The study was supported by the Swedish Research Council, the Swedish Rheumatism Asociation, Karolinska Institute Foundations, Stockholm County Council, The Wallenberg Foundation, and the GV 80 Years' Foundation for research. The authors would also like to thank Hannah Aucott for proofreading the manuscript.

Tüm hayvan deneyleri bakımı ve Karolinska Enstitüsünde, Stockholm yerel Etik Komitesi tarafından onaylanmış hayvanların kullanımı için kurallarına göre yapılmıştır. Yerel Etik Komitesi hayvan bakımı konusunda Avrupa Birliği direktiflerini takip eder. NOT: cerrahi (6 saat ile 1 saat karşı) ve LPS seviyesi (15 mg / kg karşı 2 mg / kg) enjekte sonra orijinal protokolden temel değişiklikler iyileşme süresi vardır. Aksi takdirde, ameliyattan kendisiyle ilgili farklı ayarlar değiştirilmedi. 1. Stimulation Malzeme hazırlama <ol><li> Bilgisayar ve uyarıcı elektrot (Şekil 1A) ile bağlantılı veri toplama sistemi açın. </li><li> Acknowledge programına girin. </li><li> 5 mg / 1 x PBS içinde ml, kısım o konsantrasyonda LPS bir stok çözeltisi hazırlandı ve -20 ° C&#39;de saklayın. Deney günü, bir kısım Çözülme ve bir ade hazırlamakağırlığına göre, hayvana, yaklaşık 100 ul enjekte etmek için bir LPS (0.5 mg / ml) quate örneği. </li></ol> 2. Anestezi Hayvan hazırlanması <ol><li> C57BL / 6 fareleri kullanın. , 12 saat aydınlık / karanlık döngüsü ile iklim kontrollü şartlar altında onları korumak, onlara standart kemirgen yemi yem ve onlara istedikleri kadar su verir. </li><li> Deney günü yaklaşık 25 g ağırlığında fareler üzerinde ameliyat gerçekleştirin. NOT: enflamatuar reaksiyonların neden olduğu zaman, düzenli kontrolleri ve hayvanlarda klinik reaksiyonların gözlemler gerçekleştirmek için özellikle önemlidir. Hayvan durumu etik kriterleri sağlamadığı takdirde CO2 inhalasyonuyla ötenazi erken gereklidir. </li><li> anestezik makineyi ayarlayın. <ol><li> boru doğru bağlandığını ve herhangi bir şekilde zarar görmemiş olduğundan emin olun. havalandırmalı alan düzgün çalıştığından emin olun. izofluran şişe anahtarı filtreyi bağlayın ve Vapo doldurmakizofluran yeterli bir miktarı ile Rizer. </li><li> Gaz arzı (hava ve oksijen) açın ve şişeler deney için yeterli gaz içerdiğinden emin olun. Üç yollu konnektör sonra indüksiyon odasına veya maske izofluran akışını göndermek mümkün olduğunu. </li></ol></li><li> indüksiyon odasına üç yönlü konektörü çevirin. ev kafesten bir fare seçin ve odasına hayvan yerleştirin. 1.0 L / dakika, oksijen ve 1.0 L / dak hava akış düzenleme ayarlayın. % 5 - 4 izofluran konsantrasyonu ayarlayın. </li><li> anestezi istenen seviyeye ulaşıldığında, anestezi istenilen düzeyde ulaşıldığında, cerrahi alan tıraş ve maskeye odasından hayvan taşımak. Maske akışına üç yönlü konektörü çevirin. 0.25 L / dak, oksijen ve 0.25 L / dak hava akış düzenleme ayarlayın. <ol><li> % 2.5 - 1.5 izofluran konsantrasyonu ayarlayın. ameliyat edilen başlamadan önce refleks kontrolü ve solunum oranı ile anestezi seviyesini kontrole. </li></ol></li><li> yapışkan bant kullanılarak çalışma tezgahına fare bacakları sabitleyin. Hayvanın burun hala dikkatle maskesi yerleştirilmiş olduğundan emin olun. </li></ol> Vagus sinirinin 3. Cerrahi ve stimülasyonu <ol><li> % 70 etanol ile cerrahi alan dezenfekte edin. </li><li> bir neşter kullanarak dikkatli bir şekilde boyun (yaklaşık olarak 1 ila 1.5 cm&#39;lik bir kesi) seviyesinde cilt insizyon. Not: Protokolde, cerrahi prosedür SHAM çalışan hayvanlar için burada biter. Gerçekten de, sadece bir metal araç ile sinir dokunmadan önce bir dereceye kadar uyarır olduğu gösterilmiştir. LPS az miktarda kullanıldığında nedenle, daha doğru bir ameliyat kontrol hayvanı almak için, bu adımda ameliyatı durdurun. </li><li> mikroskop (12,5X objektif) yardımı ile, kesme forseps kullanılarak karotid arterden sol vagus sinirinin izole edilmesi. İlk cilt ve yağ tabakalarını kaldırarak sternocleidomastoid kas bulun ve sonra onu geri çekmeksinir ve arter hem arkasında forseps koymak sipariş. Not: Sinir ve arter yakın birbirine yapışık olarak aşağıdaki adımı, oldukça zordur. Nedenle, gemiyi kesip hayvanı öldürmek çok kolaydır. Bununla birlikte, sinir ve arter arasında çok dikkatli bir şekilde forseps yerleştirerek, sonunda ayrı ve sinirinin izole edilmesi mümkündür. </li><li> Vagus sinir altında elektrot (Şekil 1B) yerleştirin. iğne elektrot oldukça uzun, yani sinir stimülasyonu sırasında hafifçe hareket etse bile, her zaman elektrot ile temas halinde olacaktır. </li><li> (Sitokin seviyeleri üzerinde okunması için, yani, aşağı regüle etkisini ölçmek için), bir şırınga yardımı ile LPS intraperitonal (ip) enjeksiyon (2 mg / kg) uygulayın. </li><li> uyarı başlatılmadan önce 5 dakika bekleyin. </li><li> Onaylama programında, düğmeye basılması ile 5 V ve 1 Hz, 5 dakika için vagus siniri stimüle eder. </li><li> Yenidenelektrodu taşımak ve cerrahi dikiş ipliğinin ile hayvanın yarasını sütür. </li><li> sipariş iyileşmesini geliştirmek ve enfeksiyonlara karşı korumak için de yaranın üzerine bir yok Sting Bariyer Film (NSBF) püskürtün. </li></ol> Hayvan 4. Kurtarma <ol><li> Ameliyattan sonra uyanış ve kurtarma için geri kafesine hayvan taşımak. vücut ısısını korumak için kızıl ötesi ışık altında, tam bilinç kazanmış kadar hayvan izlemek için emin olun. </li><li> Hayvan analizi için kurban öncesi 6 saat süreyle kafesine geri alalım. Not: Vagus siniri, uyarım etkisi çok hızlı ve aynı zamanda (en fazla 48 saat için) uzun ömürlü olduğu gösterilmiştir, bu nedenle iyileşme süresi çalışma gereksinimlerine göre deneyi tarafından ayarlanabilir. </li></ol> Daha fazla analiz için 5. Kurban <ol><li> Bir CO2 uygulama cihazına bağlanmış bir kafeste hayvan yerleştirin. </li><li> 5 Cihazı ayarlamaCO2 inhalasyonu -min döngüsü. </li><li> Ötanazi yapılır, ilgi organları toplamak doğrudan daha fazla analiz için kuru buz üzerinde dondurma (örneğin, bir fare TH1 ile dalak özleri sitokin düzeylerinin ölçülmesi / TH2 9-Plex tahlili) 3. </li></ol>

<ol>
	<li>Nathan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Points+of+control+in+inflammation.">Points of control in inflammation.</a> Nature. 420 (6917), 846-852 (2002).</li><li>Rosas Ballina, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetylcholine-synthesizing+T+cells+relay+neural+signals+in+a+vagus+nerve+circuit.">Acetylcholine-synthesizing T cells relay neural signals in a vagus nerve circuit.</a> Science. 334 (6052), 98-101 (2011).</li><li>Le Ma&#238;tre, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+vagus-mediated+immunosuppression+in+microsomal+prostaglandin+E+synthase-1+deficient+mice.">Impaired vagus-mediated immunosuppression in microsomal prostaglandin E synthase-1 deficient mice.</a> Prostaglandins Other Lipid Mediat. 121 (Part B), 155-162 (2015).</li><li>Borovikova, L. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vagus+nerve+stimulation+attenuates+the+systemic+inflammatory+response+to+endotoxin.">Vagus nerve stimulation attenuates the systemic inflammatory response to endotoxin.</a> Nature. 405 (6785), 458-462 (2000).</li><li>Olofsson, P. S., Rosas-Ballina, M., Levine, Y. A., Tracey, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rethinking+inflammation:+neural+circuits+in+the+regulation+of+immunity.">Rethinking inflammation: neural circuits in the regulation of immunity.</a> Immunol. Rev. 248 (1), 188-204 (2012).</li><li>Pavlov, V. A., Tracey, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+circuitry+and+immunity.">Neural circuitry and immunity.</a> Immunol Res. 63 (1-3), 38-57 (2015).</li><li>Huston, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Splenectomy+inactivates+the+cholinergic+antiinflammatory+pathway+during+lethal+endotoxemia+and+polymicrobial+sepsis.">Splenectomy inactivates the cholinergic antiinflammatory pathway during lethal endotoxemia and polymicrobial sepsis.</a> J. Exp. Med. 203 (7), 1623-1628 (2006).</li><li>Rosas-Ballina, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Splenic+nerve+is+required+for+cholinergic+anti-inflammatory+pathway+control+of+TNF+in+endotoxemia.">Splenic nerve is required for cholinergic anti-inflammatory pathway control of TNF in endotoxemia.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105 (31), 11008-11013 (2008).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotinic+acetylcholine+receptor+alpha7+subunit+is+an+essential+regulator+of+inflammation.">Nicotinic acetylcholine receptor alpha7 subunit is an essential regulator of inflammation.</a> Nature. 421 (6921), 384-388 (2003).</li><li>Pavlov, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+muscarinic+cholinergic+regulation+of+the+systemic+inflammatory+response+during+endotoxemia.">Central muscarinic cholinergic regulation of the systemic inflammatory response during endotoxemia.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103 (13), 5219-5223 (2006).</li><li>Pavlov, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+acetylcholinesterase+activity+controls+systemic+cytokine+levels+through+the+cholinergic+anti-inflammatory+pathway.">Brain acetylcholinesterase activity controls systemic cytokine levels through the cholinergic anti-inflammatory pathway.</a> Brain Behav. Immun. 23 (1), 41-45 (2009).</li><li>Rosas-Ballina, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xanomeline+suppresses+excessive+pro-inflammatory+cytokine+responses+through+neural+signal-mediated+pathways+and+improves+survival+in+lethal+inflammation.">Xanomeline suppresses excessive pro-inflammatory cytokine responses through neural signal-mediated pathways and improves survival in lethal inflammation.</a> Brain Behav. Immun. 44, 19-27 (2014).</li><li>Bellinger, D. L., Lorton, D., Lubahn, D., Felten, D. L., Ader, R., Felten, D. L., Cohen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Psychoneuroimmunology. 55, 55-112 (2001).</li><li>Andersson, U., Tracey, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+approach+to+rheumatoid+arthritis:+treating+inflammation+with+computerized+nerve+stimulation.">A new approach to rheumatoid arthritis: treating inflammation with computerized nerve stimulation.</a> Cerebrum. 2012, 3 (2012).</li><li>Ono, S. J., Nakamura, T., Miyazaki, D., Ohbayashi, M., Dawson, M., Toda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokines:+Roles+in+leucocyte+development,+trafficking,+and+effector+function.">Chemokines: Roles in leucocyte development, trafficking, and effector function.</a> J. Allergy Clin. Immunol. 111 (6), 1185-1199 (2003).</li><li>Silvestre-Roig, C., Hidalgo, A., Soehnlein, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+heterogeneity:+implications+for+homeostasis+and+pathogenesis.">Neutrophil heterogeneity: implications for homeostasis and pathogenesis.</a> Blood. , (2016).</li><li>Matteoli, G., Boeckxstaens, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+vagal+innervation+of+the+gut+and+immune+homeostasis.">The vagal innervation of the gut and immune homeostasis.</a> Gut. 62, 1214-1222 (2013).</li><li>Pereira, M. R., Leite, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+involvement+of+parasympathetic+and+sympathetic+nerve+in+the+inflammatory+reflex.">The involvement of parasympathetic and sympathetic nerve in the inflammatory reflex.</a> J. Cell. Physiol. 231, 1862-1869 (2016).</li><li>Levine, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurostimulation+of+the+cholinergic+anti-inflammatory+pathway+ameliorates+disease+in+rat+collagen-induced+arthritis.">Neurostimulation of the cholinergic anti-inflammatory pathway ameliorates disease in rat collagen-induced arthritis.</a> PLoS One. 9 (8), e104530 (2014).</li><li>Huston, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcutaneous+vagus+nerve+stimulation+reduces+serum+high+mobility+group+box+1+levels+and+improves+survival+in+murine+sepsis.">Transcutaneous vagus nerve stimulation reduces serum high mobility group box 1 levels and improves survival in murine sepsis.</a> Crit. Care Med. 35 (12), 2762-2768 (2007).</li><li>Yuan, H., Silberstein, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vagus+nerve+and+vagus+nerve+stimulation,+a+comprehensive+review:+Part+II.">Vagus nerve and vagus nerve stimulation, a comprehensive review: Part II.</a> Headache. 56 (2), 259-266 (2016).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

2000&#39;li yılların başında keşfinden beri OTP mekanizmaları iyice çalışılmıştır. Şimdi yolunun iyi bir resim var ve özellikle de hedef organ, dalak, çok verimli bir ekip olarak NE, hafıza T hücrelerinin, ACH ve makrofajlar çalışma inflamatuar mediatörler 2 aşağı düzenleyen nerede. Ayrıca, yakın zamanda tabii ki CAP 3 aktivasyonundan sonra dalak ACh salgılanması için zorunlu bir bileşenidir, özellikle fareler, işlevsel bir prostaglandin sisteminin önemini, PGE2, veri yayınlamışlardır. Vagus siniri, uyarım olarak bilinen tekniktir, kolay bir laboratuvarda yapılabilir, ancak birkaç önemli protokolleri Hayvanlar ve ameliyat işlemleri ile ilgili dikkat edilmelidir. Biz elektrik şarjlarının birikmesini önlemek amacıyla, bir &quot;-şarj dengeli&quot; uyarılması için gereken bir sinüs dalga uyarı sinyali kullanmak(Tek fazlı uyarma aksine) o yok edebilir sinir. sinir uyarıcı olsa da, sadece vagotomi deneylerle başka amaçlar için yapılabilir efferent sinyalinden gelen afferent ayırmak mümkün değildir. Deney için kullanılan süre ve sıklık, örneğin iltihaplı tehdit sonrasında sitokin salınımı üzerinde etkisi bilinmektedir, ancak kalp hızını etkileyen veya sağlıklı kontrollerde bariz yan etkileri vermezdim. Her şeyden önce, deneyci her zaman hayvanların taşınması, cerrahi ve kurtarma hayvan bakımının etik kurallara göre yapılması gerektiğini akılda tutmak gerekir. Diğer bir nokta ameliyatı uygulayan büyük önem taşıyor olmasıdır. Vagus siniri izole edilmesi, vasküler hasar oluşursa hayvan için ölümcül olabilir zor bir adımdır. tecrübe ile ameliyat 15 içinde yapılabilir - hayvan uzun bir süre için anestezi olmak zorunda değildir, yani 20 dakika hangikurtarma yardımcı olur. Bir tartışma da iyi bir SHAM çalışan hayvanın seçimi ile ilgili olarak yükseltilebilir. Protokolde, sadece vagus siniri altında elektrot yerleştirerek olmadan, boyun hizasında ameliyat hayvanları kullandı. Bu seçeneği seçmek için sebep (daha önce gözlenmiştir gibi) sadece sinir altında elektrot yerleştirilerek mekanik enflamasyon çok düşük düzeylerde ortaya potansiyel mekanizmaları maskeleme riskini arttırır bir ölçüde 19 sinir teşvik olmasıydı. LPS çok yüksek dozlarda kullanılarak, en iyi SHAM çalışan kumanda muhtemelen SHAM ameliyatı etkisi müdahale veya sitokinler patlamasının üzerinde bariz elektriksel stimülasyon etkisi maske olmaz gibi sinir altında elektrot yerleştirmek olacaktır. Biz araştırma alanımızda içinde karşılaşılan farklı konuları sığdırmak için geçerli protokol geliştirdik. Daha önceki yazıda belirtildiği üzere,Biz TEP&#39;de prostaglandin sisteminin olası katılımı baktı. Nedeniyle enzimatik metabolizma için, orijinal protokolün 1-hr iyileşme süresi bizim deney uygun olmayacağını düşündük. Bu nedenle, 6 saat için ameliyattan sonra geçen süreyi uzattı. Bunu yaparken, biz de etik ölçütlere karşılamak amacıyla LPS dozu aşağı titre zorunda kaldı. Biz 6 saat, bu amaçla yeterince uzun düşündü bir gecikme toparlanma süresi seçti. Ayrıca 0 mg / kg kadar 15 mg / kg (orijinal protokolü) LPS&#39;nin titre. 2 mg / kg olarak, sitokinler üzerindeki VNS son etkisini (Şekil 2), daha düşük dozlarda ortadan etki gördü. dalakta VNS ana etki, bilinen ve bellek T hücrelerinin aktivasyonu daha sonra, makrofaj azalma sitokinlerin-de VNS şirketinden aracıların salınmasını uyarmak görünmektedir burada göstermiştir olanak veren hücreler (karakterizeyken hala hangi hücreler necessitati gelen belirsizdirsırayla ng daha fazla çalışma) inflamasyon birincil tepki diğer hücre tipleri işe. VNS güçlü kuvvetli iltihabik bir indüksiyon (15 mg / kg LPS, yani orijinal protokolü) sonra KC / GRO azalmıştır Gerçekten de, inflamasyon yokluğunda KC / GRO çok hızlı bir bırakılmasını aktifleştiren. Kemokin KC / GROa, mutlaka kemotaktik özellikleri olan bir IL-8 ile ilgili bir protein, lökosit gelişiminde önemli bir rol oynar (örneğin, olgunlaşmasını ve aktivasyonunu sürüş), kaçakçılık (örneğin, çekilmesi ve nötrofillerin toplanması), ve 15 işlev sahip olduğu bilinmektedir . Örneğin, nötrofiller doğal bağışıklık sisteminin fagositik sistemin önemli üyeleridir. Onlar işgalci patojenlere karşı konakçı ilk savunma hattı olarak hareket, ancak aynı zamanda iltihap kaynaklı yaralanma 16 önemli mediyatörlerdir. İlginç bir şekilde, protokol iyileştirmeye yönelik girişimde, biz o zaman Direc vurgulamaktadır Bu gözleme geldivagus siniri işleyişinde dalak diğer hücre tiplerinin t tutulumu. alandaki tüm öncü çalışmalar dalak, CAP hedef organ odaklı ve sepsis veya periferik sistemik inflamasyon yanıt olarak yolunun bağışıklık etkisi vardır. Önemli olarak, bu çalışma, örneğin Bu çalışmada sunulan olarak, vagus sinirinin akut stimülasyonu kullanılarak yapıldı. Bu, belirli organların moleküler analiz için ya da (24 ila 48 saat, maksimum cerrahi sonrası) inflamasyon, kronik hayvan modelleri ile ilgili fonksiyonel çalışmalarda görülen, kısa süreli etkileri de kullanılabilir. Bununla birlikte, vagus sinirinin dolaşan programı da CAP farklı innerve organları 13 ile ilgili kronik iltihaplı hastalıkları tedavi etmek için önemli bir kullanım olabileceğini düşündürmektedir. Bu bağlamda en çok çalışılmış organların biri Crohn &amp; içerir inflamatuar bağırsak hastalığı (IBD) odaklanarak, ile, bağırsak<html> 39. hastalığı ve ülseratif kolit, aynı zamanda ameliyat sonrası bağırsak tıkanması kaynaklı 17. Ayrıca, karaciğer, böbrek ve akciğer ile ilgili birçok enflamatuar hastalıklar CAP regülasyonunun önemi inceleme 18 altındadır. Vagus siniri, aktivasyon uzun dönemli bir etki, tabii ki sadece bir in vivo implante elektrot ile yapılabilir tekrarlanan uyaranları gerektirecek gibi Bununla birlikte, mevcut protokolü, bu bağlamda kullanılamamıştır. Bu amaçla, hayvan uyarıcı manşet elektrotlar vagus siniri yaklaşık 20 yerleştirildiği bir ameliyat gerekir. Sonuncu teknik çok daha sık insanlarda veya daha büyük boyutta hayvanlarda açıklanan dikkat etmek de önemlidir. Vagus siniri uyarıcı bir başka yolu, vagus sinirinin invazif olmayan ve perkütan stimülasyonu gibi mekaniktir endotokseminin bir murin modelinde bir bağışıklık bastırıcı etki göstermiştirref &quot;&gt; 21. Ancak bu tekniğin temel ilgileri sonuçlarının tekrarlanabilirliği ve nasıl vagus siniri hayvan modellerinde uzun süreli değerlendirmede aynı şekilde uyarılır sağlamak olacaktır. Cihazlar insanlar için geliştirilmiştir gibi sujeler 21 tarafından iyi tolere edilirler, elektrik atımları, teslim olduğu, ki burada VNS uyarılması ya da trans-servikal VNS uyarma-trans aurikular olarak. Bunlar epilepsi ve migren tedavisinde temel olarak kullanılmıştır ve gelecekteki ayakta neden olabilir umut verici sonuçlar göstermiştir ve eksojen tedavisi. Özellikle nedeniyle vücutta vagus sinirinin geniş innervasyon Özetlemek gerekirse, CAP regülasyonu gelecekteki potansiyel terapötik hedeflere yol açabilecek ilginç moleküler mekanistik özelliklerini bulma umuduyla iltihaplı hastalıkların geniş bir yelpazede incelenmiştir. Burada, vagus siniri uyarmak için akut yöntem sundu. sınırlı içinde bu CAP çalışma sağlarVNS ve (enzimatik metabolizması, örneğin, yer almaya izin veren) analizi arasındaki daha uzun bir zaman aralığı ile bir araya ılımlı enflamatuar uyarıcıya enflamatuar tepkileri sayesinde. Vagus siniri, uyarım etkisi altında yatan moleküler mekanizmaların, hem de enflamatuvar hastalıkların tedavisinde etkin bir şekilde kullanımına anlama, özellikle bir klinik bakış açısından, büyük bir önem taşımaktadır. Gerçekten de, yöntem avantajları geniştir. son derece hızlı sinir sinyal niteliği nedeniyle, hızlı ve etkilidir; sitokin seviyeleri üzerinde bir etkisi gözlemlenebilir, örneğin, en az 1 saat içinde meydana gelir. 4 Ayrıca, sinir, mekanik invazif olmayan ve perkütan uyarım gelecek ayakta ve kolay bir şekilde uygulanan tedaviler için ümit vermektedir, kullanılabilir. Son olarak, düzenli tedavi aksine, vagus siniri uyarımı endojen yolu kullanır. Bu nedenle, tüm ilaç tedavilerinin aksine, hiçbir yeni ajanlar tanıtıldıvücuda, bu sayede potansiyel yan etkileri önlenir.

Doğuştan bağışıklık organizmaların geniş bir alanda enfeksiyonlara ve hastalıklara karşı savunma derhal ilk satırı sağlar. Bu tehlike ortadan kaldırmak için primer bağışıklık tepkisi başlatır değil, ama aynı zamanda aktif hale patojen-spesifik bir şekilde ikincil bağışıklık karşılıklarını gerçekleştirir adaptif bağışıklık eğitiminde önemli bir rol oynar. Enflamasyon sırayla enfeksiyon alanına diğer bağışıklık hücrelerini çekme kabiliyetine sahip ve bu tür kızarıklık, şişlik, ağrı, fonksiyon kaybı ve ateş gibi inflamasyon kardinal belirtileri, ikna etmek sitokin ve kemokin bir bolluk, tarafından orkestra edildiği . süresi ve inflamasyon yoğunluğu çeşitli faktörlere bağlıdır, ancak iltihap çözme ve homeostazı geri kronik iltihaplı hastalıkların başlamasını önlemek için önemli bir adımdır. nörobilim ve immünoloji alanında son gelişmeler iltihaplanmayı kontrol etmek muazzam bir terapötik potansiyeli olan belirli sinirsel mekanizmaları açığa çıkarılmamışhem merkezi sinir sisteminde hem de çevresinde amasyon. Bu mekanizmalardan biri, otonom sinir sisteminin 4, 5 tarafından tahrik edilen enflamatuar refleks olarak bilinen kolinerjik, anti-enflamatuar yolu (CAP) olup. Şu anda, inflamatuar mediatörler, merkezi sinir sistemine iltihabı durumuna ilişkin sinyaller duyu sinirleri aktive ve gönderme olduğu düşünülmektedir. Bir refleks yanıt sonra efferent vagus siniri tarafından etkinleştirilir. CAP anatomik detayları kapsamlı bir çalışma iki sinir oluşan bir parasempatik-sempatik modeli, vagus siniri ve dalak sinir sırasıyla 6 ortaya çıkarmıştır. CAP, aktive kolinerjik efferent vagus siniri henüz keşfedilecek bir mekanizma ile adrenerjik dalak sinir aktivasyonu ile sonuçlanan, çölyak-mezenterik ganglion sona erer. Bu şekilde aktive edilmiş dalak sinir, iç bilinmektedirbeyaz maddesinde bağışıklık hücreleri yakın, marjinal bölge ve CAP 7, 8, dalak, asil ve zorunlu organın kırmızı pulpunda vate. Dalak sinir uçlarından norepinefrin (NE) dalak T lenfositleri üzerinde eksprese gelen β 2 adrenerjik reseptörlere bağlanır. Bu da, bu şekilde sitokin üretimi ve iltihap 2 sınırlayıcı makrofajlar üzerinde α7 nikotinik asetilkolin reseptörleri (a7nACh), aktive kolin asetil transferazı (ChAT) aracılık ettiği asetilkolin (Ach) salınmasını tetikler. Sonuç olarak, sinir sistemi, periferik dokularda inflamasyonu düzenleyen ve yerel immün homeostasisi geri mümkün olduğu açıktır. yolunun Adından da anlaşılacağı gibi, ACh sistemi bu nöro-immün düzenleyici yolunun işleyişi için merkezi öneme sahiptir. İlginç bir şekilde, mekanizma aktivasyonuna katılanCAP çevresi ve merkezi sinir sisteminde, farklı gibi görünmektedir. Dalakta nikotinik reseptörlerin önemi (α7nAChR) daha önce 9 gösterilmiştir edilmiş olsa da, muskarinik reseptörleri (mAChR) yolu 10, 11 merkez aktivasyonu için zorunludur. Öldürücü murin endotoksemi sırasında Daha yakın zamanda, merkezi olarak hareket eden M1 muskarinik agonist periferik olarak verilmesi önemli ölçüde bastırdı serumu ve dalak tümör nekroz faktörü α (TNFa), 12 sinyal sağlam vagus siniri ve dalak sinir gerekli bir eylem. Ayrıca, prostaglandin E 2 yoksun fareler (PGE2) Vagus sinir uyarımına yanıt mümkün değildi ve serum ve dalak 3 sitokin LPS ile uyarılan salımını aşağı regüle yoktu son göstermiştir. Bu nedenle, CAP aynı zamanda ana ACh pathw dışındaki sistemler tarafından düzenlenir olabiliray. Vagus siniri, çünkü vücut dolanımı tabii gibi seçildi, karaciğer, akciğer, dalak, böbrek ve bağırsak 13 de dahil olmak üzere başlıca organların innerve. Bu büyük innervasyon ve vagus sinirinin çok kuvvetli immünosupresif etkisi göz önüne alındığında, CAP terapötik potansiyeli enflamatuar durumların geniş bir kapak olabilir. Uyuşturucu gövdeye eklenmiş Vagus siniri, elektriksel olarak (ya da mekanik olarak) geleneksel tedaviye voltaj ve frekans, aksine üzerinde kontrolü ile, aktive edilmiş olabilir. Denemeler kronik enflamasyonu 14 tedavisinde VNS klinik önemi test etmek için, örneğin, romatizma hastalarında halen devam etmektedir. Özet olarak, nöro-immün iletişim ve enflamasyon düzenleme geleneksel tedaviye olası bir alternatif tedavi sağlayacaktır araştırma, halen vardır. Bu nedenle, vagus sinirinin analizi stimülasyonn farklı innerve organlardaki etkisi ancak kronik enflamasyon hayvan modellerinde potansiyel terapötik etki de karakterizasyonu, kesinlikle verilerini kullanarak elde edilmesi ve yeni potansiyel tedavi edici hedefler için umut ediyorum. Tracey ve meslektaşları 4 tarafından geliştirilen özgün metodoloji nedeniyle (LPS öldürücü dozda yoluyla) inflamatuvar yanıt aşırı uyarılması ve CAP aktivasyonu ve okuma-out arasında çok kısa bir zaman aralığına araştırma alanımızla aktarılmamıştır edilemedi. Mevcut yazıda, orijinal protokole yapılan değişiklikleri sunacak sitokin seviyeleri üzerinde iki farklı yöntemler karşılaştırın ve hedef organ (dalak) yeni ve karşı gözlem vurgulamaktadır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="665">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Computer</td>
			<td style="width:91px;">Toshiba</td>
			<td style="width:136px;">-</td>
			<td style="width:191px;">Any computer is actually compatible</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">MP-150 data acquisition system</td>
			<td style="width:91px;">Biopac Systems</td>
			<td rowspan="2" style="width:136px;">MP150WSW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Acknowledge software</td>
			<td style="width:91px;">Biopac Systems</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Mice C57Bl/6</td>
			<td style="width:91px;">Charles River</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Anesthetic machine</td>
			<td style="width:91px;">Simtec Engineering</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Medical oxygen bottle</td>
			<td style="width:91px;">AGA</td>
			<td style="width:136px;">107563</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Medical air bottle&#160;</td>
			<td style="width:91px;">AGA</td>
			<td style="width:136px;">108639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Vetflurane (1000mg/g)</td>
			<td style="width:91px;">Virbac</td>
			<td style="width:136px;">137317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">LPS</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">L2630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Saline</td>
			<td style="width:91px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:136px;">1024060080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">PBS 10X</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">P5493</td>
			<td>Diluted 10 times for used concentration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Syringe (1 ml)</td>
			<td style="width:91px;">BD Plastipak</td>
			<td style="width:136px;">303172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Needles 23G</td>
			<td style="width:91px;">KD-FINE</td>
			<td style="width:136px;">900284</td>
			<td>0.6 x 30 mm (blue)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Microdissecting forceps (curved)</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">F4142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Dissecting scissors</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">Z265969</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Surgical suture 4-0</td>
			<td style="width:91px;">Ethicon</td>
			<td style="width:136px;">G667G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Euthanasia unit</td>
			<td style="width:91px;">Euthanex Smartbox</td>
			<td style="width:136px;">EA-32000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Cavilon No Sting Barrier Film</td>
			<td style="width:91px;">3M Health Care</td>
			<td style="width:136px;">3346N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">TH1/TH2 9-Plex assay, ultrasensitive kit</td>
			<td style="width:91px;">MesoScale Discovery</td>
			<td style="width:136px;">K15013C-1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

increased recovery time and decreased lps administration to study the vagus nerve stimulation mechanisms in limited inflammatory responses

Inflammation is a local response to infection and tissue damage mediated by activated macrophages, monocytes, and other immune cells that release cytokines and other mediators of inflammation. For a long time, humoral and cellular mechanisms have been studied for their role in regulating the immune response, but recent advances in the field of immunology and neuroscience have also unraveled specific neural mechanisms with interesting therapeutic potential. The so-called cholinergic anti-inflammatory pathway (CAP) has been described to control innate immune responses and inflammation in a very potent manner. In the early 2000s, Tracey and collaborators developed a technique that stimulates the vagus nerve and mimics the effect of the pathway. The methodology is based on the electrical stimulation of the vagus nerve at low voltage and frequency, in order to avoid any side effects of overstimulation, such as deregulation of heart rate variability. Electrical devices for stimulation are now available, making it easy to set up the methodology in the laboratory. The goal of this research was to investigate the potential involvement of prostaglandins in the CAP. Unfortunately, based on earlier attempts, we failed to use the original protocol, as the induced inflammatory response either was too high or was not suitable for enzymatic metabolism properties. The different settings of the original surgery protocol remained mostly unchanged, but the conditions regarding inflammatory induction and the time point before sacrifice were improved to fit our purposes (i.e., to investigate the involvement of the CAP in more limited inflammatory responses). 
The modified version of the original protocol, presented here, includes a longer time range between vagus nerve stimulation and analysis, which is associated with a lower induction of inflammatory responses. Additionally, while decreasing the level of lipopolysaccharides (LPS) to inject, we also came across new observations regarding mechanistic properties in the spleen.

TNFa ve interlökin-1 P (IL-1β) Düzeyi LPS Doz Cerrahisi sonra Zaman Atl Artan ve Azalan sonra Daha önce gösterildiği gibi, orijinal protokol kullanılarak, ki burada VNS TNFa seviyelerini ve IL-1 p (360.0 ± 40.21 ug / mg (39.7 ± 10.8 pg / VNS de mg, p &lt;0.001 versus SHAM içinde 169.3 ± 24.9 ug / mg) azalır intraperitoneal LPS enjeksiyonundan (15 mg / kg) (Şekil 2A) sonra dalak VNS içinde 191.7 ± 27.2 ug / mg, p &lt;0.01) kıyasla SHAM. 1 ila 6 saat analiz için zaman değişen ve 15 ile 2 mg / kg LPS dozunun azaltılması sonra, sadece TNFa ile VNS bir etki, gözlenen (8.82 ± 1.20 ug / mg karşı SHAM / mg 13.67 ± 1.81 pg VNS, p &lt;0.05), IL-1β etkilenmedi ise (304,99 ± 43.54 ug / mg karşı SHAM / mg 368,62 ± 35.65 ug) (Şekil 2B). Herhangi LPS inj olmadanection (yani tuzlu su), bir fark VNS (Şekil 2C) sonra tespit edilebilir. Farklı Koşullar kullanma VNS sonra Dalak içinde Keratinosit Kimyasal Çekici / İnsan Büyüme düzenlenen onkogen (KC / GRO) Düzeyleri Orijinal protokolü ile, KC / GROa, güçlü VNS (Şekil 3A) (VNS içinde 416.4 ± 29.7 ug / mg, p &lt;0.001 versus SHAM içinde 597,4 ± 17,8 pg / mg) aşağı doğru regüle edildiğini göstermiştir. VNS Örneğin, TNFa hala kuvvetli iken LPS 6 saatlik zaman noktası ve 2 mg / kg kullanılarak, herhangi bir değişiklik, SHAM ve VNS hayvanlarda (Şekil 3B) arasında gözlenmiştir. bir LPS 6 saatlik zaman noktası için enjekte edilmiştir, ancak biz VNS aşağıdaki KC / GRO güçlü bir yukarı regülasyonunu gözlenmiştir (141.22 ± 10,56 ug / VNS de mg, p &lt;0.001 versus SHAM / mg 59.37 ± 4.29 pg ) (Şekil 3C). Beklendiği gibi, çoğudiğer sitokinlerin (TNFa, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IL-12 ve IFN-y), çok düşük seviyelerde (saptanabilirse) idi ve hiçbir fark SHAM arasında görülebilir ve hayvanlar VNS uyarılmış. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54890/54890fig1.jpg" /> Şekil 1: Vagus Sinir Stimülasyon gerçekleştirin için Gerekli Malzeme resimleri. A) i) Bilgisayar, ii) veri edinme sistemi ve iii) uyarıcı elektrot cihazı. B) vagus siniri altına yerleştirilir elektrotun yakın çekim. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54890/54890fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54890/54890fig2.jpg" /> Şekil 2: Dalak E TNFa seviyeleri ve IL-1βSHAM ve VNS tedavi edilen hayvanların xtracts. ) 2 mg / kg LPS ip enjeksiyonu sonra 15 mg / kg LPS, B) 6 saatlik iyileşme ip enjeksiyonu sonrasında A) 1-saat geri kazanımı ve C: Hayvanlar, aşağıdaki koşullara göre, SHAM veya VNS cerrahi tabi tutulur LPS enjeksiyonu olmadan 6 saatlik geri kazanım. Seviyeleri bir pro-enflamatuar sitokin kaplı levha üzerinde ölçülen ve doku pg / mg olarak ifade edilmiştir. Veriler ortalama ± SEM olarak ifade edilmiştir. Bir yıldız işareti VNS ve SHAM fareler arasındaki istatistiksel farklılıkları (her grupta n = 8) göstermektedir. Student t-testi, * p &lt;0.05; ** p &lt;0.01; *** p &lt;0.001. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54890/54890fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54890/54890fig3.jpg" /> Şekil 3: Sp KC / GRO SeviyeleriSHAM ve leen özleri basit fareler VNS muamele edilmektedir. ) 2 mg / kg LPS ip enjeksiyonu sonra 15 mg / kg LPS, B) 6 saatlik iyileşme ip enjeksiyonu sonrasında A) 1-saat geri kazanımı ve C: Hayvanlar, aşağıdaki koşullara göre, SHAM veya VNS cerrahi tabi tutulur LPS enjeksiyonu olmadan 6 saatlik geri kazanım. Seviyeleri bir pro-enflamatuar sitokin kaplı levha üzerinde ölçülen ve doku pg / mg olarak ifade edilmiştir. Veriler ortalama ± SEM olarak ifade edilmiştir. Bir yıldız işareti VNS ve SHAM fareler arasındaki istatistiksel farklılıkları (her grupta n = 8) göstermektedir. Student t-testi *** p &lt;0.001.

Watch this Scientific Journal Video about Increased Recovery Time and Decreased LPS Administration to Study the Vagus Nerve Stimulation Mechanisms in Limited Inflammatory Responses at JoVE.com

Increased Recovery Time and Decreased LPS Administration to Study the Vagus Nerve Stimulation Mechanisms in Limited Inflammatory Responses

Vagus nerve stimulation has proven to have a strong efficacy for decreasing peripheral inflammation. Here, we present a modified vagus nerve stimulation protocol that allows for further examinations of the cholinergic anti-inflammatory mechanisms in limited inflammatory responses.

Kurtarma Zamanı Artan ve Sınırlı Enflamatuar Yanıtları içinde Vagus sinir stimülasyonu Mekanizmaları Eğitim için LPS İdaresi Azalmış

Inflammation is a local response to infection and tissue damage mediated by activated macrophages, monocytes, and other immune cells that release ...

increased-recovery-time-decreased-lps-administration-to-study-vagus

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.8K Görüntüleme.  Karolinska University Hospital. Vagus nerve stimulation has proven to have a strong efficacy for decreasing peripheral inflammation. Here, we present a modified vagus nerve stimulation protocol that allows for further examinations of the cholinergic anti-inflammatory mechanisms in limited inflammatory responses.

Video: Increased Recovery Time and Decreased LPS Administration to Study the Vagus Nerve Stimulation Mechanisms in Limited Inflammatory Responses

Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice to colitis. If the gene-of-interest is expressed in both bone marrow derived cells and non-bone marrow derived cells of the host; however, it is possible to differentiate the role of a gene of interest in bone marrow derived cells and non- bone marrow derived cells by bone marrow transplantation technique. To change the bone marrow derived cell genotype of mice, the original bone marrow of recipient mice were destroyed by irradiation and then replaced by new donor bone marrow of different genotype. When wild-type mice donor bone marrow was transplanted to knockout mice, we could generate knockout mice with wild-type gene expression in bone marrow derived cells. Alternatively, when knockout mice donor bone marrow was transplanted to wild-type recipient mice, wild-type mice without gene-of-interest expressing from bone marrow derived cells were produced. However, bone marrow transplantation may not be 100% complete. Therefore, we utilized cluster of differentiation (CD) molecules (CD45.1 and CD45.2) as markers of donor and recipient cells to track the proportion of donor bone marrow derived cells in recipient mice and success of bone marrow transplantation. Wild-type mice with CD45.1 genotype and knockout mice with CD45.2 genotype were used. After irradiation of recipient mice, the donor bone marrow cells of different genotypes were infused into the recipient mice. When the new bone marrow regenerated to take over its immunity, the mice were challenged by chemical agent (dextran sodium sulfate, DSS 5%) to induce colitis. Here we also showed the method to induce colitis in mice and evaluate the role of the gene of interest expressed from bone-marrow derived cells. If the gene-of-interest from the bone derived cells plays an important role in the development of the disease (such as colitis), the phenotype of the recipient mice with bone marrow transplantation can be significantly altered. At the end of colitis experiments, the bone marrow derived cells in blood and bone marrow were labeled with antibodies against CD45.1 and CD45.2 and their quantitative ratio of existence could be used to evaluate the success of bone marrow transplantation by flow cytometry. Successful bone marrow transplantation should show a vast majority of donor genotype (in term of CD molecule marker) over recipient genotype in both the bone marrow and blood of recipient mice.

Bone marrow transplantation provides a way to change the genotype of the bone marrow derived cells. If the gene of interest is expressed in both bone marrow derived cells and non-bone marrow derived cells, bone marrow transplantation can change the bone marrow derived cells to a different genotype without changing the non-bone marrow derived cell genotype.

Kemik İliği Transplantasyonu tarafından Fare Kolit immün ve non-immün Hücreler Gen Ekspresyonu İşlevsel Rolleri Farklılaşan

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing the mucosal surface of the nasopharynx, where it can reside, multiply and eventually overcome host defences to invade to other tissues of the host. Establishment of an infection in the normally lower respiratory tract results in pneumonia. Alternatively, the bacteria can disseminate into the bloodstream causing bacteraemia, which is associated with high mortality rates2, or else lead directly to the development of pneumococcal meningitis. Understanding the kinetics of, and immune responses to, nasopharyngeal colonization is an important aspect of S. pneumoniae infection models.
Our mouse model of intranasal colonization is adapted from human models3 and has been used by multiple research groups in the study of host-pathogen responses in the nasopharynx4-7. In the first part of the model, we use a clinical isolate of S. pneumoniae to establish a self-limiting bacterial colonization that is similar to carriage events in human adults. The procedure detailed herein involves preparation of a bacterial inoculum, followed by the establishment of a colonization event through delivery of the inoculum via an intranasal route of administration. Resident macrophages are the predominant cell type in the nasopharynx during the steady state. Typically, there are few lymphocytes present in uninfected mice8, however mucosal colonization will lead to low- to high-grade inflammation (depending on the virulence of the bacterial species and strain) that will result in an immune response and the subsequent recruitment of host immune cells. These cells can be isolated by a lavage of the tracheal contents through the nares, and correlated to the density of colonization bacteria to better understand the kinetics of the infection.

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Colonization of the murine nasopharynx with Streptococcus pneumoniae and the subsequent extraction of adherent or recruited cells is described. This technique involves flushing the nasopharynx and collection of the fluid through the nares and is adaptable for various readouts, including differential cell quantification and analysis of mRNA expression in situ.

Streptococcus pneumoniae ile İntranazal Kolonizasyon Sırasında İnflamatuar Yanıtların Karakterizasyonu

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing ...

Transplantation of Tail Skin to Study Allogeneic CD4 T Cell Responses in Mice

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and host T cells, to easily monitor the graft, and to adapt the system in order to answer different immunological questions. Medawar and colleagues established allogeneic tail-skin transplantation in mice in 1955. Since then, the skin transplantation model has been continuously modified and adapted to answer specific questions. The use of tail-skin renders this model easy to score for graft rejection, requires neither extensive preparation nor deep anesthesia, is applicable to animals of all genetic background, discourages ischemic necrosis, and permits chemical and biological intervention. 
In general, both CD4+ and CD8+ allogeneic T cells are responsible for the rejection of allografts since they recognize mismatched major histocompatibility antigens from different mouse strains. Several models have been described for activating allogeneic T cells in skin-transplanted mice. The identification of major histocompatibility complex (MHC) class I and II molecules in different mouse strains including C57BL/6 mice was an important step toward understanding and studying T cell-mediated alloresponses. In the tail-skin transplantation model described here, a three-point mutation (I-Abm12) in the antigen-presenting groove of the MHC-class II (I-Ab) molecule is sufficient to induce strong allogeneic CD4+ T cell activation in C57BL/6 mice. Skin grafts from I-Abm12 mice on C57BL/6 mice are rejected within 12-15 days, while syngeneic grafts are accepted for up to 100 days. The absence of T cells (CD3-/- and Rag2-/- mice) allows skin graft acceptance up to 100 days, which can be overcome by transferring 2 x 104 wild type or transgenic T cells. Adoptively transferred T cells proliferate and produce IFN-&#947; in I-Abm12-transplanted Rag2-/- mice.

Tail-skin transplantation is a powerful model for studying T cell-dependent rejection and tolerance induction during allogeneic immune responses in mice. The advantages of this protocol are minor invasive surgery, and ease of monitoring with no need to sacrifice the recipient mouse.

Farelerde allojenik CD4 + T hücre Cevapları Eğitim için Kuyruk Cilt Nakli

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and ...

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific locked nucleic acid (LNA) and molecular beacon (MB) probes, transcript standards, automated multichannel pipetting, and plate drying. Determining expression among the type I interferons (IFN), especially the twelve IFN-&#945; subtypes, is limited by their shared sequence identity; likewise, the sequences of the type III IFN, especially IFN-&#955;2 and -&#955;3, are highly similar. This assay provides a reliable, reproducible, and relatively inexpensive means to analyze the expression of the seventeen interferon subtype transcripts.

This protocol describes a high-throughput qRT-PCR assay for the analysis of type I and III IFN expression signatures. The assay discriminates single base pair differences between the highly similar transcripts of these genes. Through batch assembly and robotic pipetting, the assays are consistent and reproducible.

Yüksek verim Kantitatif Gerçek zamanlı RT-PCR Testi Türleri I ve III İnterferon Alttipleriyle İfadesi Profilleri belirlenmesi için

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the physiological mechanisms that mediate immune responses to vaccines perhaps due to the overall success of vaccination, which has reduced interest into the molecular and physiological mechanisms of vaccine immunity. However, several important human pathogens including influenza virus still pose a challenge for vaccination, and may benefit from immune-based strategies. 
Although influenza reverse genetics has been successfully applied to the generation of live-attenuated influenza vaccines (LAIVs), the addition of molecular tools in vaccine preparations such as tracer components to follow up the kinetics of vaccination in vivo, has not been addressed. In addition, the recent generation of mouse models that allow specific depletion of leukocytes during kinetic studies has opened a window of opportunity to understand the basic immune mechanisms underlying vaccine-elicited protection. Here, we describe how the combination of reverse genetics and chimeric mouse models may help to provide new insights into how vaccines work at physiological and molecular levels, using as example a recombinant, cold-adapted, live-attenuated influenza vaccine (LAIV). We utilized laboratory-generated LAIVs harboring cell tracers as well as competitive bone marrow chimeras (BMCs) to determine the early kinetics of vaccine immunity and the main physiological mechanisms responsible for the initiation of vaccine-specific adaptive immunity. In addition, we show how this technique may facilitate gene function studies in single animals during immune responses to vaccines. We propose that this technique can be applied to improve current prophylactic strategies against pathogens for which urgent medical countermeasures are needed, for example influenza, HIV, Plasmodium, and hemorrhagic fever viruses such as Ebola virus.

There is an overall lack of knowledge about how vaccines work. Here we propose the combined use of reverse genetics and bone marrow chimeric mice to gain insight into the early host immune responses to vaccines with a special focus on dendritic cells and T cell immunity.

Kimerik fare modellerinde Rekombinant Grip aşıların burun içinde yoluyla mukozal bağışıklık Okumak

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

Intra-tracheal Administration of Haemophilus influenzae in Mouse Models to Study Airway Inflammation

Here, we describe a detailed procedure to efficiently and directly deliver Haemophilus influenzae into the lower respiratory tracts of mice. We demonstrate the procedure for preparing H. influenzae inoculum, intra-tracheal instillation of H. influenzae into the lung, collection of broncho-alveolar lavage fluid (BALF), analysis of immune cells in the BALF, and RNA isolation for differential gene expression analysis. This procedure can be used to study the lung inflammatory response to any bacteria, virus or fungi. Direct tracheal instillation is mostly preferred over intranasal or aerosol inhalation procedures because it more efficiently delivers the bacterial inoculum into the lower respiratory tract with less ambiguity.

Intra-tracheal Administration of Haemophilus influenzae in Mouse Models to Study Airway Inflammation

We demonstrate the procedure for intra-tracheal inoculation of Haemophilus influenzae into the lower respiratory tracts of mice. This is a very useful tool to study signaling pathways that regulate airway inflammation in mouse models.

intra-trakeal İdaresi<em&gt; Haemophilus influenza</em&gt; Fare Modelleri Havayolu inflamasyonu Eğitim için

Here, we describe a detailed procedure to efficiently and directly deliver Haemophilus influenzae into the lower respiratory tracts of mice. We ...

Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents autoimmunity. Many approaches involving different model organisms have been utilized to understand the mechanisms controlling helper T cell development and function. However, studies using mouse models have proven to be highly informative due to the availability of genetic, cellular, and biochemical systems. One genetic approach in mice used by many labs involves retroviral transduction of primary helper T cells. This is a powerful approach due to its relative ease, making it accessible to almost any laboratory with basic skills in molecular biology and immunology. Therefore, multiple genes in wild type or mutant forms can readily be tested for function in helper T cells to understand their importance and mechanisms of action. We have optimized this approach and describe here the protocols for production of high titer retroviruses, isolation of primary murine helper T cells, and their transduction by retroviruses and differentiation toward the different helper subsets. Finally, the use of this approach is described in uncovering mechanisms utilized by microRNAs (miRNAs) to regulate pathways controlling helper T cell development and function.

Many experimental systems have been utilized to understand the mechanisms regulating T cell development and function in an immune response. Here a genetic approach using retroviral transduction is described, which is economic, time efficient, and most importantly, highly informative in identifying regulatory pathways.

Eğitim için bir genetik Yaklaşım olarak yardımcı T hücrelerinin retroviral İletimi Mekanizmaları kendi Farklılaşma ve Kontrol Fonksiyonunun

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents ...

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses

Airway inflammation is often associated with bacterial infections and represents a major determinant of lung disease. The in vivo determination of the pro-inflammatory capabilities of various factors is challenging and requires terminal procedures, such as bronchoalveolar lavage and the removal of lungs for in situ analysis, precluding longitudinal visualization in the same mouse. Here, lung inflammation is induced through the intratracheal instillation of Pseudomonas aeruginosa culture supernatant (SN) in transiently transgenized mice expressing the luciferase reporter gene under the control of a heterologous IL-8 bovine promoter. Luciferase expression in the lung is monitored by in vivo bioluminescent image (BLI) analysis over a 2.5- to 48-h timeframe following the instillation. The procedure can be repeated multiple times within 2 - 3 months, thus permitting the evaluation of the inflammatory response in the same mice without the need to terminate the animals. This approach permits the monitoring of pro- and anti-inflammatory factors acting in the lung in real time and appears suitable for functional and pharmacological studies.

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses

The method described here allows for the visualization of IL-8 promoter-dependent inflammation activation in the lungs of mice through non-invasive bioluminescence imaging (BLI). The same animal can be subjected to BLI multiple times for up to two months from the time of delivery of the luciferase reporter construct.

Bir IL-8 Geçici Transgenize Edilmiş Fare Modeli<emIn vivo</em&gt; İnflamatuvar Yanıtların Uzun Vadeli İzlenmesi

Airway inflammation is often associated with bacterial infections and represents a major determinant of lung disease. The in vivo determination of the ...

Screening Assays to Characterize Novel Endothelial Regulators Involved in the Inflammatory Response

The endothelial layer is essential for maintaining homeostasis in the body by controlling many different functions. Regulation of the inflammatory response by the endothelial layer is crucial to efficiently fight against harmful inputs and aid in the recovery of damaged areas. When the endothelial cells are exposed to an inflammatory environment, such as the outer component of gram-negative bacteria membrane, lipopolysaccharide (LPS), they express soluble pro-inflammatory cytokines, such as Ccl5, Cxcl1 and Cxcl10, and trigger the activation of circulating leukocytes. In addition, the expression of adhesion molecules E-selectin, VCAM-1 and ICAM-1 on the endothelial surface enables the interaction and adhesion of the activated leukocytes to the endothelial layer, and eventually the extravasation towards the inflamed tissue. In this scenario, the endothelial function must be tightly regulated because excessive or defective activation in the leukocyte recruitment could lead to inflammatory-related disorders. Since many of these disorders do not have an effective treatment, novel strategies with a focus on the vascular layer must be investigated. We propose comprehensive assays that are useful to the search of novel endothelial regulators that modify leukocyte function. We analyze endothelial activation by using specific expression targets involved in leukocyte recruitment (such as, cytokines, chemokines, and adhesion molecules) with several techniques, including: real-time quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR), western-blot, flow cytometry and adhesion assays. These approaches determine endothelial function in the inflammatory context and are very useful to perform screening assays to characterize novel endothelial inflammatory regulators that are potentially valuable for designing new therapeutic strategies.

Vascular endothelium tightly controls leukocyte recruitment. Inadequate leukocyte extravasation contributes to human inflammatory diseases. Therefore, searching for novel regulatory elements of endothelial activation is necessary to design improved therapies for inflammatory disorders. Here, we describe a comprehensive methodology to characterize novel endothelial regulators that can modify leukocyte trafficking during inflammation.

Deneyleri roman endotel düzenleyiciler inflamatuvar yanıtta yer alan karakterize etmek için eleme

The endothelial layer is essential for maintaining homeostasis in the body by controlling many different functions. Regulation of the inflammatory ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. typhimurium bacteria are quickly detected and phagocytized by macrophages, and contained in vesicles known as phagosomes in order to be degraded. Isolation of S. typhimurium-containing phagosomes have been widely used to study how S. typhimurium infection alters the process of phagosome maturation to prevent bacterial degradation. Classically, the isolation of bacteria-containing phagosomes has been performed by sucrose gradient centrifugation. However, this process is time-consuming, and requires specialized equipment and a certain degree of dexterity. Described here is a simple and quick method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin-streptavidin-conjugated magnetic beads. Phagosomes obtained by this method can be suspended in any buffer of choice, allowing the utilization of isolated phagosomes for a broad range of assays, such as protein, metabolite, and lipid analysis. In summary, this method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes is specific, efficient, rapid, requires minimum equipment, and is more versatile than the classical method of isolation by sucrose gradient-ultracentrifugation.

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

We describe here a simple and quick method for the isolation of Salmonella typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin and streptavidin.