Die Arbeit wurde zum Teil durch das National Institute of Health Center of Biological Research Exzellenz [Grant-Nummer 1P20GM109005], der Arkansas Raum Grants Consortium durch National Aeronautics and Space Administration [Gewährungsnummer NNX15AK32A] und das Nationale Institut für Arbeitsschutz und Health (NIOSH) [Gewährungsnummer 2T420H008436]. Die Autoren möchten sich Christopher Fettes für das Korrekturlesen und Bearbeitung des Manuskripts danken.

1. Partikelgewinnung und Vorbereitung <ol><li> Die Kalibrierung des hohen Volumens Schwebstoffe insgesamt Sampler <ol><li> Ziehen Sie den Sampler Motor von der Massendurchflussregler und der Motor zu einem stabilen Wechselstromquelle (Abbildung 1). HINWEIS: Ein Filter wird bei diesem Vorgang nicht verwendet. </li><li> Montieren Sie den Kalibrator Öffnung und Toplader-Adapterplatte an den Sampler. Ziehen Sie die Top-Loading-Adapter Niederhalte Muttern fest, um sicherzustellen, dass keine Luftlecks vorhanden sind. Lassen Sie den Sampler Motor seine normale Betriebstemperatur zu erwärmen (ca. 10-15 min). </li><li> Führen Sie eine Dichtigkeitsprüfung durch die Löcher abdecken oben auf der Öffnung und Druckhahn an der Öffnung mit den Händen. Hören Sie ein schrilles Quietschen Klang durch Luft entweicht. Wenn dieser Ton zu hören ist, nachziehen Toplader-Adapter Niederhaltemuttern als ein Leck vorhanden ist. Wenn der Ton niedriger ist, ist das Leck in der Nähe von einem der anderen Dichtungen in den system. </li><li> Schließen Sie eine Seite eines Wasser Manometer an den Druckanschluss auf der Seite der Öffnung mit einem Gummi-Vakuumröhre. Verlassen die gegenüberliegende Seite des Manometers zur Atmosphäre hin offen. Halten Sie ein Manometer vertikal, um genaue Messwerte zu gewährleisten. Durch Tippen auf die Rückseite des kontinuierlichen Fluss Recorder wird dazu beitragen, den Stift zu zentrieren und genaue Messwerte liefern. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 1.1.2 unter Verwendung von fünf Flussraten darstellen Betriebsflussraten von 30 bis 60 ft / min (etwa alle 5-6 ft 3 / min). Stellen Sie den Regler auf der variablen Öffnung an fünf verschiedenen Positionen und fünf verschiedene Messungen vornehmen. </li><li> Notieren Sie sich die Umgebungslufttemperatur, Umgebungsluftdruck, Sampler Seriennummer, Seriennummer Öffnung, Öffnung Steigung und mit Datum der letzten zertifiziert, das Datum, die Standortwahl und Betreiber Initialen auf dem Kalibrierungsblatt. </li></ol></li><li> Schwebstoffe insgesamt Probensammlung und gravimetrische Analyse <ol><li> Wickeln Sie ein8 &quot;x 10&quot; Quarzfaserfilter in zwei Schichten von Aluminiumfolie. Setzen Sie den Filter eingewickelt in den Ofen und stellen Sie die Temperatur auf 550 ° C. Backen Sie den Filter für mindestens 4 Stunden. Lassen Sie den Ofen abkühlen und rufen Sie den Filter. Setzen Sie den Filter im Exsikkator mit CaCO3. </li><li> Wiegen des Filters in einer Mikrowaage mit einer Genauigkeit von 10 &amp; mgr; g. Wiederholen Sie die Messung dreimal während eines Tages. Einzelne Messungen sollten innerhalb von 25 ug sein. Wird dies nicht erreicht wird, kehrt die verpackte Filter in den Exsikkator und wiederholen Sie den nächsten Tag den Prozess. </li><li> Öffnen Sie den Schutz Deckel (Abbildung 2). Filter entfernen Halterrahmen durch die vier Flügelmuttern lockern, so dass die Messingschrauben und Unterlegscheiben aus dem Weg zu schwingen hinunter. Klappen Sie den Filter aus der Aluminiumfolie und gereinigt Pinzette vorsichtig zu zentrieren, rauere Seite nach oben, auf dem Trag Bildschirm. richten Sie richtig den Filter auf dem Bildschirm. </li><li> Platzieren Sie den Rahmen auf dem Bildschirm, und befestigen Sie es mitDie Messingschrauben und Unterlegscheiben, während eine ausreichende Druckaufbringungsluftverlust an den Kanten zu vermeiden. Wischen Sie Staubansammlung aus der ganzen Filterhalter mit einem sauberen Tuch. Schließen Obdach Deckel vorsichtig und sichern. </li><li> Achten Sie darauf, alle Kabel sind in die entsprechenden Aufnahmebuchsen eingesteckt und der Schlauch zwischen dem Gebläsemotor Druckanschluss und den kontinuierlichen Fluss-Recorder angeschlossen ist. </li><li> Bereiten Sie den Fluss-Recorder. Drücken Sie Stift Arm Heber Stiftspitze zu heben, und legen Sie ein neues Diagramm. Richten Sie die Lasche des Diagramms auf der Antriebsnabe des Recorders und drücken Sie mit dem Daumen-Chart Zentrum auf die Nabe zu senken. Stellen Sie die Zeit von der Antriebsnabe Dreh im Uhrzeigersinn, bis die korrekte Zeit auf Diagramm mit Zeitindex Zeiger ausgerichtet ist. </li><li> Wechseln Sie manuell auf dem Sampler und die Sammlung beginnen. Überwachen Sie den Recorder sicher sein, es ist richtig Einfärben und die verstrichene Zeit Anzeige um sicherzustellen, dass es richtig funktioniert. </li><li> Am Ende der Abtastperiode, schalten Sie den Sampler, Rekord ausdie verstrichene Zeit und das Diagramm abgerufen werden. Entfernen Sie den Rahmen um den Filter zu belichten. Entfernen Sie den freigelegten Filter aus dem Stützsieb indem sie sie sanft an den Enden mit der Zange zu halten. Falten Sie den Filter der Länge nach, so dass Probe berührt Probe zweimal und wickeln Sie es in der ursprünglichen Aluminiumfolie. </li><li> Lagern Sie den Filter in einem Exsikkator mit CaCO3 für mindestens 24 Stunden vor dem Wiegen. Wiederholen Sie Schritt 1.2.2 das Gewicht der Filter nach der Probenahme zu messen. Setzen Sie den Filter in einer Zip-Plastikbeutel und lagern Sie es in -80 ° C bis zur Analyse. </li></ol></li><li> Die Analyse der gesammelten Schwebstoffe insgesamt Probe <ol><li> Abrufen der gespeicherten Filter, entfalten die Aluminiumfolie und übertragen Sie den Filter auf eine saubere Teflonoberfläche. Mit einer Pinzette und Skalpell, schneiden Außen (weiß) Teil des Filters und entsorgen. <ol><li> Als nächstes schneiden Sie den Filter in 0,5 &quot;x 0,5&quot; Stücke schneiden und Stücke in einem 100 ml Kolben. 50 ml Reinstwasser. Der Kolben wird in einem UltraschallBad und beschallen bei 33 ± 3 kHz für 60 min. </li></ol></li><li> Filter Extrakt durch ein 0,45 um Polypropylen-Spritzenfilter in einen 100 ml Rundkolben. das Wasser verdampfen, um einen Rotationsverdampfer Instrument unter Druck bei 50 ° C bis ca. 5 ml Extrakt unter Verwendung bleibt in der Flasche. <ol><li> Dampfe das restliche Wasser in einem 15 ml-Birnenkolben mit bekanntem Gewicht. Wiegen Sie die Flasche mit dem Trockenextrakt und die Masse des Trockenextrakt aufzuzeichnen. </li></ol></li><li> Man löst das trockene Probe mit 400 ul D 2 O durch Beschallen für 15 Minuten und Transfer in einem 5 - mm - Standard - NMR - Röhrchen. Zentrifuge für 5 min bei 12.000 xg bei Raumtemperatur um irgendwelche ungelösten Stoffe zu entfernen. </li><li> Wiederholen mit 300 &amp; mgr; l D 2 O. Zugabe von 10 &amp; mgr; l NaN 3 1.4% (Endkonz .: 0,02% w / v) in dem NMR - Röhrchen. Werden 10 ul (32 ug) der Gesamtmenge an suspendierten Teilchen (TSP) -D4 (3,2 mg / ml) an D 2 O (Endkonzentration 0,258 mM) in dem NMR - Röhrchen. </li><li>Erwerben 1 H - NMR - Spektren eines NMR - Spektrometers bei 600,17 MHz betrieben wird . <ol><li> Legen NMR-Röhrchen in die Tripelresonanz Kryosonde. Kalibrieren Sie das Gerät in der folgenden Reihenfolge: lock, tune, Shim, 90 ° Pulslängenkalibrierung und Empfängerverstärkungseinstellung. </li><li> Messen Sie Spektren bei 25 ° C mit einem 1 D Anregung Sculpting-Sequenz mit 180 Wasser-selektive Pulse in Digital-Quad-Erfassungsmodus, 8.192 Scans, 4 Dummy-Scans, Wobbelbreite von 8012,57 Hz, die Frequenz für die Wassersignalunterdrückung bei 4,70 ppm, eingestellt Offset 1,70 sec Erfassungszeit, 32.768 Zeitbereich Datenpunkte (TD), 1 ms Dauer Gradienten (p16), 100 &amp; mgr; s Erholung Verzögerung nach dem Gradienten (d16). </li></ol></li><li> Verfahren 1 H - NMR - Spektren , die durch eine Linienverbreiterung von 1 Hz und Nullfüllung um einen Faktor von 2 (65.536 Datenpunkte) anwenden. Korrigieren Sie die Phase und Baseline manuell und zu integrieren. Set TSP-d4-Peak bei 0,0 ppm. </li></ol></li></ol> 2. Partikelbelastung<ol><li> Kultur einrichten <ol><li> Warm vollständige Wachstumsmedium enthaltend 10% fötales Rinderserum (FBS) und Penicillin-Streptomycin-Lösung (100 U / ml), 0,25% Trypsin-Lösung und Calcium-Magnesium-freien Phosphatpuffer-Salzlösung (PBS) in einem Wasserbad (bei 37 ° C) für mindestens 30 min vor Kulturbeginn. </li><li> Nehmen Sie einen T75 - Kolben von 5% CO 2 Inkubator kultiviert RAW264.7 Zellen und die Zellen werden mit 2 ml vorgewärmtes PBS zweimal. </li><li> Abzulösen anhaftenden RAW264.7-Zellen vom Boden der Gewebekulturgefäß unter Verwendung von 1 ml vorgewärmtes Trypsin-Lösung, gefolgt von Abkratzen. </li><li> Sammle die Zellen aus Gewebekulturgefäß und stellen durch wiederholtes Pipettieren eine Einzelzellsuspension. Zähle die Anzahl der Zellen mit Trypan - Blau und der Platte bei einer Dichte von 8000 / cm 2 (500.000 Zellen insgesamt) in einer 100 mm - Gewebekulturschale mit vorgewärmtem kompletten Medien. Einstellen Medienvolumen auf 10 ml für eine Endkonzentration von 50.000 Zellenpro ml. HINWEIS: Verdoppelung der Anzahl der Platten, wenn DNA-Methylierungsanalyse wird ebenfalls durchgeführt. </li><li> Platzieren Sie die neu ausplattiert RAW264.7 - Zellen zurück in 5% CO 2 Inkubator bei 37 ° C und lassen für 24 h zu befestigen. </li><li> Auch in einem Biosicherheitsschrank resuspendieren gefilterten Partikel. Beispielsweise verdünnte Teilchen in einer Konzentration von 0,5 mg / ml in sterilem PBS für eine 5 &amp; mgr; g / ml Behandlung Dosis und bei 5 mg / ml für eine 50 &amp; mgr; g / ml Behandlungsdosis. Verdünnungen bis zu Monat im Voraus gespeichert und bei -80 ° C hergestellt werden. </li></ol></li><li> Die Behandlung mit Feinstaub <ol><li> Nehmen Sie die Zellen , die aus 5% CO 2 Inkubator und überprüfen unter 10 - facher Vergrößerung ein inverses Mikroskop für das Zellwachstum unter Verwendung der Zellmorphologie, Kulturbedingungen und Kontamination. Man sollte erwarten, dass mindestens 30% konfluenten Zellen in diesem Stadium zu haben. </li><li> Aseptisch absaugen Medien sterilisierten Pipette und waschen Sie das Kulturgefäß mit 2 ml 37 ° C PBSzwei Mal vollständig die Medien entfernen und schwebenden oder toten Zellen. </li><li> Hinzufügen vorbestimmte Dosis von Partikeln mit frischem Medium in den Kulturgefäßen und inkubieren gewünschte Zeit bei 37 ° C in 5% CO 2 -Inkubator. In dieser Studie wurden 72 h RAW264.7-Zellen mit PM behandeln, um die Belichtung für gleichzeitige genotoxischen und epigenotoxic Analyse parallel. HINWEIS: Die Zytotoxizität negativ auf die Qualität der zytogenetische Analyse beeinflussen können. Daher zusätzliche Assays wie Cytotoxizität, DNA-Methylierung, Western-Blotting oder Genexpressionsanalyse werden typischerweise auf behandelten Zellen durchgeführt. Expose Zellen mit dem spezifischen Assay gewünscht beschrieben und gehen. Unerfahrene Anwender können auch eine positive Kontrolle, wie Methyl Methansulfonat einschließen möchten ihre Fähigkeit zu testen CAs zu erkennen. </li></ol></li></ol> 3. zytogenetischen Assay <ol><li> Die Behandlung Zellen in der Metaphase zu verhaften <ol><li> Wärmen Sie die Colcemid sosung (10 &amp; mgr; g / ml) in einem Wasserbad 37 ° C für 30 min. Wischen Sie den Deckel mit 70% Alkohol unter einem biologischen Sicherheit Kabinett das Risiko einer Kontamination zu minimieren </li><li> Entfernen Sie vollständig die Medien aseptisch und waschen Sie die Kulturgefäße mit 2 ml vorgewärmt PBS zweimal. </li><li> Fügen vorgewärmtes frisches Medium (2 ml Medium / 10 6 Zellen) enthält , Colcemid - Lösung (5 ul / ml) in dem Kulturgefäß und Inkubieren für 2 Std. </li></ol></li><li> Zellernte <ol><li> Warm Trypsinlösung und PBS in einem Wasserbad bei 37 ° C für 30 min gehalten. Von diesem Schritt an ist es nicht erforderlich, aseptischen Zustand zu halten. </li><li> Komplett-Medium zu entfernen, waschen Sie die Kulturgefäße mit 2 ml 37 ° C PBS für zwei Mal, fügen Kolben erforderliche Volumen der vorgewärmten Trypsin-Lösung (in der Regel 2 ml für 60 mm Kulturschale oder T25-Flasche und 4 ml für 100-mm-Schale oder T75 ), und setzen CO &amp; sub2 ; -Inkubator das Kulturgefäß bei 37 ° C für 1 min in 5% zurück. </li><li> Take das Kulturgefäß aus, nehmen die Zellen mit einem Schaber, und 10 ml PBS hinzufügen Trypsin Aktion zu stoppen. </li><li> Pipette nach oben und unten mindestens zehnmal Einzelzellsuspension und Transfer-Zellen in einem 15 ml konischen Boden Zentrifugenröhrchen zu machen. </li><li> Zentrifuge Zellsuspension bei 400 xg für 5 min in einer Ausschwingzeit Zentrifuge bei Raumtemperatur. </li><li> Entfernen Sie den Überstand, brechen die Zellpellet durch leichtes Klopfen, mit 10 ml PBS, und wieder für fünf Minuten zentrifugiert werden. </li></ol></li><li> Hypotone Behandlung und Fixierung <ol><li> Vorwärmen 0,075 M Kaliumchloridlösung in einem 37 ° C Wasserbad für mindestens 30 min. </li><li> Überstand entfernen, ohne das Zellpellet zu stören und etwa 0,5 ml PBS verlassen. </li><li> brechen Sie vorsichtig das Zellpellet und Einzelzellsuspension machen eine P200 Pipette. </li><li> 4 ml vorgewärmten Kaliumchloridlösung tropfen unter leichtem Schütteln. </li><li> Inkubieren Sie die Zellen in hypotonischen potassium Chloridlösung in einem 37 ° C Wasserbad für 20 min. </li><li> Machen Sie frische acetomethanol Lösung durch Zugabe von 3-Teile Methanol mit 1-K-Eisessig. Halten Sie diese frisch zubereitet Fixiermittel bei Raumtemperatur. </li><li> Nach hypotonischer Behandlung, ein gleiches Volumen (4 ml) von Fixiermittel in dem Rohr hinzuzufügen und die Lösung vorsichtig durch Umdrehen des Röhrchens gemischt. </li><li> Zentrifuge bei 400 xg für 5 min bei Raumtemperatur, und entfernen Sie den Überstand. In diesem Stadium Zellpelletgröße zunimmt, werden weißlich und mehr sichtbar. </li><li> Überstand entfernen, 4 ml frisches Fixiermittel und halten bei Raumtemperatur für 30 min. </li><li> Zentrifuge bei 400 xg für 5 min, entfernen Überstand und geben zwei weitere Waschungen mit 4 ml Fixiermittel. </li></ol></li><li> Slide Reinigung und Metaphasespreitung Vorbereitung <ol><li> Tauchen Glasplättchen vollständig in 10% flüssiges Detergens für 30 min. </li><li> Spülen Sie die Folien gründlich in kaltem Leitungswasser für 30 min. </li><li> Rinse gleitet dreimal mit destilliertem Wasser vollständig Reinigungsmittel zu entfernen, in destilliertem Wasser tauchen, und für eine spätere Verwendung im Kühlschrank lagern. HINWEIS: Reinigungs Dias vor dem Gebrauch Gleichmäßigkeit des Ausbringens erleichtert und Metaphase Qualität erhöht. </li><li> Drop-10 &amp; mgr; l Zellsuspension auf gekühlten nassen Rutsche und lassen Sie es über Nacht trocknen bei Raumtemperatur an der Luft. </li></ol></li><li> Die Färbung und Montage <ol><li> Bereiten Sie 50 ml Giemsa-Lösung durch einen Teil der Giemsa-Lösung mit einem Teil PBS mischen und gießen Sie eine Glasküvette in. </li><li> Tauchen Sie die Folien in Färbelösung für 20 min. </li><li> Spülen Sie die Folien in destilliertem Wasser, um überschüssige Fleck entfernen und sofort trocknen die Folien einen Fön verwenden. </li><li> Lassen Sie die Objektträger bei Raumtemperatur über Nacht. </li><li> Tragen Sie einen einzigen Tropfen Eindeckmedium auf der Folie, legen Sie vorsichtig mit einem Deckglas auf dem Montagemedium, lassen Sie das Medium über den Objektträger zu verbreiten langsam und entfernendas überschüssige Medium mit einem Papiertuch. Erlauben die montierte Rutsche für mindestens 1 Stunde vor dem Bewegen oder Betrachten unter einem Mikroskop zu trocknen Bewegung des Deckglases zu vermeiden. Achtung: Es ist wichtig, das Deckglas sorgfältig zu platzieren, ohne dass Blasen in diesem Schritt zu bilden. Die Verwendung von übermäßiger Hitze Blasen zu entfernen, ist nicht zu empfehlen. </li></ol></li><li> Die mikroskopische Beobachtung und Aberrationstypen <ol><li> Untersuchen Sie die Struktur CAs in Metaphase bei 100-facher Vergrößerung verbreitet eine gute Qualität Hellfeld-Mikroskop. </li><li> Ergebnis mindestens 50 bis 100 Metaphase-Spreads für jede Behandlungsgruppe für Behandlungen, die eine große Anzahl von CAs induzieren. Für kleinere Effektgrößen wird die Analyse von bis zu 300 Metaphasespreitungen beraten. </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Die zytogenetische Untersuchung oder mikroskopische Analyse der Zahlen oder Strukturen der Chromosomen, in erster Linie in der Metaphase-Spreads, liefert Informationen von entscheidender Bedeutung für die Prognose, die Risikobewertung und die Behandlung für verschiedene Krankheiten. Es ist nun gut etabliert, dass zytogenetische Anomalien, die mit dem Fortschreiten und die Entwicklung von verschiedenen Krankheiten verbunden sind, einschließlich Krebs. Bisher CAs wurden in allen wichtigen Tumorarten gefunden. CAs könn...

Es wurde geschätzt , dass die Exposition gegenüber Partikeln (PM) verursacht mehr als 3 Millionen zusätzliche Todesfälle jährlich, in erster Linie von Herz - Lungen - Erkrankungen und Lungenkrebs 1. Tatsächlich PM wurde als krebserzeugend für den Menschen von der Internationalen Agentur für Krebsforschung (Gruppe 1), ein erhöhtes Risiko für Lungenkrebs erkannt mit Exposition gegenüber PM zugenommen hat 2 gezeigt. Interessanterweise fast alle Krebszellen beherbergen numerische und / oder strukturelle Chromosomenanomalien. Partikulärer organischer Kohlenstoff ist eine Variante, komplexe und heterogene Mischung, deren Zusammensetzung und Größenverteilung auf die Emissionen abhängig sowie physikalischen und chemischen Umwandlungen. Auf sie entfallen 35 bis 55% der städtischen PM 2.5 Masse (PM 2,5 um Größe und kleiner) und mehr als 60% der ländlichen und kontinentalen Hintergrund PM 2.5 Masse 3, 4. Die wasserlösliche Fraktion einen Anteil von 30-90% der organischen Aerosol. Eine große Anzahl von organischen Verbindungen,identifiziert wurden, einschließlich aliphatischer Kohlenwasserstoffe, polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe und deren oxygenierte und nitrierte Derivate, aliphatische Aldehyde und Alkohole, freie Fettsäuren und deren Salze, Di-Carbonsäuren, multifunktionelle Verbindungen, Proteine ​​und Huminsäure artigen Makromoleküle (HULIS) unter Verwendung von chromatographische Methoden gekoppelt mit massenspektrometrischen Techniken 5-8. Diese Verbindungen weisen weniger als 10-20% der partikulären organischen Kohlenstoff, wodurch die meisten organischen Kohlenstoff ist unbekannt 9. Experimentelle Beweise legen nahe, dass die Zytotoxizität, oxidativer Stress, Entzündung und bei der Entwicklung von PM-assoziierten Krankheitszuständen beteiligt sind. Es wurde kürzlich gezeigt, jedoch, dass Exposition gegenüber PM resultiert auch in einer Reihe von epigenetischen Veränderungen, einschließlich Änderungen in der DNA - Methylierung von repetitiven Elementen in beiden experimentellen in vitro - Systemen und in menschlichen Subjekten 10-12. Von besonderem Interesse sind die Auswirkungen derPM auf Satelliten-DNA - größere und kleinere Satelliten -, die in der heterochromatischen Region um die Zentromer der Chromosomen zu finden sind. Es wurde gezeigt , daß diese Wirkungen von der Natur persistent sein kann, wie sie für mindestens 72 Stunden nach der Exposition 12 detektiert werden. Veränderungen in der DNA - Methylierung, besonders um Zentromeren kann zur Ansammlung von Satelliten - DNA - mRNA - Transkripte, Kompromisses chromosomale Integrität während der Zellteilung führen und in der Folge in der Entwicklung einer Vielzahl von pathologischen Zuständen 13 führen. Die Anpassung der zytogenetischen Ansatz für die Analyse von CAs als Endpunkt epigenetischen Veränderungen von PM verursacht, so ist von großer Bedeutung. Hier berichten wir den Ansatz für die Umgebungs PM Sammlung und Vorbereitung, in vitro - Exposition und Analyse von CAs die murine Makrophagen RAW264.7 Modellsystem. Makrophagen umfassen die erste Verteidigungslinie gegen die inhalierte Fremdkörper und damit tseine Zelllinie dient als etablierter und der am häufigsten verwendete Modell in der Partikel Toxikologie 11, 12, 14, 15.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="726">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Total suspended particulate sampler</td>
			<td style="width:179px;">Tisch Environmental</td>
			<td style="width:119px;">TE-5170</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:261px;">Bruker Avance III NMR spectrometer&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Bruker</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">TopSpin 3.5/pl2 software</td>
			<td style="width:179px;">Bruker</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:261px;">ACD/NMR Processor Academic Edition</td>
			<td style="width:179px;">ACD/Labs</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RAW264.7 murine macrophages</td>
			<td style="width:179px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">ATCC TIB-71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:261px;">High glucose DMEM GlutaMAX media</td>
			<td style="width:179px;">ThermoFisher</td>
			<td align="right" style="width:119px;">10569010</td>
			<td>Warm in a 37&#176;C waterbath before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:179px;">ThermoFisher</td>
			<td align="right" style="width:119px;">16000044</td>
			<td>Warm in a 37&#176;C waterbath before use</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:261px;">Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td style="width:179px;">ThermoFisher</td>
			<td align="right" style="width:119px;">15140163</td>
			<td>Warm in a 37&#176;C waterbath before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td style="width:179px;">ThermoFisher</td>
			<td align="right" style="width:119px;">25200056</td>
			<td>Warm in a 37&#176;C waterbath before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">PBS, pH 7.4</td>
			<td style="width:179px;">ThermoFisher</td>
			<td align="right" style="width:119px;">10010049</td>
			<td>Warm in a 37&#176;C waterbath before use</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:261px;">KaryoMAX Colcemid Solution in PBS</td>
			<td style="width:179px;">ThermoFisher</td>
			<td align="right" style="width:119px;">15212012</td>
			<td>Warm in a 37&#176;C waterbath before use</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:261px;">KaryoMAX Potassium Chloride Solution</td>
			<td style="width:179px;">ThermoFisher</td>
			<td align="right" style="width:119px;">10575090</td>
			<td>Warm in a 37&#176;C waterbath before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Methanol (HPLC)</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A452N1-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Acetic Acid, Glacial</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP1185-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:261px;">Decon Contrad 70 Liquid Detergent</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">04-355-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:261px;">Wright and Wright-Giemsa Stain Solutions</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">23-200733</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Permount Mounting Medium</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">SP15-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Axio Imager 2</td>
			<td style="width:179px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of the ambient particulate matter-induced chromosomal aberrations using an in vitro system

Die Exposition gegenüber Feinstaub (PM) ist eine der weltweit wichtigsten gesundheitlichen Bedenken, die verschiedene zelluläre Komponenten beschädigen können, einschließlich der nuklearen genetischen Materials. Um die Auswirkungen der PM auf nukleare genetische Integrität, strukturelle Chromosomenaberrationen erzielte in den Metaphasespreitungen der Maus RAW264.7-Makrophagenzellen zu bewerten. PM wird aus der Umgebungsluft mit einem hohen Volumen Schwebstoffe insgesamt Sampler gesammelt. Das gesammelte Material wird solubilisiert und filtriert, um das wasserlösliche, Feinanteil beibehalten. Die Teilchen werden für die chemische Zusammensetzung, die durch Kernspinresonanz (NMR) -Spektroskopie charakterisiert. Verschiedene Konzentrationen von Partikelsuspension werden auf eine in - vitro - Kultur von RAW264.7 Makrophagen der Maus für eine Gesamtbelichtungszeit von 72 Stunden zugegeben, zusammen mit unbehandelten Kontrollzellen. Am Ende der Belichtung wird die Kultur mit Colcemid behandelten Zellen in der Metaphase zu verhaften. Die Zellen werden dann geerntet, mit hypotonischer Lösung behandelt, in acetomethanol fixiert, dropped auf Glasobjektträger und schließlich mit Giemsa-Lösung gefärbt. Die Objektträger werden untersucht die strukturellen Chromosomenaberrationen zu bewerten (CAs) in Metaphase bei 1,000x Vergrößerung breitet sich ein Hellfeld-Mikroskop. 50 bis 100 Metaphasespreitung sind für jede Behandlungsgruppe erzielt. Diese Technik ist für den Nachweis von strukturellen Chromosomenaberrationen (CAs) wie Chromatidentyp Art bricht, Chromatidentyp Art Austausch, acentric Fragmente angepasst, dizentrischen und Ringchromosomen, Doppel Minuten, Endoreduplikation und Robertson&#39;sche Translokation in vitro nach der Exposition gegen Uhr. Es ist eine leistungsfähige Methode, um eine gut etablierte zytogenetische Endpunkt zu epigenetischen Veränderungen zu verknüpfen.

Große Sorgfalt sollte, sowie die Zeit des Jahres, in der Wahl der Position des TSP-Sampler genommen werden, wenn Sammlung durchgeführt wird. Die chemische Zusammensetzung sowie die Größe der Teilchen im wesentlichen die Ergebnisse beeinflussen können. Das Material gesammelt haben, sollten vor dem weißen Filter sichtbar sein. Eine normale Maus Metaphasespreitung wird 40 acentric Chromosomen haben. Das Ziel dieser Technik ist es, eine Änderung (oder das Fehlen davon) in dem Anteil d...

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Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

Dieses Protokoll beschreibt Techniken für die Quantifizierung und Charakterisierung von Chromosomenaberrationen in vitro in RAW264.7 Makrophagen der Maus nach der Behandlung mit der Umgebungsluft Feinstaub.

Die Analyse der Feinstaub in der Luft-induzierte Chromosomenaberrationen Mit Hilfe eines<em&gt; In Vitro</em&gt; System

Exposure to particulate matter (PM) is a major world health concern, which may damage various cellular components, including the nuclear genetic material. ...

analysis-ambient-particulate-matter-induced-chromosomal-aberrations

Research

JoVE Journal

Genetics

Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

8.6K Aufrufe.  University of Arkansas for Medical Sciences.  Dieses Protokoll beschreibt Techniken für die Quantifizierung und Charakterisierung von Chromosomenaberrationen in vitro in RAW264.7 Makrophagen der Maus nach der Behandlung mit der Umgebungsluft Feinstaub. 

Serie: Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

In vitro transcription assays have been developed and widely used for many years to study the molecular mechanisms involved in transcription. This process requires multi-subunit DNA-dependent RNA polymerase (RNAP) and a series of transcription factors that act to modulate the activity of RNAP during gene expression. Sequencing gel electrophoresis of radiolabeled transcripts is used to provide detailed mechanistic information on how transcription proceeds and what parameters can affect it. In this paper we describe the protocol to study how the essential elongation factor NusA regulates transcriptional pausing, as well as a method to identify an antibacterial agent targeting transcription initiation through inhibition of RNAP holoenzyme formation. These methods can be used a as platform for the development of additional approaches to explore the mechanism of action of the transcription factors which still remain unclear, as well as new antibacterial agents targeting transcription which is an underutilized drug target in antibiotic research and development.

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

In this manuscript, we describe a protocol to functionally examine transcription and the inhibitory activity of antibacterial agents targeting bacterial transcription.

In - vitro - Transkriptionsassays und ihre Anwendung in der Drug Discovery

In vitro transcription assays have been developed and widely used for many years to study the molecular mechanisms involved in transcription. This process ...

Forschung

Genetik

Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization (mFISH) and Spectral Karyotyping (SKY) in Irradiated Mice

Ionizing radiation (IR) induces numerous stable and unstable chromosomal aberrations. Unstable aberrations, where chromosome morphology is substantially compromised, can easily be identified by conventional chromosome staining techniques. However, detection of stable aberrations, which involve exchange or translocation of genetic materials without considerable modification in the chromosome morphology, requires sophisticated chromosome painting techniques that rely on in situ hybridization of fluorescently labeled DNA probes, a chromosome painting technique popularly known as fluorescence in situ hybridization (FISH). FISH probes can be specific for whole chromosome/s or precise sub-region on chromosome/s. The method not only allows visualization of stable aberrations, but it can also allow detection of the chromosome/s or specific DNA sequence/s involved in a particular aberration formation. A variety of chromosome painting techniques are available in cytogenetics; here two highly sensitive methods, multiple fluorescence in situ hybridization (mFISH) and spectral karyotyping (SKY), are discussed to identify inter-chromosomal stable aberrations that form in the bone marrow cells of mice after exposure to total body irradiation. Although both techniques rely on fluorescent labeled DNA probes, the method of detection and the process of image acquisition of the fluorescent signals are different. These two techniques have been used in various research areas, such as radiation biology, cancer cytogenetics, retrospective radiation biodosimetry, clinical cytogenetics, evolutionary cytogenetics, and comparative cytogenetics.

Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization mFISH and Spectral Karyotyping SKY in Irradiated Mice

The present protocol describes the usefulness of multiple fluorescence in situ hybridization (mFISH) and spectral karyotyping (SKY) in identifying inter-chromosomal stable aberrations in the bone marrow cells of mice after exposure to total body irradiation.

Der Nachweis von Inter-chromosomale Stable Abberationen durch Mehrfachfluoreszenz<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisierung (MFISH) und Spektrale Karyotypisierung (SKY) in Bestrahlte Mäuse

Ionizing radiation (IR) induces numerous stable and unstable chromosomal aberrations. Unstable aberrations, where chromosome morphology is substantially ...

Analysis of the c-KIT Ligand Promoter Using Chromatin Immunoprecipitation

Multiple cellular processes, including DNA replication and repair, DNA recombination, and gene expression, require interactions between proteins and DNA. Therefore, DNA-protein interactions regulate multiple physiological, pathophysiological, and biological functions, such as cell differentiation, cell proliferation, cell cycle control, chromosome stability, epigenetic gene regulation, and cell transformation. In eukaryotic cells, the DNA interacts with histone and nonhistone proteins and is condensed into chromatin. Several technical tools can be used to analyze DNA-protein interactions, such as the Electrophoresis (gel) Mobility Shift Assay (EMSA) and DNase I footprinting. However, these techniques analyze the protein-DNA interaction in vitro, not within the cellular context. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a technique that captures proteins at their specific DNA binding sites, thereby allowing for the identification of DNA-protein interactions within their chromatin context. It is done by fixation&#160;of the DNA-protein interaction, followed by&#160;immunoprecipitation of the protein of interest. Subsequently, the genomic site that the protein was bound to is characterized. Here, we describe and discuss ChIP and demonstrate its analytical value for the identification of the Transforming Growth Factor-&#946; (TGF-&#946;)-induced binding of the transcription factor SMAD2 to SMAD Binding Elements (SBE) within the promoter region of the tyrosine-protein kinase Kit (c-KIT) receptor ligand Stem Cell Factor (SCF).

DNA-protein interactions are essential for multiple biological processes. During the evaluation of cellular functions, the analysis of DNA-protein interactions is indispensable for understanding gene regulation. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to analyze such interactions in vivo.

Analyse des c-KIT-Liganden-Promotors unter Verwendung von Chromatin-Immunpräzipitation

Multiple cellular processes, including DNA replication and repair, DNA recombination, and gene expression, require interactions between proteins and DNA. ...

Determination of the Optimal Chromosomal Location(s) for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In bacteria, the impact of the genetic context on the function of a genetic element can be difficult to assess. Several mechanisms, including topological effects, transcriptional interference from neighboring genes, and/or replication-associated gene dosage, may affect the function of a given genetic element. Here, we describe a method that permits the random integration of a DNA element into the chromosome of Escherichia coli and select the most favorable locations using a simple growth competition experiment. The method takes advantage of a well-described transposon-based system of random insertion, coupled with a selection of the fittest clone(s) by growth advantage, a procedure that is easily adjustable to experimental needs. The nature of the fittest clone(s) can be determined by whole-genome sequencing on a complex multi-clonal population or by easy gene walking for the rapid identification of selected clones. Here, the non-coding DNA region DARS2, which controls the initiation of chromosome replication in E. coli, was used as an example. The function of DARS2 is known to be affected by replication-associated gene dosage; the closer DARS2 gets to the origin of DNA replication, the more active it becomes. DARS2 was randomly inserted into the chromosome of a DARS2-deleted strain. The resultant clones containing individual insertions were pooled and competed against one another for hundreds of generations. Finally, the fittest clones were characterized and found to contain DARS2 inserted in close proximity to the original DARS2 location.

Determination of the Optimal Chromosomal Locations for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Here, the power of a transposon-mediated random insertion of a non-coding DNA element was used to resolve its optimal chromosomal position.

Bestimmung der optimalen chromosomalen Speicherorte für eine DNA-Element in Escherichia coli mit einem neuartigen Transposon-vermittelte Ansatz

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In ...

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA mutation rates. Changes in replication timing occur during development and in cancer, but the role replication timing plays in development and disease is not known. Zebrafish were recently established as an in vivo model system to study replication timing. Here is detailed the protocols for using the zebrafish to determine DNA replication timing. After sorting cells from embryos and adult zebrafish, high-resolution genome-wide DNA replication timing patterns can be constructed by determining changes in DNA copy number through analysis of next generation sequencing data. The zebrafish model system allows for evaluation of the replication timing changes that occur in vivo throughout development, and can also be used to assess changes in individual cell types, disease models, or mutant lines. These methods will enable studies investigating the mechanisms and determinants of replication timing establishment and maintenance during development, the role replication timing plays in mutations and tumorigenesis, and the effects of perturbing replication timing on development and disease.

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Zebrafish were recently used as an in vivo model system to study DNA replication timing during development. Here is detailed the protocols for using zebrafish embryos to profile replication timing. This protocol can be easily adapted to study replication timing in mutants, individual cell types, disease models, and other species.

DNA-Replikation Timing mit Zebrafisch als ein In Vivo Modell-System-Profiling

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA ...

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene expression, but whether looping is responsible for or a result of alterations in gene expression is still unknown. Until recently, how chromatin looping affects the regulation of gene activity and cellular function has been relatively ambiguous, and limitations in existing methods to manipulate these structures prevented in-depth exploration of these interactions. To resolve this uncertainty, we engineered a method for selective and reversible chromatin loop re-organization using CRISPR-dCas9 (CLOuD9). The dynamism of the CLOuD9 system has been demonstrated by successful localization of CLOuD9 constructs to target genomic loci to modulate local chromatin conformation. Importantly, the ability to reverse the induced contact and restore the endogenous chromatin conformation has also been confirmed. Modulation of gene expression with this method establishes the capacity to regulate cellular gene expression and underscores the great potential for applications of this technology in creating stable de novo chromatin loops that markedly affect gene expression in the contexts of cancer and development.

Chromatin looping plays a significant role in gene regulation; however, there have been no technological advances that allow for selective and reversible modification of chromatin loops. Here we describe a powerful system for chromatin loop re-organization using CRISPR-dCas9 (CLOuD9), demonstrated to selectively and reversibly modulate gene expression at targeted loci.

CRISPR-vermittelten Reorganisation der Chromatinstruktur mit Schleife

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

Measuring Exercise Levels in Drosophila melanogaster Using the Rotating Exercise Quantification System (REQS)

Drosophila melanogaster is a new model organism for studies in exercise biology. To date, two main exercise systems, the Power Tower and the Treadwheel have been described. However, a method to measure the amount of additional animal activity induced through the exercise treatment has been lacking. The Rotating Exercise Quantification System (REQS) fills this need, providing a measure of animal activity for animals experiencing rotational exercise. This protocol details how to use the REQS to assess animal activity during rotational exercise and illustrates the type of data that can be generated. Here, we demonstrate how the REQS is used to measure sex- and strain-specific differences in exercise induced activity. The REQS can also be used to evaluate the impact of various other experimental parameters such as age, diet, or population size on exercise induced activity. In addition, it can be used to compare the efficacy of different exercise training protocols. Importantly, it provides an opportunity to standardize exercise treatments between strains, allowing the researcher to achieve equal amounts of activity between groups if needed. Thus, the REQS is a notable new resource for exercise biologists working with the Drosophila model system and complements existing exercise systems.

Measuring Exercise Levels in Drosophila melanogaster Using the Rotating Exercise Quantification System REQS

The Rotating Exercise Quantification System (REQS) can induce exercise in Drosophila melanogaster through rotation while simultaneously measuring the amount of activity performed by the animals. Here, we present a point-by-point protocol detailing how to measure activity levels of animals experiencing rotational exercise treatments using the REQS.

Übung Messhöhen in Drosophila Melanogaster mit der rotierenden Bewegung Quantifizierung System (Anforderung)

Drosophila melanogaster is a new model organism for studies in exercise biology. To date, two main exercise systems, the Power Tower and the Treadwheel ...

Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences is desired. We herein provide a detailed in vitro and in-cell selective 2&#39;-hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE) protocol to study the RNA structural change in the presence of an experimental drug for spinal muscular atrophy (SMA), survival of motor neuron (SMN)-C2, and in exon 7 of the pre-mRNA of the SMN2 gene. In in vitro SHAPE, an RNA sequence of 140 nucleotides containing SMN2 exon 7 is transcribed by T7 RNA polymerase, folded in the presence of SMN-C2, and subsequently modified by a mild 2&#39;-OH acylation reagent, 2-methylnicotinic acid imidazolide (NAI). This 2&#39;-OH-NAI adduct is further probed by a 32P-labeled primer extension and resolved by polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE). Conversely, 2&#39;-OH acylation in in-cell SHAPE takes place in situ with SMN-C2 bound cellular RNA in living cells. The pre-mRNA sequence of exon 7 in the SMN2 gene, along with SHAPE-induced mutations in the primer extension, was then amplified by PCR and subject to next-generation sequencing. Comparing the two methodologies, in vitro SHAPE is a more cost-effective method and does not require computational power to visualize results. However, the in vitro SHAPE-derived RNA model sometimes deviates from the secondary structure in a cellular context, likely due to the loss of all interactions with RNA-binding proteins. In-cell SHAPE does not need a radioactive material workplace and yields a more accurate RNA secondary structure in the cellular context. Furthermore, in-cell SHAPE is usually applicable for a larger range of RNA sequences (~1,000 nucleotides) by utilizing next-generation sequencing, compared to in vitro SHAPE (~200 nucleotides) that usually relies on PAGE analysis. In case of exon 7 in SMN2 pre-mRNA, the in vitro and in-cell SHAPE derived RNA models are similar to each other.

Detailed protocols for both in vitro and in-cell selective 2&#39;-hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE) experiments to determine the secondary structure of pre-mRNA sequences of interest in the presence of an RNA-targeting small molecule are presented in this article.

Mit In-vitro- und In der Zelle Form zu untersuchen, kleines Molekül induzierte Pre-mRNA Strukturveränderungen

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences ...

Determining the Egg Fertilization Rate of Bemisia tabaci Using a Cytogenetic Technique

A few species of sap-sucking whiteflies are some of the most damaging terrestrial pests worldwide because of the crop damage they inflict and plant viruses they vector. Despite numerous studies of the biology of these species in different environments, a key life history parameter, offspring sex ratios, has received little attention, yet is important for predicting population dynamics. The primary sex ratio (sex ratio at oviposition) of Bemisia tabaci has never been reported but can be found by determining the egg fertilization rate of this haplodiploid insect. The technique involves the dechorionation of eggs with bleach, a series of fixation steps, and the application of the general DNA fluorescent stain, DAPI (4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole, a DNA-binding fluorescent dye), to bind to female and male pronuclei. Here, we present the technique, and an example of its application, to test whether an endosymbiotic bacterium, Rickettsia sp. nr. bellii, influenced the primary sex ratio of B. tabaci. This method may assist in population studies of whiteflies, or in determining if sex allocation exists with certain environmental stimuli.

Determining the Egg Fertilization Rate of Bemisia tabaci Using a Cytogenetic Technique

We present a simple cytogenetic technique using 4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) to determine the fertilization rate and primary sex ratio of the haplodiploid invasive pest Bemisia tabaci.

Festsetzung des Ei Befruchtung Tabak Tabaci mit einer zytogenetischen Technik

A few species of sap-sucking whiteflies are some of the most damaging terrestrial pests worldwide because of the crop damage they inflict and plant ...

Characterization of In Vitro Differentiation of Human Primary Keratinocytes by RNA-Seq Analysis

Human primary keratinocytes are often used as in vitro models for studies on epidermal differentiation and related diseases. Methods have been reported for in vitro differentiation of keratinocytes cultured in two-dimensional (2D) submerged manners using various induction conditions. Described here is a procedure for 2D in vitro keratinocyte differentiation method by contact inhibition and subsequent molecular characterization by RNA-seq. In brief, keratinocytes are grown in defined keratinocyte medium supplemented with growth factors until they are fully confluent. Differentiation is induced by close contacts between the keratinocytes and further stimulated by excluding growth factors in the medium. Using RNA-seq analyses, it is shown that both 1) differentiated keratinocytes exhibit distinct molecular signatures during differentiation and 2) the dynamic gene expression pattern largely resembles cells during epidermal stratification. As for comparison to normal keratinocyte differentiation, keratinocytes carrying mutations of the transcription factor p63 exhibit altered morphology and molecular signatures, consistent with their differentiation defects. In conclusion, this protocol details the steps for 2D in vitro keratinocyte differentiation and its molecular characterization, with an emphasis on bioinformatic analysis of RNA-seq data. Because RNA extraction and RNA-seq procedures have been well-documented, it is not the focus of this protocol. The experimental procedure of in vitro keratinocyte differentiation and bioinformatic analysis pipeline can be used to study molecular events during epidermal differentiation in healthy and diseased keratinocytes.

Presented here is a stepwise procedure for in vitro differentiation of human primary keratinocytes by contact inhibition followed by characterization at the molecular level by RNA-seq analysis.

Charakterisierung der In-Vitro-Differenzierung menschlicher Primärkeratinozyten durch RNA-Seq-Analyse

Human primary keratinocytes are often used as in vitro models for studies on epidermal differentiation and related diseases. Methods have been reported ...