The authors thank Masaki Yoda and Elise Lamar for critical reading of the manuscript, Kazumasa Takenouchi for help with histology, Mari Fujiwara for help with microscopy and Makoto Morikawa for help in photographing human and mouse auditory ossicles.

Bu çalışmada yapılan tüm hayvan prosedürleri Keio Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanan (IACUC - onay numarası: 09221) ve araştırma hayvanların kullanımı için Keio Üniversitesi&#39;nde Hayvan Deneyleri üzerinde Kurumsal Yönergeleri izleyin. İnsan örnekler Anatomi, Keio Üniversitesi Tıp Fakültesi Anabilim bağışlanan bir kadavradan izole edilmiştir ve kurumsal düzenlemelere uygun olarak kullanılmıştır. İşitsel Bulla ve Kapsül 1. İzolasyonu <ol><li> Solunum havalandırma min fazla bitene kadar izofluran veya sevofluran batırılmış kağıt havlu üzerinde bir platform içeren bir kavanoza fareler Euthanize ve sonra servikal dislokasyon gerçekleştirin. batırılmış kağıt havlu ile farelerin doğrudan temas önlemek için dikkatli olun. </li><li> boyun sırt tarafında küçük bir enine bir kesi yapmak ve kafasına doğru ayrı cilt çekin ve iki elinizi kullanarak kuyruk altında yatan boyun mu maruzSistemik lupus dokusu. </li><li> 14 cm keskin cerrahi makas kullanarak Servikal bölgede fareler başını kesmek. </li><li> tamamen burnuna doğru soyma cilt. burnu ve kesici diş ile birlikte tüm cilt kesti. </li><li> ağzına makas yerleştirin ve her iki tarafta masseter kasları kesti. </li><li> dikkatle çene açın ve birlikte dil ve alt çene çıkarın. </li><li> Midsagital düzlemde (Şekil 1A, B) boyunca ikiye keskin bir makas, split kafatası ve kafa tabanı kullanma. </li><li> forseps kullanarak, serebral ve serebellar hemisferlerin ve beyin sapı çıkarın. işitsel bül ve kapsül beyincik ve beyin sapı lateral yer almaktadır. İşitsel bül işitsel kapsül (Şekil 1C, D) daha fazla yanal olarak olduğuna dikkat edin. </li><li> Çevreleyen kafatası kemiği (Şekil 1E) ile bül ve kapsül parçalara ayır. </li><li> Oda sıcaklığında fosfat tamponlu tuz (PBS), pH 7.4 ihtiva eden bir çanak için numune aktarın. </li><li> Ubinoküler diseksiyon mikroskobu nder, bül ve kapsül (Şekil 1F) etrafında gevşetilmiş sınır kesmek için çevredeki kemikleri ve makas ayrı çekmek için forseps kullanabilir. kaldırıldı çevreleyen kemikler basioccipital (ventral sınır), exoccipital (ventro-posterior sınır), supraoccipital (arka kenar), interparietal, paryetal (dorsal sınır), skuamöz (dorso-anterior sınır), alisphenoid (anterior sınır) ve basisphenoid vardır (antero-ventral sınır) kemikleri. Östaki tüpünün 41 timpanik açılmasını destekler styliform süreci (Sp), temporal kemik stiloid farklı olduğunu unutmayın. </li></ol> Malleus, örs ve stapes: işitme kemiklerine 2. izolasyonu <ol><li> çekiç kemiği <ol><li> Kulak zarı görülebilecek şekilde küçük bir makas ve forseps hem kullanarak, (Şekil 2A, B sulkus tympanicus dış kulak yolu yanal parçası kaldırmak). </li><li> Ventral (noktalı) ve posterior (#) duvarları (Şekil 2C) malleal processus brevis (yuvarlak apofizlidir, Tartışma), hem de yakın kulak zarı ve kulak kemiğinin bir kısmını çıkarın. Malleus ve tensör timpani kas şimdi (Şekil 2B, E) açık olmalıdır. </li><li> Malleus ile stapes tabanı (Şekil 2F) kaldırın ve bir 27 G iğne (Şekil 2G) eğimli kenarı tensör timpani kas kesti. diğer memelilerde görüldüğü gibi malleal manubrium sıkıca timpanik membrana takılan unutmayın. </li><li> kırılgan manubrium, dikkatlice kulak zarına ayırın. Üç işitsel kemikçik ortaya çıkarmak için timpanik kemik çıkarın. </li><li> Kemikçik eklem (Şekil 2H) de inkus gelen malleus ile stapes tabanı yerinden. </li><li> goniale anterior süreci çatlatma ile malleus ile stapes tabanı izole edin. </li></ol></li><li> Incus ve Stapes <ol><li> t yalıtmakKısa crus (Şekil 3A) inkus posterior ligament keserek o incus. </li><li> 27 G iğne (Şekil 3B, C) kesik kenarı stapes yakın stapes arter keserek stapes izole edin. Gerekirse, iğne ile stapes kas sürecinde stapes kasının tendonu kesti. </li><li> stapesin obturator foramen içine dikiş iğnesine (veya işaretleme pimi) takın ve stapes yukarı kaldırın. Stapes uzaklaştırıldıktan sonra, oval pencere açıklığı açıkça görülebilir (Şekil 3D) olmalıdır. </li></ol></li></ol> İşitsel Bulla ve Kapsül 3. gömülmesi <ol><li> Parafine gömme için hazırlık <ol><li> Bölüm 1 &#39;de tarif edildiği gibi bül ve kapsül izole edin. </li><li> Makasla rahatsız bül (styliform işlemi) ön ucu kesilir, 4 ° C&#39;de PBS içinde% 4 paraformaldehid (PFA) bül ve kapsül batırmakC ve fiksatif bül içine girmesine izin verir. Hava bulla hapsolur ise, bir iğne ve şırınga ile çıkarın. Bir tüp rotator 4 ° CO / N de fiksatif bül ve kapsül bırakın. Dikkat: PFA toksik ve dikkatle ele alınmalıdır. </li><li> Bir kez PBS ile yıkayın. </li><li> % 10 etilendiamintetraasetik asit disodyum tuzu dihidrat 4 ° C&#39;de bir hafta kirecini bül ve kapsül (EDTA 2Na), 2 ml bir tüp içinde 100 mM Tris baz, pH 7.0. Her gün tampon değiştirin. </li><li> Bir kez PBS ile yıkayın. Numuneler 4 ° C&#39;de su içinde% 70 etanol içinde saklanır. İsteğe bağlı olarak, kademeli alkol serisi (% 30,% 50, su içinde% 70) ile,% 70 etanol aktarın. </li><li> Doku işlemcide (4x 40 ° C&#39;de her biri 1 saat), ksilen içinde açık bir etanol çözeltileri kademeli bir seri örnekleri (% 70, 2 x% 95, 3 x% 100 her biri 1 H), kurutma, ile numune sızmaya erimiş parafin mumu 42. İsteğe bağlı olarak, ticari doku clearin ile yerine ksileng çözelti (örneğin, Histo-Temizle). </li><li> işlemci örnekleri boşaltın ve onların kasetleri çıkarın. </li><li> Bir doku gömme konsol sisteminde, bir yerde erimiş parafin mumu ile dolu kalıplar içine numune. (Bölüm 4) gömme geçin. </li></ol></li><li> (Kawamoto film yöntemiyle) dondurulmuş blokların gömme için hazırlık 43 <ol><li> Bölüm 1 &#39;de tarif edildiği gibi bül ve kapsül izole edin. </li><li> makası ile bül (styliform işlemi) ön ucu kesilir, 4 ° C &#39;de (antijenikliği korumak için% 2 ya da% 1 PFA yerine PBS içinde% 4) sabitleştirici bül ve kapsül bırakın. Hava bulla kaldıysa, bir iğne ve şırınga kullanılarak çıkarın. Bir tüp rotator 4 ° CO / N de fiksatif bül ve kapsül bırakın. </li><li> PBS hızla bül ve kapsül yıkayın ve hemen 4 ° C&#39;de sıvı cryo-gömme bileşik batırın. </li><li> Önemli: hava kabarcıklarını çıkarın eğer ortada herhangi birve bir iğne ile, ve forseps ile gömme bileşiğin eklenmesi ile aspirasyon yoluyla dış kulak. (Bölüm 4) gömme geçin. </li></ol></li></ol> 4. Numune Oryantasyon ve katıştırma Not: Bütün bül ve kapsül arzu edilen bölümleri kesmek için gömme boyunca belirli bir yönde düzenlenmiş olması gerekir. aşağıda belirtilen prosedürler bölümüne, çeşitli yönlerde malleus ile stapes tabanı kullanılmaktadır. <ol><li> Malleusun Boyuna (Parasagital) kesit <ol><li> Sıcak parafin (veya cryo gömme bileşik) aşağı bül veya dış kulak yolu lateral tarafını koyun. Malleusun boyun ve enine lamina gömme çanak (- C Şekil 4A) yatay altına paralel olacak şekilde yönlendirmeyi ayarlayın. Timpanik membran fare kafasının (Şekil 4A&#39;da dikey yaklaşık 30 ° &#39;lik bir açı ile eğimli dikkat edin; Şekil 59 Kampen <sup&gt; 44). </li></ol></li><li> Malleusun Yatay kesit <ol><li> Sıcak parafin (veya cryo gömme bileşik) yatay dorsal tepe yerleştirin. Malleusun boyun ve enine lamina gömme kabı (- F Şekil 4D) tabanına dik olacak şekilde bül ve kapsülün yönünü ayarlar. </li></ol></li><li> Manubrium ve kulak zarı 5 frontal kesit (kesitler) <ol><li> Bu gömme tabağın tabanına dik olacak şekilde sıcak bir parafin (veya kriyo-gömme bileşim) &#39;de malleal manubrium yerleştirin. </li></ol></li><li> Bir doku gömme konsol sistemi üzerinde parafin sertleşmesine uygun sıcaklıklara blok soğumasını (alternatif, kuru buz / hekzan banyosunda cryo gömme bileşik kullanın). </li><li> Süreç doku blok ve rutin prosedürler kullanılarak kesilmiş bölümleri. hematoksilen ve eozin (H &amp; # ile örneğin, leke parafin kesitleri38 E), safranin O (kıkırdak için) veya osteoklastlar için tartarata dirençli asit fosfataz (TRAP) aktivitesi () 3 veya imünohistokimya ile. Undekalsifiye cryosections kemik fluorochromes 14 kullanılarak etiketleme, kalsiyum alizarin kırmızısı boyama ve immünofloresans 42 için uygundur. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Burada, doğum sonrası farelerde işitsel bül ve kapsül izole etmek için kullanışlı bir yöntem mevcut. P12 önce, dokular kırılgan ve izolasyonu sırasında zarar görebilir. P12 sonra, işitsel bül ve kapsül kolay çevre dokulardan izole edilebilir. kesit önce kafa bül Kesme pek çok avantajı vardır. İlk olarak, doğum sonrası kavitasyon ve işitsel bül büyüme en aktif itibaren P6 meydana gelir ve P14 50 tarafından tamamlandı. kulak zarı ve koklear duvar arasındaki mezenkimal doku kavitasyon sürecinde hava ile değiştirilir. orta kulak boşluğunda bileşke hava fiksasyon, yumuşatma ve gömme sırasında doku ve sıvılar arasındaki teması engelleyebilir. Ön uç (styliform sürecini) keserek yerine unisolated bül bunu yapmak çalışarak izole işitsel bül havayı çıkarmak için daha kolaydır. İkinci olarak, malleus (ve kulak zarı) yönünü dikey değilKafada. Bu, belirli bir yönde izole işitsel bül ve kapsül gömerek istenilen düzlemde malleus ile stapes tabanı bölümünde bu nedenle kolaydır. izole sonra, işitsel bül ve kapsüller çeşitli analizler için de yararlıdır. Örneğin, yüksek çözünürlüklü X-ışını mikro-BT gibi malleus 14 osteojenik kılcal damarlar gibi kemik mikro morfoloji ortaya çıkarabilir. Stereofluorescence diseksiyon mikroskobu, orta veya iç kulak 33 floresan proteinleri ifade muhabiri fareler değerlendirmede yapıları görselleştirmek için güçlü bir araçtır. Buna ek olarak, in vivo veya ex vivo olarak floresans etiketleme yöntemleri ve bütün montaj immünofloresan algılama çeşitli üstlenilebilir. Işık levha floresan mikroskobu da üç boyutlu analiz 51 için yararlıdır. Burada açıklanmamış olmasına rağmen, çeşitli anatomik yapıları, periferal sinirler, kan damarları gibi işitsel bül ve kapsül ile bağlantılı veOrta kulaktaki kulak zarı da bu protokolü kullanarak değerlendirilebilir. O parafin kesit mineralizasyon analizini izin vermez, bu nedenle gömmeden önce kemik dokularının dekalsifikasyon gerektirir ve unutmayın. Buna karşılık, dondurulmuş kesitler hazırlamak için kullanılan Kawamoto filmi yöntemi 43 yumuşatma gerçekleştirilir, örneğin Alizarin boyama gibi in vivo kemik etiketleme teknikleri ya da özel boyama kullanılarak mineralizasyon çalışmalar için uygun olan edilebilir. Kriyo-ayırma koşulları, fare yaşına göre göre optimize edilmelidir. Örneğin, kriyostat odası içinde bir daha soğuk ısı bölümlerine hasarı en aza indirmek için daha büyük bir fare numuneler için tavsiye edilir. Fare, malleusun önde gelen yarı küresel çıkıntı için doğru terim &quot;orbicular apophysis&quot; dir. Bununla birlikte, &quot;prosesus brevis&quot; çok fazla th yuvarlak apofize belirtmek için kullanılmaktadırÖzellikle fare gelişimsel biyologlar 16,20,22-25 arasında bir iki yıl. &quot;Prosessus brevis&quot; aslen orbicular apofizlidir farklı yanal süreç (processus lateralis), atıfta bulundu. İnsanlarda, hafif konik bir çıkıntı benzeyen bir yanal işlemi (şekil 6B, dış görünüşü görülmektedir) manubrium uzanan kulak zarı bağlanma genel hat oluşturur. Farelerde, yan işlemi, umbo 48 karşı ucunda manubrium bir tahmindir. Kulak zarının pars flaccida malleusun yanal süreç üzerindedir. Yuvarlak apofizi insan malleusun belirgin değildir.

Orta kulak üç işitsel kemikçikleri, yani malleus, incus ve stapes, kulak iç kulak zarının ya da koklea 1,2 ses iletir bir memeli özgü işitsel zinciri oluştururlar. İşitme fonksiyonu İşitsel Beyin Sapı Yanıtı (ABR) 3-6 ve Laser Doppler Vibrometry (LDV) 7 kullanılarak izlenebilir kulak zarı arkasında malleusun titreşim eşikleri ölçerek farelerde değerlendirilebilir. ABR, LDV ve otoakustik emisyon (DPOAE) ölçümleri birleştirerek, iletim tipi işitme kaybı sensorinöral bozukluğu 8 ayırt edilebilir. Kulak koşulları hayvan modelleri her yaştan hastaların refahı için işitme ve kulak sağlığı önemi göz önüne alındığında, ihtiyaç vardır. Örneğin, orta kulak iltihabı, insan bebekler ve çocuklarda ve şiddetli, akut otitis media görülen son derece yaygın bir kulak enfeksiyonu ve komplikasyonları Condi oluşabiliryon uygun antimikrobik 9 ile tedavi edilmez. Otitis media Fare modelleri patogenezini anlamak ve tedaviler 10,11 geliştirilmesinde faydalı olabilir. (Malleusun goniale kısmı hariç) endokondral kemikleşme 12,13 oluşturduğu Murin kemikçikleri, kemik metabolizması ve morfolojilerinden çalışmaya son derece alakalı. Birincisi, kendi küçük boyutlu X-ray veya floresan mikroskobu 14 kullanılarak sağlam bir periost ile kemiklerin yüksek çözünürlüklü analiz sağlar. İkincisi, bu tür kemik hücreleri 15 arasında aşırı veya yetersiz kemik erimesinin, veya bozulmuş etkileşimleri gibi anormal kemik metabolizması, kayıp 3,4,7 işitme potansiyel katılımcı olarak analiz edilebilir. Üçüncü olarak, anormal kemik parçası morfogenez gibi Hoxa2 16-19 Msx1 20-22 Prrx1 23 Goosecoid yoksun hayvanlarda gibi çeşitli gen eksikliği olan farelerde, bildirilir(GSC) 24,25, Bapx1 13 Tshz1 26 dusp6 (Mkp3) 27, Noggin (Nog), 28, FGFR1 29 farelerde tiroid hormon reseptörleri (thrA, Thrb) 5 Bcl2 30 ve diğerleri 1,31 ya da aşırı eksprese Hoxa2 32. Son olarak, kendi küçük boyutuna rağmen, yapıları kaslar 33 ve eklem 34,35 olarak Kemikcikler ile ilişkili erişilebilir. Fare kemikçikleri insan kemiklerinin daha küçük, ama fare orta kulak insan muadili bir minyatür sürümü değil dikkat çekicidir. İnsanlarda, oluşum safhasındaki stapedial arter gebelik sırasında kaybolur, oysa Örneğin farelerde, üzengi halkası geçer stapedial arter, yaşam 36 boyunca devam eder. Buna ek olarak, fare malleusun morfolojisi th farklıdıre insan kemik (Şekil 6). İnsanlarda, temporal kemik trabeküler kemiğin oluşan mastoid hava hücreleri bül 37 yerine kemikçik evler ise farelerde, işitsel (timpanik) bül, hava dolu orta kulak boşluğu kapatmaktadır. Her iki türde de işitsel kapsül (otik kapsül, kemik labirent) koklea ve iç kulak yarı dairesel kanallar kapsar. Orta kulak Karşılaştırmalı ve evrimsel biyoloji yoğun 38-40 gözden geçirilmiştir. İlk Aşağıda verilen protokol sırasıyla, öncelikle orta kulak ve iç kulak oluşan işitme bül ve kapsül, teşrih açıklamaktadır. Bu protokol aynı zamanda işitsel bül gelen malleus, incus ve stapes izole etmek için nasıl gösterir. Son olarak, işitsel kemiklerin doku kesit için hazırlık gömmek için işitsel bül ve kapsül yönlendirmek için nasıl gösterir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="823">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:240px;">Tools/Equipment</td>
			<td style="width:201px;"></td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td style="width:259px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Paper towel</td>
			<td>DAIO PAPER CORPORATION</td>
			<td>703347</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glass Jar</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">14cm surgical scissors</td>
			<td>Fine Science Tools (F.S.T.)</td>
			<td>91400-14</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Extra fine scissors-straight</td>
			<td>Fine Science Tools (F.S.T.)</td>
			<td>14084-08</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fine Forceps Angled 45&#176;</td>
			<td>Fine Science Tools (F.S.T.)</td>
			<td>11063-07</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dissecting microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ800N</td>
			<td>for routine dissection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dissecting microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ18</td>
			<td>for movies&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Injection needle 27G</td>
			<td>TERUMO</td>
			<td>NN-2719S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe (1ml)</td>
			<td>TERUMO</td>
			<td>SS-01T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Marking Pin</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tube rotator RT-50</td>
			<td>TAITEC</td>
			<td>0000165-000</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="67">
			<td height="67" style="height:67px;">Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM3050S</td>
			<td style="width:259px;">http://www.leicabiosystems.com/histology-equipment/cryostats/details/product/leica-cm3050-s/</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TC-65 Tungsten blade</td>
			<td>Leica</td>
			<td>14021626379</td>
			<td>for Kawamoto&#39;s firm method</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Stainless containers</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>for Kawamoto&#39;s firm method</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cryofilm type IIC</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>for Kawamoto&#39;s firm method</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Silane coated slide (New Silane II)</td>
			<td>Muto Pure Chemicals</td>
			<td>511617</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cover glass</td>
			<td>Matsunami</td>
			<td></td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tissue processor</td>
			<td>Sakura Finetek</td>
			<td style="width:124px;">VIP-5</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tissue Embedding Console System</td>
			<td>Sakura Finetek</td>
			<td style="width:124px;">Tissue-Tek TEC 5&#160;</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sliding microtome for paraffin</td>
			<td>Yamato Kohki Industrial</td>
			<td>REM-710</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Path Blade+pro for hard tissue</td>
			<td>Matsunami</td>
			<td>PB3503C</td>
			<td>for paraffin section</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Micro-CT</td>
			<td>RIGAKU</td>
			<td>R_mCT2</td>
			<td>http://www.rigaku.com/en</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fluorescence microscope</td>
			<td>KEYENCE</td>
			<td>BZ-9000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Isoflurane</td>
			<td>Maruishi pharmaceutical Co. Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaCl</td>
			<td>wako</td>
			<td>191-01665</td>
			<td>for PBS</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KCl</td>
			<td>wako</td>
			<td>285-14</td>
			<td>for PBS</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Na2HPO4 12H2O</td>
			<td>wako</td>
			<td>196-02835</td>
			<td>for PBS</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">KH2PO4</td>
			<td>wako</td>
			<td>287-21</td>
			<td>for PBS</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Paraformaldehyde(EM Grade)</td>
			<td>TAAB</td>
			<td>P001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EDTA-2Na</td>
			<td>wako</td>
			<td>15111-45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trizma base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1503-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Super Cryoembedding Medium</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>for Kawamoto&#39;s firm method</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dry Ice</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td>for Kawamoto&#39;s firm method</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hexane</td>
			<td>wako</td>
			<td>080-03423</td>
			<td>for Kawamoto&#39;s firm method</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Super Cryomouting Medium type R2</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>for Kawamoto&#39;s firm method</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Paraffin</td>
			<td>Sakura Finetek</td>
			<td>781001A0107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Histo-Clear</td>
			<td>NDS</td>
			<td>HS-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Calcein</td>
			<td>DOJINDO</td>
			<td>340-00433</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hematoxylin&#160;</td>
			<td>wako</td>
			<td>131-09665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Eosin</td>
			<td>wako</td>
			<td>051-06515</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection of the auditory bulla in postnatal mice: isolation of the middle ear bones and histological analysis

En Memelilerde, malleus, inkus ve stapes olmak üzere orta kulakta işitme kemikçikleri, en küçük kemiklerdir. Farelerde, bir kemik yapısı işitsel kapsül iç kulağı, yani koklea ve semisirküler kanallar kapsayan oysa işitsel bül, kemikçik evler çağırdı. Murin kemikçikler otolaringoloji alanındaki araştırmacılar büyük ilgi dolayısıyla işitme ve için gerekli olan, ancak onların metabolizma, gelişim ve evrim diğer alanlarda son derece alakalı. Değişmiş kemik metabolizması erişkin farelerde işitme fonksiyonu etkileyebilir ve çeşitli gen yoksun fareler in utero işitme kemiklerine morfogenezindeki değişiklikleri göstermek. fare işitsel kemikçikler küçük olmasına rağmen bir anatomik oryantasyon ve 3D yapısını anlar ise, kendi manipülasyon mümkündür. Burada, işitsel bül ve doğum sonrası farelerin kapsülü incelemek ve sonra bül kısmını kaldırarak bireysel kemikçik izole açıklanmıştır. Biz de tartışmak nasıl em içinfarklı yönlerde yatak bül ve kapsül malleusun, uzunlamasına yatay, ya da frontal kesitlerin hazırlanması için parafin veya dondurulmuş kesitler uygun üretmek için. Son olarak, biz fare ve insan işitme kemiklerine arasındaki anatomik farklılıklar numaralandırmak. Bu yöntemler işitsel kemiklerin, patolojik gelişim ve evrimsel açıdan ve farelerde orta kulağa analiz yararlı olacaktır.

Bu protokol, fare işitsel bül gelen kemikçik izole etmek için bir yöntem sunar. İlk olarak, bül ve kapsül kafatası (Şekil 1) tek bir parça olarak kesilir. Parçalara bül sonra malleus ile stapes tabanı (Şekil 2) ve örs ve üzengi (Şekil 3) hazırlamak için kullanılır. Işitsel bül ve kapsülün Merkezi bül, dorsal sorguç, ön semisirküler kanal ve subarcuate fossa (Şekil 1F) ön ucunda styliform süreçtir. Microcomputed tomografi (BT) görüntüleme işitsel bül kemikçiklerdeki yanı sıra bu kemiklerin uzunlamasına ve yatay bir kesit (Şekil 4) için en uygun oryantasyon ortaya koymaktadır. malleusun uzunlamasına parafın kesit için, bül ve kapsül pa gömülü bir hafta boyunca 4 ° C&#39;de EDTA içinde dekalsifiye edildiŞekil 4 A&#39;da gösterilen yönde de raffin blok - C, 4 um kesitler ve daha sonra H &amp; E ile boyandı. Işitsel bül de kulak zarı bağlı malleus P14 (Şekil 5A) devam eden endokondral ossifikasyon saptandı. yeni kemik oluşumunu görselleştirmek için, kalsein (30 mg / g vücut ağırlığı), periton bir P20 fareye enjekte edildi ve bül ve kapsül P21, 24 saat sonra izole edilmiştir. Yumuşatma olmaksızın örnek dondurulup yerleştirilebilir ve Kawamoto 43 yöntemine göre bir yapışkan film kullanılarak 6 uM&#39;de cryosectioned edildi. DAPI ile nükleer boyama (4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindol) sonra bu bölüm flöresanlı bir mikroskop altında gözlemlendi. Kalsein sinyalleri (yeşil) Malleus (m) &#39;de, yeni kemik oluşumunu, bül ve kapsül (Şekil 5B) gösterdi. malleusun yatay kesit için, 5 haftalık bir fare izole işitsel bül için (yumuşatma olmadan donmuş gömülüoryantasyon Şekil 4D bkz - Kawamoto yöntemi kullanılarak 6 mikron olarak cryosectioned F) ve H &amp; E ile boyandı. Malleal Processus brevis (MPB) yatay kesit, aynı zamanda koklea (Şekil 5C) göstermektedir. Bir P31 fare izole sağ işitme kemiklerine bir medial görünüm fare malleusun tipik özelliklerini gösterir, yani &quot;kayma-martı kanat benzeri&quot; (ya da Farsça kılıç gibi 45) manubrium, önemli bir processus brevis (yuvarlak apofiz ,) (Şekil 6) Tartışma görebilir ve enine lamina. Ön işlem (prosesus anterior) goniale yaklaşık diseksiyon işlemi kırıldığı ve (ectotympanic) timpanik halkasından ayrılabilir dikkat etmek gerekir. incudostapedial eklem yerinden oysa bu temsili numune, malleus ve inkus arasında sağlam bir incudomalleolar eklemi sergiler. malleal içine tendon girmeler vestapedial kas işlemler tespit (Şekil 6A, yıldızlar) vardır. Şekil 6B, aynı büyütmede, fare ve insan işitme kemiklerine karşılaştırır. boyut dışındaki türlerden farklılıklar, aşağıdakileri içerir. malleal manubrium kanat benzeri farelerde ancak insanlarda kulüp gibi. anatomik ekseni (ya da dönme ekseni, malleusun inkus ve kısa bir süreç ön işleminde çizgi) ve manubrium arasındaki açı farelerde çok küçük ve hemen hemen dik olan karşıt iki hemen hemen paralel olan insanlarda 6,46-48 yılında. İnsan Kemikcikler olarak, vibrometric çalışmalar incudo-malleoler ortak işlevsel 49 sabit ziyade hareketli olduğunu ortaya koymaktadır. Fare Malleus insanlarda 47 belirgin olmayan bir geniş, ince ve düz enine lamina sergiler. Farelerde, prosesus ön zar kemik, yani goniale ve tympani üzere kaynaşırC halkasının, insanlarda prosesus ön kemik 41 küçük bir spicule düşürülür ise. Fare ve insan üzengi da farklıdır: farelerde, ön crus kavislidir ve arka crus daha düz ise, insanlarda olduğu, ön crus düz arka crus daha fazladır. Bu vücut büyüklüğüne malleus baş göreli kitlesel &quot;küçük&quot; kemiklerin 48 allometrik ilişkilerinde önemli değişkenlik gösteren, örneğin altın köstebek gibi türler büyütülür dikkati çekiyor. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/55054/55054fig1.jpg" /> Şekil İşitsel Bulla ve Kapsül 1. Diseksiyon. Bir P31 fare kafatası (A) sağ ve sol yarısı ayrılmıştır. A, ön; P, arka; L, sol; R, doğru. (B) ikiye, derili başının sağ yarısında medial yüzeyi. Cx, serebral korteks; Cb, beyincik; İşletmeleri, brainstem. D, dorsal; V, ventral. Forseps ile beyin (C) Sökme. (D) sağ kafatasında işitsel kapsül medial görünümü. dorsal tepe (ok başları), orta kranial fossa (MCF) ve posterior fossa (pcf) arasında uzanan ve dorso-anterior ve işitsel kapsülün ventro-arka yüzeyleri ayırır. Ölçek çubuğu, 2 mm. (E), işitsel bül ve kapsül (medial görünüm) Yüksek büyütme. Co, koklea; VII, yüz siniri; VIII, sinir vestibülokohlear; AC, anterior (üstün) semisirküler kanal; serebellar paraflokkulusun evler sf, subarcuate fossa. Ölçek çubuğu, 1 mm. İzole işitsel bül ve kapsül (medial görünüm) (F) Mikrografik. Sp, styliform süreci. Ölçek çubuğu, 1 mm. (A - E), P31 fare. (F), P33 fare. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55054/55054fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/55054/55054fig2.jpg" /> Malleusun 2. Diseksiyon Şekil. (A) sağ işitsel bül ve kapsülün ventrolateral görünümü. sulkus tympanicus (ST, kesik ok) kulak zarı eki sitesidir. ST kemik yanal dış kulak parçası ve ST kemik medial orta kulak boşluğunun tabanını oluşturur. A, ön; P, arka; D, dorsal; V, ventral. Dış kulak yolu çıkarıldıktan sonra (B) Görünüm pars flaccida (Pf) ve tensa pars (Pt) dahil timpanik membran (TM) ortaya çıkarmak için. Timpanik kemik malleal prosesus brevis (MPB) yakınındaki (noktalı çizgiler ve #) parçaları (C) çıkarılması. m, malleus; mM malleal manubrium. kulak zarından görülen orta kulak boşluğunda, hava kabarcığı ok. (D) Exposed malleus. Malleus kafa gösterilir. Noktalıhat inkus eklem yüzeyini gösterir. Tensör timpani kasının (E) tendon (TT) malleusun bağlı. Malleus kaldırıldığında (F) tensör tympani çekilir. * Kas süreç. (G) tensör timpaninin iğne kullanılarak kesilir. Üç işitsel kemikçikler kulak zarı çıkarıldıktan sonra (H). incudo-malleoler eklem yerinden edilir. m, malleus; i incus; s, stapes; , Goniale (çekiç kemiği ve timpanik halka, TR kaynaştırılmış) gidin. Tüm ölçek barlar, 0.5 mm. (A, lH), P33 fare. (B - G), P31 fare. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55054/55054fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/55054/55054fig3.jpg" /> Şekil inkus ve stapes 3. Diseksiyon. (A) incus vemalleusun çıkarılmasından sonra üzengi. stapedial arterin (SA) üzengi (ler) geçer. Noktalı çizgi inkus eklem yüzeyini gösterir. kısa bacak inkus (i) (ICB, crus breve) posterior ligaman sabit unutmayın (gösterilmemiştir). Asterisk, stapes kas süreci. (B) inkus çıkarılmasından sonra Stapes. İğne ucu stapedial arter (SA) kesmek için kullanılır. Kan akış yönünü ok. Noktalı çizgi stapesin eklem yüzeyini gösterir. (C) stapedial arter üzengi kaldırılır. X stapes arter (SA) kesik ucunu gösterir. (D) oval pencere (Ah, fenestra ovalis veya fenestra Vestibül) stapes çıkarılmasından sonra görülebilir. Rw, yuvarlak pencere (fenestra rotunda veya fenestra cochleae). Ölçek çubukları, 0.5 mm. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55054/55054fig3large.jpg" target="_blank">Bu daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız</a>rakam. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/55054/55054fig4.jpg" /> (- C parasagital, A) ve Yatay (D - E) malleusun Kesit Boyuna için gömülmesi sırasında İşitsel bül ve Kapsül yönlendirme Şekil 4.. (A - C) malleusun boyun ve enine lamina çanak gömme tabanına paralel yerleştirilir. (A) Yandan görünüm: Mikro BT görüntüsünde (mavi yalancı) bül sağ malleusun katıştırma göstermek için. Malleus ve inkus yeşil yalancı edilir. Kesikli çizgi, istenilen kesme düzlemi. Düz çizgi, çanak gömme alt. m, malleus; ok uçları, sırt sorguç. M, medial; L, yan; D, dorsal; V, ventral. (B) Üstten görünüm: Mikro-BT görüntüsü. bül (styliform işlemi) ön ucu uzaklaştırılmıştır unutmayın. i incus. (C) Üstten görünüm: a çekilmiş mikroskobu (renk filtresi). AC, anterior (üstün) semisirküler kanal; Sf, subarcuate fossa; Sp, styliform süreci. A, ön; P, arka; D, dorsal; V, ventral. (D - F) malleusun processus brevis çanak gömme dibine dik yerleştirilir. (D) Yandan görünüm: Mikro-BT görüntüsünde sağ malleusun katıştırma göstermek için. Kesikli çizgi, istenilen kesme düzlemi. Düz çizgi, çanak gömme alt. (E) Üstten görünüm: Mikro-BT görüntüsü. mM malleal manubrium. (F) Üstten görünüm: (a renk filtresiyle çekilmiş) mikrografı. Ölçek çubukları, 1mM. Daha önce 7 açıklandığı gibi Mikro-BT görüntüleri, 5 um bir voksel çözünürlükte elde edildi. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55054/55054fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/55054/55054fig5.jpg" /> FŞEKIL 5. Histoloji. (A) H &amp; E boyama. P14 işitsel bül (noktalı çizgi), parafine gömülü sağ malleus (m) Boyuna (Parasagital) bölümü. TM, kulak zarı. (B) Calcein kemik etiketleme. P21 işitsel bül dondurulmuş, undekalsifiye sol malleus (m) Boyuna kesit. Counterstain, DAPI. (C) &#39;H &amp; E boyama. İşitsel bül ve kapsülün (5 haftalık fare) dondurulmuş, kalan undekalsifiye malleal Processus brevis (MPB) yatay kesit. Co, koklea. Ölçek çubukları, 1mM. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55054/55054fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 6," src="/files/ftp_upload/55054/55054fig6.jpg" /> Şekil 6. işitme kemiklerine medial görünümü. (A), P sağ işitme kemiklerine31 fare. A, ön; P, arka; D, dorsal; V, ventral. Ölçek çubuğu, 1 mm. Malleus kafası (Caput mallei, capitulum mallei); Boyun (Collum mallei); lamina (enine lamina); mM (Ağız sapı mallei); siyah yıldız (malleusun kas süreci); MPA (prosessus anterior, prosessus gracilis); MPB (processus brevis); örs gövdesi (Corpus incudis); ICB (Crus breve, kısa crus, kısa bir süreç); ICL (Crus longum, uzun crus, uzun bir süreç); IPL (prosessus lenticularis, lentiküler işlem olup, Silviyan apofizi); stapes başı (Caput stapedis); beyaz yıldız (stapes kas süreci); ScA (Crus anterius, ön bacak); SCP (Crus posterius, arka bacak); Baz (Baz stapedis, kürek); Sof (obturator foramen, intercrural foramen). (B) 76 yaşındaki insan kadın sağ işitsel kemikçikler (Anatomi Anabilim Tıp, Keio Üniversitesi izniyle). insan Kemikcikler için kullanıldığı gibi P31 fare kemikçikleri (sağ alt) aynı büyütmede görüntülenmiş. CurvEd oklar anatomik ekseni ile manubrium (noktalı çizgiler) arasındaki açı gösterir. Ölçek çubuğu, 2 mm. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55054/55054fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Dissection of the Auditory Bulla in Postnatal Mice: Isolation of the Middle Ear Bones and Histological Analysis at JoVE.com

Dissection of the Auditory Bulla in Postnatal Mice: Isolation of the Middle Ear Bones and Histological Analysis

We present a protocol to isolate the auditory bulla, capsule, and ossicles from postnatal mice for whole mount and histological analysis.

Doğum sonrası Farelerde İşitsel Bulla diseksiyonu: Orta Kulak Kemikler ve histolojik analiz izolasyonu

In most mammals, auditory ossicles in the middle ear, including the malleus, incus and stapes, are the smallest bones. In mice, a bony structure called ...

dissection-auditory-bulla-postnatal-mice-isolation-middle-ear-bones

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

29.8K Görüntüleme.  Keio University School of Medicine. We present a protocol to isolate the auditory bulla, capsule, and ossicles from postnatal mice for whole mount and histological analysis. 

Video: Dissection of the Auditory Bulla in Postnatal Mice: Isolation of the Middle Ear Bones and Histological Analysis

Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish (Danio rerio)

Neurosensory epithelia in the inner ear are the crucial structures for hearing and balance functions. Therefore, it is important to understand the cellular and molecular features of the epithelia, which are mainly composed of two types of cells: hair cells (HCs) and supporting cells (SCs). Here we choose to study the inner ear sensory epithelia in adult zebrafish not only because the epithelial structures are highly conserved in all vertebrates studied, but also because the adult zebrafish is able to regenerate HCs, an ability that mammals lose shortly after birth. We use the inner ear of adult zebrafish as a model system to study the mechanisms of inner ear HC regeneration in adult vertebrates that could be helpful for clinical therapy of hearing/balance deficits in human as a result of HC loss.
Here we demonstrate how to do gross and fine dissections of inner ear sensory epithelia in adult zebrafish. The gross dissection removes the tissues surrounding the inner ear and is helpful for preparing tissue sections, which allows us to examine the detailed structure of the sensory epithelia. The fine dissection cleans up the non-sensory-epithelial tissues of each individual epithelium and enables us to examine the heterogeneity of the whole epithelium easily in whole-mount epithelial samples.

Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish Danio rerio

The inner ear sensory epithelium of adult zebrafish is a good model system for understanding the mechanisms of hair cell regeneration in adult vertebrates. This protocol demonstrates the fine dissection of the epithelia, through which we can get tissue samples for studying the regenerative events at cellular and subcellular levels.

Yetişkin Zebra balığı İç Kulak Duyu Epiteli Brüt ve Güzel Diseksiyon ( Danio rerio)

Neurosensory epithelia in the inner ear are the crucial structures for hearing and balance functions. Therefore, it is important to understand the ...

Biyoloji

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. 

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the inner ear (fig 1). Hair cells in the developing cochlea, which are the mechanosensory cells of the auditory system, are aligned in one row of inner hair cells and three (in the base and mid-turns) to four (in the apical turn) rows of outer hair cells that span the length of the organ of Corti. Hair cells transduce sound-induced mechanical vibrations of the basilar membrane into neural impulses that the brain can interpret. Most cases of sensorineural hearing loss are caused by death or dysfunction of cochlear hair cells.
An increasingly essential tool in auditory research is the isolation and in vitro culture of the organ explant 1,2,9. Once isolated, the explants may be utilized in several ways to provide information regarding normative, anomalous, or therapeutic physiology. Gene expression, stereocilia motility, cell and molecular biology, as well as biological approaches for hair cell regeneration are examples of experimental applications of organ of Corti explants.
This protocol describes a method for the isolation and culture of the organ of Corti from neonatal mice. The accompanying video includes stepwise directions for the isolation of the temporal bone from mouse pups, and subsequent isolation of the cochlea, spiral ligament, and organ of Corti. Once isolated, the sensory epithelium can be plated and cultured in vitro in its entirety, or as a further dissected micro-isolate that lacks the spiral limbus and spiral ganglion neurons. Using this method, primary explants can be maintained for 7-10 days. As an example of the utility of this procedure, organ of Corti explants will be electroporated with an exogenous DsRed reporter gene. This method provides an improvement over other published methods because it provides reproducible, unambiguous, and stepwise directions for the isolation, microdissection, and primary culture of the organ of Corti.

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti.

This procedure describes a method for the isolation and culture of the murine organ of Corti with or without the spiral limbus and spiral ganglion neurons. We also demonstrate a method for the expression of an exogenous reporter gene in the organ of Corti explant by electroporation.

İlköğretim Kültür ve Corti murin Organ Plazmid Elektroporasyon.

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the ...

Isolation of Neonatal Extrahepatic Cholangiocytes

The intra and extrahepatic bile ducts of the liver are developmentally distinct, and may be differentially affected by certain diseases. However, differences between intra and extrahepatic cholangiocytes, and between neonatal and adult cells, are not well understood.
Methods for the isolation of cholangiocytes from intrahepatic bile ducts are well established1-4. Isolation of extrahepatic ductal cells, especially from the neonate, has not yet been described, although this would be of great benefit in understanding the differences between distinct cholangiocyte populations and in studying diseases such as biliary atresia that appear to target the extrahepatic ducts. Described here is an optimized technique to isolate both neonatal and adult mouse extrahepatic bile duct cells. This technique yields a pure cell population with minimal contamination from mesenchymal cells like fibroblasts.
This method is based on the removal of the extrahepatic ducts and gallbladder, followed by meticulous dissection and scraping to remove fat and fibroblast layers. Structures are embedded in thick layers of collagen and cultured for approximately 3 weeks to allow outgrowth of cholangiocytes in monolayers, which can then be trypsinized and re plated for experimental use.

A technique to isolate cholangiocytes from the extrahepatic bile ducts of neonatal mice is described. The ducts are meticulously dissected, and then cells are isolated by outgrowth in thick collagen gels. This method provides a useful tool for studying extrahepatic bile duct development and pathology.

Yenidoğan Ekstrahepatik Cholangiocytes İzolasyonu

The intra and extrahepatic bile ducts of the liver are developmentally distinct, and may be differentially affected by certain diseases. However, ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.

The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.

Murin Vana Endotel Hücreleri İzolasyon

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

Yüksek çözünürlüklü Time-lapse Görüntüleme ve Yaşayan İnsan Umbilikal Ven Endotelyal Hücrelerinde Mikrotubul Dinamiği Otomatik Analizi

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad to extract cellular DNA from whole blood in less than 2 min. The blood specimen is treated with detergent, mixed briefly and applied by pipet to the separation membrane. The lysate wicks into the blotting pad due to capillary action, capturing the genomic DNA on the surface of the separation membrane. The extracted DNA is retained on the membrane during a simple wash step wherein PCR inhibitors are wicked into the absorbent blotting pad. The membrane containing the entrapped DNA is then added to the PCR reaction without further purification. This simple method does not require laboratory equipment and can be easily implemented with inexpensive laboratory supplies. Here we describe a protocol for highly sensitive detection and quantitation of HIV-1 proviral DNA from 100 &#181;l whole blood as a model for early infant diagnosis of HIV that could readily be adapted to other genetic targets.

We describe here a simple and rapid paper-based DNA extraction method of HIV proviral DNA from whole blood detected by quantitative PCR. This protocol can be extended for use in detecting other genetic markers or using alternative amplification methods.

Nükleik Asitlerin süzülmesi İzolasyonu: basit ve hızlı DNA izolasyonu,

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

Dissection and Lipid Droplet Staining of Oenocytes in Drosophila Larvae

Lipids are essential for animal development and physiological homeostasis. Dysregulation of lipid metabolism results in various developmental defects and diseases, such as obesity and fatty liver. Usually, lipids are stored in lipid droplets, which are the multifunctional lipid storage organelles in cells. Lipid droplets vary in size and number in different tissues and under different conditions. It has been reported that lipid droplets are tightly controlled through regulation of its biogenesis and degradation. In Drosophila melanogaster, the oenocyte is an important tissue for lipid metabolism and has been recently identified as a human liver analogue regarding lipid mobilization in response to stress. However, the mechanisms underlying the regulation of lipid droplet metabolism in oenocytes remain elusive. To solve this problem, it is of utmost importance to develop a reliable and sensitive method to directly visualize lipid droplet dynamic changes in oenocytes during development and under stressful conditions. Taking advantage of the lipophilic BODIPY 493/503, a lipid droplet-specific fluorescent dye, described here is a detailed protocol for the dissection and subsequent lipid droplet staining in the oenocytes of Drosophila larvae in response to starvation. This allows for qualitative analysis of lipid droplet dynamics under various conditions by confocal microscopy. Furthermore, this rapid and highly reproducible method can also be used in genetic screens for indentifying novel genetic factors involving lipid droplet metabolism in oenocytes and other tissues.

Dissection and Lipid Droplet Staining of Oenocytes in Drosophila Larvae

Presented here are detailed methods for the dissection and lipid droplet staining of oenocytes in Drosophila larvae using BODIPY 493/503, a lipid droplet-specific fluorescent dye.

Drosophila Larvalarında Oenositlerin Diseksiyonu ve Lipid Damlacık Boyaması

Lipids are essential for animal development and physiological homeostasis. Dysregulation of lipid metabolism results in various developmental defects and ...

Isolation and Differentiation of Primary White and Brown Preadipocytes from Newborn Mice

The understanding of the mechanisms underlying adipocyte differentiation and function has greatly benefited from the use of immortalized white preadipocyte cell lines. These cultured cell lines, however, have limitations. They do not fully capture the diverse functional spectrum of the heterogenous adipocyte populations that are now known to exist within white adipose depots. To provide a more physiologically relevant model to study the complexity of white adipose tissue, a protocol has been developed and optimized to enable simultaneous isolation of primary white and brown adipocyte progenitors from newborn mice, their rapid expansion in culture, and their differentiation in vitro into mature, fully functional adipocytes. The primary advantage of isolating primary cells from newborn, rather than adult mice, is that the adipose depots are actively developing and are, therefore, a rich source of proliferating preadipocytes. Primary preadipocytes isolated using this protocol differentiate rapidly upon reaching confluence and become fully mature in 4-5 days, a temporal window that accurately reflects the appearance of developed fat pads in newborn mice. Primary cultures prepared using this strategy can be expanded and studied with high reproducibility, making them suitable for genetic and phenotypic screens and enabling the study of the cell-autonomous adipocyte phenotypes of genetic mouse models. This protocol offers a simple, rapid, and inexpensive approach to study the complexity of adipose tissue in vitro.

This report describes a protocol for the simultaneous isolation of primary brown and white preadipocytes from newborn mice. Isolated cells can be grown in culture and induced to differentiate into fully mature white and brown adipocytes. The method enables genetic, molecular, and functional characterization of primary fat cells in culture.

Primer Beyaz ve Kahverengi Preadipositlerin Yenidoğan Farelerden İzolasyonu ve Farklılaşması

The understanding of the mechanisms underlying adipocyte differentiation and function has greatly benefited from the use of immortalized white ...

Efficient Dissection and Culture of Primary Mouse Retinal Pigment Epithelial Cells

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to understand the pathophysiology of ocular diseases because of their similarities with human anatomy and physiology. Alterations in the retinal pigment epithelium (RPE), including changes in morphology and function, are common features shared by many ocular disorders. However, successful isolation and culture of primary mouse RPE cells is very challenging. This paper is an updated audiovisual version of the protocol previously published by Fernandez-Godino et al. in 2016 to efficiently isolate and culture primary mouse RPE cells. This method is highly reproducible and results in robust cultures of highly polarized and pigmented RPE monolayers that can be maintained for several weeks on Transwells. This model opens new avenues for the study of the molecular and cellular mechanisms underlying eye diseases. Moreover, it provides a platform to test therapeutic approaches that can be used to treat important eye diseases with unmet medical needs, including inherited retinal disorders and macular degenerations.

This protocol, which was originally reported by Fernandez-Godino et al. in 20161, describes a method to efficiently isolate and culture mouse RPE cells, which form a functional and polarized RPE monolayer within one week on Transwell plates. The procedure takes approximately 3 hours.

Birincil Fare Retina Pigment Epitel Hücrelerinin Verimli Diseksiyonu ve Kültürü

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to ...

Dissection of the Endolymphatic Sac from Mice

The study of mutant mouse models of human hearing and balance disorders has unraveled many structural and functional changes which may contribute to the human phenotypes. Although important progress has been done in the understanding of the development and function of the neurosensory epithelia of the cochlea and vestibula, limited knowledge is available regarding the development, cellular composition, molecular pathways and functional characteristics of the endolymphatic sac. This is, in large part, due to the difficulty of visualizing and microdissecting this tissue, which is an epithelium comprised of only one cell layer. The study presented here describes an approach to access and microdissect the endolymphatic sac from the wild-type mouse inner ear at different ages. The result of a similar dissection is shown in a pendrin-deficient mouse model of enlargement of the vestibular aqueduct. A transgenic mouse with a fluorescent endolymphatic sac is presented. This reporter mouse can be used to readily visualize the endolymphatic sac with limited dissection and determine its size. It can also be used as an educational tool to teach how to dissect the endolymphatic sac. These dissection procedures should facilitate further characterization of this understudied part of the inner ear.

<meta charset="utf8"></head><body>Farelerden Endolenfatik Kesenin Diseksiyonu

This study describes how to dissect the endolymphatic sac from the inner ear of the mouse at different ages. The result of a similar dissection is shown in an Slc26a4-null mouse model of enlargement of the endolymphatic sac. A transgenic mouse with a fluorescent reporter expressed in the endolymphatic sac is presented as a model to readily visualize the endolymphatic sac, and educational tool.

Farelerden Endolenfatik Kesenin Diseksiyonu

The study of mutant mouse models of human hearing and balance disorders has unraveled many structural and functional changes which may contribute to the ...