Il lavoro è stato sostenuto, in parte, dal National Institute of Health Center of Biological Research Excellence [concessione numero 1P20GM109005], il Consorzio Arkansas spazio di Grant attraverso National Aeronautics and Space Administration [codice di autorizzazione NNX15AK32A], e l&#39;Istituto nazionale per la sicurezza e la Salute (NIOSH) [codice di autorizzazione 2T420H008436]. Gli autori desiderano ringraziare Christopher Fettes per la correzione e la modifica di questo manoscritto.

1. Raccolta e preparazione delle particelle <ol><li> La calibrazione delle particelle campionatore ad alto volume totale sospeso <ol><li> Scollegare il motore campionatore dal controllore di flusso di massa e collegare il motore ad una sorgente di alimentazione CA stabile (figura 1). Nota: Un filtro non viene utilizzato durante questa procedura. </li><li> Montare l&#39;orifizio calibratore e piastra di adattamento di carico superiore al campionatore. Serrare l&#39;adattatore di carico dadi superiori hold-down in modo sicuro per evitare perdite d&#39;aria sono presenti. Lasciare che il motore campionatore di riscaldarsi fino alla sua normale temperatura di esercizio (circa 10-15 minuti). </li><li> Eseguire un test di tenuta coprendo i fori sulla parte superiore del rubinetto dell&#39;orifizio e la pressione sul foro con le mani. Ascoltate per un suono acuto stridio fatta da fuoriuscita dell&#39;aria. Se si sente questo suono, serra nuovamente le adattatori di carico dadi superiori hold-down come è presente una perdita. Se il suono è bassa, la perdita è vicino ad una delle altre guarnizioni in sysTEM. </li><li> Collegate un lato di un manometro ad acqua al rubinetto pressione sul lato del foro con un tubo a vuoto di gomma. Lasciare il lato opposto del manometro aperto all&#39;atmosfera. Tenere un manometro in verticale per garantire letture precise. Toccando retro del registratore flusso continuo contribuirà a centrare la penna e fornire letture precise. </li><li> Ripetere il passaggio 1.1.2 utilizzando cinque portate che rappresentano le portate che operano da 30 a 60 ft / min (circa ogni 5-6 ft 3 / min). Regolare la manopola sul orifizio variabile a cinque diverse posizioni e prendere cinque letture diverse. </li><li> Registrare la temperatura ambientale dell&#39;aria, pressione barometrica ambiente, numero di serie campionatore, numero di serie orifizio, pendenza orifizio e intercetta con ultima data di certificazione, la data, il luogo del sito, e le iniziali dell&#39;operatore sul foglio di calibrazione. </li></ol></li><li> Totale raccolta particelle del campione in sospensione e analisi gravimetrica <ol><li> avvolgere un8 filtri in fibra di quarzo &quot;x 10&quot; in due strati di fogli di alluminio. Posizionare il filtro avvolta nel forno e impostare la temperatura a 550 ° C. Cuocere il filtro per almeno 4 ore. Lasciare raffreddare il forno e recuperare il filtro. Posizionare il filtro in un essiccatore con CaCO3. </li><li> Pesare il filtro in una microbilancia con precisione di 10 mg. Ripetere la misurazione per tre volte nel corso di una giornata. misurazioni individuali devono essere all&#39;interno di 25 mcg. Se questo non è raggiunto, restituire il filtro avvolto in un essiccatore e ripetere il processo il giorno seguente. </li><li> Aprire il coperchio riparo (Figura 2). Rimuovere il filtro telaio titolare allentando i quattro dadi ad alette, consentendo i bulloni in ottone e rondelle ad oscillare verso il basso fuori strada. Aprire il filtro dal foglio di alluminio, e utilizzare pinze puliti per centrare attentamente, parte più ruvida up, sullo schermo di supporto. Allineare correttamente il filtro sullo schermo. </li><li> Posizionare la cornice dello schermo e fissarlo coni bulloni ottone e rondelle applicando pressione sufficiente a evitare perdite d&#39;aria ai bordi. Pulire ogni accumulo di polvere provenienti da tutto il supporto del filtro con un panno pulito. Chiudere il coperchio riparo con cura e fissarlo. </li><li> Assicurarsi che tutti i cavi siano collegati a loro appropriate prese recipiente e il tubo tra la presa di pressione motore del ventilatore e il registratore flusso continuo è collegato. </li><li> Preparare il registratore di flusso. Premere penna braccio sollevatore per sollevare punto di penna e inserire un nuovo grafico. Allineare la scheda del grafico per il mozzo del registratore e premere con il pollice per abbassare il centro grafico sul mozzo. Imposta ora facendo ruotare il mozzo in senso orario fino al momento corretto sul grafico è allineato con il puntatore indice temporale. </li><li> passare manualmente sul campionatore e iniziare la raccolta. Monitorare il registratore per assicurarsi che sia correttamente inchiostrazione e l&#39;indicatore del tempo trascorso per essere sicuri che funzioni correttamente. </li><li> Alla fine del periodo di campionamento, spegnere il campionatore, registrareil tempo trascorso e recuperare il grafico. Rimuovere il telaio per esporre il filtro. Rimuovere il filtro esposto dalla schermata di supporto tenendolo dolcemente alle estremità con la pinza. Piegare il filtro longitudinalmente in modo che tocchi campione campione due volte e avvolgerla in un foglio di alluminio originale. </li><li> Conservare il filtro in un essiccatore con CaCO 3 per almeno 24 ore prima della pesata. Ripetere il passo 1.2.2 per misurare il peso dei filtri dopo il prelievo. Posizionare il filtro in un sacchetto di plastica con cerniera e conservarla in -80 ° C fino al momento dell&#39;analisi. </li></ol></li><li> Analisi di raccolta del campione sospesi totali di particelle <ol><li> Recupero del filtro memorizzato, aprire il foglio di alluminio e trasferire il filtro su una superficie pulita Teflon. Utilizzando pinze e bisturi, tagliare (bianco) esterno parte del filtro e smaltire. <ol><li> Quindi, tagliare il filtro in 0,5 &quot;x 0,5&quot; pezzi e pezzi in un pallone da 100 ml. Aggiungere 50 ml di acqua ultrapura. Porre il pallone in un ultrasuonobagno e ultrasuoni per 60 minuti a 33 ± 3 kHz. </li></ol></li><li> Estratto del filtro attraverso un 0,45 micron filtro in polipropilene siringa per 100 ml pallone da fondo. Evaporare l&#39;acqua usando uno strumento evaporatore rotante sotto pressione a 50 ° C fino a circa 5 ml di estratto rimane nel pallone. <ol><li> Evaporare l&#39;acqua residua in 15 ml pallone a pera di peso noto. Pesare il pallone con l&#39;estratto secco e registrare la massa dell&#39;estratto secco. </li></ol></li><li> Sciogliere il campione secco con 400 ml di D 2 O da sonicating per 15 minuti e trasferire in un tubo NMR standard di 5 mm. Centrifugare per 5 minuti a 12.000 xg a temperatura ambiente per rimuovere qualsiasi questione non disciolto. </li><li> Ripetere con 300 ml di D 2 O. Aggiungere 10 ml di NaN 3 1,4% (conc finale .: 0,02% w / v) nel tubo NMR. Aggiungere 10 microlitri (32 ug) di polveri totali sospese (TSP) -d4 (3,2 mg / ml) di D 2 O (concentrazione finale 0,258 mM) nel tubo NMR. </li><li>Acquisire 1 spettri H NMR utilizzando uno spettrometro NMR operante a 600,17 MHz. <ol><li> Inserire il tubo NMR nella cryoprobe tripla risonanza. Calibrare lo strumento nel seguente ordine: serratura, sintonia, lo spessore, la calibrazione lunghezza impulso a 90 ° e la regolazione guadagno del ricevitore. </li><li> Misurare spettri a 25 ° C con un 1 D sequenza di eccitazione scultura con 180 impulsi selettivi-acqua in modalità di rilevamento Quad digitale, 8.192 scansioni, 4 scansioni fittizi, larghezza spazzata di 8012,57 Hz, frequenza di offset per la soppressione del segnale dell&#39;acqua fissato a 4,70 ppm, 1,70 sec tempo di acquisizione, 32.768 punti di dati in tempo dominio (TD), 1 msec durata gradiente (P16), 100 msec ritardare il recupero dopo il gradiente (d16). </li></ol></li><li> Processo 1 H NMR spectra applicando un allargamento linea di 1 Hz e riempimento di zero per un fattore 2 (65.536 punti dati). Correggere la fase e linea di base manuale e integrare. Set TSP-d4 picco a 0,0 ppm. </li></ol></li></ol> Esposizione 2. particelle<ol><li> Cultura istituito <ol><li> mezzi di crescita completo caldo contenente 10% di siero fetale bovino (FBS) e la soluzione di penicillina-streptomicina (100 U / ml), soluzione di tripsina 0,25% e magnesio calcio libero tampone fosfato salino (PBS) in un bagno d&#39;acqua (a 37 ° C) per almeno 30 minuti prima dell&#39;inizio della cultura. </li><li> Estrarre un pallone T75 dal 5% di CO 2 incubatore contenente cellule in coltura RAW264.7 e lavare le cellule con 2 ml di pre-riscaldato PBS due volte. </li><li> Staccare le cellule aderenti RAW264.7 dal fondo del recipiente di coltura tissutale con 1 ml di soluzione di pre-riscaldato tripsina seguite da raschiare. </li><li> Raccogliere le cellule dal recipiente di coltura tissutale e fare una sospensione singola cella pipettando ripetutamente. Contare il numero di cellule con trypan blu e la piastra ad una densità di 8.000 / cm 2 (500.000 cellule totali) in un tessuto coltura piatto 100 mm con supporti completa pre-riscaldato. Regolare volume di supporto a 10 ml per una concentrazione finale di 50.000 celluleper ml. NOTA: il doppio del numero di piastre se viene eseguita anche l&#39;analisi della metilazione del DNA. </li><li> Mettere le cellule RAW264.7 recente placcato indietro nel 5% di CO 2 incubatore a 37 ° C e permettono di collegare per 24 ore. </li><li> Anche in un armadio biosicurezza, risospendere le particelle filtrate. Ad esempio, diluire particelle ad una concentrazione di 0,5 mg / ml in PBS sterile per una dose di trattamento 5 ug / ml e 5 mg / ml per una dose di trattamento 50 ug / ml. Le diluizioni possono essere preparate fino a mese in anticipo e conservati a -80 ° C. </li></ol></li><li> Il trattamento con particolato <ol><li> Estrarre le cellule dal 5% di CO 2 incubatore e visualizzate a 10 ingrandimenti utilizzando un microscopio invertito per la crescita cellulare, la morfologia delle cellule, la condizione della cultura, e la contaminazione. Si dovrebbe aspettare di avere almeno il 30% di cellule confluenti in questa fase. </li><li> Asetticamente, aspirare i media con una pipetta sterile e lavare il recipiente di coltura con 2 ml 37 ° C PBSdue volte per rimuovere completamente i mezzi di comunicazione e le cellule galleggianti o morti. </li><li> Aggiungere dosaggio predeterminato di particolato con mezzi freschi nei recipienti di coltura e incubare per tempo desiderato a 37 ° C in 5% CO 2 incubatore. In questo studio, il trattamento di cellule RAW264.7 con PM per 72 ore in parallelo all&#39;esposizione utilizzato per l&#39;analisi genotossico e epigenotoxic concorrente. NOTA: La citotossicità può influire negativamente sulla qualità delle analisi citogenetica. Pertanto, saggi aggiuntivi come citotossicità, metilazione del DNA, Western blotting, o analisi di espressione genica sono tipicamente eseguite su cellule trattate. Esporre le cellule come descritto e procedere con il test specifico desiderato. Gli utenti inesperti possono anche voler includere un controllo positivo, come metansulfonato metile per testare la loro capacità di rilevare CA. </li></ol></li></ol> 3. test citogenetico <ol><li> Il trattamento di arrestare le cellule in metafase <ol><li> Scaldare il Colcemid cosìluzione (10 ug / ml) in un bagno di acqua a 37 ° C per 30 min. Pulire il coperchio con il 70% di alcool sotto un armadio biosicurezza per minimizzare il rischio di contaminazione </li><li> Rimuovere completamente i mezzi di comunicazione in modo asettico e lavare i recipienti di coltura con 2 ml di pre-riscaldato PBS due volte. </li><li> Aggiungere mezzi freschi pre-riscaldato (2 ml supporti / 10 6 celle) contenenti soluzione Colcemid (5 ml / ml) nel recipiente di coltura e incubare per 2 ore. </li></ol></li><li> la raccolta delle cellule <ol><li> soluzione tripsina caldo e PBS in un bagno d&#39;acqua mantenuto a 37 ° C per 30 min. Da questo punto in poi, non vi è alcuna necessità di mantenere condizioni asettiche. </li><li> Rimuovere completamente i media, lavare i recipienti di coltura con 2 ml 37 ° C PBS per due volte, aggiungere il volume richiesto di soluzione pre-riscaldato tripsina (di solito 2 ml per 60 millimetri piatto cultura o pallone T25 e 4 ml per piatto 100 mm o pallone T75 ), e posizionare il recipiente di coltura nel 5% CO 2 incubatore a 37 ° C per 1 min. </li><li> Take il recipiente di coltura, staccare le cellule con un raschietto, e aggiungere 10 ml di PBS per fermare l&#39;azione tripsina. </li><li> Pipetta su e giù per almeno dieci volte per fare sospensione cellulare unico e le cellule di trasferimento in un 15 ml conica tubo fondo centrifuga. </li><li> sospensione cellulare Centrifugare a 400 xg per 5 min in un&#39;oscillazione fuori centrifuga a temperatura ambiente. </li><li> Rimuovere il surnatante, rompere il pellet cellulare con lievi colpetti, aggiungere 10 ml di PBS, e di nuovo centrifugare per cinque minuti. </li></ol></li><li> Trattamento ipotonico e la fissazione <ol><li> Pre-warm 0,075 M soluzione di cloruro di potassio in un bagnomaria a 37 ° C per almeno 30 min. </li><li> Rimuovere il surnatante senza disturbare il pellet cellulare e lasciare circa 0,5 ml di PBS. </li><li> rompere delicatamente il pellet di cellule e rendere la sospensione singola cella utilizzando una pipetta P200. </li><li> Aggiungere 4 ml di soluzione di cloruro di potassio goccia pre-riscaldato a goccia agitando delicatamente. </li><li> Incubare le cellule a ipotonica psoluzione di cloruro otassium a bagnomaria C 37 ° per 20 min. </li><li> Fai la soluzione acetomethanol fresco con l&#39;aggiunta di 3 parti metanolo con acido acetico glaciale 1-parte. Tenere questo fissativo appena preparato a temperatura ambiente. </li><li> Dopo il trattamento ipotonico, aggiungere un volume uguale (4 ml) di fissativo nel tubo e mescolare delicatamente la soluzione capovolgendo la provetta. </li><li> Centrifugare a 400 xg per 5 min a temperatura ambiente, e rimuovere il surnatante. A questo aumento delle dimensioni pellet cellulare palco, diventano biancastre e più visibile. </li><li> Rimuovere il surnatante, aggiungere 4 ml di fissativo aperta e mantenerlo a temperatura ambiente per 30 min. </li><li> Centrifugare a 400 xg per 5 minuti, rimuovere il surnatante, e dare più due lavaggi con 4 ml di fissativo. </li></ol></li><li> Pulizia scivolo e preparazione diffusione metafase <ol><li> Immergere vetrini completamente in 10% di detergente liquido per 30 min. </li><li> Sciacquare i vetrini completamente in acqua fredda rubinetto aperto per 30 minuti. </li><li> Rinse vetrini tre volte con acqua distillata per rimuovere completamente il detersivo, immergere in acqua distillata, e conservare in frigorifero per uso futuro. NOTA: scivoli pulizia prima dell&#39;uso facilita uniformità di applicazione e aumenta la qualità metafase. </li><li> Goccia sospensione cellulare 10 microlitri sul vetrino bagnato freddo e lasciarlo all&#39;aria asciugare per una notte a temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Colorazione e montaggio <ol><li> Preparare 50 ml di soluzione colorante Giemsa mescolando una parte della soluzione colorante Giemsa con una parte di PBS e versare in una vaschetta Coplin. </li><li> Immergere i vetrini nella soluzione colorante per 20 min. </li><li> Sciacquare i vetrini in acqua distillata per rimuovere l&#39;eccesso macchia e immediatamente asciugare le diapositive utilizzando un asciugacapelli. </li><li> Lasciare le diapositive a temperatura ambiente per una notte. </li><li> Applicare una sola goccia di mezzo di montaggio sul vetrino, inserire delicatamente un coprioggetto sul mezzo di montaggio, consentono il supporto di diffondere sul vetrino lentamente, e rimuovereil mezzo eccesso con un tovagliolo di carta. Lasciare che il vetrino montato ad asciugare per almeno 1 ora prima di spostare o la visualizzazione al microscopio per evitare movimenti del vetrino. Attenzione: è importante mettere il vetrino accuratamente senza formare eventuali bolle durante questa fase. L&#39;uso del calore eccessivo per rimuovere bolle non è raccomandato. </li></ol></li><li> Tipi osservazione al microscopio e di aberrazione <ol><li> Esaminare le CA strutturali in metafase si diffonde a ingrandimento 100X utilizzando un campo chiaro microscopio di buona qualità. </li><li> Segna almeno 50 a 100 metafase diffonde per ciascun gruppo di trattamento per i trattamenti che inducono un gran numero di CA. Per dimensioni dell&#39;effetto più piccoli, si consiglia l&#39;analisi di un massimo di 300 spread metafase. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Lim, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+risk+assessment+of+burden+of+disease+and+injury+attributable+to+67+risk+factors+and+risk+factor+clusters+in+21+regions,+1990-2010:+a+systematic+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2010.">A comparative risk assessment of burden of disease and injury attributable to 67 risk factors and risk factor clusters in 21 regions, 1990-2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010.</a> Lancet. 380, 2224-2260 (2012).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> IARC: Outdoor air pollution a leading environmental cause of cancer deaths. , (2013).</li><li>Putaud, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+European+aerosol+phenomenology-2:+chemical+characteristics+of+particulate+matter+at+kerbside,+urban,+rural+and+background+sites+in+Europe.">A European aerosol phenomenology-2: chemical characteristics of particulate matter at kerbside, urban, rural and background sites in Europe.</a> Atmos. Environ. 38 (16), 2579-2595 (2004).</li><li>Hand, J., Schichtel, B., Pitchford, M., Malm, W., Frank, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seasonal+composition+of+remote+and+urban+fine+particulate+matter+in+the+United+States.">Seasonal composition of remote and urban fine particulate matter in the United States.</a> J Geophys Res-Atmos. 117 (5), (2012).</li><li>Schauer, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Source+apportionment+of+airborne+particulate+matter+using+organic+compounds+as+tracers.">Source apportionment of airborne particulate matter using organic compounds as tracers.</a> Atmos. Environ. 30 (22), 3837-3855 (1996).</li><li>Simoneit, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+biomarker+compounds+as+source+indicators+and+tracers+for+air+pollution.">A review of biomarker compounds as source indicators and tracers for air pollution.</a> Environ. Sci. Pollut. Res. 6 (3), 159-169 (1999).</li><li>Kavouras, I. G., Stephanou, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+size+distribution+of+organic+primary+and+secondary+aerosol+constituents+in+urban,+background+marine,+and+forest+atmosphere.">Particle size distribution of organic primary and secondary aerosol constituents in urban, background marine, and forest atmosphere.</a> J Geophys Res-Atmos. 107 (8), (2002).</li><li>Graber, E., Rudich, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atmospheric+HULIS:+How+humic-like+are+they?+A+comprehensive+and+critical+review.">Atmospheric HULIS: How humic-like are they? A comprehensive and critical review.</a> Atmos. Chem. Phys. 6 (3), 729-753 (2006).</li><li>P&#246;schl, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atmospheric+aerosols:+composition,+transformation,+climate+and+health+effects.">Atmospheric aerosols: composition, transformation, climate and health effects.</a> Angew. Chem. Int. 44 (46), 7520-7540 (2005).</li><li>Hou, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+methylation+in+tandem+repeat+element+and+elemental+component+levels+in+inhalable+air+particles.">Altered methylation in tandem repeat element and elemental component levels in inhalable air particles.</a> Environ. Mol. Mutagen. 55 (3), 256-265 (2014).</li><li>Miousse, I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+alterations+induced+by+ambient+particulate+matter+in+mouse+macrophages.">Epigenetic alterations induced by ambient particulate matter in mouse macrophages.</a> Environ. Mol. Mutagen. 55 (5), 428-435 (2014).</li><li>Miousse, I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Toxicity+and+Epigenotoxicity+of+Different+Types+of+Ambient+Particulate+Matter.">In Vitro Toxicity and Epigenotoxicity of Different Types of Ambient Particulate Matter.</a> Toxicol. Sci. 148 (2), 473-487 (2015).</li><li>Ehrlich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+instability+in+cancer+development.">Genomic instability in cancer development.</a> Genome Instability in Cancer Development. , 363-392 (2005).</li><li>Michael, S., Montag, M., Dott, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pro-inflammatory+effects+and+oxidative+stress+in+lung+macrophages+and+epithelial+cells+induced+by+ambient+particulate+matter.">Pro-inflammatory effects and oxidative stress in lung macrophages and epithelial cells induced by ambient particulate matter.</a> Environ Pollut. 183, 19-29 (2013).</li><li>Li, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+heme+oxygenase-1+expression+in+macrophages+by+diesel+exhaust+particle+chemicals+and+quinones+via+the+antioxidant-responsive+element.">Induction of heme oxygenase-1 expression in macrophages by diesel exhaust particle chemicals and quinones via the antioxidant-responsive element.</a> J Immunol. 165 (6), 3393-3401 (2000).</li><li>Pathak, R., Ramakumar, A., Subramanian, U., Prasanna, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+radio-sensitivities+of+human+chromosomes+1+and+2+in+one+donor+in+interphase-+and+metaphase-spreads+after+60Co+gamma-irradiation.">Differential radio-sensitivities of human chromosomes 1 and 2 in one donor in interphase- and metaphase-spreads after 60Co gamma-irradiation.</a> BMC Med. Phys. 9, 6649 (2009).</li><li>Pathak, R., Dey, S. K., Sarma, A., Khuda-Bukhsh, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotoxic+effects+in+M5+cells+and+Chinese+hamster+V79+cells+after+exposure+to+7+Li-beam+(LET=+60keV/&#181;m)+and+correlation+of+their+survival+dynamics+to+nuclear+damages+and+cell+death.">Genotoxic effects in M5 cells and Chinese hamster V79 cells after exposure to 7 Li-beam (LET= 60keV/&#181;m) and correlation of their survival dynamics to nuclear damages and cell death.</a> Mutat. Res. Genet. Toxicol. Environ. Mutagen. 628 (1), 56-66 (2007).</li><li>Pathak, R., Dey, S. K., Sarma, A., Khuda-Bukhsh, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+killing,+nuclear+damage+and+apoptosis+in+Chinese+hamster+V79+cells+after+irradiation+with+heavy-ion+beams+of+16+O,+12+C+and+7+Li.">Cell killing, nuclear damage and apoptosis in Chinese hamster V79 cells after irradiation with heavy-ion beams of 16 O, 12 C and 7 Li.</a> Mutat. Res. Genet. Toxicol. Environ. Mutagen. 632 (1), 58-68 (2007).</li><li>Chalbot, M. C., Kavouras, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+magnetic+resonance+spectroscopy+for+determining+the+functional+content+of+organic+aerosols:+a+review.">Nuclear magnetic resonance spectroscopy for determining the functional content of organic aerosols: a review.</a> Environ. Pollut. 191, 232-249 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

studio citogenetica o analisi microscopica dei numeri o strutture di cromosomi, soprattutto in spread metafase, fornisce informazioni cruciali per la prognosi, la valutazione del rischio, e il trattamento per varie malattie. E &#39;ormai ben stabilito che le anomalie citogenetiche sono collegati con la progressione e lo sviluppo di diverse malattie, compreso il cancro. Fino ad oggi, le CA sono stati trovati in tutti i principali tipi di tumore. CA può sorgere spontaneamente o da entrambi gli stimoli esterni o interni, come le radiazioni ionizzanti (IR) - uno dei principali fattori di rischio esterni che possono indurre vari tipi di alterazioni citogenetica 16. Analisi degli aiuti CAS valutazione della dose di radiazione assorbita (chiamato radiazioni citogenetica biodosimetry). Inoltre, l&#39;analisi di frequenza e il tipo di specifica aberrazione fornisce anche informazioni importanti per determinare la qualità di radiazione assorbita 17, 18. studio citogenetica fornisce un&#39;immagine diretta del IMPACT di agenti dannosi sul DNA. Questo è in contrasto con tecniche indirette quali il test cometa. Tuttavia, lo studio di citogenetica è stato sotto-utilizzate in settori al di fuori di radiazioni, anche a causa dei numerosi hands-on passaggi coinvolti. Anche se l&#39;esposizione al carbonio organico presente nel PM è noto per influenzare negativamente la nostra salute, alcuni studi che riportano effetti biologici includono la loro composizione 9. Ciò è dovuto ai metodi cromatografici costosi ed ingombranti che richiedono l&#39;estrazione di manodopera, trasformazione, concentrazioni e protocolli di derivatizzazione, mentre forniscono solo in relazione ad un piccolo sottoinsieme di un tipo molto specifico di composti ogni volta. Inoltre, i protocolli comportano la manipolazione o la distruzione del campione originale sostanziale, pertanto, ulteriori test non può essere eseguita. Vantaggi di risonanza magnetica (NMR) analisi nucleare comprendono che NMR è un metodo non distruttivo; richiede un numero molto limitato di steps (estrazione, concentrazione) prima dell&#39;analisi, e strumenti NMR ad alta frequenza (da 400 MHz a 900 MHz) sono disponibili in molte, se non tutte, università all&#39;interno della struttura di base. Una rassegna completa di aerosol atmosferico studi NMR è stato recentemente pubblicato 19. Infine, a causa della sua capacità di fornire informazioni strutturali e legami tra gruppi, NMR è superiore ad altri metodi di spettrometria come FT-IR, UV-Vis e Raman spettrometria che forniscono solo i dati del tipo di gruppi funzionali. Se necessario, la caratterizzazione morfologica di PM può essere eseguita in aggiunta a NMR spettrometria con l&#39;uso del microscopio elettronico a scansione. Anche da un unico luogo, la composizione del PM raccolti possono variare a seconda del periodo dell&#39;anno. Una grande quantità sufficiente di materiale deve essere elaborato e conservato a -80 ° C per esperimenti di ripetizione o saggi complementari. Le fasi 2.1.1 tramite 3.1.3 deve essere eseguita in modo asettico in un BIOScabinet icurezza. Se si osserva la contaminazione o compromesso morfologia cellulare, non procedere con il resto del protocollo. Il tempo di trattamento tripsina deve essere regolato in base al tipo di cellule. Qui, i macrofagi sono molto aderenti e abbiamo scoperto che una combinazione di 1 min tripsina e raschiatura funziona meglio, ma solo tripsina per 5 min opere per la maggior parte tipi di cellule. tempo di trattamento ipotonico varia anche a seconda del tipo di cellula e deve essere standardizzato. Il tempo di dosaggio e trattamento delle Colcemid sono i parametri più importanti per la preparazione cromosoma; un over-dose può uccidere le cellule o stallo del ciclo cellulare. Descriviamo qui le condizioni per le cellule RAW264.7, ed è necessaria ottimizzazione per altri tipi di cellule. La mancata per trovare le condizioni ideali in questa fase possono influenzare negativamente l&#39;indice mitotico, nonché cromosoma morfologia, che influenzano i risultati. Si raccomanda inoltre di valutare i livelli di citotossicità del PM prima dell&#39;analisi citogenetica e selezionare le dosi di conseguenza. in vitro valutazioni tossicologiche sono limitate dal tipo di cellule utilizzate, ampiezza dell&#39;esposizione, e le concentrazioni di particelle. Inoltre, in questo studio, abbiamo utilizzato l&#39;estratto solubile in acqua di PM e, di conseguenza, il potenziale di specie insolubili in acqua può causare aberrazioni citogenetiche non può essere spiegato. Altre limitazioni sono associati alla presenza di &quot;varianti polimorfiche&quot; - variazioni nelle regioni centromeriche e bracci corti del cromosoma; alcuni submicroscopica o riarrangiamenti criptici che possono essere fraintesi e la presenza di cariotipi complessi. Qui, dimostriamo che l&#39;introduzione di analisi citogenetica può aiutare nell&#39;identificazione dei danni PM indotto al DNA e può potenzialmente servire come endpoint predittivo nella valutazione degli effetti sulla salute causati dall&#39;esposizione al PM ambiente. Il nostro studio è, a nostra conoscenza, il primo per indicare CA in risposta a PM. La replica di questi risultati èdesiderabile per confermare i nostri risultati. Questo protocollo potrebbe anche essere adattato per valutare qualsiasi tipo di DNA sospetta agente dannoso.

E &#39;stato stimato che l&#39;esposizione al particolato (PM) fa sì che oltre 3 milioni di morti in eccesso ogni anno, soprattutto per malattie cardiopolmonari e cancro ai polmoni 1. Infatti, PM è stata riconosciuta come cancerogena per l&#39;uomo dall&#39;Agenzia internazionale per la ricerca sul cancro (Gruppo 1), come un aumento del rischio di cancro ai polmoni con l&#39;aumento dei livelli di esposizione al PM è stato indicato 2. È interessante notare che quasi tutte le cellule tumorali porto anomalie cromosomiche numeriche e / o strutturali. Particulate carbonio organico è una variante, complessa, e la miscela eterogenea, la cui composizione e distribuzione dimensione dipende emissioni nonché trasformazioni fisiche e chimiche. Esso rappresenta 35-55% del urbana PM 2,5 di massa (PM 2,5 micron di dimensione e più piccolo) e più del 60% del fondo rurale e continentale PM 2,5 di massa 3, 4. rappresenta la frazione solubile in acqua per 30-90% di aerosol organico. Un gran numero di composti organicisono stati identificati, compresi gli idrocarburi alifatici, idrocarburi policiclici aromatici, e loro derivati ​​ossigenati e nitrati, aldeidi alifatici e alcoli, acidi grassi liberi e loro sali, acidi di-carbossilici, composti multifunzionali, proteine ​​e macromolecole umiche-like (HULIS) utilizzando metodi cromatografici accoppiato con tecniche di spettrometria di massa 5-8. Questi composti rappresentano meno del 10-20% di carbonio organico particolato, quindi la maggior parte del carbonio organico è sconosciuto 9. Prove sperimentali suggeriscono che la citotossicità, stress ossidativo, e infiammazione sono coinvolti nello sviluppo di stati patologici PM-associati. Recentemente è stato dimostrato, tuttavia, che l&#39;esposizione a PM traduce anche in un certo numero di alterazioni epigenetiche, comprese le alterazioni nella metilazione del DNA di elementi ripetitivi, sia sperimentale sistemi in vitro ed in soggetti umani 10-12. Di particolare interesse sono gli effetti dellaPM DNA satellite - maggiori e minori satelliti - che si trovano nella regione heterochromatic attorno al centromero dei cromosomi. E &#39;stato dimostrato che questi effetti possono essere persistenti per natura, in quanto possono essere rilevati per almeno 72 ore dopo l&#39;esposizione 12. Alterazioni nella metilazione del DNA, in particolare intorno centromeri, possono portare ad accumulo di trascritti di mRNA DNA satellite, l&#39;integrità cromosomica compromesso durante la divisione cellulare e, successivamente, provocare lo sviluppo di una varietà di stati patologici 13. Adattamento di approccio per l&#39;analisi citogenetica di CA come end-point di alterazioni epigenetiche causati da PM, quindi, è di grande importanza. Qui, riportiamo l&#39;approccio per il PM di raccolta e preparazione ambiente, in esposizione in vitro e analisi delle CA utilizzando il sistema murino macrofagi modello RAW264.7. I macrofagi comprendono la prima linea di difesa contro i corpi estranei inalati e, di conseguenza, tla linea cellulare serve come stabilito e il modello più utilizzato in tossicologia particelle 11, 12, 14, 15.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="726">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Total suspended particulate sampler</td>
			<td style="width:179px;">Tisch Environmental</td>
			<td style="width:119px;">TE-5170</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:261px;">Bruker Avance III NMR spectrometer&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Bruker</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">TopSpin 3.5/pl2 software</td>
			<td style="width:179px;">Bruker</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:261px;">ACD/NMR Processor Academic Edition</td>
			<td style="width:179px;">ACD/Labs</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RAW264.7 murine macrophages</td>
			<td style="width:179px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">ATCC TIB-71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:261px;">High glucose DMEM GlutaMAX media</td>
			<td style="width:179px;">ThermoFisher</td>
			<td align="right" style="width:119px;">10569010</td>
			<td>Warm in a 37&#176;C waterbath before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:179px;">ThermoFisher</td>
			<td align="right" style="width:119px;">16000044</td>
			<td>Warm in a 37&#176;C waterbath before use</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:261px;">Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td style="width:179px;">ThermoFisher</td>
			<td align="right" style="width:119px;">15140163</td>
			<td>Warm in a 37&#176;C waterbath before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td style="width:179px;">ThermoFisher</td>
			<td align="right" style="width:119px;">25200056</td>
			<td>Warm in a 37&#176;C waterbath before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">PBS, pH 7.4</td>
			<td style="width:179px;">ThermoFisher</td>
			<td align="right" style="width:119px;">10010049</td>
			<td>Warm in a 37&#176;C waterbath before use</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:261px;">KaryoMAX Colcemid Solution in PBS</td>
			<td style="width:179px;">ThermoFisher</td>
			<td align="right" style="width:119px;">15212012</td>
			<td>Warm in a 37&#176;C waterbath before use</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:261px;">KaryoMAX Potassium Chloride Solution</td>
			<td style="width:179px;">ThermoFisher</td>
			<td align="right" style="width:119px;">10575090</td>
			<td>Warm in a 37&#176;C waterbath before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Methanol (HPLC)</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A452N1-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Acetic Acid, Glacial</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP1185-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:261px;">Decon Contrad 70 Liquid Detergent</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">04-355-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:261px;">Wright and Wright-Giemsa Stain Solutions</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">23-200733</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Permount Mounting Medium</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">SP15-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Axio Imager 2</td>
			<td style="width:179px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of the ambient particulate matter-induced chromosomal aberrations using an in vitro system

L&#39;esposizione al particolato (PM) è una delle principali preoccupazioni di salute mondo, che può danneggiare i vari componenti cellulari, tra cui il materiale genetico nucleare. Per valutare l&#39;impatto del PM sull&#39;integrità genetica nucleare, aberrazioni cromosomiche strutturali sono segnati degli spread metafase dei macrofagi del mouse RAW264.7. PM è raccolto da aria ambiente con particelle campionatore ad alto volume totale sospeso. Il materiale raccolto viene solubilizzato e filtrato per mantenere la porzione fini idrosolubile. Le particelle si caratterizzano per la composizione chimica mediante spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR). Differenti concentrazioni di sospensione di particelle vengono aggiunti a una coltura in vitro di RAW264.7 macrofagi di topo per un tempo di esposizione di 72 ore, insieme con cellule di controllo non trattate. Alla fine dell&#39;esposizione, la coltura viene trattata con Colcemid di arrestare le cellule in metafase. Le cellule vengono quindi raccolte, trattate con soluzione ipotonica, fissato acetomethanol, dropped su vetrini e infine colorate con la soluzione Giemsa. I vetrini sono esaminati per valutare le aberrazioni strutturali cromosomiche (CA) in metafase propagarsi 1,000X ingrandimento utilizzando un microscopio in campo chiaro. 50 a 100 diffusione metafase vengono assegnati per ciascun gruppo di trattamento. Questa tecnica è adatta per la rivelazione di aberrazioni strutturali cromosomiche (CA), come ad esempio le pause cromatidio-tipo, gli scambi cromatidi-tipo, frammenti acentrici, cromosomi dicentrici e ad anello, doppie minuti, endoreduplicazione, e le traslocazioni robertsoniane in vitro dopo l&#39;esposizione a PM. Si tratta di un potente metodo per associare un endpoint citogenetica consolidata ad alterazioni epigenetiche.

Grande attenzione dovrebbe essere presa nella scelta della posizione del campionatore TSP, nonché il tempo dell&#39;anno in cui viene eseguita la raccolta. La composizione chimica e le dimensioni delle particelle possono influenzare notevolmente i risultati. Il materiale raccolto deve essere visibile contro il filtro bianco. Un normale del mouse metafase diffusione avrà 40 cromosomi acentrici. L&#39;obiettivo della tecnica è quello di dimostrare un cambiamento (o assenza) nella proporzione di cromosomi anormali in cellule trattate rispetto ai controlli. Questo cambiamento può essere quantificato (numero di cromosomi anormali) e qualificato (tipo di anomalie). Normale del mouse metafase diffusione avrà 40 cromosomi acentrici (Figura 3a). Il trattamento con particolato induce vari CA come mostrato in figura 3, come la rottura cromatidio (3B), frammento acentrico ( <strong&gt; 3C), cromosoma ad anello (3D), cromosoma dicentrici (3E), doppia min (3F), traslocazione Robertsoniana (3G), e endoreduplicazione (3H). Per i risultati completi, si prega di fare riferimento al nostro studio pubblicato 12. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54969/54969fig1.jpg" /> Figura 1. L&#39;elevato volume totale di particelle sospese (TSP) campionatore. L&#39;immagine mostra installata in un tetto in un&#39;area urbana per raccogliere le particelle ambientali il campionatore TSP. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54969/54969fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54969/54969fig2.jpg" /> Figura 2. Loaded filtri in fibra di quarzo dopo la raccolta con l&#39;elevato volume TSP spiù ampia. Primo piano sul filtro installato sul campionatore TSP, dopo l&#39;uso. Si noti che il colore del filtro passa da bianco a grigio. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54969/54969fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54969/54969fig3.jpg" /> Figura 3. Microfotografia mostra esempi rappresentativi di diversi tipi di aberrazioni strutturali indotte in cellule RAW264.7 dopo trattamento con differenti concentrazioni di particelle. Le aberrazioni sono indicati da frecce. (A) normale diffusione metafase con 40 cromosomi acrocentrici, (B) cromatidi-tipo di interruzione (CTB), (C) frammento acentrico (acentrics), (D) anello cromosoma, (E) cromosoma dicentrici (DIC), (F) doppio min (Dimn), ( <strong&gt; G) traslocazione Robertsoniana, e) endoreduplicazione (H (cromosomi duplicati sono tenute insieme). ingrandimento originale 100X, barra della scala = 5 micron. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54969/54969fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System at JoVE.com

Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

Questo protocollo descrive le tecniche per la quantificazione e la caratterizzazione delle aberrazioni cromosomiche in vitro in RAW264.7 macrofagi di topo dopo il trattamento con particolato nell&#39;aria ambiente.

L&#39;analisi del particolato ambientale indotto aberrazioni cromosomiche L&#39;utilizzo di un<em&gt; In Vitro</em&gt; sistema

Exposure to particulate matter (PM) is a major world health concern, which may damage various cellular components, including the nuclear genetic material. ...

analysis-ambient-particulate-matter-induced-chromosomal-aberrations

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

8.6K Views.  University of Arkansas for Medical Sciences.  Questo protocollo descrive le tecniche per la quantificazione e la caratterizzazione delle aberrazioni cromosomiche in vitro in RAW264.7 macrofagi di topo dopo il trattamento con particolato nell'aria ambiente. 

Video: Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

In vitro transcription assays have been developed and widely used for many years to study the molecular mechanisms involved in transcription. This process requires multi-subunit DNA-dependent RNA polymerase (RNAP) and a series of transcription factors that act to modulate the activity of RNAP during gene expression. Sequencing gel electrophoresis of radiolabeled transcripts is used to provide detailed mechanistic information on how transcription proceeds and what parameters can affect it. In this paper we describe the protocol to study how the essential elongation factor NusA regulates transcriptional pausing, as well as a method to identify an antibacterial agent targeting transcription initiation through inhibition of RNAP holoenzyme formation. These methods can be used a as platform for the development of additional approaches to explore the mechanism of action of the transcription factors which still remain unclear, as well as new antibacterial agents targeting transcription which is an underutilized drug target in antibiotic research and development.

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

In this manuscript, we describe a protocol to functionally examine transcription and the inhibitory activity of antibacterial agents targeting bacterial transcription.

In vitro trascrizione saggi e la loro applicazione in Drug Discovery

In vitro transcription assays have been developed and widely used for many years to study the molecular mechanisms involved in transcription. This process ...

Ricerca

Genetica

Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization (mFISH) and Spectral Karyotyping (SKY) in Irradiated Mice

Ionizing radiation (IR) induces numerous stable and unstable chromosomal aberrations. Unstable aberrations, where chromosome morphology is substantially compromised, can easily be identified by conventional chromosome staining techniques. However, detection of stable aberrations, which involve exchange or translocation of genetic materials without considerable modification in the chromosome morphology, requires sophisticated chromosome painting techniques that rely on in situ hybridization of fluorescently labeled DNA probes, a chromosome painting technique popularly known as fluorescence in situ hybridization (FISH). FISH probes can be specific for whole chromosome/s or precise sub-region on chromosome/s. The method not only allows visualization of stable aberrations, but it can also allow detection of the chromosome/s or specific DNA sequence/s involved in a particular aberration formation. A variety of chromosome painting techniques are available in cytogenetics; here two highly sensitive methods, multiple fluorescence in situ hybridization (mFISH) and spectral karyotyping (SKY), are discussed to identify inter-chromosomal stable aberrations that form in the bone marrow cells of mice after exposure to total body irradiation. Although both techniques rely on fluorescent labeled DNA probes, the method of detection and the process of image acquisition of the fluorescent signals are different. These two techniques have been used in various research areas, such as radiation biology, cancer cytogenetics, retrospective radiation biodosimetry, clinical cytogenetics, evolutionary cytogenetics, and comparative cytogenetics.

Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization mFISH and Spectral Karyotyping SKY in Irradiated Mice

The present protocol describes the usefulness of multiple fluorescence in situ hybridization (mFISH) and spectral karyotyping (SKY) in identifying inter-chromosomal stable aberrations in the bone marrow cells of mice after exposure to total body irradiation.

Rilevazione di Inter-aberrazioni cromosomiche stabili per fluorescenza multipla<em&gt; In Situ</em&gt; Ibridazione (mFISH) e spettrale cariotipo (SKY) in topi irradiati

Ionizing radiation (IR) induces numerous stable and unstable chromosomal aberrations. Unstable aberrations, where chromosome morphology is substantially ...

Analysis of the c-KIT Ligand Promoter Using Chromatin Immunoprecipitation

Multiple cellular processes, including DNA replication and repair, DNA recombination, and gene expression, require interactions between proteins and DNA. Therefore, DNA-protein interactions regulate multiple physiological, pathophysiological, and biological functions, such as cell differentiation, cell proliferation, cell cycle control, chromosome stability, epigenetic gene regulation, and cell transformation. In eukaryotic cells, the DNA interacts with histone and nonhistone proteins and is condensed into chromatin. Several technical tools can be used to analyze DNA-protein interactions, such as the Electrophoresis (gel) Mobility Shift Assay (EMSA) and DNase I footprinting. However, these techniques analyze the protein-DNA interaction in vitro, not within the cellular context. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a technique that captures proteins at their specific DNA binding sites, thereby allowing for the identification of DNA-protein interactions within their chromatin context. It is done by fixation&#160;of the DNA-protein interaction, followed by&#160;immunoprecipitation of the protein of interest. Subsequently, the genomic site that the protein was bound to is characterized. Here, we describe and discuss ChIP and demonstrate its analytical value for the identification of the Transforming Growth Factor-&#946; (TGF-&#946;)-induced binding of the transcription factor SMAD2 to SMAD Binding Elements (SBE) within the promoter region of the tyrosine-protein kinase Kit (c-KIT) receptor ligand Stem Cell Factor (SCF).

DNA-protein interactions are essential for multiple biological processes. During the evaluation of cellular functions, the analysis of DNA-protein interactions is indispensable for understanding gene regulation. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to analyze such interactions in vivo.

Analisi del promotore di ligandi di c-KIT utilizzando l&#39;immunoprecipitazione cromatina

Multiple cellular processes, including DNA replication and repair, DNA recombination, and gene expression, require interactions between proteins and DNA. ...

Determination of the Optimal Chromosomal Location(s) for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In bacteria, the impact of the genetic context on the function of a genetic element can be difficult to assess. Several mechanisms, including topological effects, transcriptional interference from neighboring genes, and/or replication-associated gene dosage, may affect the function of a given genetic element. Here, we describe a method that permits the random integration of a DNA element into the chromosome of Escherichia coli and select the most favorable locations using a simple growth competition experiment. The method takes advantage of a well-described transposon-based system of random insertion, coupled with a selection of the fittest clone(s) by growth advantage, a procedure that is easily adjustable to experimental needs. The nature of the fittest clone(s) can be determined by whole-genome sequencing on a complex multi-clonal population or by easy gene walking for the rapid identification of selected clones. Here, the non-coding DNA region DARS2, which controls the initiation of chromosome replication in E. coli, was used as an example. The function of DARS2 is known to be affected by replication-associated gene dosage; the closer DARS2 gets to the origin of DNA replication, the more active it becomes. DARS2 was randomly inserted into the chromosome of a DARS2-deleted strain. The resultant clones containing individual insertions were pooled and competed against one another for hundreds of generations. Finally, the fittest clones were characterized and found to contain DARS2 inserted in close proximity to the original DARS2 location.

Determination of the Optimal Chromosomal Locations for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Here, the power of a transposon-mediated random insertion of a non-coding DNA element was used to resolve its optimal chromosomal position.

Determinazione dei percorsi cromosomici ottimali per un elemento di DNA in Escherichia coli usando un approccio novello Transposon-mediata

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In ...

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA mutation rates. Changes in replication timing occur during development and in cancer, but the role replication timing plays in development and disease is not known. Zebrafish were recently established as an in vivo model system to study replication timing. Here is detailed the protocols for using the zebrafish to determine DNA replication timing. After sorting cells from embryos and adult zebrafish, high-resolution genome-wide DNA replication timing patterns can be constructed by determining changes in DNA copy number through analysis of next generation sequencing data. The zebrafish model system allows for evaluation of the replication timing changes that occur in vivo throughout development, and can also be used to assess changes in individual cell types, disease models, or mutant lines. These methods will enable studies investigating the mechanisms and determinants of replication timing establishment and maintenance during development, the role replication timing plays in mutations and tumorigenesis, and the effects of perturbing replication timing on development and disease.

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Zebrafish were recently used as an in vivo model system to study DNA replication timing during development. Here is detailed the protocols for using zebrafish embryos to profile replication timing. This protocol can be easily adapted to study replication timing in mutants, individual cell types, disease models, and other species.

Tempo di replicazione del DNA utilizzando Zebrafish come un sistema di modello In Vivo di profilatura

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA ...

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene expression, but whether looping is responsible for or a result of alterations in gene expression is still unknown. Until recently, how chromatin looping affects the regulation of gene activity and cellular function has been relatively ambiguous, and limitations in existing methods to manipulate these structures prevented in-depth exploration of these interactions. To resolve this uncertainty, we engineered a method for selective and reversible chromatin loop re-organization using CRISPR-dCas9 (CLOuD9). The dynamism of the CLOuD9 system has been demonstrated by successful localization of CLOuD9 constructs to target genomic loci to modulate local chromatin conformation. Importantly, the ability to reverse the induced contact and restore the endogenous chromatin conformation has also been confirmed. Modulation of gene expression with this method establishes the capacity to regulate cellular gene expression and underscores the great potential for applications of this technology in creating stable de novo chromatin loops that markedly affect gene expression in the contexts of cancer and development.

Chromatin looping plays a significant role in gene regulation; however, there have been no technological advances that allow for selective and reversible modification of chromatin loops. Here we describe a powerful system for chromatin loop re-organization using CRISPR-dCas9 (CLOuD9), demonstrated to selectively and reversibly modulate gene expression at targeted loci.

CRISPR-mediata di riorganizzazione della struttura della cromatina Loop

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

Measuring Exercise Levels in Drosophila melanogaster Using the Rotating Exercise Quantification System (REQS)

Drosophila melanogaster is a new model organism for studies in exercise biology. To date, two main exercise systems, the Power Tower and the Treadwheel have been described. However, a method to measure the amount of additional animal activity induced through the exercise treatment has been lacking. The Rotating Exercise Quantification System (REQS) fills this need, providing a measure of animal activity for animals experiencing rotational exercise. This protocol details how to use the REQS to assess animal activity during rotational exercise and illustrates the type of data that can be generated. Here, we demonstrate how the REQS is used to measure sex- and strain-specific differences in exercise induced activity. The REQS can also be used to evaluate the impact of various other experimental parameters such as age, diet, or population size on exercise induced activity. In addition, it can be used to compare the efficacy of different exercise training protocols. Importantly, it provides an opportunity to standardize exercise treatments between strains, allowing the researcher to achieve equal amounts of activity between groups if needed. Thus, the REQS is a notable new resource for exercise biologists working with the Drosophila model system and complements existing exercise systems.

Measuring Exercise Levels in Drosophila melanogaster Using the Rotating Exercise Quantification System REQS

The Rotating Exercise Quantification System (REQS) can induce exercise in Drosophila melanogaster through rotation while simultaneously measuring the amount of activity performed by the animals. Here, we present a point-by-point protocol detailing how to measure activity levels of animals experiencing rotational exercise treatments using the REQS.

Misurazione dei livelli di esercizio in Drosophila melanogaster utilizzando il sistema di quantificazione esercizio rotanti (Rich)

Drosophila melanogaster is a new model organism for studies in exercise biology. To date, two main exercise systems, the Power Tower and the Treadwheel ...

Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences is desired. We herein provide a detailed in vitro and in-cell selective 2&#39;-hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE) protocol to study the RNA structural change in the presence of an experimental drug for spinal muscular atrophy (SMA), survival of motor neuron (SMN)-C2, and in exon 7 of the pre-mRNA of the SMN2 gene. In in vitro SHAPE, an RNA sequence of 140 nucleotides containing SMN2 exon 7 is transcribed by T7 RNA polymerase, folded in the presence of SMN-C2, and subsequently modified by a mild 2&#39;-OH acylation reagent, 2-methylnicotinic acid imidazolide (NAI). This 2&#39;-OH-NAI adduct is further probed by a 32P-labeled primer extension and resolved by polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE). Conversely, 2&#39;-OH acylation in in-cell SHAPE takes place in situ with SMN-C2 bound cellular RNA in living cells. The pre-mRNA sequence of exon 7 in the SMN2 gene, along with SHAPE-induced mutations in the primer extension, was then amplified by PCR and subject to next-generation sequencing. Comparing the two methodologies, in vitro SHAPE is a more cost-effective method and does not require computational power to visualize results. However, the in vitro SHAPE-derived RNA model sometimes deviates from the secondary structure in a cellular context, likely due to the loss of all interactions with RNA-binding proteins. In-cell SHAPE does not need a radioactive material workplace and yields a more accurate RNA secondary structure in the cellular context. Furthermore, in-cell SHAPE is usually applicable for a larger range of RNA sequences (~1,000 nucleotides) by utilizing next-generation sequencing, compared to in vitro SHAPE (~200 nucleotides) that usually relies on PAGE analysis. In case of exon 7 in SMN2 pre-mRNA, the in vitro and in-cell SHAPE derived RNA models are similar to each other.

Detailed protocols for both in vitro and in-cell selective 2&#39;-hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE) experiments to determine the secondary structure of pre-mRNA sequences of interest in the presence of an RNA-targeting small molecule are presented in this article.

Utilizzando In Vitro e nelle celle di forma per indagare la piccola molecola ha indotto cambiamenti strutturali Pre-mRNA

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences ...

Determining the Egg Fertilization Rate of Bemisia tabaci Using a Cytogenetic Technique

A few species of sap-sucking whiteflies are some of the most damaging terrestrial pests worldwide because of the crop damage they inflict and plant viruses they vector. Despite numerous studies of the biology of these species in different environments, a key life history parameter, offspring sex ratios, has received little attention, yet is important for predicting population dynamics. The primary sex ratio (sex ratio at oviposition) of Bemisia tabaci has never been reported but can be found by determining the egg fertilization rate of this haplodiploid insect. The technique involves the dechorionation of eggs with bleach, a series of fixation steps, and the application of the general DNA fluorescent stain, DAPI (4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole, a DNA-binding fluorescent dye), to bind to female and male pronuclei. Here, we present the technique, and an example of its application, to test whether an endosymbiotic bacterium, Rickettsia sp. nr. bellii, influenced the primary sex ratio of B. tabaci. This method may assist in population studies of whiteflies, or in determining if sex allocation exists with certain environmental stimuli.

Determining the Egg Fertilization Rate of Bemisia tabaci Using a Cytogenetic Technique

We present a simple cytogenetic technique using 4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) to determine the fertilization rate and primary sex ratio of the haplodiploid invasive pest Bemisia tabaci.

Determinare il tasso di fertilizzazione dell'uovo di Bemisia tabaci utilizzando una tecnica citogenetica

A few species of sap-sucking whiteflies are some of the most damaging terrestrial pests worldwide because of the crop damage they inflict and plant ...

Characterization of In Vitro Differentiation of Human Primary Keratinocytes by RNA-Seq Analysis

Human primary keratinocytes are often used as in vitro models for studies on epidermal differentiation and related diseases. Methods have been reported for in vitro differentiation of keratinocytes cultured in two-dimensional (2D) submerged manners using various induction conditions. Described here is a procedure for 2D in vitro keratinocyte differentiation method by contact inhibition and subsequent molecular characterization by RNA-seq. In brief, keratinocytes are grown in defined keratinocyte medium supplemented with growth factors until they are fully confluent. Differentiation is induced by close contacts between the keratinocytes and further stimulated by excluding growth factors in the medium. Using RNA-seq analyses, it is shown that both 1) differentiated keratinocytes exhibit distinct molecular signatures during differentiation and 2) the dynamic gene expression pattern largely resembles cells during epidermal stratification. As for comparison to normal keratinocyte differentiation, keratinocytes carrying mutations of the transcription factor p63 exhibit altered morphology and molecular signatures, consistent with their differentiation defects. In conclusion, this protocol details the steps for 2D in vitro keratinocyte differentiation and its molecular characterization, with an emphasis on bioinformatic analysis of RNA-seq data. Because RNA extraction and RNA-seq procedures have been well-documented, it is not the focus of this protocol. The experimental procedure of in vitro keratinocyte differentiation and bioinformatic analysis pipeline can be used to study molecular events during epidermal differentiation in healthy and diseased keratinocytes.

Presented here is a stepwise procedure for in vitro differentiation of human primary keratinocytes by contact inhibition followed by characterization at the molecular level by RNA-seq analysis.

Caratterizzazione della differenziazione in vitro dei cheratinociti primari umani mediante analisi RNA-Seq

Human primary keratinocytes are often used as in vitro models for studies on epidermal differentiation and related diseases. Methods have been reported ...