iş Biyolojik Araştırma Mükemmellik [hibe sayısı 1P20GM109005], Ulusal Havacılık ve Uzay Dairesi [hibe sayısı NNX15AK32A] aracılığıyla Arkansas Uzay Grant Konsorsiyumu Sağlığı Merkezi Ulusal Enstitüsü ve İş Güvenliği Ulusal Enstitüsü tarafından, kısmen, desteklenen Sağlık (NIOSH) [hibe sayısı 2T420H008436]. Yazarlar redaksiyon ve bu taslağın düzenlenmesi için Christopher Fettes teşekkür etmek istiyorum.

1. Parçacık Toplama ve Hazırlama <ol><li> Yüksek hacimli toplam asılı parçacıklar örnekleyici kalibrasyonu <ol><li> Kütle akış kontrol cihazından örnekleyici motoru kesin ve kararlı bir AC güç kaynağına (Şekil 1) motoru bağlayın. NOT: Bir filtre, bu işlem sırasında kullanılmaz. </li><li> örnekleyici kalibratör deliğini ve üstten yüklemeli adaptör plakasını monte edin. Hiçbir hava kaçağı mevcut olduğundan emin olmak için güvenli üstten yüklemeli adaptörü tutma somunlarını sıkın. örnekleyici motoru normal çalışma sıcaklığına (yaklaşık 10-15 dakika) kadar ısınmasını bekleyin. </li><li> elleriyle ağzına ağız ve basınç musluğu üstündeki delikleri kapatarak bir sızıntı testi yapıyoruz. havayı kaçan tarafından yapılan bir tiz squealing sesi dinleyin. Bu ses duyulur bir kaçak söz konusu olduğu gibi, üstten yüklemeli adaptör tutma somunları yeniden sıkın. Ses düşükse, kaçak sys diğer contalar birine yakın olduğutem. </li><li> Bir lastik vakum tüpü ile deliğin tarafındaki basınç musluğa su manometre bir tarafını bağlayın. atmosfere açık manometre karşı tarafını bırakın. doğru okuma sağlamak için dikey bir manometre tutun. sürekli akış kaydedici ters dokunulduğunda kalem ortalamak ve doğru okumalarını sağlamak için yardımcı olacaktır. </li><li> Adımı tekrarlayın / dk (yaklaşık olarak her 5-6 ft 3 / dak) 30 ila 60 ft faaliyet akış hızlarının temsil eden beş akış oranları kullanılarak 1.1.2. Beş farklı pozisyonlarda değişken ağzına düğmeyi ayarlayın ve beş farklı okumalara alır. </li><li> sertifikalı son tarih, tarih, site konumu ve kalibrasyon kağıda operatör baş harfleri ile ortam hava sıcaklığı, ortam barometrik basınç, örnekleyici seri numarası, delik seri numarası, delik eğimi ve kesişme kaydedin. </li></ol></li><li> Toplam askıda partiküller numune toplama ve gravimetrik analiz <ol><li> Wrap birAlüminyum folyo iki kat 8 &quot;x 10&quot; kuvars elyaf filtre. fırında sarılmış filtreyi yerleştirin ve 550 ° C&#39;de sıcaklığını ayarlamak. en az 4 saat süreyle filtreyi pişirin. fırın soğuması ve filtreyi almak. CaCO 3 desikatörde filtre yerleştirin. </li><li> 10 ug hassasiyetle bir mikro filtreyi tartılır. Bir gün boyunca ölçüm üç kez tekrarlayın. Bireysel ölçümler 25 mikrogram içinde olmalıdır. Bu elde değilse, desikatöre sarılmış filtreyi dönmek ve işlemini ertesi gün tekrarlayın. </li><li> Barınak kapağı (Şekil 2) açın. Dört kanat fındık gevşeterek pirinç civatalar ve contalar dışına aşağı salıncak izin vererek filtre tutucu çerçeveyi çıkarın. destekleyen ekranda, kaba yüzü yukarı, alüminyum folyo filtreyi açılmak ve dikkatle ortalamak için temizlenmiş forseps kullanabilir. Düzgün ekranda filtreyi hizalayın. </li><li> Ekranda çerçevesini yerleştirin ve sabitleyinyeterli basınç uygularken pirinç civatalar ve contalar kenarlarında hava sızıntısını önlemek için. temiz bir bezle filtre tutucu etrafında herhangi bir toz birikmesini silin. Yakın barınak kapağı dikkatli ve emniyete alın. </li><li> emin olun tüm kabloları bunların uygun priz yuvalarına takılı ve fan motoru basınç musluğu ve sürekli akış kaydedici arasında boru bağlanır. </li><li> Akış kaydedici hazırlayın. kalem noktasını yükseltmek ve yeni bir grafik eklemek için kalem kol kaldırıcı basınız. kaydedici sürücü göbeğine grafiğin sekmeyi hizalayın ve göbek üzerine grafik merkezini düşürmek için başparmak ile bastırın. grafikte doğru zaman zaman indeksi işaretçisi ile aynı hizaya gelene kadar sürücü hub saat yönünde çevirerek saati ayarlayın. </li><li> El ile örnekleyici açmak ve toplama başlar. doğru mürekkep ve geçen süre göstergesi düzgün çalıştığından emin olmak için emin olmak için kaydedici izleyin. </li><li> Örnekleme döneminin sonunda, örnekleyici, kayıt kapatmakgeçen süre ve grafik almak. Filtreyi ortaya çıkarmak için çerçeveyi çıkarın. forseps ile uçlarında hafifçe tutarak destek ekrandan maruz filtreyi kaldırmak. Bu örnek iki örnek dokunur, böylece uzunlamasına filtreyi katlayın ve orijinal alüminyum folyoya sarın. </li><li> Tartılmadan önce en az 24 saat boyunca CaCO 3 bir kurutucuda filtre saklayın. Adımı tekrarlayın 1.2.2 örnekleme sonra filtrelerin ağırlığını ölçmek için. zip plastik bir torba içinde filtreyi yerleştirin ve analize kadar -80 ° C saklayın. </li></ol></li><li> Toplanan toplam askıda partiküller numunenin analizi <ol><li> Saklanan filtre Al alüminyum folyo açılmak ve temiz bir teflon yüzeyi üzerinde filtre aktarın. forseps ve neşter kullanılarak, filtrenin dış (beyaz) bir bölümünü kesmek ve atınız. <ol><li> Daha sonra, 100 ml&#39;lik bir şişe içinde 0.5 &quot;x 0.5&quot; parçaları ve yeri parçaları filtre kesin. ultra saf su 50 ml ekleyin. Bir ultrason şişeyi koyunbanyo ve 33 ± 3 kHz 60 dakika sonikasyon. </li></ol></li><li> 100 ml&#39;lik bir yuvarlak tabanlı şişe için 0.45 um polipropilen şırınga filtre ile filtre özü. ekstresi, yaklaşık 5 ml kadar 50 ° C&#39;de basınç altında rotavap aleti kullanarak suyu buharlaştırmak şişede kalmaktadır. <ol><li> ağırlığı bilinen bir 15 ml armut şekilli bir şişeyi, kalan su buharlaşır. Kuru ekstre ile balon tartılır ve kuru özüt kütlesini kaydedin. </li></ol></li><li> 15 dakika boyunca sonike ile D 2 O 400 ul kuru örnek çözülür ve 5 mm standart NMR tüpü içine aktarın. çözünmemiş maddeleri uzaklaştırmak üzere oda sıcaklığında 12.000 x g&#39;de 5 dakika boyunca santrifüj. </li><li> O. NaN 3% 1.4 10 ul (son kons .:% 0.02 w / v) NMR tüpü içinde ekleme D2 300 ul ile tekrarlayın. NMR tüpü içinde D 2 O (nihai konsantrasyon 0.258 mM) toplam asılı parçacıklar (TSP)-d4 (3.2 mg / ml) 10 ul (32 ug) ekleyin. </li><li>600,17 MHz&#39;de çalışan bir NMR spektrometresi kullanılarak 1H NMR spektrumları elde edin. <ol><li> üçlü rezonans kriyoprob içine NMR tüpü yerleştirin. aşağıdaki sırayla enstrüman kalibre: kilidi, melodi, dolgu, 90 ° darbe uzunluğu kalibrasyon ve alıcı kazanç ayarı. </li><li> Dijital Dört algılama modunda 180 suda seçici pulsları, 8.192 taramaları 4 yapay taramaları, 8012,57 Hz tarama genişliği ile bir 1 D uyarım şekillendirici sekansı ile 25 ° C &#39;de spektrumunu ölçmek, frekans 4.70 ppm&#39;de ayarlanmıştır su sinyal bastırılması, 1.70 için ofset sn kazanım süresi, 32.768 time domain veri noktaları (TD), 1 msn süre gradyan (p16), gradyan (D16) sonra 100 mikro-sn kurtarma gecikme. </li></ol></li><li> Proses 1 2 (65,536 veri noktaları) içindeki bir faktör ile, 1 Hz ve sıfır dolgulu bir hat genişletmesi uygulanarak NMR spektrumları. elle faz ve taban çizgisini düzeltin ve entegre. 0.0 ppm TSP-d4 zirve ayarlayın. </li></ol></li></ol> 2. Parçacık Pozlama<ol><li> Kültür kurmak <ol><li> (37 ° C&#39;de),% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve penisilin-streptomisin çözeltisi (100 U / ml),% 0.25 tripsin solüsyonu ve kalsiyum, magnezyum içermeyen fosfat tamponu tuz, bir su banyosu içinde (PBS) ihtiva eden sıcak bir tam büyüme ortamı için kültür başlamadan önce en az 30 dakika. </li><li> Kültürlenmiş RAW264.7 hücreleri ihtiva eden bir% 5 CO2 inkübatör T75 şişesi çıkarın ve önceden ısıtılmış PBS ile iki kez 2 ml hücreleri yıkayın. </li><li> kazınarak ardından önceden ısıtılmış tripsin çözeltisi 1 ml kullanılarak doku kültürü kabının altından yapışkan RAW264.7 hücreleri çıkarmak. </li><li> Doku kültürü kabı hücreleri toplamak ve tekrar pipetleme ile tek bir hücre süspansiyonu yapmak. Önceden ısıtılmış tam ortam maddesi ile 100 mm doku kültürü çanağı içinde 8.000 N / cm2 (toplam 500.000 hücre) bir yoğunlukta tripan mavi ve plaka hücre sayısı. 50,000 hücrelik nihai konsantrasyonda 10 ml&#39;lik Ortam ses seviyesini ayarlamaml başına. NOT: DNA metilasyonu analizi de yapılır eğer plakaların sayısını ikiye katlayın. </li><li> 37 ° C de geri CO2 inkübatör% 5 yeni kaplama RAW264.7 hücreleri yerleştirin ve 24 saat boyunca eklemesini sağlar. </li><li> Ayrıca biyogüvenlik kabini, süzülmüş parçacıkların tekrar süspansiyon. Örneğin, bir 5 ug / ml bir tedavi dozu için steril PBS içinde 0.5 mg / ml&#39;lik bir konsantrasyonda parçacıkları seyreltilmesi ve 5 mg / 50 ug / ml bir tedavi dozu için ml&#39;de. Dilüsyonlar önceden aya kadar hazırlanır ve -80 ° C&#39;de muhafaza edilebilir. </li></ol></li><li> Parçacık madde ile muamele <ol><li> % 5 CO 2 inkübatör hücreleri almak ve hücre büyümesi, hücre morfolojisi, kültür durumuna ve kirlenme ters bir mikroskop kullanılarak 10x büyütme altında kontrol edin. Bir bu aşamada en az% 30 konfluent hücrelere sahip beklemesin. </li><li> Aseptik, sterilize pipet kullanarak medya aspire ve 2 ml 37 ° C PBS ile kültür damarı yıkayınİki kez tamamen medya ve yüzen veya ölü hücreleri çıkarmak için. </li><li> Kültür damarlarda taze ortam parçacıklı maddenin önceden belirlenmiş doz ekleyin ve CO2 inkübatör% 5 37 ° C&#39;de, istenen bir süre için inkübe edilir. Bu çalışmada, eş zamanlı genotoksik ve epigenotoxic analiz için kullanılan pozlama paralel 72 saat PM ile RAW264.7 hücreleri tedavi. NOT: Sitotoksisite olumsuz sitogenetik analiz kalitesini etkileyebilir. Bu nedenle, sitotoksisite, DNA metilasyonu, Western blotting ya da gen ekspresyon analizi gibi ek deneyler tipik haliyle muamele edilmiş hücreler üzerinde gerçekleştirilmiştir. tarif edildiği gibi hücreler ortaya çıkarmak ve istenen spesifik deney devam edin. Deneyimsiz kullanıcılar, aynı zamanda CA&#39;larını tespit yeteneklerini test etmek için metil metansülfonat gibi bir pozitif kontrol eklemek isteyebilirsiniz. </li></ol></li></ol> 3. Sitogenetik Testi <ol><li> Tedavi metafaz hücrelerin tutuklamak için <ol><li> böylece colcemid ısıtındökülmesinden 30 dakika boyunca 37 ° C su banyosu içinde (10 ug / ml). kontaminasyon riskini en aza indirmek için bir biyogüvenlik kabini altında% 70 alkol ile silin kapağı </li><li> Tamamen aseptik ortamı çıkarın ve 2 ml önceden ısıtılmış PBS ile iki kez kültür damarları yıkayın. </li><li> Önceden ısıtılmış taze ortam (2 mi ortam / 10 6 hücre), kültür kabı içinde colcemid çözeltisi (5 ul / ml) ihtiva eden ve 2 saat süreyle inkübe edin. </li></ol></li><li> hücre hasat <ol><li> bir su banyosunda ılık bir tripsin çözeltisi ve PBS, 30 dakika boyunca 37 ° C&#39;de tutuldu. Bundan böyle aşağıda aşama aseptik durumunu korumak için herhangi bir gerek yoktur. </li><li> Tamamen iki kez 2 ml 37 ° C PBS ile kültür damarları, yıkama ortamı çıkarın önceden ısıtılmış tripsin çözeltisinin gerekli hacim eklemek (genellikle 60 mm kültür çanağı veya T25 şişesi 2 ml ve 100 mm tabak veya T75 şişesinin 4 mi ) ve 1 dakika için 37 ° C &#39;de geri CO2 inkübatör% 5 kültür kabını yerleştirin. </li><li> Take dışarı kültür damarı, bir kazıyıcı kullanarak hücreleri ayırmak ve tripsin eylemi durdurmak için PBS 10 ml ekleyin. </li><li> Pipet yukarı ve aşağı, en az on kez 15 ml konik alt santrifüj tüpü içinde tek bir hücre süspansiyonu ve transfer hücreleri yapmak. </li><li> Oda sıcaklığında katlanırlar santrifüj içinde 5 dakika boyunca 400 x g&#39;de santrifüje hücre süspansiyonu. </li><li> Süpernatantı nazik dokunarak hücre pelet kırmak, PBS 10 ml ekleyin ve tekrar beş dakika süreyle santrifüj. </li></ol></li><li> Hipotonik tedavi ve sabitleme <ol><li> en az 30 dakika boyunca 37 ° C su banyosu içinde önceden sıcak 0.075 M potasyum klorür çözeltisi. </li><li> Hücre pelet bozmadan Süpernatantı ve PBS yaklaşık 0,5 ml bırakın. </li><li> Yavaşça hücre pelet kırmak ve bir P200 pipet kullanarak tek bir hücre süspansiyonu yapmak. </li><li> hafifçe çalkalanarak damla önceden ısıtılmış potasyum klorür solüsyonu damla 4 ml. </li><li> hipotonik p hücreleri inkübe20 dakika boyunca 37 ° C su banyosu içinde otassium klorür çözeltisi. </li><li> 1-kısım buzlu asetik asit ile 3 parça metanol ilave taze acetomethanol çözeltisi olun. Oda sıcaklığında, bu yeni hazırlanmış fiksatif tutun. </li><li> hipotonik tedaviden sonra, tüp içinde sabitleyici eşit hacimde (4 mi) ekleme ve tüp hafifçe ters çevirerek çözelti karıştırılır. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 400 x g&#39;de santrifüj ve supernatant çıkarın. Bu aşamada hücre pelet boyutu artar, beyazımsı ve daha görünür hale gelir. </li><li> Süpernatantı, 4 ml taze fiksatif ilave edin ve 30 dakika boyunca oda sıcaklığında tutulması. </li><li> 5 dakika boyunca 400 x g&#39;de santrifüj, süpernatant kaldırmak ve 4 ml fiksatif ile iki yıkar verir. </li></ol></li><li> Slayt temizleme ve metafaz yayılması hazırlığı <ol><li> 30 dakika boyunca tamamen% 10 sıvı deterjan, cam slaytlar daldırın. </li><li> 30 dakika süre ile akan soğuk musluk suyunda iyice slaytlar durulayın. </li><li> rinSE tamamen deterjanı çıkarmak damıtılmış suya batırın ve ileride kullanılmak üzere buzdolabında depolamak için damıtılmış su ile üç kez kaymaktadır. NOT: kullanım yayılma tekdüzelik kolaylaştırır ve metafaz kalitesini artırır önce slaytlar temizlenmesi. </li><li> soğutulmuş, ıslak slayt üzerinde 10 ul hücre süspansiyonu damla ve oda sıcaklığında gece boyunca kurumaya hava sağlar. </li></ol></li><li> Boyama montaj <ol><li> PBS bir kısım Giemsa boyası çözeltisinin bir bölümü karıştırılarak 50 mi Giemsa boyama çözeltisi hazırlayın ve Coplin kavanoza ilave edin. </li><li> 20 dakika boyunca boyama çözeltisi slaytlar daldırın. </li><li> Bir saç kurutma makinesi kullanarak slaytları fazla leke çıkarmak ve hemen kurumaya distile su slaytlar durulayın. </li><li> gece boyunca, oda sıcaklığında slaytlar bırakın. </li><li> slaytta montaj orta tek bir damla uygulayın, nazikçe, montaj ortamında bir lamel yerleştirin orta yavaş yavaş slayt yayılmış izin ve kaldırmakBir kağıt havlu ile fazla orta. monte slayt önce hareketli veya lamel hareketini önlemek için bir mikroskop altında inceleyen en az 1 saat kurumasını bekleyin. Dikkat: Bu adımda sırasında herhangi bir baloncukları oluşturmadan dikkatle lamel yerleştirilmesi önemlidir. kabarcıklarını çıkarmak için aşırı ısı kullanımı tavsiye edilmez. </li></ol></li><li> Mikroskobik gözlem ve sapmaları türleri <ol><li> metafaz iyi kalitede parlak alan mikroskobu kullanarak 100X büyütmede yayılır yapısal CA&#39;larını inceleyin. </li><li> 100 metafaz CA&#39;larının sayıda neden tedaviler için, her tedavi grubu için yayılır en az 50 puan. Daha küçük etki boyutları için, 300 metafaz yayılır analizi tavsiye edilir. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Lim, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+risk+assessment+of+burden+of+disease+and+injury+attributable+to+67+risk+factors+and+risk+factor+clusters+in+21+regions,+1990-2010:+a+systematic+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2010.">A comparative risk assessment of burden of disease and injury attributable to 67 risk factors and risk factor clusters in 21 regions, 1990-2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010.</a> Lancet. 380, 2224-2260 (2012).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> IARC: Outdoor air pollution a leading environmental cause of cancer deaths. , (2013).</li><li>Putaud, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+European+aerosol+phenomenology-2:+chemical+characteristics+of+particulate+matter+at+kerbside,+urban,+rural+and+background+sites+in+Europe.">A European aerosol phenomenology-2: chemical characteristics of particulate matter at kerbside, urban, rural and background sites in Europe.</a> Atmos. Environ. 38 (16), 2579-2595 (2004).</li><li>Hand, J., Schichtel, B., Pitchford, M., Malm, W., Frank, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seasonal+composition+of+remote+and+urban+fine+particulate+matter+in+the+United+States.">Seasonal composition of remote and urban fine particulate matter in the United States.</a> J Geophys Res-Atmos. 117 (5), (2012).</li><li>Schauer, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Source+apportionment+of+airborne+particulate+matter+using+organic+compounds+as+tracers.">Source apportionment of airborne particulate matter using organic compounds as tracers.</a> Atmos. Environ. 30 (22), 3837-3855 (1996).</li><li>Simoneit, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+biomarker+compounds+as+source+indicators+and+tracers+for+air+pollution.">A review of biomarker compounds as source indicators and tracers for air pollution.</a> Environ. Sci. Pollut. Res. 6 (3), 159-169 (1999).</li><li>Kavouras, I. G., Stephanou, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+size+distribution+of+organic+primary+and+secondary+aerosol+constituents+in+urban,+background+marine,+and+forest+atmosphere.">Particle size distribution of organic primary and secondary aerosol constituents in urban, background marine, and forest atmosphere.</a> J Geophys Res-Atmos. 107 (8), (2002).</li><li>Graber, E., Rudich, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atmospheric+HULIS:+How+humic-like+are+they?+A+comprehensive+and+critical+review.">Atmospheric HULIS: How humic-like are they? A comprehensive and critical review.</a> Atmos. Chem. Phys. 6 (3), 729-753 (2006).</li><li>P&#246;schl, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atmospheric+aerosols:+composition,+transformation,+climate+and+health+effects.">Atmospheric aerosols: composition, transformation, climate and health effects.</a> Angew. Chem. Int. 44 (46), 7520-7540 (2005).</li><li>Hou, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+methylation+in+tandem+repeat+element+and+elemental+component+levels+in+inhalable+air+particles.">Altered methylation in tandem repeat element and elemental component levels in inhalable air particles.</a> Environ. Mol. Mutagen. 55 (3), 256-265 (2014).</li><li>Miousse, I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+alterations+induced+by+ambient+particulate+matter+in+mouse+macrophages.">Epigenetic alterations induced by ambient particulate matter in mouse macrophages.</a> Environ. Mol. Mutagen. 55 (5), 428-435 (2014).</li><li>Miousse, I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Toxicity+and+Epigenotoxicity+of+Different+Types+of+Ambient+Particulate+Matter.">In Vitro Toxicity and Epigenotoxicity of Different Types of Ambient Particulate Matter.</a> Toxicol. Sci. 148 (2), 473-487 (2015).</li><li>Ehrlich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+instability+in+cancer+development.">Genomic instability in cancer development.</a> Genome Instability in Cancer Development. , 363-392 (2005).</li><li>Michael, S., Montag, M., Dott, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pro-inflammatory+effects+and+oxidative+stress+in+lung+macrophages+and+epithelial+cells+induced+by+ambient+particulate+matter.">Pro-inflammatory effects and oxidative stress in lung macrophages and epithelial cells induced by ambient particulate matter.</a> Environ Pollut. 183, 19-29 (2013).</li><li>Li, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+heme+oxygenase-1+expression+in+macrophages+by+diesel+exhaust+particle+chemicals+and+quinones+via+the+antioxidant-responsive+element.">Induction of heme oxygenase-1 expression in macrophages by diesel exhaust particle chemicals and quinones via the antioxidant-responsive element.</a> J Immunol. 165 (6), 3393-3401 (2000).</li><li>Pathak, R., Ramakumar, A., Subramanian, U., Prasanna, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+radio-sensitivities+of+human+chromosomes+1+and+2+in+one+donor+in+interphase-+and+metaphase-spreads+after+60Co+gamma-irradiation.">Differential radio-sensitivities of human chromosomes 1 and 2 in one donor in interphase- and metaphase-spreads after 60Co gamma-irradiation.</a> BMC Med. Phys. 9, 6649 (2009).</li><li>Pathak, R., Dey, S. K., Sarma, A., Khuda-Bukhsh, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotoxic+effects+in+M5+cells+and+Chinese+hamster+V79+cells+after+exposure+to+7+Li-beam+(LET=+60keV/&#181;m)+and+correlation+of+their+survival+dynamics+to+nuclear+damages+and+cell+death.">Genotoxic effects in M5 cells and Chinese hamster V79 cells after exposure to 7 Li-beam (LET= 60keV/&#181;m) and correlation of their survival dynamics to nuclear damages and cell death.</a> Mutat. Res. Genet. Toxicol. Environ. Mutagen. 628 (1), 56-66 (2007).</li><li>Pathak, R., Dey, S. K., Sarma, A., Khuda-Bukhsh, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+killing,+nuclear+damage+and+apoptosis+in+Chinese+hamster+V79+cells+after+irradiation+with+heavy-ion+beams+of+16+O,+12+C+and+7+Li.">Cell killing, nuclear damage and apoptosis in Chinese hamster V79 cells after irradiation with heavy-ion beams of 16 O, 12 C and 7 Li.</a> Mutat. Res. Genet. Toxicol. Environ. Mutagen. 632 (1), 58-68 (2007).</li><li>Chalbot, M. C., Kavouras, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+magnetic+resonance+spectroscopy+for+determining+the+functional+content+of+organic+aerosols:+a+review.">Nuclear magnetic resonance spectroscopy for determining the functional content of organic aerosols: a review.</a> Environ. Pollut. 191, 232-249 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Sitogenetik çalışma veya numaraları veya öncelikle metafaz yayılır kromozom, yapılarının mikroskobik analizi, çeşitli hastalıklar için prognoz, risk değerlendirmesi ve tedavisi için önemli bilgiler sağlar. Şimdi sitogenetik anormallikler kanser de dahil olmak üzere çeşitli hastalıkların ilerlemesi ve gelişimi ile bağlantılı olduğu iyi bilinmektedir. Bugüne kadar, CA tüm ana tümör tiplerinde olduğu bulunmuştur. Sitogenetik değişikler 16 çeşitli uyarabilir önemli dış risk faktörlerinden biri - CA kendiliğinden ya da radyasyon (IR) iyonize olarak ya içsel veya dışsal uyaranlara ile ortaya çıkabilir. absorbe radyasyon dozunun değerlendirilmesinde CA yardımların Analizi (sitogenetik radyasyon biodosimetry denir). Ayrıca, frekans ve belirli bir sapma türü analizi radyasyon kalitesinin saptanması için önemli bilgileri 17, 18 emilmek içerir. Sitogenetik çalışma i doğrudan görüntü sağlarDNA hasar verici maddelerinin MPACT. Bu, kuyruklu deneyi gibi dolaylı teknikleri tersidir. radyasyon dışındaki alanlarda kullanılan altında Ancak sitogenetik çalışma kısmen pek çok eller alan adımları olmuştur. PM organik karbon günümüze kadar maruz sağlığımızı olumsuz etkilediği bilinmesine rağmen, biyolojik etkilere bildiren az sayıda çalışma kendi kompozisyon 9 içerir. onlar sadece bileşiklerin çok özel bir tip her zaman küçük bir alt kümesi için anlayış sağlamak ise bu, emek-yoğun çıkarma, işleme, konsantrasyonlarını ve türetme protokolleri gerektiren masraflı ve külfetli kromatografik yöntemlerle kaynaklanmaktadır. Ayrıca, protokoller önemli manipülasyon veya orijinal numune imha, böylece ek testler yapılamaz sonuçlanır. nükleer manyetik rezonans (NMR) analizi avantajları NMR tahribatsız bir yöntem olduğunu içerir; bu ste çok sınırlı sayıda gerektirirps (ekstraksiyon, konsantrasyon) analizden önce, ve yüksek frekanslı NMR aletleri (900 MHz, 400 MHz), çekirdek tesis içinde üniversiteler hepsi değilse de, birçok mevcuttur. Atmosferik aerosol NMR çalışmaları kapsamlı bir inceleme geçtiğimiz günlerde 19 yayımlanmıştır. Son olarak, yapısal bilgi ve gruplar arasındaki bağlar sağlayacak kabiliyeti nedeniyle, NMR yalnızca işlevsel grupların türü hakkında veri sağlar, FT-IR, UV-Vis ve Raman spektrometresi gibi spektrometrik yöntemlere göre daha üstündür. Gerekirse, PM morfolojik karakterizasyonu taramalı elektron mikroskobu kullanılarak NMR spektrometresi ilave olarak gerçekleştirilebilir. Hatta tek bir yerden, PM bileşimi yılın zamanına bağlı olarak değişebilir topladı. bir malzeme, yeterince büyük miktarda işlenerek tekrar deneyinin ya da tamamlayıcı deneyler için -80 ° C&#39;de saklanmalıdır. 3.1.3 ile 2.1.1 bios aseptik yapılmalıdır adımlarEC Güvenlik kabine. kirlenme veya tehlikeye hücresel morfoloji görülürse, protokolün geri kalanı ile devam etmeyin. Tripsin tedavi süresi hücre türüne göre ayarlanması gerekiyor. Burada, makrofajlar çok yapışık ve biz 1 dakika tripsin ve kazıma bir arada en iyi şekilde çalışır bulundu, ancak çoğu hücre tipleri için 5 dakika işler için yalnız tripsin var. Hipotonik tedavi süresi de hücre tipine bağlı olarak değişir ve standardize edilmesi gerekmektedir. colcemid dozu ve tedavi süresi kromozom hazırlanması için en önemli parametreler; aşırı doz hücrelerini öldürmek veya hücre döngüsünü durak olabilir. Bu RAW264.7 hücreleri burada koşullarını tarif ve optimizasyonu, diğer hücre tipleri için gereklidir. Başarısızlık sonuçlarını etkileyen ideal bir olumsuz mitotik indeksi etkileyebilir Bu adımda koşullarının yanı sıra kromozom morfolojisi, bulmak için. Aynı zamanda öncesinde sitogenetik analiz PM sitotoksisite düzeylerini değerlendirmek ve buna göre doz seçilmesi tavsiye edilir. in vitro olarak toksikolojik değerlendirmeler kullanılan hücrelerin, pozlama büyüklüğü ve partikül konsantrasyonlarının tipi ile sınırlıdır. Bundan başka, bu çalışmada, bu nedenle, sitogenetik anormallikleri neden suda çözünür olmayan türleri, potansiyel hesaba olabilir, PM suda çözünür özü kullanılabilir ve. Diğer sınırlamalar &quot;polimorfik varyantları&quot; varlığı ile ilişkilidir - sentromerik bölge ve kromozomun kısa kol varyasyonlar; Bazı mikroskopik veya yanlış olabilir şifreli düzenlenmeler ve karmaşık karyotiplerin varlığı. Burada, sitogenetik analiz tanıtımı DNA PM kaynaklı hasar belirlenmesinde yardımcı olabilir ve potansiyel çevre PM maruz kalmanın yol açtığı sağlık etkilerinin değerlendirilmesi bir öngörü son nokta olarak hizmet edebilir göstermektedir. Çalışmamız Bildiğimiz kadarıyla, PM cevaben CA&#39;ları göstermek için ilk biri vardır. Bu sonuçların çoğaltma olduğunuBizim bulguları doğrulamak için arzu. Bu protokol, aynı zamanda şüpheli, DNA hasar verici maddenin hemen hemen her tür değerlendirmek için uyarlanabilir.

Partikül madde (PM) maruz kalma öncelikle kardiyopulmoner hastalığı ve akciğer kanseri 1 yılda 3 milyondan fazla aşırı ölümlere neden olması tahmin edilmektedir. PM maruz kalma seviyeleri arttıkça akciğer kanseri riski 2 gösterilmiştir Nitekim, PM, Uluslararası Kanser Araştırmaları Ajansı (Grup 1) ile insanlarda kansere olarak tanındı. İlginç bir şekilde, hemen hemen tüm kanser hücrelerinin sayısal ve / veya yapısal kromozom anomalileri liman. Partikül organik karbon, terkibi ve boyut dağılımı emisyonları ve fiziksel ve kimyasal dönüşümler bağlı olan bir varyantı, karmaşık ve heterojen karışım vardır. Bu 35-55 (boyutunda PM 2.5 mikron ve daha küçük) kentsel PM 2.5 kütlesinin% kırsal ve kıta arka plan PM 2.5 kütle 3, 4 den fazla% 60 oluşturmaktadır. suda çözünen fraksiyon organik aerosol 30-90% oluşturmaktadır. Organik bileşiklerin büyük bir kısmıalifatik hidrokarbonlar, poliaromatik hidrokarbonlar ve bunların oksijenli nitratlı türevlerini, alifatik aldehitler ve alkoller, serbest yağ asitleri ve bunların tuzları, di-karboksilik asitler, çok fonksiyonlu bileşikler, proteinler, ve hümik benzeri makromoleküller (HULIS) kullanılması dahil olmak üzere tespit edilmiştir kütle spektrometrik teknikleri 5-8 ile birleştiğinde kromatografik yöntemler. Bu nedenle bu bileşikler, organik karbonun çoğu 9 bilinmemektedir, parçacık halinde organik karbon az% 10-20 temsil etmektedir. Deneysel kanıtlar, sitotoksisite, oksidatif stres ve enflamasyon PM ile ilişkili patolojik durumların gelişiminde rol oynadığını düşündürmektedir. Yakın zamanda, bununla birlikte, PM bu maruz kalma da in vitro sistemlerinde, insan konularında 10-12 hem de deneysel olarak, tekrar eden elemanların, DNA metilasyon değişiklikler de dahil olmak üzere epigenetik değişiklikler, bir dizi ile sonuçlanır gösterilmiştir. Özel ilgi konusu olan etkileri vardırMajör ve minör uydular - - kromozomların sentromer etrafında heterokromatik bölgesinde bulunan uydu DNA PM. Onlar maruz 12. sonra en az 72 saat süreyle tespit edilebilir olarak bu etkiler, doğası gereği kalıcı olabileceğini gösterilmiştir. Özellikle sentromer yaklaşık DNA metilasyonu değişiklikler, hücre bölünmesi esnasında, uydu, DNA mRNA transkript, bir uzlaşma kromozom bütünlük birikimine yol açabilir ve daha sonra, patolojik durumların 13 çeşitli oluşmasına da neden olabilir. PM bağlı epigenetik değişiklikler bir son nokta olarak bir CA analizi için sitogenetik yaklaşım adaptasyonu, bu şekilde, yüksek bir öneme sahiptir. Burada, fare makrofaj RAW264.7 modeli sistemini kullanarak CA&#39;ların in vitro maruziyet ve analiz ortam PM toplama ve hazırlama yaklaşımı, rapor. Makrofajlar t nedenle, inhale yabancı nesnelere karşı ilk savunma hattını oluşturan veCep hattı kurulmuş ve partikül toksikoloji 11, 12, 14, 15, en sık kullanılan bir model olarak hizmet vermektedir.

<table><tbody><tr><td>Total suspended particulate sampler</td><td>Tisch Environmental</td><td>TE-5170</td><td></td></tr><tr><td>Bruker Avance III NMR spectrometer&amp;nbsp;</td><td>Bruker</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>TopSpin 3.5/pl2 software</td><td>Bruker</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>ACD/NMR Processor Academic Edition</td><td>ACD/Labs</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>RAW264.7 murine macrophages</td><td>ATCC</td><td>ATCC TIB-71</td><td></td></tr><tr><td>High glucose DMEM GlutaMAX media</td><td>ThermoFisher</td><td>10569010</td><td>Warm in a 37 &amp;deg;C waterbath before use</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>ThermoFisher</td><td>16000044</td><td>Warm in a 37 &amp;deg;C waterbath before use</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml)</td><td>ThermoFisher</td><td>15140163</td><td>Warm in a 37 &amp;deg;C waterbath before use</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td><td>ThermoFisher</td><td>25200056</td><td>Warm in a 37 &amp;deg;C waterbath before use</td></tr><tr><td>PBS, pH 7.4</td><td>ThermoFisher</td><td>10010049</td><td>Warm in a 37 &amp;deg;C waterbath before use</td></tr><tr><td>KaryoMAX Colcemid Solution in PBS</td><td>ThermoFisher</td><td>15212012</td><td>Warm in a 37 &amp;deg;C waterbath before use</td></tr><tr><td>KaryoMAX Potassium Chloride Solution</td><td>ThermoFisher</td><td>10575090</td><td>Warm in a 37 &amp;deg;C waterbath before use</td></tr><tr><td>Methanol (HPLC)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A452N1-19</td><td></td></tr><tr><td>Acetic Acid, Glacial</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1185-500</td><td></td></tr><tr><td>Decon Contrad 70 Liquid Detergent</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-355-1</td><td></td></tr><tr><td>Wright and Wright-Giemsa Stain Solutions</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-200733</td><td></td></tr><tr><td>Permount Mounting Medium</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP15-100</td><td></td></tr><tr><td>Axio Imager 2</td><td>Zeiss</td><td>NA</td><td></td></tr></tbody></table>

analysis of the ambient particulate matter-induced chromosomal aberrations using an in vitro system

partiküler madde (PM) maruz kalma nükleer genetik materyalin dahil olmak üzere çeşitli hücresel bileşenleri, zarar verebilir önemli bir dünya sağlık sorunu vardır. Nükleer genetik bütünlüğü üzerindeki PM etkisini değerlendirmek için, yapısal kromozom bozuklukları fare RAW264.7 makrofaj hücrelerinin metafaz mamulünün puanlanır. PM yüksek hacimli toplam askıda partiküller örnekleyici ile ortam havasından toplanır. Toplanan malzeme çözünebilir ve suda çözünür ince kısmı tutmak için filtre edilir. partiküller, nükleer manyetik rezonans (NMR) spektroskopi ile kimyasal bileşim açısından karakterize edilir. Parçacık süspansiyonu farklı konsantrasyonları muamele edilmemiş kontrol hücreleri ile birlikte, 72 saatlik bir toplam maruz kalma süresi için RAW264.7 fare makrofaj bir in vitro kültürü üzerine ilave edilir. Temas süresi sonunda, kültür metafaz hücreleri yakalama colcemid ile işlenir. Daha sonra hücreler toplandı, acetomethanol sabit hipotonik çözelti, D ile muamele edilirCam slaytlar üzerine ropped ve son olarak Giemsa çözeltisi ile boyandı. Slaytlar parlak alan mikroskobu kullanılarak 1,000X büyütmede metafaz yayılır yapısal kromozom sapmaları (CA) değerlendirmek için incelenir. 50 ila 100 metafaz yayılımı, her tedavi grubu için puan verilir. Bu teknik kromatid tipi tatili, chromatid tipi alışverişi, acentric parçaları, disentrik ve halka kromozomlar, çift dakika endoreduplication ve PM maruz kaldıktan sonra in vitro Robertsonian translokasyonları gibi yapısal kromozomal anomaliler (CA), tespiti için uyarlanmıştır. Epigenetik değişikliklere köklü bir sitogenetik uç noktasını ilişkilendirmek için güçlü bir yöntemdir.

Büyük bakım TSP numune yerini yanı sıra koleksiyon yapılır yılın zaman seçiminde dikkatli olunmalıdır. Kimyasal bileşim, aynı zamanda parçacıkların boyutu esas olarak sonuçlarını etkileyebilir. Toplanan malzeme beyaz filtre karşı görünür olmalıdır. Normal bir fare metafaz yayılması 40 acentric kromozom vardır. tekniğin amacı kontrol grubuna göre muamele edilen hücrelerde anormal kromozom oranında bir değişim (ya da bunun olmayan) göstermektir. Bu değişiklik daha sonra (anormal kromozomların sayısı) ve nitelikli (anormalliklerin tipi) belirlenebilir. Normal fare metafaz yayılması 40 acentric kromozom (Şekil 3A) sahip olacaktır. Partikül madde ile tedavi gibi kromatid sonu olarak, Şekil 3&#39;te gösterildiği gibi, gibi CAS, (3B), asentrik fragmanını (indükler <strong&gt; 3C), halka kromozomu (3D), disentrik kromozom (3E), çift dak (3F), Robertsonian translokasyonu (3G) ve endoreduplication (3H). Tüm sonuçlar için, bizim yayınlanmış bir çalışmada 12 başvurun. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54969/54969fig1.jpg" /> Şekil 1. yüksek hacimli toplam askıda partiküller (TSP) örnekleyici. resim ortam parçacıkları toplamak için bir kentsel alanda bir çatı yüklü TSP Örnekleyiciye gösterir. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54969/54969fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54969/54969fig2.jpg" /> Yüksek hacimli TSP s kullanarak Şekil 2. Loaded kuvars elyaf filtre aşağıdaki koleksiyonampler. Kullandıktan sonra TSP örnekleyici yüklü filtre üzerinde Close-up. Filtreleri rengi beyazdan griye doğru değiştirilir unutmayın. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54969/54969fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54969/54969fig3.jpg" /> Parçacık halinde maddenin farklı konsantrasyonları ile muamele sonrasında RAW264.7 hücrelerinin oluşturduğu yapısal anormalliklerin farklı türde temsili örnekleri Şekil 3. Photomicrograph. anormallikler oklar ile belirtilmiştir. (A) 40 akrosentrik kromozomlar normal metafaz yayılması, (B) chromatid-tipi sonu (CTB), (C) acentric fragmanı (acentrics), (D) halka kromozom, (E) disentrik kromozom (Dic), (F) çift dak (Dimn), ( <strong&gt; G) Robertsonian translokasyonu ve (H) endoreduplication (çoğaltılamaz kromozomlar) bir arada tutulur. Orijinal büyütme 100X, ölçek çubuğu = 5 mikron. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54969/54969fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System at JoVE.com

Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

Bu protokol ortam havası partiküler madde ile tedaviden sonra RAW264.7 fare makrofajlar in vitro ölçümü ve kromozomal anomaliler karakterizasyonu için teknikleri açıklar.

Bir Kullanarak Ortam Partikül Madde kaynaklı kromozomal anormallikler Analizi<em&gt; İn Vitro</em&gt; Sistem

Exposure to particulate matter (PM) is a major world health concern, which may damage various cellular components, including the nuclear genetic material. ...

analysis-ambient-particulate-matter-induced-chromosomal-aberrations

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

8.6K Görüntüleme.  University of Arkansas for Medical Sciences.  Bu protokol ortam havası partiküler madde ile tedaviden sonra RAW264.7 fare makrofajlar in vitro ölçümü ve kromozomal anomaliler karakterizasyonu için teknikleri açıklar. 

Video: Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the field of environmental health. This is due in part to the paucity of model systems that can (1) accurately recapitulate keys features of reproductive processes and (2) do so in a medium- to high-throughput fashion, without the need for a high number of vertebrate animals.
We describe here an assay in the nematode C. elegans that allows the rapid identification of germline toxicants by monitoring the induction of aneuploid embryos. By making use of a GFP reporter line, errors in chromosome segregation resulting from germline disruption are easily visualized and quantified by automated fluorescence microscopy. Thus the screening of a particular set of compounds for its toxicity can be performed in a 96- to 384-well plate format in a matter of days. Secondary analysis of positive hits can be performed to determine whether the chromosome abnormalities originated from meiotic disruption or from early embryonic chromosome segregation errors. Altogether, this assay represents a fast first-pass strategy for the rapid assessment of germline dysfunction following chemical exposure.

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

We describe the detailed steps of a high-throughput chemical assay in the nematode Caenorhabditis elegans used to assess germline toxicity. In this assay, disruption of germline function following chemical exposure is monitored using a fluorescent reporter specific to aneuploid embryos.

Nematod kullanma Germline Kimyasal zehirlilik Kapsamlı Değerlendirme<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the ...

Gelişim Biyolojisi

Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization (mFISH) and Spectral Karyotyping (SKY) in Irradiated Mice

Ionizing radiation (IR) induces numerous stable and unstable chromosomal aberrations. Unstable aberrations, where chromosome morphology is substantially compromised, can easily be identified by conventional chromosome staining techniques. However, detection of stable aberrations, which involve exchange or translocation of genetic materials without considerable modification in the chromosome morphology, requires sophisticated chromosome painting techniques that rely on in situ hybridization of fluorescently labeled DNA probes, a chromosome painting technique popularly known as fluorescence in situ hybridization (FISH). FISH probes can be specific for whole chromosome/s or precise sub-region on chromosome/s. The method not only allows visualization of stable aberrations, but it can also allow detection of the chromosome/s or specific DNA sequence/s involved in a particular aberration formation. A variety of chromosome painting techniques are available in cytogenetics; here two highly sensitive methods, multiple fluorescence in situ hybridization (mFISH) and spectral karyotyping (SKY), are discussed to identify inter-chromosomal stable aberrations that form in the bone marrow cells of mice after exposure to total body irradiation. Although both techniques rely on fluorescent labeled DNA probes, the method of detection and the process of image acquisition of the fluorescent signals are different. These two techniques have been used in various research areas, such as radiation biology, cancer cytogenetics, retrospective radiation biodosimetry, clinical cytogenetics, evolutionary cytogenetics, and comparative cytogenetics.

Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization mFISH and Spectral Karyotyping SKY in Irradiated Mice

The present protocol describes the usefulness of multiple fluorescence in situ hybridization (mFISH) and spectral karyotyping (SKY) in identifying inter-chromosomal stable aberrations in the bone marrow cells of mice after exposure to total body irradiation.

Çoklu Floresan Inter-kromozomal Kararlı sapmaları Algılama<em&gt; In Situ</em&gt; Hibridizasyon (mFISH) ve ışınlanmış Farelerde Spektral Karyotipik (SKY)

Ionizing radiation (IR) induces numerous stable and unstable chromosomal aberrations. Unstable aberrations, where chromosome morphology is substantially ...

Genetik

Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH

Defective DNA repair leads to increased genomic instability, which is the root cause of mutations that lead to tumorigenesis. Analysis of the frequency and type of chromosome aberrations in different cell types allows defects in DNA repair pathways to be elucidated. Understanding mammalian DNA repair biology has been greatly helped by the production of mice with knockouts in specific genes. The goal of this protocol is to quantify genomic instability in mouse B lymphocytes. Labeling of the telomeres using PNA-FISH probes (peptide nucleic acid - fluorescent in situ hybridization) facilitates the rapid analysis of genomic instability in metaphase chromosome spreads. B cells have specific advantages relative to fibroblasts, because they have normal ploidy and a higher mitotic index. Short-term culture of B cells therefore enables precise measurement of genomic instability in a primary cell population which is likely to have fewer secondary genetic mutations than what is typically found in transformed fibroblasts or patient cell lines.

DNA repair pathways are essential for maintenance of genomic integrity and preventing mutation and cancer. The goal of this protocol is to quantify genomic instability by direct observation of chromosome aberrations in metaphase spreads from mouse B cells using fluorescent in situ hybridization (FISH) for telomeric DNA repeats.

PNA-FISH ile Fare B Lenfositlerindeki kromozom anormallikleri hızlı Analizi

Defective DNA repair leads to increased genomic instability, which is the root cause of mutations that lead to tumorigenesis. Analysis of the frequency ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

An Automated Method to Perform The In Vitro Micronucleus Assay using Multispectral Imaging Flow Cytometry

The in vitro micronucleus (MN) assay is often used to evaluate cytotoxicity and genotoxicity but scoring the assay via manual microscopy is laborious and introduces uncertainty in results due to variability between scorers. To remedy this, automated slide-scanning microscopy as well as conventional flow cytometry methods have been introduced in an attempt to remove scorer bias and improve throughput. However, these methods have their own inherent limitations such as inability to visualize the cytoplasm of the cell and the lack of visual MN verification or image data storage with flow cytometry. Multispectral Imaging Flow Cytometry (MIFC) has the potential to overcome these limitations. MIFC combines the high resolution fluorescent imagery of microscopy with the statistical robustness and speed of conventional flow cytometry. In addition, all collected imagery can be stored in dose-specific files. This paper describes the protocol developed to perform a fully automated version of the MN assay on MIFC. Human lymphoblastoid TK6 cells were enlarged using a hypotonic solution (75 mM KCl), fixed with 4% formalin and the nuclear content was stained with Hoechst 33342. All samples were run in suspension on the MIFC, permitting acquisition of high resolution images of all key events required for the assay (e.g. binucleated cells with and without MN as well as mononucleated and polynucleated cells). Images were automatically identified, categorized and enumerated in the MIFC data analysis software, allowing for automated scoring of both cytotoxicity and genotoxicity. Results demonstrate that using MIFC to perform the in vitro MN assay allows statistically significant increases in MN frequency to be detected at several different levels of cytotoxicity when compared to solvent controls following exposure of TK6 cells to Mitomycin C and Colchicine, and that no significant increases in MN frequency are observed following exposure to Mannitol.

The in vitro micronucleus assay is a well-established method for evaluating genotoxicity and cytotoxicity but scoring the assay using manual microscopy is laborious and suffers from subjectivity and inter-scorer variability. This paper describes the protocol developed to perform a fully automated version of the assay using multispectral imaging flow cytometry.

Multispectral görüntüleme akışı sitometrisi kullanarak In vitro micronucleus assay gerçekleştirmek için otomatik bir yöntem

The in vitro micronucleus (MN) assay is often used to evaluate cytotoxicity and genotoxicity but scoring the assay via manual microscopy is laborious and ...

Biyomühendislik

The Lambda Select cII Mutation Detection System

A number of transgenic animal models and mutation detection systems have been developed for mutagenicity testing of carcinogens in mammalian cells. Of these, transgenic mice and the Lambda (&#955;) Select cII Mutation Detection System have been employed for mutagenicity experiments by many research groups worldwide. Here, we describe a detailed protocol for the Lambda Select cII mutation assay, which can be applied to cultured cells of transgenic mice/rats or the corresponding animals treated with a chemical/physical agent of interest. The protocol consists of the following steps: (1) isolation of genomic DNA from the cells or organs/tissues of transgenic animals treated in vitro or in vivo, respectively, with a test compound; (2) recovery of the lambda shuttle vector carrying a mutational reporter gene (i.e., cII transgene) from the genomic DNA; (3) packaging of the rescued vectors into infectious bacteriophages; (4) infecting a host bacteria and culturing under selective conditions to allow propagation of the induced cII mutations; and (5) scoring the cII-mutants and DNA sequence analysis to determine the cII mutant frequency and mutation spectrum, respectively.

The Lambda Select cII Mutation Detection System

We describe a detailed protocol for the Lambda Select cII mutation assay in cultured cells of transgenic rodents or the corresponding animals treated with a chemical/physical agent of interest. This approach has been widely used for mutagenicity testing of carcinogens in mammalian cells.

Lambda seçin CII mutasyon tespit sistemi

A number of transgenic animal models and mutation detection systems have been developed for mutagenicity testing of carcinogens in mammalian cells. Of ...

Chromosomics: Detection of Numerical and Structural Alterations in All 24 Human Chromosomes Simultaneously Using a Novel OctoChrome FISH Assay

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a technique that allows specific DNA sequences to be detected on metaphase or interphase chromosomes in cell nuclei1. The technique uses DNA probes with unique sequences that hybridize to whole chromosomes or specific chromosomal regions, and serves as a powerful adjunct to classic cytogenetics. For instance, many earlier studies reported the frequent detection of increased chromosome aberrations in leukemia patients related with benzene exposure, benzene-poisoning patients, and healthy workers exposed to benzene, using classic cytogenetic analysis2. Using FISH, leukemia-specific chromosomal alterations have been observed to be elevated in apparently healthy workers exposed to benzene3-6, indicating the critical roles of cytogentic changes in benzene-induced leukemogenesis. 
Generally, a single FISH assay examines only one or a few whole chromosomes or specific loci per slide, so multiple hybridizations need to be conducted on multiple slides to cover all of the human chromosomes. Spectral karyotyping (SKY) allows visualization of the whole genome simultaneously, but the requirement for special software and equipment limits its application7. Here, we describe a novel FISH assay, OctoChrome-FISH, which can be applied for Chromosomics, which we define here as the simultaneous analysis of all 24 human chromosomes on one slide in human studies, such as chromosome-wide aneuploidy study (CWAS)8. The basis of the method, marketed by Cytocell as the Chromoprobe Multiprobe System, is an OctoChrome device that is divided into 8 squares, each of which carries three different whole chromosome painting probes (Figure 1). Each of the three probes is directly labeled with a different colored fluorophore, green (FITC), red (Texas Red), and blue (Coumarin). The arrangement of chromosome combinations on the OctoChrome device has been designed to facilitate the identification of the non-random structural chromosome alterations (translocations) found in the most common leukemias and lymphomas, for instance t(9;22), t(15;17), t(8;21), t(14;18)9. Moreover, numerical changes (aneuploidy) in chromosomes can be detected concurrently. The corresponding template slide is also divided into 8 squares onto which metaphase spreads are bound (Figure 2), and is positioned over the OctoChrome device. The probes and target DNA are denatured at high-temperature and hybridized in a humid chamber, and then all 24 human chromosomes can be visualized simultaneously. 
OctoChrome FISH is a promising technique for the clinical diagnosis of leukemia and lymphoma and for detection of aneuploidies in all chromosomes. We have applied this new Chromosomic approach in a CWAS study of benzene-exposed Chinese workers8,10.

A novel fluorescence in situ hybridization (FISH) method that simultaneously examines both numerical and structural chromosome alterations, particularly the specific chromosomal translocations associated with leukemia and lymphoma, of all 24 human chromosomes on a single device in one hybridization, is described.

Chromosomics: Sayısal ve Yapısal Değişmeler Algılama Tüm 24 İnsan Kromozomlar Aynı zamanda Roman OctoChrome BALIK Test kullanma

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a technique that allows specific DNA sequences to be detected on metaphase or interphase chromosomes in cell ...

Biyoloji

Quantification of three DNA Lesions by Mass Spectrometry and Assessment of Their Levels in Tissues of Mice Exposed to Ambient Fine Particulate Matter

DNA adducts and oxidized DNA bases are examples of DNA lesions that are useful biomarkers for the toxicity assessment of substances that are electrophilic, generate reactive electrophiles upon biotransformation, or induce oxidative stress. Among the oxidized nucleobases, the most studied one is 8-oxo-7,8-dihydroguanine (8-oxoGua) or 8-oxo-7,8-dihydro-2&#39;-deoxyguanosine (8-oxodGuo), a biomarker of oxidatively induced base damage in DNA. Aldehydes and epoxyaldehydes resulting from the lipid peroxidation process are electrophilic molecules able to form mutagenic exocyclic DNA adducts, such as the etheno adducts 1,N2-etheno-2&#39;-deoxyguanosine (1,N2-&#949;dGuo) and 1,N6-etheno-2&#39;-deoxyadenosine (1,N6-&#949;dAdo), which have been suggested as potential biomarkers in the pathophysiology of inflammation. Selective and sensitive methods for their quantification in DNA are necessary for the development of preventive strategies to slow down cell mutation rates and chronic disease development (e.g., cancer, neurodegenerative diseases). Among the sensitive methods available for their detection (high performance liquid chromatography coupled to electrochemical or tandem mass spectrometry detectors, comet assay, immunoassays, 32P-postlabeling), the most selective are those based on high performance liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry (HPLC-ESI-MS/MS). Selectivity is an essential advantage when analyzing complex biological samples and HPLC-ESI-MS/MS evolved as the gold standard for quantification of modified nucleosides in biological matrices, such as DNA, urine, plasma and saliva. The use of isotopically labeled internal standards adds the advantage of corrections for molecule losses during the DNA hydrolysis and analyte enrichment steps, as well as for differences of the analyte ionization between samples. It also aids in the identification of the correct chromatographic peak when more than one peak is present.
We present here validated sensitive, accurate and precise HPLC-ESI-MS/MS methods that were successfully applied for the quantification of 8-oxodGuo, 1,N6-dAdo and 1,N2-dGuo in lung, liver and kidney DNA of A/J mice for the assessment of the effects of ambient PM2.5 exposure.

We describe here methods for sensitive and accurate quantification of the lesions 8-oxo-7,8-dihydro-2&#39;-deoxyguanosine (8-oxodGuo), 1,N6-etheno-2&#39;-deoxyadenosine (1,N6-dAdo) and 1,N2-etheno-2&#39;-deoxyguanosine (1,N2-dGuo) in DNA. The methods were applied to the assessment of the effects of ambient fine particulate matter (PM2.5) in tissues (lung, liver and kidney) of exposed A/J mice.

Kütle spektrometresi ile üç DNA lezyonlarının ölçülmesi ve ortam Ince partikül madde maruz fareler dokularda düzeylerinin değerlendirilmesi

DNA adducts and oxidized DNA bases are examples of DNA lesions that are useful biomarkers for the toxicity assessment of substances that are ...

Study of the DNA Damage Checkpoint using Xenopus Egg Extracts

On a daily basis, cells are subjected to a variety of endogenous and environmental insults. To combat these insults, cells have evolved DNA damage checkpoint signaling as a surveillance mechanism to sense DNA damage and direct cellular responses to DNA damage. There are several groups of proteins called sensors, transducers and effectors involved in DNA damage checkpoint signaling (Figure 1). In this complex signaling pathway, ATR (ATM and Rad3-related) is one of the major kinases that can respond to DNA damage and replication stress. Activated ATR can phosphorylate its downstream substrates such as Chk1 (Checkpoint kinase 1). Consequently, phosphorylated and activated Chk1 leads to many downstream effects in the DNA damage checkpoint including cell cycle arrest, transcription activation, DNA damage repair, and apoptosis or senescence (Figure 1). When DNA is damaged, failing to activate the DNA damage checkpoint results in unrepaired damage and, subsequently, genomic instability. The study of the DNA damage checkpoint will elucidate how cells maintain genomic integrity and provide a better understanding of how human diseases, such as cancer, develop.
Xenopus laevis egg extracts are emerging as a powerful cell-free extract model system in DNA damage checkpoint research. Low-speed extract (LSE) was initially described by the Masui group1. The addition of demembranated sperm chromatin to LSE results in nuclei formation where DNA is replicated in a semiconservative fashion once per cell cycle.
The ATR/Chk1-mediated checkpoint signaling pathway is triggered by DNA damage or replication stress 2. Two methods are currently used to induce the DNA damage checkpoint: DNA damaging approaches and DNA damage-mimicking structures 3. DNA damage can be induced by ultraviolet (UV) irradiation, &gamma;-irradiation, methyl methanesulfonate (MMS), mitomycin C (MMC), 4-nitroquinoline-1-oxide (4-NQO), or aphidicolin3, 4. MMS is an alkylating agent that inhibits DNA replication and activates the ATR/Chk1-mediated DNA damage checkpoint 4-7. UV irradiation also triggers the ATR/Chk1-dependent DNA damage checkpoint 8. The DNA damage-mimicking structure AT70 is an annealed complex of two oligonucleotides poly-(dA)70 and poly-(dT)70. The AT70 system was developed in Bill Dunphy's laboratory and is widely used to induce ATR/Chk1 checkpoint signaling 9-12.
Here, we describe protocols (1) to prepare cell-free egg extracts (LSE), (2) to treat Xenopus sperm chromatin with two different DNA damaging approaches (MMS and UV), (3) to prepare the DNA damage-mimicking structure AT70, and (4) to trigger the ATR/Chk1-mediated DNA damage checkpoint in LSE with damaged sperm chromatin or a DNA damage-mimicking structure.

Study of the DNA Damage Checkpoint using Xenopus Egg Extracts

Xenopus egg extract is a useful model system to investigate the DNA damage checkpoint. This protocol is for the preparation of Xenopus egg extracts and DNA damage checkpoint inducing reagents. These techniques are adaptable to a variety of DNA damaging approaches in the study of the DNA damage checkpoint signaling.

Kullanılarak DNA hasar Checkpoint incelenmesi<em&gt; Xenopus</em&gt; Yumurta ayıklar

On a daily basis, cells are subjected to a variety of endogenous and environmental insults. To combat these insults, cells have evolved DNA damage ...

Chromosome Preparation From Cultured Cells

Chromosome (cytogenetic) analysis is widely used for the detection of chromosome instability. When followed by G-banding and molecular techniques such as fluorescence in situ hybridization (FISH), this assay has the powerful ability to analyze individual cells for aberrations that involve gains or losses of portions of the genome&#160;and rearrangements involving one or more chromosomes. In humans, chromosome abnormalities occur in approximately 1 per 160 live births1,2, 60-80% of all miscarriages3,4, 10% of stillbirths2,5, 13% of individuals with congenital heart disease6, 3-6% of infertility cases2, and in many patients with developmental delay&#160;and birth defects7. Cytogenetic analysis of malignancy is routinely used by researchers and clinicians, as observations of clonal chromosomal abnormalities have been shown to have both diagnostic and prognostic significance8,9.&#160; Chromosome isolation is invaluable for gene therapy and stem cell research of organisms including nonhuman primates and rodents10-13.
Chromosomes can be isolated from cells of live tissues, including blood lymphocytes, skin fibroblasts, amniocytes, placenta, bone marrow, and tumor specimens. Chromosomes are analyzed at the metaphase stage of mitosis, when they are most condensed and therefore more clearly visible. The first step of the chromosome isolation technique involves the disruption of the spindle fibers by incubation with Colcemid, to prevent the cells from proceeding to the subsequent anaphase stage. The cells are then treated with a hypotonic solution and preserved in their swollen state with Carnoy&#39;s fixative. The cells are then dropped on to slides and can then be utilized for a variety of procedures. G-banding involves trypsin treatment followed by staining with Giemsa to create characteristic light and dark bands. The same procedure to isolate chromosomes can be used for the preparation of cells for procedures such as fluorescence in situ hybridization (FISH), comparative genomic hybridization (CGH), and spectral karyotyping (SKY)14,15.

Chromosomes can be isolated from live cells such as lymphocytes or skin fibroblasts, and from organisms including humans or mice. These chromosome preparations can be further utilized for routine G-banding and molecular cytogenetic procedures such as fluorescence in situ hybridization (FISH), comparative genomic hybridization (CGH), and spectral karyotyping (SKY).

Kültür Hücrelerinin itibaren Kromozom Hazırlık

Chromosome (cytogenetic) analysis is widely used for the detection of chromosome instability. When followed by G-banding and molecular techniques such as ...

Measuring DNA Damage and Repair in Mouse Splenocytes After Chronic In Vivo Exposure to Very Low Doses of Beta- and Gamma-Radiation

Low dose radiation exposure may produce a variety of biological effects that are different in quantity and quality from the effects produced by high radiation doses. Addressing questions related to environmental, occupational and public health safety in a proper and scientifically justified manner heavily relies on the ability to accurately measure the biological effects of low dose pollutants, such as ionizing radiation and chemical substances. DNA damage and repair are the most important early indicators of health risks due to their potential long term consequences, such as cancer. Here we describe a protocol to study the effect of chronic in vivo exposure to low doses of &#947;- and &#946;-radiation on DNA damage and repair in mouse spleen cells. Using a commonly accepted marker of DNA double-strand breaks, phosphorylated histone H2AX called &#947;H2AX, we demonstrate how it can be used to evaluate not only the levels of DNA damage, but also changes in the DNA repair capacity potentially produced by low dose in vivo exposures. Flow cytometry allows fast, accurate and reliable measurement of immunofluorescently labeled &#947;H2AX in a large number of samples. DNA double-strand break repair can be evaluated by exposing extracted splenocytes to a challenging dose of 2 Gy to produce a sufficient number of DNA breaks to trigger repair and by measuring the induced (1 hr post-irradiation) and residual DNA damage (24 hrs post-irradiation). Residual DNA damage would be indicative of incomplete repair and the risk of long-term genomic instability and cancer. Combined with other assays and end-points that can easily be measured in such in vivo studies (e.g., chromosomal aberrations, micronuclei frequencies in bone marrow reticulocytes, gene expression, etc.), this approach allows an accurate and contextual evaluation of the biological effects of low level stressors.

Measuring DNA Damage and Repair in Mouse Splenocytes After Chronic In Vivo Exposure to Very Low Doses of Beta- and Gamma-Radiation

A protocol to evaluate changes in DNA damage levels and DNA repair capacity that may be induced by chronic in vivo low dose irradiation in mouse spleen lymphocytes, by measuring phosphorylated histone H2AX, a marker of DNA double-strand breaks, using flow cytometry is presented.

Kronik sonra fare dalak DNA hasar ve Onarım Ölçme<em&gt; In Vivo</em&gt; Beta ve gamma-Radyasyonun Çok Düşük Doz Maruz Kalma

Low dose radiation exposure may produce a variety of biological effects that are different in quantity and quality from the effects produced by high ...

Bir Kullanarak Ortam Partikül Madde kaynaklı kromozomal anormallikler Analizi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Nematod kullanma Germline Kimyasal zehirlilik Kapsamlı Değerlendirme

Çoklu Floresan Inter-kromozomal Kararlı sapmaları Algılama