The study was supported by the Swedish Research Council, the Swedish Rheumatism Asociation, Karolinska Institute Foundations, Stockholm County Council, The Wallenberg Foundation, and the GV 80 Years' Foundation for research. The authors would also like to thank Hannah Aucott for proofreading the manuscript.

全ての動物実験は、カロリンスカ研究所、ストックホルムで地元の倫理委員会によって承認された動物の管理と使用のためのガイドラインに従って行いました。地元の倫理委員会は、動物のケアに関する欧州連合指令に従っています。 注：元のプロトコルからの主な変更点は、手術後の回復時間（1時間対 6時間）であり、LPSのレベルを（15ミリグラム/ kgの対 2mg / kgの）を注入しました。それ以外の場合は、手術自体に関連するさまざまな設定が変更されていません。 1.刺激のための材料を準備<ol><li>コンピュータ及び刺激電極（ 図1A）に連結されたデータ収集システムをオン。 </li><li>アクノリッジプログラムを入力します。 </li><li> 1×PBS中5mg / mlの濃度のLPSのストック溶液を調製し、アリコートにし、-20℃で保管します。実験の日に、アリコートを解凍し、ADEを準備重量に応じて、動物に約100μLを注入するために、LPSのquateサンプル（0.5 mg / mlと）。 </li></ol> 2.麻酔のための動物の準備<ol><li> C57BL / 6マウスを使用してください。 、12時間の明/暗サイクルで気候制御された条件下でそれらを維持し、それらを標準的なげっ歯類固形飼料を供給し、それらに水を自由に与えます。 </li><li>実験の日に、周りに25グラムの重量を量るマウスに手術を行います。 注：炎症反応が誘導されると、動物での臨床反応の定期検診や観察を行うことが特に重要です。動物の条件は倫理的な基準を満たしていない場合はCO 2吸入による早期の安楽死が必要とされています。 </li><li>麻酔マシンを設定します。 <ol><li>チューブが正しく接続されており、どのような方法で破損していないことを確認します。換気が正常に動作していることを確認してください。イソフルランボトルにキーフィルタを接続し、VAPOを埋めますイソフルランの十分な量とrizer。 </li><li>ガス供給（空気や酸素）を開き、ボトルは、実験のために十分なガスが含まれていることを確認してください。 3ウェイコネクタは、誘導室やマスクにイソフルランの流れを送信することができます。 </li></ol></li><li>誘導室に、三方コネクタを回します。ホームケージから1匹のマウスを選択し、チャンバー内に動物を挿入します。 1.0 L /分の酸素と1.0 L /分の空気を流量調整器を調整します。 5％ - 4にイソフルラン濃度を調整します。 </li><li>麻酔の所望のレベルに達したときに、麻酔の所望のレベルに達したとき、手術領域を剃るマスクにチャンバーから動物を移動させます。マスクの流れに、三方コネクタを回します。 0.25リットル/分の酸素および0.25リットル/分の空気を流量調整器を調整します。 <ol><li> 2.5％ - 1.5イソフルラン濃度を調整します。外科procedurを開始する前に、反射制御および呼吸数によって麻酔のレベルをチェックしてください電子。 </li></ol></li><li>粘着テープを使用した作業台にマウスの足を固定してください。動物の鼻はまだ慎重にマスク内に配置されていることを確認してください。 </li></ol>迷走神経の3手術と刺激<ol><li> 70％エタノールで手術領域を消毒します。 </li><li>メスを使用して、慎重に首（約1〜1.5センチの切開部）のレベルで皮膚を切開。 注意：プロトコルでは、手術の手順は、偽手術動物のためにここで終了。確かに、それだけで金属製の工具で神経に触れることは、すでにある程度までそれを刺激することが示されています。したがって、LPSの少量を使用した場合、より正確な手術コントロール動物を取得するには、この段階で手術を停止します。 </li><li>顕微鏡（12.5Xの目的）の助けを借りて、解剖ピンセットを用いて頸動脈から左迷走神経を分離します。まず皮膚や脂肪の層を除去することにより、胸鎖乳突筋を見つけて、それを撤回神経と動脈の両方の後ろに鉗子を置くため。 注：神経および動脈が互いに密接に付着される次のステップは、非常に厄介です。したがって、血管を切断して、動物を殺すことは非常に簡単です。しかし、神経と動脈の間で非常に慎重にピンセットを置くことによって、彼らは最終的に分離し、神経を単離することが可能です。 </li><li>迷走神経の下電極（ 図1B）を置きます。針電極はかなり長いので、神経が刺激中に、わずかに移動しても、それは常に、電極と接触することになります。 </li><li> （サイトカインレベルに対する読み出しのために、 すなわち、ダウンレギュレーションの効果を測定するために）注射器の助けを借りて、LPSの腹腔内（ip）注射（2mg / kgの）を実行します。 </li><li>刺激を開始する前に、5分待ってください。 </li><li>アクノリッジプログラムのスタートボタンを押して5 V及び1Hzで5分間、迷走神経を刺激します。 </li><li>再電極を移動させ、手術用縫合糸を用いて動物の創傷を縫合。 </li><li>治癒を向上させ、感染から保護するために傷口にはありませんスティングバリアフィルム（NSBF）をスプレーしてください。 </li></ol>動物の4.回復<ol><li>手術後、目覚めと回復のために戻ってそのホームケージに動物を移動します。体温を維持するために、赤外光の下では、完全な意識が回復されるまで、動物を監視するようにしてください。 </li><li>動物は、分析のために犠牲にする前に6時間、そのケージに回復しましょう。 注意：迷走神経刺激の効果は非常に高速であり、また、（48時間まで）持続長いことが示されているので、回復時間は、研究のニーズに応じて、実験者によって設定することができます。 </li></ol>さらなる分析のための5サクリファイス<ol><li> CO 2投与装置にリンクされているケージに動物を置きます。 </li><li> 5上のデバイスを設定します。CO 2吸入の-minサイクル。 </li><li>安楽死が行われると、関心のある器官を収集し、直接、さらなる分析（ 例えば、マウスTH1 / TH2 9プレックスアッセイを用いて脾臓抽出物中のサイトカインレベルの測定）のためにドライアイス上でそれらを凍結3。 </li></ol>

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著者らは、開示することは何もありません。

2000年代初頭におけるその発見以来、CAPのメカニズムは、徹底的に研究されてきました。私たちは今、ダウンレギュ炎症性メディエーター2に経路の良い写真を持って、特に、標的臓器、脾臓、非常に効率的なチームとしてNE、メモリーT細胞、のAch、およびマクロファージの仕事。また、最近明らかにCAP 3の活性化後の脾臓におけるACh放出のための必須の成分である、特に、PGE 2、マウスにおける機能的なプロスタグランジンシステムの重要性に関するデータを発表しています。 迷走神経刺激として知られている実験的な技術は、簡単に実験室で行うことができますが、いくつかの重要なプロトコルは、動物や手術の手順について観察する必要があります。私たちは中に電荷を構築しないようにするためには、「電荷平衡」刺激することになっている正弦波刺激信号を、使用します（単相性刺激ではなく）、それを破壊する可能性が神経。神経を刺激しながら、それだけで迷走神経切断実験と、他の目的のために行うことができる遠心性信号から、求心性を分離することはできません。実験に使用期間や頻度は、例えば、炎症チャレンジ後のサイトカイン放出に影響を与えることが知られているが、心拍数に影響を与えたり、健常対照者の明らかな副作用を与えないだろう。 まず第一に、実験者は常に取り扱い、手術、および動物の回復は、動物のケアのための倫理規則に従って行われなければならないことを心に留めておく必要があります。他の点は、手術を練習することは非常に重要であるということです。迷走神経を分離すること、血管損傷が発生した場合、動物のために致命的なことができ困難な工程です。これは、動物が長期間にわたって麻酔をする必要がないことを意味し、20分 - 経験により、手術は15以内に行うことができます回復に役立ちます。 議論はまた、良好な偽手術動物の選択に関して上昇させることができます。私たちのプロトコルでは、我々は唯一の迷走神経の下に電極を配置することなく、首のレベルで手術を受けた動物を使用していました。このオプションを選択した理由は、（以前に観察されたように）ちょうど神経の下に電極を配置すること、機械的に炎症の非常に低いレベルで発生する可能性のメカニズムをマスキングするリスクを作成、ある程度の19を神経を刺激することでした。 LPSの非常に高用量を使用している場合は、最高の偽手術コントロールは、おそらく偽手術の効果は、サイトカインのバーストに明白な電気刺激の効果を妨げたりマスクしないと同じように、神経の下に電極を配置することです。 私たちは、研究の私たちのフィールド内で発生したさまざまな問題に合わせて現在のプロトコルを開発しました。前報で述べたように、私たちは、CAPにおけるプロスタグランジンシステムの関与の可能性を見ました。酵素代謝のために、我々は、元のプロトコルの1時間の回復時間は我々の実験に合っていないだろうと思いました。したがって、我々は6時間に手術後の経過時間を延長しました。そうすることで、我々はまた、倫理的な基準を満たすために、LPSの投与量をダウン滴定する必要がありました。私たちは、私たちは、この目的のために十分に長いと思った遅延を6時間の回復時間を選びました。我々はまた、0 / kgのダウンを15mg / kgの（元のプロトコル）からのLPSを滴定しました。 2mg / kgで、我々は、サイトカイン上のVNSの最後の効果（ 図2）、低用量で消失効果を見ました。 脾臓におけるVNSの主な効果は知られており、特徴記憶T細胞の活性化により、その後、減少可能マクロファージ細胞サイトカインは、我々はまた、VNS直接メディエーターの放出を（誘導すると思われることがここで示されているがそれはまだどのセル、necessitatiから不明です炎症への一次応答から他の細胞型を採用するために）さらなる研究をngの。 VNSは強く、強い炎症誘発た（15mg / kgのLPS; すなわち、オリジナルのプロトコル）の後KC / GRO減実際、それは炎症の非存在下におけるKC / GROの非常に速い放出を活性化させます。ケモカインKC / GRO、強い走化性特性を有するIL-8関連タンパク質は、白血球の開発において重要な役割（ 例えば、成熟および活性化駆動）、トラフィッキング（ 例えば、引力及び好中球の動員を）、そしてする15の機能を有することが知られています。例えば、好中球は、自然免疫系の食システムの重要なメンバーです。彼らは、侵入する病原体に対する宿主防御の第一線として働き、彼らはまた、炎症誘発性傷害16の重要なメディエーターです。興味深いことに、プロトコルを改善するために私たちの試みで、私たちはその後、DIRECを強調し、この観察に出くわしました迷走神経機能における脾臓中の他の細胞型のトンの関与。 フィールドのすべての先駆的な仕事は、脾臓、CAPの標的臓器に焦点を当て、および敗血症または末梢全身性炎症に応答して、経路の免疫調節効果にしています。重要なのは、この作品は、この論文で提示された1つとして、迷走神経の急性刺激を用いて行きました。これは、（手術後24〜48時間の最大値）は、特定の器官の分子分析のために、または炎症の慢性動物モデルを含む機能的研究に見られる短期的効果を用いることができます。 しかし、迷走神経の徘徊コースはまた、CAPが異なる神経支配臓器13を伴う慢性炎症性疾患を治療するための重要な用途のものであってもよいことを意味しています。この文脈の中で最も研究さ器官の一つは、クローン病が含まれる炎症性腸疾患（IBD）、に焦点を当てて、腸であります<html> ＃39;病および潰瘍性大腸炎だけでなく、術後誘発性イレウス17。また、肝臓、腎臓、および肺を含む多くの他の炎症性疾患におけるCAP調節の重要性は、調査18の下にもあります。迷走神経活性化の長期的効果はもちろんのみインビボで移植された電極を用いて行うことができ、反復刺激を必要とするようにもかかわらず、現在のプロトコルは、この文脈で使用することができませんでした。この目的のために、動物は刺激カフ電極は迷走神経20の周りに配置されている手術を受けるべきです。後者の技術は、はるかに頻繁にヒトでのサイズ以上の動物で記述されていることに注意することも重要です。迷走神経の非侵襲的および経皮的刺激が内毒素血症のマウスモデルにおける免疫抑制効果が認められたとして、迷走神経を刺激する別の方法は、機械的ですREF &quot;&gt; 21。しかし、この技術の主な関心事は、結果の再現だろうと迷走神経は、動物モデルの長期評価で、同じように刺激されることを確実にする方法。デバイスは、人間のために開発されてきましたこのようなうまく被験者21によって許容される電気パルスを、提供するトランス耳介VNS刺激またはトランス子宮頸VNS刺激、など。彼らは、てんかんや偏頭痛の治療に主に使用されており、今後の通院につながる有望な結果を示していますそして外因性治療。 特に理由は、体内の迷走神経の広範な神経支配、要約すると、CAPの規制は、潜在的な将来の治療標的につながる可能性があり、興味深い分子メカニズムの性質を見つけることを期待して炎症性疾患の広い範囲で検討されます。ここでは、迷走神経を刺激する急性の方法を提示しました。に限らにはCAPの研究を可能にflammatory応答（酵素代謝は、例えば、場所を取ることが可能）VNSと分析の間に長い時間範囲と組み合わせる中等度の炎症性刺激に感謝を。 迷走神経刺激効果の根底にある分子機構、ならびに炎症性疾患の治療におけるその効率的な使用を理解すること、特に臨床的観点から、非常に重要です。確かに、方法論の利点は広範です。非常に高速な神経シグナルの性質のために、それが迅速かつ効果的です。サイトカインレベルに対する観察可能な効果は、例えば、1時間未満で起こります。 4、また、機械的な非侵襲的、および神経の経皮的刺激は、将来の通院と簡単に投与療法のための希望を与えて、使用することができます。最後に、定期的な治療に反して、迷走神経刺激は、内因性経路を使用しています。したがって、すべての薬物療法とは異なり、新しい薬が中に導入されませんボディに、それによって、任意の潜在的な副作用を回避することができます。

先天性免疫は、生物の広い範囲の感染および疾患に対する防御の即時の最初のラインを提供します。それは脅威を排除するための一次免疫応答を開始するだけでなく、それはまた、病原体特異的に二次免疫応答を行い、適応免疫を活性化し、教育において重要な役割を果たしています。炎症は順番に感染部位に他の免疫細胞を誘引する能力を持っていると、このような赤み、腫れ、痛み、機能の喪失、および発熱などの炎症の基本的兆候を誘導するサイトカインおよびケモカインの過多によって画策されました。期間や炎症の強さは、いくつかの要因に依存するが、炎症を解決し、恒常性を回復することは慢性炎症性疾患の発症を回避するための重要なステップです。神経科学および免疫学の分野における最近の進歩はINFLを制御するために巨大な治療的可能性を持つ特定の神経機構を解明してきました中枢神経系における及び末梢の両方でammation。これらのメカニズムのいずれかはまた、自律神経系4、5により駆動される炎症性の反射として知られているコリン作動性抗炎症経路（CAP）、です。 現在、炎症性メディエーターは、感覚神経を活性化し、中枢神経系に炎症の状態に関するシグナルを送ることを考えています。反射反応は、その後、遠心性迷走神経を介して活性化されます。 CAPの解剖学的詳細について鋭意研究がそれぞれ二つの神経、迷走神経および脾臓神経、6からなる副交感神経、交感神経モデルを明らかにしました。 CAPにおいて、活性化されたコリン作動性遠心性迷走神経は、まだ探求される機構によってアドレナリン脾臓神経の活性化をもたらす、セリアック病、腸間膜神経節で終わります。このようにして活性化脾臓神経は、内側にはよく知られています白色パルプ、マージナルゾーン、および脾臓の赤脾髄、CAP 7,8の主及び必須の器官における免疫細胞に近接しvate。脾臓神経終末からのノルエピネフリン（NE）は、脾臓Tリンパ球上に発現される、対応するβ2アドレナリン受容体に結合します。これは、今度は、それによりサイトカイン産生および炎症2を限定マクロファージ上のα7ニコチン性アセチルコリン受容体（α7nACh）を、活性化コリンアセチルトランスフェラーゼ（ChAT）媒介性アセチルコリン（ACH）放出を誘導します。したがって、神経系は、末梢組織に炎症を調節すると、局所免疫恒常性を復元することが可能であることが明らかです。 経路の名前が示すように、AChのシステムでは、この神経免疫調節経路の機能に中心的な重要性です。興味深いことに、メカニズムは、の活性化に関与しますCAPは、周囲の中枢神経系で異なるように見えます。脾臓中のニコチン性受容体（α7nAChR）の重要性は以前9が実証されてきたが、ムスカリン受容体（のmAChR）は経路10、11の中心活性のために必須です。致死マウス内毒素血症時より最近、中枢作用性M1ムスカリン性アゴニストの末梢投与が有意に抑制血清および脾臓腫瘍壊死因子α（TNFα）、12シグナリング無傷の迷走神経及び脾臓神経を必要なアクション。我々はまた、プロスタグランジンE 2（PGE 2）を欠損したマウスは、迷走神経刺激に応答し、血清および脾臓3におけるサイトカインのLPS誘導性の解放をダウンレギュレートしませんでしたができなかったことが最近示されています。したがって、CAPは、メインアセチルコリンpathw以外のシステムにより調節されるかもしれませんAY。 迷走神経は、理由は体内での放浪もちろん、肝臓、肺、脾臓、腎臓、および腸13を含む主要臓器を支配などの名前が挙がっています。この大規模な神経支配と迷走神経の非常に強力な免疫抑制効果を考慮すると、CAPの治療可能性は、炎症状態の広い範囲をカバーできます。迷走神経は、体に加えない薬剤と、電気的に（または機械的に）活性化され、電圧および周波数の制御と、従来の治療法とは逆であってもよいです。試験は、慢性炎症14を治療する際のVNSの臨床的意義をテストするために、例えば、リウマチ患者では、現在進行中です。要するに、炎症の神経免疫通信および調節は、従来の治療に対する可能な代替治療を提供しており、現在調査中です。そのため、迷走神経の分析stimulation個の異なる神経支配器官における効果が、慢性炎症の動物モデルでの潜在的な治療行為のも特徴づけは、間違いなく洞察を与え、新しい潜在的な治療標的のために望んでいるだろう。 トレイシーと同僚4によって開発されたオリジナルの方法論が原因（LPSの致死量によって）炎症反応の過剰刺激とCAPの活性化と読み出しの間にあまりにも短い時間帯に研究の私たちのフィールドに置き換えることができませんでした。本論文では、我々は、元のプロトコルに対する変更を提示サイトカインレベル上の2つの異なる方法を比較し、標的臓器（脾臓）に新しい反対観察を強調表示します。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="665">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Computer</td>
			<td style="width:91px;">Toshiba</td>
			<td style="width:136px;">-</td>
			<td style="width:191px;">Any computer is actually compatible</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">MP-150 data acquisition system</td>
			<td style="width:91px;">Biopac Systems</td>
			<td rowspan="2" style="width:136px;">MP150WSW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Acknowledge software</td>
			<td style="width:91px;">Biopac Systems</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Mice C57Bl/6</td>
			<td style="width:91px;">Charles River</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Anesthetic machine</td>
			<td style="width:91px;">Simtec Engineering</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Medical oxygen bottle</td>
			<td style="width:91px;">AGA</td>
			<td style="width:136px;">107563</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Medical air bottle&#160;</td>
			<td style="width:91px;">AGA</td>
			<td style="width:136px;">108639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Vetflurane (1000mg/g)</td>
			<td style="width:91px;">Virbac</td>
			<td style="width:136px;">137317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">LPS</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">L2630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Saline</td>
			<td style="width:91px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:136px;">1024060080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">PBS 10X</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">P5493</td>
			<td>Diluted 10 times for used concentration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Syringe (1 ml)</td>
			<td style="width:91px;">BD Plastipak</td>
			<td style="width:136px;">303172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Needles 23G</td>
			<td style="width:91px;">KD-FINE</td>
			<td style="width:136px;">900284</td>
			<td>0.6 x 30 mm (blue)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Microdissecting forceps (curved)</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">F4142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Dissecting scissors</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">Z265969</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Surgical suture 4-0</td>
			<td style="width:91px;">Ethicon</td>
			<td style="width:136px;">G667G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Euthanasia unit</td>
			<td style="width:91px;">Euthanex Smartbox</td>
			<td style="width:136px;">EA-32000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Cavilon No Sting Barrier Film</td>
			<td style="width:91px;">3M Health Care</td>
			<td style="width:136px;">3346N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">TH1/TH2 9-Plex assay, ultrasensitive kit</td>
			<td style="width:91px;">MesoScale Discovery</td>
			<td style="width:136px;">K15013C-1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

increased recovery time and decreased lps administration to study the vagus nerve stimulation mechanisms in limited inflammatory responses

Inflammation is a local response to infection and tissue damage mediated by activated macrophages, monocytes, and other immune cells that release cytokines and other mediators of inflammation. For a long time, humoral and cellular mechanisms have been studied for their role in regulating the immune response, but recent advances in the field of immunology and neuroscience have also unraveled specific neural mechanisms with interesting therapeutic potential. The so-called cholinergic anti-inflammatory pathway (CAP) has been described to control innate immune responses and inflammation in a very potent manner. In the early 2000s, Tracey and collaborators developed a technique that stimulates the vagus nerve and mimics the effect of the pathway. The methodology is based on the electrical stimulation of the vagus nerve at low voltage and frequency, in order to avoid any side effects of overstimulation, such as deregulation of heart rate variability. Electrical devices for stimulation are now available, making it easy to set up the methodology in the laboratory. The goal of this research was to investigate the potential involvement of prostaglandins in the CAP. Unfortunately, based on earlier attempts, we failed to use the original protocol, as the induced inflammatory response either was too high or was not suitable for enzymatic metabolism properties. The different settings of the original surgery protocol remained mostly unchanged, but the conditions regarding inflammatory induction and the time point before sacrifice were improved to fit our purposes (i.e., to investigate the involvement of the CAP in more limited inflammatory responses). 
The modified version of the original protocol, presented here, includes a longer time range between vagus nerve stimulation and analysis, which is associated with a lower induction of inflammatory responses. Additionally, while decreasing the level of lipopolysaccharides (LPS) to inject, we also came across new observations regarding mechanistic properties in the spleen.

手術後の経過時間を増加し、LPSの投与量を減少した後、TNFαおよびインターロイキン-1β（IL-1β）のレベル先に示したように、元のプロトコルを使用して、VNSは、TNFαのレベルおよびIL-1β（360.0±40.21 PG / MGに（39.7±10.8 PG / VNSのMg、P &lt;0.001対SHAMで169.3±24.9 PG / mg）を減少しました腹腔内LPS注射（15ミリグラム/ kg）を（ 図2A）後の脾臓におけるVNSにおける191.7±27.2 PG / mgで、P &lt;0.01）に対するSHAM。 6時間に1から、分析のために時間を変えて15 2 / kgでのLPSの投与量を減少した後、我々は、TNFαに対するVNSの効果を観察した（13.67±1.81で8.82±1.20 PG / mgの対SHAMに/ mgのPG VNS、P &lt;0.05）、IL-1βは影響されなかった（368.62±35.65 304.99±43.54 PG / mgの対SHAMにおけるPG / MG）（ 図2B）。任意のLPS INJなしection（ すなわち、生理食塩水）、差はVNS（ 図2C）の後に検出することができませんでした。 異なる条件を使用VNS後の脾臓におけるケラチノサイト走化性/ヒト成長調節性癌遺伝子（KC / GRO）のレベル元のプロトコルでは、我々はKC / GROが強くVNS（ 図3A）（VNSにおける416.4±29.7 PG / mgで、P &lt;0.001対SHAMで597.4±17.8 PG / MG）によってダウンレギュレートされることを示しました。 VNSは、例えば、TNFαに依然として強力であるLPSの6時間の時点及び2mg / kgのを使用して、変更は、SHAMとVNS動物（ 図3B）との間で観察されませんでした。何LPSが6時間の時点のために注入されなかった場合しかし、我々は、VNSを以下KC / GROの強いアップレギュレーションを観察した（141.22±10.56 PG / VNSのMg、P &lt;0.001対SHAMに/ mgで59.37±4.29 PG ）（ 図3C）。予想通り、ほとんどの他のサイトカイン（TNFα、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IL-12、およびIFNγ）は、非常に低いレベル（検出可能な場合）であって、差はSHAMとの間に見られませんでしたそして、VNS刺激による動物。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54890/54890fig1.jpg" /> 図1： 迷走神経刺激を実行するために必要な材料の写真。 A）I）コンピュータ、II）データ収集システム、およびiii）刺激電極装置。 B）迷走神経の下に配置される電極のクローズアップ。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54890/54890fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54890/54890fig2.jpg" /> 図2：脾臓EにおけるTNFαおよびIL-1βのレベルSHAMとVNS処理された動物のxtracts。 ）2mg / kgのLPSの腹腔内注射後15ミリグラム/ kgのLPS、B）6時間の回復の腹腔内注射後A）1時間の回復、及びC：動物は、以下の条件に従って、SHAMまたはVNS手術が施されますLPS注射なしで6時間の回復。レベルは、炎症性サイトカインでコーティングしたプレート上で測定し、組織のPG /ミリグラムとして表されます。データは平均±SEMとして表されています。アスタリスクは、VNSとSHAMマウスとの間の統計的差異（各群においてN = 8）を示します。スチューデントのt検定* pを&lt;0.05; ** P &lt;0.01; *** P &lt;0.001。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54890/54890fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/54890/54890fig3.jpg" /> 図3：Sp の中KC / GROのレベルSHAMとVNS処理された未処理マウスのLEEN抽出。 ）2mg / kgのLPSの腹腔内注射後15ミリグラム/ kgのLPS、B）6時間の回復の腹腔内注射後A）1時間の回復、及びC：動物は、以下の条件に従って、SHAMまたはVNS手術が施されますLPS注射なしで6時間の回復。レベルは、炎症性サイトカインでコーティングしたプレート上で測定し、組織のPG /ミリグラムとして表されます。データは平均±SEMとして表されています。アスタリスクは、VNSとSHAMマウスとの間の統計的差異（各群においてN = 8）を示します。スチューデントのt検定*** P &lt;0.001。

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Increased Recovery Time and Decreased LPS Administration to Study the Vagus Nerve Stimulation Mechanisms in Limited Inflammatory Responses

Vagus nerve stimulation has proven to have a strong efficacy for decreasing peripheral inflammation. Here, we present a modified vagus nerve stimulation protocol that allows for further examinations of the cholinergic anti-inflammatory mechanisms in limited inflammatory responses.

回復時間の増加とリミテッド炎症反応における迷走神経刺激メカニズムを研究するためにLPSの管理を減少

Inflammation is a local response to infection and tissue damage mediated by activated macrophages, monocytes, and other immune cells that release ...

increased-recovery-time-decreased-lps-administration-to-study-vagus

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.8K ビュー.  Karolinska University Hospital. Vagus nerve stimulation has proven to have a strong efficacy for decreasing peripheral inflammation. Here, we present a modified vagus nerve stimulation protocol that allows for further examinations of the cholinergic anti-inflammatory mechanisms in limited inflammatory responses.

ビデオ: Increased Recovery Time and Decreased LPS Administration to Study the Vagus Nerve Stimulation Mechanisms in Limited Inflammatory Responses

Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice to colitis. If the gene-of-interest is expressed in both bone marrow derived cells and non-bone marrow derived cells of the host; however, it is possible to differentiate the role of a gene of interest in bone marrow derived cells and non- bone marrow derived cells by bone marrow transplantation technique. To change the bone marrow derived cell genotype of mice, the original bone marrow of recipient mice were destroyed by irradiation and then replaced by new donor bone marrow of different genotype. When wild-type mice donor bone marrow was transplanted to knockout mice, we could generate knockout mice with wild-type gene expression in bone marrow derived cells. Alternatively, when knockout mice donor bone marrow was transplanted to wild-type recipient mice, wild-type mice without gene-of-interest expressing from bone marrow derived cells were produced. However, bone marrow transplantation may not be 100% complete. Therefore, we utilized cluster of differentiation (CD) molecules (CD45.1 and CD45.2) as markers of donor and recipient cells to track the proportion of donor bone marrow derived cells in recipient mice and success of bone marrow transplantation. Wild-type mice with CD45.1 genotype and knockout mice with CD45.2 genotype were used. After irradiation of recipient mice, the donor bone marrow cells of different genotypes were infused into the recipient mice. When the new bone marrow regenerated to take over its immunity, the mice were challenged by chemical agent (dextran sodium sulfate, DSS 5%) to induce colitis. Here we also showed the method to induce colitis in mice and evaluate the role of the gene of interest expressed from bone-marrow derived cells. If the gene-of-interest from the bone derived cells plays an important role in the development of the disease (such as colitis), the phenotype of the recipient mice with bone marrow transplantation can be significantly altered. At the end of colitis experiments, the bone marrow derived cells in blood and bone marrow were labeled with antibodies against CD45.1 and CD45.2 and their quantitative ratio of existence could be used to evaluate the success of bone marrow transplantation by flow cytometry. Successful bone marrow transplantation should show a vast majority of donor genotype (in term of CD molecule marker) over recipient genotype in both the bone marrow and blood of recipient mice.

Bone marrow transplantation provides a way to change the genotype of the bone marrow derived cells. If the gene of interest is expressed in both bone marrow derived cells and non-bone marrow derived cells, bone marrow transplantation can change the bone marrow derived cells to a different genotype without changing the non-bone marrow derived cell genotype.

骨髄移植によるマウス大腸炎における免疫および非免疫細胞からの遺伝子発現の機能的役割を差別化

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice ...

免疫・感染学

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing the mucosal surface of the nasopharynx, where it can reside, multiply and eventually overcome host defences to invade to other tissues of the host. Establishment of an infection in the normally lower respiratory tract results in pneumonia. Alternatively, the bacteria can disseminate into the bloodstream causing bacteraemia, which is associated with high mortality rates2, or else lead directly to the development of pneumococcal meningitis. Understanding the kinetics of, and immune responses to, nasopharyngeal colonization is an important aspect of S. pneumoniae infection models.
Our mouse model of intranasal colonization is adapted from human models3 and has been used by multiple research groups in the study of host-pathogen responses in the nasopharynx4-7. In the first part of the model, we use a clinical isolate of S. pneumoniae to establish a self-limiting bacterial colonization that is similar to carriage events in human adults. The procedure detailed herein involves preparation of a bacterial inoculum, followed by the establishment of a colonization event through delivery of the inoculum via an intranasal route of administration. Resident macrophages are the predominant cell type in the nasopharynx during the steady state. Typically, there are few lymphocytes present in uninfected mice8, however mucosal colonization will lead to low- to high-grade inflammation (depending on the virulence of the bacterial species and strain) that will result in an immune response and the subsequent recruitment of host immune cells. These cells can be isolated by a lavage of the tracheal contents through the nares, and correlated to the density of colonization bacteria to better understand the kinetics of the infection.

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Colonization of the murine nasopharynx with Streptococcus pneumoniae and the subsequent extraction of adherent or recruited cells is described. This technique involves flushing the nasopharynx and collection of the fluid through the nares and is adaptable for various readouts, including differential cell quantification and analysis of mRNA expression in situ.

肺炎球菌による鼻腔内コロニー形成時の炎症反応の特徴

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing ...

Transplantation of Tail Skin to Study Allogeneic CD4 T Cell Responses in Mice

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and host T cells, to easily monitor the graft, and to adapt the system in order to answer different immunological questions. Medawar and colleagues established allogeneic tail-skin transplantation in mice in 1955. Since then, the skin transplantation model has been continuously modified and adapted to answer specific questions. The use of tail-skin renders this model easy to score for graft rejection, requires neither extensive preparation nor deep anesthesia, is applicable to animals of all genetic background, discourages ischemic necrosis, and permits chemical and biological intervention. 
In general, both CD4+ and CD8+ allogeneic T cells are responsible for the rejection of allografts since they recognize mismatched major histocompatibility antigens from different mouse strains. Several models have been described for activating allogeneic T cells in skin-transplanted mice. The identification of major histocompatibility complex (MHC) class I and II molecules in different mouse strains including C57BL/6 mice was an important step toward understanding and studying T cell-mediated alloresponses. In the tail-skin transplantation model described here, a three-point mutation (I-Abm12) in the antigen-presenting groove of the MHC-class II (I-Ab) molecule is sufficient to induce strong allogeneic CD4+ T cell activation in C57BL/6 mice. Skin grafts from I-Abm12 mice on C57BL/6 mice are rejected within 12-15 days, while syngeneic grafts are accepted for up to 100 days. The absence of T cells (CD3-/- and Rag2-/- mice) allows skin graft acceptance up to 100 days, which can be overcome by transferring 2 x 104 wild type or transgenic T cells. Adoptively transferred T cells proliferate and produce IFN-&#947; in I-Abm12-transplanted Rag2-/- mice.

Tail-skin transplantation is a powerful model for studying T cell-dependent rejection and tolerance induction during allogeneic immune responses in mice. The advantages of this protocol are minor invasive surgery, and ease of monitoring with no need to sacrifice the recipient mouse.

マウスにおける同種のCD4 T細胞応答を研究する尾皮膚の移植

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and ...

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific locked nucleic acid (LNA) and molecular beacon (MB) probes, transcript standards, automated multichannel pipetting, and plate drying. Determining expression among the type I interferons (IFN), especially the twelve IFN-&#945; subtypes, is limited by their shared sequence identity; likewise, the sequences of the type III IFN, especially IFN-&#955;2 and -&#955;3, are highly similar. This assay provides a reliable, reproducible, and relatively inexpensive means to analyze the expression of the seventeen interferon subtype transcripts.

This protocol describes a high-throughput qRT-PCR assay for the analysis of type I and III IFN expression signatures. The assay discriminates single base pair differences between the highly similar transcripts of these genes. Through batch assembly and robotic pipetting, the assays are consistent and reproducible.

ハイスループット定量的リアルタイムRT-PCRアッセイのタイプIおよびIIIインターフェロンサブタイプの発現プロファイルを決定するための

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the physiological mechanisms that mediate immune responses to vaccines perhaps due to the overall success of vaccination, which has reduced interest into the molecular and physiological mechanisms of vaccine immunity. However, several important human pathogens including influenza virus still pose a challenge for vaccination, and may benefit from immune-based strategies. 
Although influenza reverse genetics has been successfully applied to the generation of live-attenuated influenza vaccines (LAIVs), the addition of molecular tools in vaccine preparations such as tracer components to follow up the kinetics of vaccination in vivo, has not been addressed. In addition, the recent generation of mouse models that allow specific depletion of leukocytes during kinetic studies has opened a window of opportunity to understand the basic immune mechanisms underlying vaccine-elicited protection. Here, we describe how the combination of reverse genetics and chimeric mouse models may help to provide new insights into how vaccines work at physiological and molecular levels, using as example a recombinant, cold-adapted, live-attenuated influenza vaccine (LAIV). We utilized laboratory-generated LAIVs harboring cell tracers as well as competitive bone marrow chimeras (BMCs) to determine the early kinetics of vaccine immunity and the main physiological mechanisms responsible for the initiation of vaccine-specific adaptive immunity. In addition, we show how this technique may facilitate gene function studies in single animals during immune responses to vaccines. We propose that this technique can be applied to improve current prophylactic strategies against pathogens for which urgent medical countermeasures are needed, for example influenza, HIV, Plasmodium, and hemorrhagic fever viruses such as Ebola virus.

There is an overall lack of knowledge about how vaccines work. Here we propose the combined use of reverse genetics and bone marrow chimeric mice to gain insight into the early host immune responses to vaccines with a special focus on dendritic cells and T cell immunity.

キメラマウスモデルにおける組換えインフルエンザワクチンの鼻腔内投与は、粘膜免疫を研究するために、

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

Intra-tracheal Administration of Haemophilus influenzae in Mouse Models to Study Airway Inflammation

Here, we describe a detailed procedure to efficiently and directly deliver Haemophilus influenzae into the lower respiratory tracts of mice. We demonstrate the procedure for preparing H. influenzae inoculum, intra-tracheal instillation of H. influenzae into the lung, collection of broncho-alveolar lavage fluid (BALF), analysis of immune cells in the BALF, and RNA isolation for differential gene expression analysis. This procedure can be used to study the lung inflammatory response to any bacteria, virus or fungi. Direct tracheal instillation is mostly preferred over intranasal or aerosol inhalation procedures because it more efficiently delivers the bacterial inoculum into the lower respiratory tract with less ambiguity.

Intra-tracheal Administration of Haemophilus influenzae in Mouse Models to Study Airway Inflammation

We demonstrate the procedure for intra-tracheal inoculation of Haemophilus influenzae into the lower respiratory tracts of mice. This is a very useful tool to study signaling pathways that regulate airway inflammation in mouse models.

の気管内の管理<em&gt;インフルエンザ菌</em&gt;マウスモデルにおいて気道炎症を研究します

Here, we describe a detailed procedure to efficiently and directly deliver Haemophilus influenzae into the lower respiratory tracts of mice. We ...

Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents autoimmunity. Many approaches involving different model organisms have been utilized to understand the mechanisms controlling helper T cell development and function. However, studies using mouse models have proven to be highly informative due to the availability of genetic, cellular, and biochemical systems. One genetic approach in mice used by many labs involves retroviral transduction of primary helper T cells. This is a powerful approach due to its relative ease, making it accessible to almost any laboratory with basic skills in molecular biology and immunology. Therefore, multiple genes in wild type or mutant forms can readily be tested for function in helper T cells to understand their importance and mechanisms of action. We have optimized this approach and describe here the protocols for production of high titer retroviruses, isolation of primary murine helper T cells, and their transduction by retroviruses and differentiation toward the different helper subsets. Finally, the use of this approach is described in uncovering mechanisms utilized by microRNAs (miRNAs) to regulate pathways controlling helper T cell development and function.

Many experimental systems have been utilized to understand the mechanisms regulating T cell development and function in an immune response. Here a genetic approach using retroviral transduction is described, which is economic, time efficient, and most importantly, highly informative in identifying regulatory pathways.

遺伝的分化を制御するメカニズムを研究するためのアプローチと機能などのヘルパーT細胞のレトロウイルス形質導入

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents ...

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses

Airway inflammation is often associated with bacterial infections and represents a major determinant of lung disease. The in vivo determination of the pro-inflammatory capabilities of various factors is challenging and requires terminal procedures, such as bronchoalveolar lavage and the removal of lungs for in situ analysis, precluding longitudinal visualization in the same mouse. Here, lung inflammation is induced through the intratracheal instillation of Pseudomonas aeruginosa culture supernatant (SN) in transiently transgenized mice expressing the luciferase reporter gene under the control of a heterologous IL-8 bovine promoter. Luciferase expression in the lung is monitored by in vivo bioluminescent image (BLI) analysis over a 2.5- to 48-h timeframe following the instillation. The procedure can be repeated multiple times within 2 - 3 months, thus permitting the evaluation of the inflammatory response in the same mice without the need to terminate the animals. This approach permits the monitoring of pro- and anti-inflammatory factors acting in the lung in real time and appears suitable for functional and pharmacological studies.

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses

The method described here allows for the visualization of IL-8 promoter-dependent inflammation activation in the lungs of mice through non-invasive bioluminescence imaging (BLI). The same animal can be subjected to BLI multiple times for up to two months from the time of delivery of the luciferase reporter construct.

IL-8トランジェントトランスジェニックマウスモデル<em&gt;インビボ</em&gt;炎症反応の長期モニタリング

Airway inflammation is often associated with bacterial infections and represents a major determinant of lung disease. The in vivo determination of the ...

Screening Assays to Characterize Novel Endothelial Regulators Involved in the Inflammatory Response

The endothelial layer is essential for maintaining homeostasis in the body by controlling many different functions. Regulation of the inflammatory response by the endothelial layer is crucial to efficiently fight against harmful inputs and aid in the recovery of damaged areas. When the endothelial cells are exposed to an inflammatory environment, such as the outer component of gram-negative bacteria membrane, lipopolysaccharide (LPS), they express soluble pro-inflammatory cytokines, such as Ccl5, Cxcl1 and Cxcl10, and trigger the activation of circulating leukocytes. In addition, the expression of adhesion molecules E-selectin, VCAM-1 and ICAM-1 on the endothelial surface enables the interaction and adhesion of the activated leukocytes to the endothelial layer, and eventually the extravasation towards the inflamed tissue. In this scenario, the endothelial function must be tightly regulated because excessive or defective activation in the leukocyte recruitment could lead to inflammatory-related disorders. Since many of these disorders do not have an effective treatment, novel strategies with a focus on the vascular layer must be investigated. We propose comprehensive assays that are useful to the search of novel endothelial regulators that modify leukocyte function. We analyze endothelial activation by using specific expression targets involved in leukocyte recruitment (such as, cytokines, chemokines, and adhesion molecules) with several techniques, including: real-time quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR), western-blot, flow cytometry and adhesion assays. These approaches determine endothelial function in the inflammatory context and are very useful to perform screening assays to characterize novel endothelial inflammatory regulators that are potentially valuable for designing new therapeutic strategies.

Vascular endothelium tightly controls leukocyte recruitment. Inadequate leukocyte extravasation contributes to human inflammatory diseases. Therefore, searching for novel regulatory elements of endothelial activation is necessary to design improved therapies for inflammatory disorders. Here, we describe a comprehensive methodology to characterize novel endothelial regulators that can modify leukocyte trafficking during inflammation.

炎症反応に関与する新規血管内皮レギュレータを特徴付けるための試金をスクリーニング

The endothelial layer is essential for maintaining homeostasis in the body by controlling many different functions. Regulation of the inflammatory ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. typhimurium bacteria are quickly detected and phagocytized by macrophages, and contained in vesicles known as phagosomes in order to be degraded. Isolation of S. typhimurium-containing phagosomes have been widely used to study how S. typhimurium infection alters the process of phagosome maturation to prevent bacterial degradation. Classically, the isolation of bacteria-containing phagosomes has been performed by sucrose gradient centrifugation. However, this process is time-consuming, and requires specialized equipment and a certain degree of dexterity. Described here is a simple and quick method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin-streptavidin-conjugated magnetic beads. Phagosomes obtained by this method can be suspended in any buffer of choice, allowing the utilization of isolated phagosomes for a broad range of assays, such as protein, metabolite, and lipid analysis. In summary, this method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes is specific, efficient, rapid, requires minimum equipment, and is more versatile than the classical method of isolation by sucrose gradient-ultracentrifugation.

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

We describe here a simple and quick method for the isolation of Salmonella typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin and streptavidin.