen+prevalence+in+ticks+parasitizing+humans+in+Georgia,+USA.">Factors associated with tick bites and pathogen prevalence in ticks parasitizing humans in Georgia, USA.</a> Parasites &amp;amp; Vectors. 9 (125), 1-13 (2016).</li><li>Krober, T., Guerin, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+feeding+assays+for+hard+ticks.">In vitro feeding assays for hard ticks.</a> Trends Parasitol. 23 (9), 445-449 (2007).</li><li>Kuhnert, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feeding+of+Hard+Ticks+In+Vitro:+New+Perspectives+for+Rearing+and+for+the+Identification+of+Systemic+Acaricides.">Feeding of Hard Ticks In Vitro: New Perspectives for Rearing and for the Identification of Systemic Acaricides.</a> ALTEX. 13 (2), 76-87 (1996).</li><li>Voigt, W. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+feeding+of+instars+of+the+ixodid+tick+Amblyomma+variegaturn+on+skin+membranes+and+its+application+to+the+transmission+of+Theileria+mutans+and+Cowdria+ruminantium.">In vitro feeding of instars of the ixodid tick Amblyomma variegaturn on skin membranes and its application to the transmission of Theileria mutans and Cowdria ruminantium.</a> Parasitol. 107, 257-263 (1993).</li><li>Gregson, J. D., Smith, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ticks.">Ticks.</a> Insect Colonization and Mass Production. , 49-72 (1966).</li><li>Sonenshine, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biology of Ticks. 2, (1993).</li><li>Bouchard, K. R., Wikel, S. K., Marquaedt, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Care,+maintenance,+and+experimental+infestation+of+ticks+in+the+laboratory+setting.">Care, maintenance, and experimental infestation of ticks in the laboratory setting.</a> Biology of Disease Vectors. , 705-711 (2005).</li><li>Schumaker, T. S., Barros, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+cycle+of+Ornithodoros+(Alectorobius)+talaje.+(Acari:Argasidae)+in+laboratory.">Life cycle of Ornithodoros (Alectorobius) talaje. (Acari:Argasidae) in laboratory.</a> J Med Entomol. 32, 249-254 (1995).</li><li>Banks, C. W., Oliver, J. H., Hopla, C. E., Dotson, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+life+cycle+of+Ixodes+woodi+(Acari:Ixodidae).">Laboratory life cycle of Ixodes woodi (Acari:Ixodidae).</a> J. Med. Entomol. 35, 177-179 (1998).</li><li>James, A. M., Oliver, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feeding+and+host+preference+of+immature+Ixodes+dammini,I.scapularis,and+I.pacificus.(Acari:Ixodidae).">Feeding and host preference of immature Ixodes dammini,I.scapularis,and I.pacificus.(Acari:Ixodidae).</a> J. Med. Entomol. 27, 324-330 (1990).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Protokolün Kritik Adımları Kazara kaçmayı önlemek için kenevir yetiştirirken birkaç güvenlik seviyesine sahip olmak önemlidir. Yapışkan bant ve su hendeği kullanımı, güvenliği sağlamak için kritik öneme sahiptir. Vücut ısısını sabit tutmak için anestezi uygulanmış fareyi ısıtma pedinde tutmak önemlidir. Fareyi tıraş etmenin kene ataşmanı için herhangi bir ek fayda sağlamadığını da bulduk. Bireysel bir fare, belirlenen bir &quot;kene odası&quot; nda bir hafta boyunca aynı kafeste tutulabilir ve bu da kenelerin kenarlarla personel arasında daha fazla temasını engeller. Değişiklikler ve Sorun Giderme Yüksek kaliteli, laboratuarda yetiştirilen kenelerin üretimi, tik biyolojisi ve kene patojen etkileşimleri üzerine yapılan çalışmalar için gereklidir. Eskiden kullanılan besleme protokolleri askıdaki tel zemin 8&#39;i veya silikon kafesleri fareleri hareketsiz tutmak için kullandı 6 , 1Hayvana ekstra maliyet hem de strese maruz 0. Buna ek olarak, süspanse tel kafes tıkalı keneler idrar ve böylece kalıp oluşumu riskini artan fare dışkı ile kirlenmiş su içerisine tel üzerinden düşmesini sağlar. Tekniğin Sınırlamalar verilerden de anlaşılabileceği gibi, başarılı kenelerin (% 92 kadar), ortalama% 65 oranında geri kazanılmıştır. Zaman zaman fare kafes dışında su hendekte kenelerin bulunduğu ancak hiçbiri kurtuldu. ikinci kabın dış duvarlarında yapışkan bant kaçmasını keneler engelledi. Mevcut / Alternatif Yöntemler Açısından Tekniği Önemi Ayakkabı kutusu stili atılabilir fareler kafesleri kullanarak Bizim protokol hareket serbest yelpazesi izin ve fareler kene beslenmesini izin verecek ölçülü olması gerekmez göstermektedir. En beslenen keneler kolayca görülebilir ve şeffaf bir kafes duvar toplanmış ve geri kalan keneler kolaylıkla olan edildiBeslenme döngüsünün sonunda yataklar arasında tespit edildi. Bu protokol, herhangi bir özel fare kafes gerektirmez, bu nedenle, maliyet etkin olur. Edebiyat, kenelerin% 50&#39;sinden fazlasının fare ile ilişkili olduğunu ve tüm bağlı kenelerin tamamlanmadığını önermektedir. Ortalama olarak, ~% 60 engajged larval keneler toplandı. Hiçbir kaçan çiçeksiz veya beslenmiş kenarı bulamadık. Bazen, su hendeklerinde bir veya iki adet engebeli larval kene bulunurdu, ancak yapışkan bantta hiçbiri yoktu. Bulgularımız, tüm kenelerin ev sahibine bağlanmadığını ve beslenmeden ölebileceğini göstermektedir. Güvensiz, ölü keneler çöp bulmak zordu. Bazen beyaz yataklarda kan lekeleri tespit ettik; bu da, fare düşürdükten sonra veya damlamadan sonra tıkanmış kene öldürdüğünü göstermektedir. Verilerimiz ve günlük kafes gözlemimiz, tıkanmış kenelerin ya kafes duvarlarında ve kafesin üstünde hareket ettiklerini ya da farenin ulaştığı yerden uzakta yatağın altına gizlenmesini öneriyor. Dolayısıyla, kapalı kafesinK işaretinin hayatta kalmasına olumsuz etkisi. Bu Tekniği Ustaladıktan Sonra Gelecekteki Uygulamalar veya Talimatlar Protokolümüz, hayvanları tutan personelin ekstra maliyet veya emniyetini azaltmaksızın kenelerin toplu yetiştirilmesi için basitleştirilmiş bir alternatif sunmaktadır. Gelecekteki deneylerde yetişkin I. scapularis&#39;in beslenme yöntemlerinin geliştirilmesi üzerinde durulacak .

Keneler omurgalıların zorunlu hematophagous ektoparazitlerdir ve dünya çapında dağıtılmaktadır. Amerika Birleşik Devletleri&#39;nde, kenelerin en az 11 türün halk sağlığı önemi 1&#39;in patojenlerin vektörler bulunmaktadır. Ixodes scapularis, Lyme hastalığı (Borrelia burgdorferi) ateş (B. miyamotoi) nükseden, insan granülosit anaplazmoz (Anaplasma phagocytophilum) ve babeziyoz neden olan maddeler olarak çeşitli patojenlerin iletiminden sorumludur (Babesia spp.). Laboratuvarda çalışmalar için vahşi bolca bu arachnids toplama bir hastalık vektörü olarak I. scapularis önemine rağmen her zaman mümkün değildir. Bu nedenle, sağlıklı laboratuvarda yetiştirilmiş kene üretimi kene biyolojisi üzerinde çalışmalar çok önemlidir ve etkileşimleri-patojen işaretleyin. I. scapularis dahil tüm sert keneler (aile Ixodidae), yaşam döngüsü, yumurta ve üç activ oluşurE aşamaları: larva, nimf ve yetişkin. Her aktif aşamada bir omurgalı konakçı beslenir. Bağlar ve besleme birkaç gün içinde keneler ve onların konak arasında gerçekleşen karmaşık etkileşimler yapay besleyiciler kullanarak çoğaltmak için neredeyse imkansızdır ve 2 , 3 , 4 toplu yetiştirme için yeterli sayıdaki beslemiş kenelerin sağlanması pek olası değildir. Dolayısıyla, canlı fareler ve tavşanlar en sık olgunlaşmamış (larvalar ve nimfler) yetiştirme ana bilgisayarları ve tavukların olgun aşamaları (yetişkinler) olarak kullanılır. Her gelişim evresi boyunca kan beslemeye yönelik çoklu konut gereksinimi, kenelerin yetiştirilmesini zorlaştırmaktadır ve zaman ve maliyet yoğun 5 , 6 , 7 . Çoğu kene destekleme protokolleri, fareleri asma tel ızgara taban kafesindeki 7 , 8 ya da silindirik bir kabin içinde tutmayı gerektirirHayvan öyle boyutlara sahip ki, hayvan serbestçe hareket edemez ve kendini damatlayamaz 6 , 9 , 10 . Bu silindirik kafesler daha sonra bir tel örgü ile bir ayakkabı kutusu kafesine aktarılır. Sızdırılmış, ayrılmış keneler altındaki sudan toplanır. Bununla birlikte, bu yöntem, beslenen kenelerin, idrar ve dışkı ile kirlenmiş mantar büyümesini ve kene ölüm oranını artırabilecek suya maruz kalmasına neden olur. Buna ek olarak, kene su çukurundan kaçma ve aynı zamanda farelere stres yaratma olasılığını artırır. Bu sorunları gidermek için, burada plastik ayakkabı kutusu tipi tek kullanımlık kafeslerdeki farelerde larval kene beslemeyi göstermektedir. Bu yöntem, farelerin normal davranışına izin verir, tıkanmış tıkanıklığı artırır ve kontaminasyondan ötürü kene ölümünü azaltır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="865">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Puralube vet ointment</td>
			<td style="width:207px;">Amazon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:323px;">Available from any Pet store or online store</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disposable mouse cage</td>
			<td>&#160;Innovive, San Diego, CA&#160;</td>
			<td>MV 2</td>
			<td>Set of bottom and lid</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">White Alpha dri bedding&#160;</td>
			<td>Lab Supply, Fort Worth, TX</td>
			<td>&#160;ALPHA-Dri&#8482;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rearing ixodes scapularis, the black-legged tick: feeding immature stages on mice

Lyme hastalığının vektörü Ixodes scapularis , doğu ve orta batı Amerika Birleşik Devletleri&#39;ndeki en önemli hastalık vektörlerinden biridir. Bu tür, her gelişim evresi için bir omurgalı konakçıdan bir kan yemek isteyen üç ana kene ve yetişkin dişiler üreme için kan dolumu gerektirir. Larval keneler beslenmek için ev sahibine 3 - 5 gün boyunca bağlarlar ve evin tamamen tıkıldıktan sonra bırakırlar. Birkaç farklı konağa bağımlılık ve engorgement için uzun ekleme zamanı, laboratuar ortamında kenelerin yetiştirilmesini zorlaştırır. Bununla birlikte, kene biyolojisi ve kene-patojen etkileşimlerini anlamak için sağlıklı, laboratuar bakımlı kenelerin üretimi önemlidir. Burada, farelerde olgunlaşmamış kene beslemeye yönelik basit ve uygun maliyetli bir protokol gösteriyoruz. Farelerde azaltılmış stres için varolan protokolleri değiştirdik ve kenelerin temas etmesini önlemek için örgü dipleri olmayan tek kullanımlık kafesleri kullanarak kene besleme başarısı ve hayatta kalma oranını arttırdık.İdrar ve dışkılarla kirlenmiş su.

Geliştirilmiş besleme etkinliği ve fare konak üzerinde stresin azaltılması için mevcut kenot yetiştirme protokolleri 6 , 10&#39;u değiştirdik. Sonuçlar, standart ayakkabı kutusu tarzı fare kafeslerinin, kenelerin yetiştirilmesi için çok uygun olduğunu ortaya koymaktadır. Beyaz yatak, beslenen kenelerin kolay toplanması için iyi bir kontrast sağladı. Çoğu keneler, beslendikten sonra kapların duvarlarına tırmandı ve toplanması kolaydı. Buna ek olarak, tek kullanımlık plastik kutuların sıkıca monte edilmiş kapağı (UNR&#39;de bulunan fareler için rutin olarak kullanılır) kutudan kaçmayı önledi. Buna ek olarak, kene istila için fareler tıraş vermedi ( Şekil 1 ). Yayınlanmış protokollerdeki bu değişiklikler önemli kene takviyesi, engorgement ve hayatta kalma ile sonuçlandı. Bu protokol, alread&#39;in dışında herhangi bir özel fare kafesleri gerektirmediğinden maliyet etkintir.Y kullanımda. Ayrıca, her gün tıkanmış kene toplamamız gerekmediğinden, daha az emek harcıyor. Enfestasyondan sonraki 4. ve 6. günler arasında keneler toplandı. Çoğu kene 4. günde ayrılmış ve geri kalan bazıları 5. günde müstakil olmuştur. 7. günde tüm farelerde keneler bulunmuyordu. Ortalama% 67 (dağılım 52 - 92%) engebeli larval keneleri kurtarmaya başladık ( Tablo 1 ). Bütün fareler sağlıklıydı ve herhangi bir rahatsızlık belirtisi göstermedi. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/55286/55286fig1.jpg" /> Şekil 1: Farelerde Ixodes scapularis Larvaları besleme. Fareler, 50 larval kenardan bireysel olarak istila edildi. Sıkışan keneler, 4-6 günler arasında fare düşürüldü. Kafesler, gün içinde kalan keneler için kontrol edildi ve bundan sonra atıldı. C: Farelere çiçeksiz larval kenelerle enfeste ediliyor. B: Farenin kulağına bağlanan bir larval kene. C: BirSıçan yumurtasından 3 gün sonra bir fare kulağına tutturulmuş enginar larval kene. D: Tamamlanmamış kene larvaları ile beslenmemiştir. <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/55286/55286fig2.jpg" /> Şekil 2: Fare Kafesi, Tick Infestation için ayarlayın. İki atılabilir fare kafesi bir gerce kafes içinde tutuldu. Yaklaşık 3 cm. Hendek yapmak için gerbil kafesine su ilave edildi. Kene kaçışını önlemek için gerce kafesin üst kenarlarının etrafına çift taraflı yapışkan halıcı bant takıldı. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Hayvan (fare) </td><td> Kurtarılan larval kenelerin toplam sayısı </td><td> Kurtarılan larva keneler yüzdesi </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 34 </td><td> % 68 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 32 </td><td> % 64 </td></tr><tr><td>3 </td><td> 38 </td><td> % 76 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 28 </td><td> % 56 </td></tr><tr><td> 5 </td><td> 39 </td><td> % 78 </td></tr><tr><td> 6 </td><td> 26 </td><td> % 52 </td></tr><tr><td> 7 </td><td> 46 </td><td> % 92 </td></tr><tr><td> 8 </td><td> 29 </td><td> % 58 </td></tr><tr><td> 9 </td><td> 29 </td><td> % 58 </td></tr><tr><td> 10 </td><td> 33 </td><td> % 66 </td></tr><tr><td> ORTALAMA </td><td></td><td> % 66.8 </td></tr></tbody></table> Tablo 1: Anestezi altındaki fare konakçıları üzerinde laboratuar istilasından sonra toparlanan Ixodes scapularis larva sayısı . Her fareye 50 larvanın enfekte edildi.

Watch this Scientific Journal Video about Rearing Ixodes scapularis, the Black-legged Tick: Feeding Immature Stages on Mice at JoVE.com

Rearing Ixodes scapularis, the Black-legged Tick: Feeding Immature Stages on Mice

Sağlıklı laboratuarda yetiştirilen kenelerin üretimi, kene biyolojisi ve kene patojen etkileşimleri üzerine çalışmalar için gereklidir. Burada, fare için düşük maliyetli ve stresli olgunlaşmamış kene beslemesi için basit bir protokolü gösteriyoruz.

yetiştirme<em&gt; Geyik kenesi,</em&gt; Siyah Ayaklı Tik Tak: Fare üzerinde Olgunlaşmamış Evreleri Besleme

Ixodes scapularis, the vector of Lyme disease, is one of the most important disease vectors in the eastern and Midwestern United States. This species is a ...

rearing-ixodes-scapularis-black-legged-tick-feeding-immature-stages

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Rearing Ixodes scapularis, the Black-legged Tick: Feeding Immature Stages on Mice

11.9K Görüntüleme.  University of Nevada, Reno.  Sağlıklı laboratuarda yetiştirilen kenelerin üretimi, kene biyolojisi ve kene patojen etkileşimleri üzerine çalışmalar için gereklidir. Burada, fare için düşük maliyetli ve stresli olgunlaşmamış kene beslemesi için basit bir protokolü gösteriyoruz. 

Video: Rearing Ixodes scapularis, the Black-legged Tick: Feeding Immature Stages on Mice

Methods for Rapid Transfer and Localization of Lyme Disease Pathogens Within the Tick Gut

Lyme disease is caused by infection with the spirochete pathogen Borrelia burgdorferi, which is maintained in nature by a tick-rodent infection cycle 1. A tick-borne murine model 2 has been developed to study Lyme disease in the laboratory. While na&iacute;ve ticks can be infected with B. burgdorferi by feeding them on infected mice, the molting process takes several weeks to months to complete. Therefore, development of more rapid and efficient tick infection techniques, such as a microinjection-based procedure, is an important tool for the study of Lyme disease 3,4. The procedure requires only hours to generate infected ticks and allows control over the delivery of equal quantities of spirochetes in a cohort of ticks. This is particularly important as the generation of B. burgdorferi infected ticks by the natural feeding process using mice fails to ensure 100% infection rate and potentially results in variation of pathogen burden amongst fed ticks. Furthermore, microinjection can be used to infect ticks with B. burgdorferi isolates in cases where an attenuated strain is unable to establish infection in mice and thus can not be naturally acquired by ticks 5. This technique can also be used to deliver a variety of other biological materials into ticks, for example, specific antibodies or double stranded RNA 6. In this article, we will demonstrate the microinjection of nymphal ticks with in vitro-grown B. burgdorferi. We will also describe a method for localization of Lyme disease pathogens in the tick gut using confocal immunofluorescence microscopy.

Lyme disease research studies often require generation of ticks infected with the pathogen Borrelia burgdorferi, a process that typically takes several weeks. Here we demonstrate a microinjection-based tick infection procedure that can be accomplished within hours. We also demonstrate an immunofluorescence method for in situ localization of B. burgdorferi within ticks.

Hızlı Aktarım ve Lyme Hastalığı Patojenler lokalizasyonu için işaretleyin Gut içinde Yöntemleri

Lyme disease is caused by infection with the spirochete pathogen Borrelia burgdorferi, which is maintained in nature by a tick-rodent infection cycle 1.  ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne relapsing fever (Borrelia spp.), Rocky Mountain Spotted fever (Rickettsia rickettsii), ehrlichiosis (Ehrlichia chaffeensis and E. equi), anaplasmosis (Anaplasma phagocytophilum), encephalitis (tick-borne encephalitis virus), babesiosis (Babesia spp.), Colorado tick fever (Coltivirus), and tularemia (Francisella tularensis) 1-8. To be properly transmitted into the host these infectious agents differentially regulate gene expression, interact with tick proteins, and migrate through the tick 3,9-13. For example, the Lyme disease agent, Borrelia burgdorferi, adapts through differential gene expression to the feast and famine stages of the tick's enzootic cycle 14,15. Furthermore, as an Ixodes tick consumes a bloodmeal Borrelia replicate and migrate from the midgut into the hemocoel, where they travel to the salivary glands and are transmitted into the host with the expelled saliva 9,16-19.
As a tick feeds the host typically responds with a strong hemostatic and innate immune response 11,13,20-22. Despite these host responses, I. scapularis can feed for several days because tick saliva contains proteins that are immunomodulatory, lytic agents, anticoagulants, and fibrinolysins to aid the tick feeding 3,11,20,21,23. The immunomodulatory activities possessed by tick saliva or salivary gland extract (SGE) facilitate transmission, proliferation, and dissemination of numerous tick-borne pathogens 3,20,24-27. To further understand how tick-borne infectious agents cause disease it is essential to dissect actively feeding ticks and collect tick saliva. This video protocol demonstrates dissection techniques for the collection of hemolymph and the removal of salivary glands from actively feeding I. scapularis nymphs after 48 and 72 hours post mouse placement. We also demonstrate saliva collection from an adult female I. scapularis tick.

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

The collection of infected tick hemolymph, salivary glands, and saliva is important to study how tick-borne pathogens cause disease. In this protocol we demonstrate how to collect hemolymph and salivary glands from feeding Ixodes scapularis nymphs. We also demonstrate saliva collection from female I. scapularis adults.

Ixodes scapularis Keneler gelen tükürük, Tükürük Bezi ve hemolimf Koleksiyonu

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne ...

Rearing and Injection of Manduca sexta Larvae to Assess Bacterial Virulence

Manduca sexta, commonly known as the tobacco hornworm, is considered a significant agricultural pest, feeding on solanaceous plants including tobacco and tomato. The susceptibility of M. sexta larvae to a variety of entomopathogenic bacterial species1-5, as well as the wealth of information available regarding the insect's immune system6-8, and the pending genome sequence9 make it a good model organism for use in studying host-microbe interactions during pathogenesis. In addition, M. sexta larvae are relatively large and easy to manipulate and maintain in the laboratory relative to other susceptible insect species. Their large size also facilitates efficient tissue/hemolymph extraction for analysis of the host response to infection.
The method presented here describes the direct injection of bacteria into the hemocoel (blood cavity) of M. sexta larvae. This approach can be used to analyze and compare the virulence characteristics of various bacterial species, strains, or mutants by simply monitoring the time to insect death after injection. This method was developed to study the pathogenicity of Xenorhabdus and Photorhabdus species, which typically associate with nematode vectors as a means to gain entry into the insect. Entomopathogenic nematodes typically infect larvae via natural digestive or respiratory openings, and release their symbiotic bacterial contents into the insect hemolymph (blood) shortly thereafter10. The injection method described here bypasses the need for a nematode vector, thus uncoupling the effects of bacteria and nematode on the insect. This method allows for accurate enumeration of infectious material (cells or protein) within the inoculum, which is not possible using other existing methods for analyzing entomopathogenesis, including nicking11 and oral toxicity assays12. Also, oral toxicity assays address the virulence of secreted toxins introduced into the digestive system of larvae, whereas the direct injection method addresses the virulence of whole-cell inocula.
The utility of the direct injection method as described here is to analyze bacterial pathogenesis by monitoring insect mortality. However, this method can easily be expanded for use in studying the effects of infection on the M. sexta immune system. The insect responds to infection via both humoral and cellular responses. The humoral response includes recognition of bacterial-associated patterns and subsequent production of various antimicrobial peptides7; the expression of genes encoding these peptides can be monitored subsequent to direct infection via RNA extraction and quantitative PCR13. The cellular response to infection involves nodulation, encapsulation, and phagocytosis of infectious agents by hemocytes6. To analyze these responses, injected insects can be dissected and visualized by microscopy13, 14.

Rearing and Injection of Manduca sexta Larvae to Assess Bacterial Virulence

The method described here utilizes direct injection of entomopathogenic bacteria into the hemocoel of Manduca sexta insect larvae. M. sexta is a commercially available and well-studied insect. Thus, this method represents a simple approach to analyzing host-bacterial interactions from the perspective of one or both partners.

Ve Yetiştirme ve Enjeksiyon<em&gt; Manduca Sexta</emBakteriyel virülans Değerlendirememesi&gt; Larva

Manduca sexta, commonly known as the tobacco hornworm, is considered a significant agricultural pest, feeding on solanaceous plants including tobacco and ...

Feeding of Ticks on Animals for Transmission and Xenodiagnosis in Lyme Disease Research

Transmission of the etiologic agent of Lyme disease, Borrelia burgdorferi, occurs by the attachment and blood feeding of Ixodes species ticks on mammalian hosts. In nature, this zoonotic bacterial pathogen may use a variety of reservoir hosts, but the white-footed mouse (Peromyscus leucopus) is the primary reservoir for larval and nymphal ticks in North America. Humans are incidental hosts most frequently infected with B. burgdorferi by the bite of ticks in the nymphal stage. B. burgdorferi adapts to its hosts throughout the enzootic cycle, so the ability to explore the functions of these spirochetes and their effects on mammalian hosts requires the use of tick feeding. In addition, the technique of xenodiagnosis (using the natural vector for detection and recovery of an infectious agent) has been useful in studies of cryptic infection. In order to obtain nymphal ticks that harbor B. burgdorferi, ticks are fed live spirochetes in culture through capillary tubes. Two animal models, mice and nonhuman primates, are most commonly used for Lyme disease studies involving tick feeding. We demonstrate the methods by which these ticks can be fed upon, and recovered from animals for either infection or xenodiagnosis.

Lyme disease is the most commonly-reported vector-borne disease in North America. The causative agent, Borrelia burgdorferi is a spirochete bacterium transmitted by Ixodid ticks. Transmission and detection of infection in animal models is optimized by the use of tick feeding, which we describe here.

Lyme Hastalığı Araştırma İletim ve Xenodiagnosis için Hayvanlar Keneler besleme

Transmission of the etiologic agent of Lyme disease, Borrelia burgdorferi, occurs by the  attachment and blood feeding of Ixodes species ticks on ...

Measuring Local Anaphylaxis in Mice

Allergic responses are the result of the activation of mast cells and basophils, and the subsequent release of vasoactive and proinflammatory mediators. Exposure to an allergen in a sensitized individual can result in clinical symptoms that vary from minor erythema to life threatening anaphylaxis. In the laboratory, various animal models have been developed to understand the mechanisms driving allergic responses. Herein, we describe a detailed method for measuring changes in vascular permeability to quantify localized allergic responses. The local anaphylaxis assay was first reported in the 1920s, and has been adapted from the technique published by Kojima et al. in 20071. In this assay, mice sensitized to OVA are challenged in the left ear with vehicle and in the right ear with OVA. This is followed by an intravenous injection of Evans Blue dye. Ten min after injecting Evans Blue, the animal is euthanized and the dye that has extravasated into the ears is extracted overnight in formamide. The absorbance of the extracted dye is then quantified with a spectrophotometer. This method reliably results in a visual and quantifiable manifestation of a local allergic response.

Allergic responses, characterized by the activation of mast cells and basophils, are driven by the cross-linking of IgE and release of proinflammatory mediators. A quantitative assessment of allergic responses can be achieved by using Evans Blue dye to monitor changes in vascular permeability after allergen challenge.

Farelerde Yerel Anafilaksi Ölçme

Allergic responses are the result of the activation of mast cells and basophils, and the subsequent release of vasoactive and proinflammatory mediators. ...

Generation of Immature, Mature and Tolerogenic Dendritic Cells with Differing Metabolic Phenotypes

Immune response results from a complex interplay between the antigen non-specific innate immune system and the antigen specific adaptive immune system. The immune system is a constant balance in maintaining tolerance to self-molecules and reacting rapidly to pathogens. Dendritic cells (DCs) are powerful professional antigen presenting cells that link the innate immune system to the adaptive immune system and balance the adaptive response between self and non-self. Depending on the maturation signals, immature dendritic cells can be selectively stimulated to differentiate into immunogenic or tolerogenic DCs. Immunogenic dendritic cells provide proliferation signals to antigen-specific T cells for clonal expansion; while tolerogenic dendritic cells regulate tolerance by antigen-specific T-cell deletion or clonal expansion of regulatory T-cells. Due to this unique property, dendritic cells are highly sought after as therapeutic agents for cancer and autoimmune diseases. Dendritic cells can be loaded with specific antigens in vitro and injected into the human body to mount a specific immune response both immunogenic and tolerogenic. This work presents a means to generate in vitro from monocytes, immature monocyte derived dendritic cells (moDCs), tolerogenic and mature moDCs that differ in surface marker expression, function and metabolic phenotypes.

Immature dendritic cells can be selectively differentiated into tolerogenic or mature dendritic cells to regulate the balance between immunity and tolerance. This work presents a means to generate from immature monocyte derived dendritic cells (moDCs), in vitro tolerogenic and mature moDCs that differ in metabolic phenotypes.

Metabolik fenotipleri farklı olarak sahip Olgunlaşmamış, Olgun ve tolerojenik Dendritik Hücrelerinin Üretimi

Immune response results from a complex interplay between the antigen non-specific innate immune system and the antigen specific adaptive immune system. ...

Development of a Hepatitis B Virus Reporter System to Monitor the Early Stages of the Replication Cycle

Currently, it is possible to construct recombinant forms of various viruses, such as human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) and hepatitis C virus (HCV), that carry foreign genes such as a reporter or marker protein in their genomes. These recombinant viruses usually faithfully mimic the life cycle of the original virus in infected cells and exhibit the same host range dependence. The development of a recombinant virus enables the efficient screening of inhibitors and the identification of specific host factors. However, to date the construction of recombinant hepatitis B virus (HBV) has been difficult because of various experimental limitations. The main limitation is the compact genome size of HBV, and a fairly strict genome size that does not exceed 1.3 genome sizes, that must be packaged into virions. Thus, the size of a foreign gene to be inserted should be smaller than 0.4 kb if no deletion of the genome DNA is to be performed. Therefore, to overcome this size limitation, the deletion of some HBV DNA is required. Here, we report the construction of recombinant HBV encoding a reporter gene to monitor the early stage of the HBV replication cycle by replacing part of the HBV core-coding region with the reporter gene by deleting part of the HBV pol coding region. Detection of recombinant HBV infection, monitored by the reporter activity, was highly sensitive and less expensive than detection using the currently available conventional methods to evaluate HBV infection. This system will be useful for a number of applications including high-throughput screening for the identification of anti-HBV inhibitors, host factors and virus-susceptible cells.

Here we describe a newly developed hepatitis B virus (HBV) reporter system to monitor the early stages of the HBV life cycle. This simplified in vitro system will aid in the screening of anti-HBV agents using a high-throughput strategy.

Bir Hepatit B Virüsü Muhabir Sisteminin Geliştirilmesi Çoğaltma Döngüsü Erken Aşamaları Monitör

Currently, it is possible to construct recombinant forms of various viruses, such as human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) and hepatitis C virus (HCV), ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against currently circulating strains. In addition to their use in treating seasonal influenza, the NA inhibitors have been stockpiled by a number of countries for use in the event of a pandemic. It is therefore important to monitor the susceptibility of circulating influenza viruses to this class of antivirals. There are different types of assays that can be used to assess the susceptibility of influenza viruses to the NA inhibitors, but the enzyme inhibition assays using either a fluorescent substrate or a chemiluminescent substrate are the most widely used and recommended. This protocol describes the use of a fluorescence-based assay to assess influenza virus susceptibility to NA inhibitors. The assay is based on the NA enzyme cleaving the 2&#8242;-(4-Methylumbelliferyl)-&#945;-D-N-acetylneuraminic acid (MUNANA) substrate to release the fluorescent product 4-methylumbelliferone (4-MU). Therefore, the inhibitory effect of an NA inhibitor on the influenza virus NA is determined based on the concentration of the NA inhibitor that is required to reduce 50% of the NA activity, given as an IC50 value.

We describe the use of a phenotypic fluorescence-based neuraminidase inhibition assay to assess the susceptibility of influenza A and B viruses to the neuraminidase inhibitor class of antivirals.

Floresans tabanlı Nöraminidaz İnhibisyonu Tahlili antivirallerin nöraminidaz inhibitörü Class Nezle Virüslerinden eğilimi değerlendirilebilir

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...

Phenotypic Analysis of Rodent Malaria Parasite Asexual and Sexual Blood Stages and Mosquito Stages

Recent advances in genetics and systems biology technologies have promoted our understanding of the biology of malaria parasites on the molecular level. However, effective malaria parasite targets for vaccine and chemotherapy development are still limited. This is largely due to the unavailability of relevant and practical in vivo infection models for human Plasmodium species, most notably for P.&#160;falciparum and P. vivax. Therefore, rodent malaria species have been extensively used as practical alternative in vivo models for malaria vaccine, drug targeting, immune response, and functional characterization studies of conserved Plasmodiumspp. genes. Indeed, rodent malaria models have proven to be invaluable, especially for exploring mosquito transmission and liver stage biology, and were indispensable for immunological studies. However, there are discrepancies in the methods used to evaluate the phenotypes of transgenic and wild-type asexual and sexual blood-stage parasites.&#160;Examples of these discrepancies are the choice of an intravenous vs. intraperitoneal infection of rodents with blood-stage parasites and the evaluation of male gamete exflagellation. Herein, we detail standardized experimental methods to evaluate the phenotypes of asexual and sexual blood stages in transgenic parasites expressing reporter-gene or wild-type rodent malaria parasite species. We also detail the methods to evaluate the phenotypes of malaria parasite mosquito stages (gametes, ookinetes, oocysts, and sporozoites) inside Anopheles mosquito vectors. These methods are detailed and simplified here for the lethal and non-lethal strains of P. berghei and P. yoelii but can also be applied with some adjustments to P. chabaudi and P. vinckei rodent malaria species.

Due to the striking similarities of the life cycle and biology of rodent malaria parasites to human malaria parasites, rodent malaria models have become indispensable for malaria research. Herein, we standardized some of the most important techniques used in the phenotypic analysis of wild-type and transgenic rodent malaria species.

Kemirgen Sıtma paraziti Asexual ve cinsel kan aşamaları ve sivrisinek aşamaları phenotypic Analizi

Recent advances in genetics and systems biology technologies have promoted our understanding of the biology of malaria parasites on the molecular level. ...

Generating Recombinant Avian Herpesvirus Vectors with CRISPR/Cas9 Gene Editing

Herpesvirus of turkeys (HVT) is an ideal viral vector for the generation of recombinant vaccines against a number of avian diseases, such as avian influenza (AI), Newcastle disease (ND), and infectious bursal disease (IBD), using bacterial artificial chromosome (BAC) mutagenesis or conventional recombination methods. The clustered regularly interspaced palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 system has been successfully used in many settings for gene editing, including the manipulation of several large DNA virus genomes. We have developed a rapid and efficient CRISPR/Cas9-mediated genome editing pipeline to generate recombinant HVT. To maximize the potential use of this method, we present here detailed information about the methodology of generating recombinant HVT expressing the VP2 protein of IBDV. The VP2 expression cassette is inserted into the HVT genome via an NHEJ (nonhomologous end-joining)-dependent repair pathway. A green fluorescence protein (GFP) expression cassette is first attached to the insert for easy visualization and then removed via the Cre-LoxP system. This approach offers an efficient way to introduce other viral antigens into the HVT genome for the rapid development of recombinant vaccines.

Herpesvirus of turkeys (HVT) is widely used as a vector platform for the generation of recombinant vaccines against a number of avian diseases. This article describes a simple and rapid approach for the generation of recombinant HVT-vectored vaccines using an integrated NHEJ-CRISPR/Cas9 and Cre-Lox system.