RUM Amerikan Kalp Derneği Öncesi doktora bursu (14PRE18560010) tarafından finanse edildi. Araştırma Amerikan Kalp Derneği Scientist Kalkınma Grant (13SDG14270009) &amp; SS NIH (1DP2 CA186752-01 ve 1-R01-GM-105646-01-A1) tarafından finanse edildi

1. DNA hazırlama <ol><li> Tasarım sensörü modüler klonlama şemasını kullanarak oluşturur. Daha önce 1 ayrıntılı β 2 -AR sensör tasarımı başvurun. </li><li> 1.9, 260 / 2.0 bir 230 - - 2.29, 260 / 1.7 280 ticari bir miniprep kiti protokolüne göre DNA hazırlamak ve konsantrasyon ≥ de, 2 mM Tris-HCI çözeltisi pH 8, 750 ng / | il elüte. </li></ol> 2. Hücre kültürü preparasyonu <ol><li> ile takviye edilmiş 4.5 g / L D-glikoz, ihtiva eden DMEM içinde kültür HEK-293T-Flp n hücreleri% 10 FBS (ısıyla aktifliği giderilmiş) (hac / hac),% 1 L-glutamin ek, 20 mM HEPES, pH 7.5, 37 ° C&#39;de % 5 CO2 de nemli bir atmosferde ° C. sonraki adımlar için biyolojik güvenlik kabini hücreleri anlaştım. </li><li> Hücreler altı kuyu yemekleri içine Pasajlanması önce konfluent tek tabaka büyümeye izin verin. confluency ulaşmak için zaman ilk kaplama yoğunluğuna bağlıdır. Kullanım plakaları1 içinde birleştirilmek üzere gelecek - için kaplama 2 gün altı-iyi kaplama. Bir birleşik, 10 cm doku kültürü ile muamele edilmiş çanak yaklaşık 4 x 10 6 hücre / ml hücre yoğunluğuna sahiptir. Hücre kültürü büyüme görüntü için Bkz: Şekil 1. </li><li> 10 ml PBS ile hücreleri yıkayın ve% 0.25 tripsin ile trypsinize (Tartışma, paragraf 2&#39;ye bakınız). Levha 8 x 10 5 hücre / göz dokusu ortam 2 ml altı iyi yemekler kültürü ile işlenmiş ve 16 yapışmaya izin - 20 saat süredir. </li></ol> 3. Transfeksiyon koşulları <ol><li> (- 36 saat 20 arasında) optimal ekspresyonu başarmak üzere farklı süreler gerektirir yapıları için transfections yerleştiriniz. birleşik deney süresi şartları senkronize. Ayrıca bir untransfected kontrol de eşdeğer hücre yoğunluğu analizi sırasında arka plan gürültü ve saçılma çıkarma için kullanılmalıdır. </li><li> Oda sıcaklığına transfeksiyon reaktifleri getirmek: düşük serum ortamı, DNA transfeksiyon reaktifi. </li><li> İçindebiyolojik güvenlik kapağı aşağıdaki sırada steril mikrosantrifüj tüpü içinde reaktif birleştirir: 100 ul düşük serum ortamında 2 ug DNA karıştırın. Karışımın yüzey veya tüp yan dokunmadan medya / DNA karışımı içine transfeksiyon reaktif 6 ul Spike. kuyu başına bir transfeksiyon reaksiyonu ayarlayın. Tutarlı ekspresyon seviyelerini elde etmek için (transfeksiyon reaktifi 6 ul - 3 - DNA 4 ug 1) Transfeksiyon koşulları optimize edilebilir. Daha fazla optimize edilmiş oranları için Tablo 1&#39;e bakınız. </li><li> 30 dakika - 15 biyolojik güvenlik kabini, oda sıcaklığında inkübe karışımı. 30 dakika boyunca inkübasyona bırakıldı halinde reaksiyon kullanmayın. </li><li> karşısında iyi damla damla bir şekilde hücrelere reaksiyonu ekleyin ve hafifçe iyice karışmasını sağlamak için altı-iyi sallayın. oyuk başına bir reaksiyon ekleyin. </li><li> İfade, 20 saat sonra monitör floresans doku kültür floresan mikroskop kullanılarak. 40X bir hücrede 10X objektif ve protein lokalizasyonu ile nüfus ifadesini değerlendirmek. obsplazma zarı (PM) protein ekspresyonu için erve. önemli içselleştirilmesi kaydetti edilirse önemli ifade PM tespit edilinceye kadar, transfeksiyon monitör. </li></ol> 4. Reaktif ve Ekipmanları Hazırlık <ol><li> -80 ° C de 100 mM ilaç stokları ve mağaza hazırlayın: isoproterenol bitartarat (100 mM, 300 mM askorbik asit ihtiva eden dH 2 O). hemen soğuk oda ve flaş dondurucuda / buz üzerinde yapın. Alikot yapılmış ve bir yıla kadar kullanılabilmektedir. </li><li> Celi tamponu hazırlayın (~ 2 mL / durumu), bir 37 ° C su banyosu içinde saklayın. Her gün taze olun. Hücre Tampon bileşenleri için referans Tablo 2. </li><li> İlaç tamponu (10 mi) Hazırlama ve oda sıcaklığında saklayın. İlaç Tampon bileşenleri için referans Tablo 2. </li><li> Asit, konsantre HCI kullanılarak küvetler yıkayın. Zayıf bir baz (1 M KOH) ile nötralize ve iyice DH 2 O. ile küvetler yıkayın </li><li> Birkaç ile florometre etrafında iş istasyonu hazırlayın10, 200 ve 1000 ul pipet uçları, ultra saf H 2 O ile 10 dk geri sayım, küvet temizliği için ipuçları, narin görev mendil ile erişilebilir bir vakum hattına ve fışkırtma şişesi ile ayarlanmış bir zamanlayıcı kutu </li><li> florimetre ve ısı bloğu ile 37 ° C için harici su banyosu ısıtın. </li><li> Florometre açın; 430 nm, bant geçiren 8 nm eksitasyon için OBP toplama floresan toplama programını ayarlamak; emisyon aralığı 450 nm - 600 nm, bant geçiren 4 nm. 600 nm, bant geçiren 4 nm - sadece sensör kontrolü gibi YFP koleksiyonu için 490 nm, bandpass 8 nm, emisyon aralığında 500 set uyarma (Tartışma bakınız). CFP toplama ayarları Bu deneyde, bir FRET spektrumu elde etmek için kullanılır. </li><li> Şekil 2&#39;de gösterildiği gibi, ısı bloğu on 1.5 ml mikrosantrifüj tüpleri yerleştirin. Bu tüpler hücre kısım tüpleri için sahibidir (500 ul mikrosantrifüj tüpler.) Burada yer küvetler minder sahipleri 1 ve 7 doku küçük bir parça yerleştirin. Not: Tedavi edilmemiş durumda ve çapraz bulaşmayı önlemek için ilaç durum için ayrı küvetler kullanın. </li></ol><img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54696/54696fig2.jpg" /> Şekil 2. Mikrosantrifüj Tüp Kurma ve işlenmemiş numuneler için ısı Blok Cuvette pozisyon Referans 1 konumunda olduğunu.; Hücre kısım tüpleri 2 konumlarında - ilaç verilen örnekler için 6. Küvet konum 7&#39;de olduğu; Hücre kısım tüpleri pozisyonlarda 8 - 12. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54696/54696fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <ol start="9"><li> mini 37 ° C su banyosu oluşturmak için su ~ 750 ul 12 - 6 ve 8 - tutucuları 2 doldurun. </li><li> mini su banyoları (- 6, 8-12 sahipleri 2) içine hücre alikotları on 500 ul mikrosantrifüj tüpleri yerleştirin. Her tüp (untreate 5 durumun bireysel tekrar olacakD, tedavi edilen 5 ilaç). </li><li> İfade hücreleri Monitör (adım 3.6). </li></ol> 5. Deney ve Veri Toplama <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54696/54696fig3.jpg" /> Şekil 3. Deneysel şematik. Deneysel için ayrıntılı adım adım rehber yukarı ve yürütme ayarlayın. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54696/54696fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <ol><li> Deneysel şematik için referans Şekil 3. Hücreler floresan mikroskop ile tespit protein ifadesine dayalı, hasat için hazır olduğunuzda (Tartışma, paragraf 4): biyolojik güvenlik kabini, hafifçe bir P1,000 ile kültüründe ~ 1 medyanın ml, tekrar süspansiyon hücreleri çıkarmak ve tabanda transferi 1.5 ml mikrosantrifüj tüp içine. Not: N-ucunu sindirmek ve olabilir tripsin kullanmaktan kaçının /ya GPCR sensörünün bağlayıcı cebinde. </li><li> yeniden süspansiyon uygun hücre yoğunluğu sağlamak için hücre sayımı. 4 x 10 6 hücre / ml tabanda hacmi optimize edin. </li><li> 3 dakika boyunca, oda sıcaklığında, 290 xg sallanan kovalı bir santrifüj hücreleri dönerler. santrifüj sonra süpernatantı. </li><li> Yavaşça (37 ° C&#39;de saklanan), 1 ml hücre tamponu içinde tekrar süspansiyon hücreleri ve adım 5.3 tekrarlayın. İkinci spin sırasında, -80 ° C ila 100 mM ilaç stok kısım toplamak. 1 mM çalışma hisse senedi için İlaç Tampon 100 seyreltme ve oda sıcaklığında tutmak: 1 olun. </li><li> İkinci santrifüj işleminden sonra hücre tamponu (4 x 10 6 hücre / mL), 1 ml supernatant ve yavaşça tekrar süspansiyon hücreleri çıkarmak. Hücre 1 ml ve boş olarak hücre 1 ml tampon ile spektrofotometre örnek Ölçü OD 600. Bir tek kullanımlık plastik küvete hücreleri koyun ve hemen spektrofotometri ardından mikrosantrifüj tüp geri aktarın. </li><li> Bir kontrol edilmemiş Cep telefonl koşulu spektrumu, nazikçe, P1,000 pipet ile 1 ml Hücre Tampon untransfected hücrelerin tekrar süspansiyon küvete ve uyarma 430 nm FRET spektrumunu elde etmek için hücrelerin 90 ul ekleyin, bant geçiren 8 nm, emisyon 450-600 nm, bant geçiren 4 nm. Hücrelerin taze 90 ul 5 tekrar spektrumları - 3 toplayın. Örnekler arasında ultra saf H2O ile küvet, özellikleri arasında, 37 ° C&#39;de hücre stok tutmak her bir örnek kısım arasında P1,000 nazikçe tekrar süspansiyon ve çalkalayın. </li><li> 6, 8 - - ısı bloğu 12 deneysel koşullar, kısım 90 tutucular 2 500 ul tüplerin her birine transfekte edilmiş hücrelerin uL. Yavaşça her kısım arasındaki P1,000 pipet ile hücrelerin stok tekrar süspansiyon. </li><li> tedavisiz örnekleri için 6 - hücreleri aliquoted sonra, 2 tüpler için İlaç Tampon 10 ul ekleyin. </li><li> boru 8 içine doğru 1 mM ilaç çözeltisinin 10 ul ekleyerek deney başlar, 10 dakika geri sayım ve yavaşça P200 pipetiyle tüp karıştırmak için zamanlayıcıyı başlatın. Yakın tüp ve 37 dönüşC ısıtma bloğu °. </li><li> Hemen (yeni bir uç kullanın) P200 ile hafifçe karıştırın, tüp 2 pick up tedavisiz küvete hücre süspansiyonu 90 ul ekleyin ve florometre yer. </li><li> 600 nm, bant geçiren 4 nm - uyarma 430 nm, bant geçiren 8 nm, emisyon 450 FRET spektrum kazanır. </li><li> 9 dk - 10 saniye, yavaşça, 1 mM ilaç çözeltisinin 10 ul tüp 9 spike P200 (yeni uç kullanın) ile karıştırmak ve blok ısı tüp döner. </li><li> tüp 10 ile tüp 3 ve 5.12 ile 5.11 - 5.10 tekrarlayın adımları. </li><li> Spektrumları tüm tedavisiz örnekleri için toplanır ve ilaç tüm uyuşturucu koşulu numunelere ilave edilene kadar 1 dakika aralıklarla (08:10, 07:10, vs.) 5.13 - Tekrar 5.10 adımları. çapraz bulaşmayı önlemek için her pipet adımı için yeni bir ucu kullanın. </li><li> 5 dk - 10 saniye, yavaşça P200 pipetiyle boru 8 (ilaç durum) karıştırılması başlar florometre ilaç ile muamele edilen numune ve yeri için ayrı küvete hücre süspansiyonu 90 ul ekle. </li><li> F edinmeRET spektrumu (ayarları için adım 5.11 bakınız). </li><li> Kalan ilaç durum örneklerinin (- 12 tüpler 9) için 1 dakika aralıklarla (04:10, 03:10, vs.) 5.16 - Tekrar 5.15 adımları. </li><li> Deney bittikten sonra, iyice ultra saf H2O ile küvetleri yıkayın, proje dosyalarını kaydetmek ve bir sonraki durum için tüpler re-stock. yıkama aşamasında çapraz bulaşmayı önlemek için özen gösterin. H2O şişe hem de yıkama arasında vakum hattında uç değiştirme. </li></ol> 6. Veri Analizi <ol><li> Kaydet ve KÜB&#39;de ihracat veri dosyaları analiz için kullanılacak biçimlendirmek. Analiz programları Sivaramakrishnan Lab yayın web sitesinden yüklenebilir. </li><li> analiz programları (v9, v15), untransfected örnekleri dosyaları (untransfected hücre spektrum toplama adım 5.6) veri girişi için, ÇIKIŞ veri dosyasını ve virgülle ayrılmış değerler (CSV) dosyaları içerir analiz yazılımı için yol dosyaları oluşturun. </li><li> Aşağıdaki bilgileri girinCSV dosyası içine dahil, her bir örnek için ilgili koşullar (Tablo 3&#39;te örneğe bakın) ve tayin: Dosya adı - bireysel SPC grafik dosyaları Reseptör - hangi GPCR yapı adayı test edilmiştir (örneğin, Β2) Bağlayıcı - adayı olan yapının peptit varyantı test edilmiştir (örneğin, S) Agonist - (N) muamele edilmemiş belirlemek ya da ilaç ile muamele edilmiş (D) koşullar Directory - SPC dosyaları genellikle, kaydedilmiş tarihe göre organize edildiği yolu klasör OD - spektrofotometreden numunenin kaydedilen optik yoğunluk </li><li> örneklerden tampon ve saçılma gürültü çıkarmak için untransfected numuneler (adım 5.6) için dosya adlarını girin. </li><li> analiz programı içine koşullarını girin. </li><li> Programları çalıştırma bireysel koşullarına (v9) içinde ve koşullar (v15) karşısında örnekleri analiz etmek. </li><li> veri kümesinde belirgin aykırı olan örnek dosyaları dışlamak veya artan ya Indivi OD değerini düşürerek çıkartma için ayarlamakİkili dosyaları. </li><li> erişmek için hesaplanan için ÇIKIŞ dosyasına İhracat verileri oranları (525 nm / 475 nm) FRET. </li><li> tedavi (ilaç) koşulları için bireysel FRET oranlarından işlenmemiş durum için ortalama FRET oranının çıkarılmasıyla elde ΔFRET hesaplayın. </li></ol>

<ol>
	<li>Malik, R. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+G+Protein-selective+G+Protein-coupled+Receptor+(GPCR)+Conformations+in+Live+Cells.">Detection of G Protein-selective G Protein-coupled Receptor (GPCR) Conformations in Live Cells.</a> J. Biol. Chem. 288, 17167-17178 (2013).</li><li>Oldham, W. M., Hamm, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterotrimeric+G+protein+activation+by+G-protein-coupled+receptors.">Heterotrimeric G protein activation by G-protein-coupled receptors.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Bio. 9, 60-71 (2008).</li><li>Rasmussen, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+&#946;2+adrenergic+receptor-Gs+protein+complex.">Crystal structure of the &#946;2 adrenergic receptor-Gs protein complex.</a> Nature. 477, 549-555 (2011).</li><li>Alexander, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energetic+analysis+of+the+rhodopsin-G-protein+complex+links+the+&#945;5+helix+to+GDP+release.">Energetic analysis of the rhodopsin-G-protein complex links the &#945;5 helix to GDP release.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 21 (1), 56-63 (2014).</li><li>Conklin, B. R., Farfel, Z., Lustig, K. D., Julius, D., Bourne, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substitution+of+three+amino+acids+switches+receptor+specificity+of+Gq&#945;+to+that+of+Gi&#945;.">Substitution of three amino acids switches receptor specificity of Gq&#945; to that of Gi&#945;.</a> Nature. 363, 274-276 (1993).</li><li>Conklin, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carboxyl-Terminal+Mutations+of+Gq&#945;+and+Gs&#945;+That+Alter+the+Fidelity+of+Receptor+Activation.">Carboxyl-Terminal Mutations of Gq&#945; and Gs&#945; That Alter the Fidelity of Receptor Activation.</a> Mol. Pharmacol. 50, 855-890 (1996).</li><li>Onaran, H. O., Costa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Where+have+all+the+active+receptor+states+gone.">Where have all the active receptor states gone.</a> Nat. Chem. Bio. 8, 674-677 (2012).</li><li>Jares-Erijman, E. A., Jovin, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FRET+imaging.">FRET imaging.</a> Nat Biotechnol. 21 (11), 1387-1395 (2003).</li><li>Lohse, M. J., Nuber, S., Hoffman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence/bioluminescence+resonance+energy+transfer+techniques+to+study+G-protein-coupled+receptor+activation+and+signaling.">Fluorescence/bioluminescence resonance energy transfer techniques to study G-protein-coupled receptor activation and signaling.</a> Pharmacol Rev. 64 (2), 299-336 (2012).</li><li>Vilardaga, J. P., B&#252;nemann, M., Krasel, C., Castro, M., Lohse, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+the+millisecond+activation+switch+of+G+protein-coupled+receptors+in+living+cells.">Measurement of the millisecond activation switch of G protein-coupled receptors in living cells.</a> Nat. Biotechnol. 21, 807-812 (2003).</li><li>B&#252;nemann, M., Frank, M., Lohse, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gi+protein+activation+in+intact+cells+involves+subunit+rearrangement+rather+than+dissociation.">Gi protein activation in intact cells involves subunit rearrangement rather than dissociation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100 (26), 16077-16082 (2003).</li><li>Stumpf, A. D., Hoffman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+probes+based+on+G+protein-coupled+receptors+-+added+work+or+added+value.">Optical probes based on G protein-coupled receptors - added work or added value.</a> Brit. J. Pharmacol. 173, 255-266 (2016).</li><li>Sivaramakrishnan, S., Spudich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+control+of+protein+interaction+using+a+modular+ER/K+&#945;-helix+linker.">Systemic control of protein interaction using a modular ER/K &#945;-helix linker.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108, 20467-20472 (2011).</li><li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins.">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nat. Methods. 2 (12), 905-909 (2005).</li></ol>

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması olduğunu beyan ederim.

Bu sistemde FRET ölçümlerinin sıkı dinamik aralık Bu protokolün her aşamasında hassas kalite kontrol gerekliliğini güçlendirmektedir. Başarılı bir FRET deneyi sağlamak için en önemli adımlar tahlil yürütülmesi sırasında 1) hücre kültürü, 2) transfeksiyon 3) protein ekspresyon ve 4) zamanında, hassas koordinasyon vardır. Hücre sağlık ve bakım / kaplama kalitesi imkansız FRET herhangi tutarlı bir değişiklik tespit yapabilirsiniz deneysel sistem ve kötü h...

G-proteinine kenetlenmiş reseptörlerin (GPCR&#39;ler) yedi transmembran reseptörlerdir. İnsan genomu tek ışık, koku, hormonlar, peptitler, ilaçlar ve diğer küçük moleküller de dahil olmak üzere, çeşitli ligandlı ile aktive olan GPCR, kodlayan yaklaşık 800 gen içermektedir. Piyasa hedef GPCRs şu anda tüm ilaçların yaklaşık% 30 birçok hastalık durumlarında 2 büyük bir rol oynamaktadır çünkü. Bu reseptör ailesinin üzerinde yapılan kapsamlı çalışmaların yıllardır rağmen, özellikle GPCR-efektör etkileşimleri sürücü moleküler mekanizmaları açısından, alanında önemli seçkin soruları orada kalır. Bugüne kadar, sadece bir yüksek çözünürlüklü kristal yapı β 2 adrenerjik reseptör (β 2-AR) ve Gs proteini 3 arasındaki etkileşim içgörü sağlayarak, yayımlandı. Birlikte son üç yıl içinde kapsamlı bir araştırma ile, bu çok önemlidir belirli bir yapısal bileşen yineledietkileşim: Gα alt birim C-terminali. Bu yapı, GPCR 4 G protein seçiminde 5-6 her iki G protein aktivasyonu için önemlidir. Bu nedenle, Gα C-terminali GPCR ligand uyarılması ve seçici G protein aktivasyonu arasındaki önemli bir bağlantı sağlar. son on yılda Araştırma GPCR&#39;ler GPCR yapılardan alt kümelerini stabilize ligand bağlama ile, geniş bir yapısal peyzaj doldurmak olduğunu göstermektedir. Kristalografisi, NMR ve floresan spektroskopisi, ve kütle spektrometresi dahil olmak üzere birçok teknik, GPCR yapısal peyzaj incelemek için mevcut iken, efektör seçimi 7 fonksiyonel önemini açıklamak için yaklaşımlar azdır. Burada, G protein seçici GPCR konformasyonlar tespit etmek için bir Fӧrster rezonans enerji transferi (FRET) tabanlı bir yaklaşım özetlemektedir. FRET emisyon (donör) a örtüşen iki fluorophores yakınlığı ve paralel yönde dayanırve tahrik (akseptör) spektrumları 8. Verici ve alıcı floroforlar konformasyonel protein değişikliği veya bir protein-protein etkileşimini bir sonucu olarak daha yakın bir araya geldiğinde, bunlar arasında FRET arttırır ve yöntem 8 bir dizi kullanarak ölçülebilir. FRET tabanlı biyosensörler GPCR alanda 9 yaygın istihdam edilmiştir. Üçüncü hücre döngüsü ve GPCR Cı-terminalindeki verici ve alıcı ekleyerek GPCR konformasyon değişiklikleri incelemek için kullanılmıştır; Sensör ayrı FRET çifti 10, GPCR ve efektör (G protein alt-birimleri / arrestins) etiketleyerek GPCR ve efektör etkileşimlerini incelemek için dizayn edilmiştir; Bazı sensörler ayrıca G-proteinine 11 yapısal değişiklikleri algılar. Bu biyosensörler yapısal GPCR değişiklikler ve efektör, GPCR-efektör etkileşim kinetik ve allosterik ligandlar 12 olmak üzere seçkin sorular çok sayıda sormak alanını sağlamıştır. Bizim grubumuzagonist odaklı koşullar altında G-protein spesifik GPCR konformasyonlar tespit olabilecek bir biyosensör oluştururken özellikle ilgi oldu. Bu biyosensör (sistematik protein afinite gücü modülasyon) 13 SPASM adında bir süre önce geliştirilen teknoloji dayanmaktadır. SPASM etkin konsantrasyonlarını kontrol eden bir ER / K linker kullanılarak bağlama etkileşimli protein alanları içerir. Fluorophores bir FRET çifti ile linker sınırdaş proteinler 12 arasındaki etkileşimin durumunu rapor bir araç oluşturur. Daha önce 1 SPASM modülü GPCR için Gα C-ucunu halata ve FRET fluorophores ile etkileşimlerini izlemek için kullanılan, mCitrine (onun bilinen varyant, Sarı Floresan Protein (YFP), uyarma / emisyon zirve de bu protokolde atıfta bulunulan , uyarma / emisyon zirve 430/475 nm) (onun yaygın olarak bilinen varyant Mavi Floresan Protein (OBP bu protokolde atıfta bulunulan) 490/525 nm) ve mCerulean. N- Cı-terminaline, tonun genetik olarak kodlanmış bir polipeptidi içerir: tam uzunlukta bir GPCR, Alıcı (mCitrine / YFP) FRET, 10 nm ER / K bağlayıcı, FRET verici (mCerulean / CFP) ve Gα C-terminali peptid. Bu çalışmada, sensörler GPCR-bağlayıcı uzunluğu Gα peptidi olarak kısaltılmıştır. Bütün bileşenler her bir alan serbest dönmesine olanak sağlayan bir yapısal olmayan (Gly-Ser-Gly) 4 bağlayıcı ile ayrılır. Sensörler ayrıntılı özellikleri daha önce iki prototipik GPCR&#39;ler kullanılarak gerçekleştirilmiştir: 2-Ar ve opsin 1 β. Bu sensör geçici HEK-293T hücreleri ve varlığı ya da ligandın yokluğunda saniye (cps) başına keyfi birimler FRET çiftinin florimetre bazlı canlı hücre deneyleri ölçer floresans spektrumları transfekte edilir. Bu ölçümler fluorophores (YFP max / OBP en yüksek) arasında bir FRET oranını hesaplamak için kullanılır. FRET (ΔFRET) bir değişiklik daha sonra ortalama FRET oranının çıkarılmasıyla hesaplanırLigand muamele edilmiş numunelerin FRET oranından işlem görmemiş örnekler. ΔFRET (β 2-AR-10 nm-Gαs peptid 2-AR-10 nm-hayır peptid p olan karşı) yapıları arasında mukayese edilebilir. Burada, detay protokol, canlı HEK-293T hücrelerinde bu sensörleri ifade ifadesini izlemek ve florimetre tabanlı canlı hücrenin kurulumu, yürütme ve analiz ilaç tedavi koşulları karşısında işlenmemiş için ölçüm FRET için. Bu protokol, 100 uM izoproterenol bitartarat ile muamele β 2-AR-10 nm Gαs peptid sensör için özel olsa farklı GPCR Gα çiftleri ve ligandlar için optimize edilebilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1151">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:312px;">B2-AR-10 nm- Gas peptide sensor</td>
			<td style="width:144px;">Addgene</td>
			<td style="width:148px;">47438</td>
			<td style="width:547px;">https://www.addgene.org/Sivaraj_Sivaramakrishnan/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">GeneJET Plasmid Miniprep Kit</td>
			<td style="width:144px;">Fermentas/Fisher Sci</td>
			<td style="width:148px;">FERK0503</td>
			<td>Elute in 2 mM Tris elution buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:312px;">HEK-293T-Flp-n cells</td>
			<td style="width:144px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:148px;">R78007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Trypsin (0.25%)</td>
			<td style="width:144px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:148px;">25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">DMEM- high glucose</td>
			<td style="width:144px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:148px;">11960-044</td>
			<td>Warm in&#160; 37 &#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">FBS, certified, Heat inactivated, US origin</td>
			<td style="width:144px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:148px;">10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:312px;">Glutamax I 100x</td>
			<td style="width:144px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:148px;">35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">HEPES</td>
			<td style="width:144px;">Corning</td>
			<td style="width:148px;">MT25060CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Opti-MEM</td>
			<td style="width:144px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:148px;">31985-070</td>
			<td>Reduced serum media; Bring to room temperature before use</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:312px;">XtremeGene HP transfection reagenet</td>
			<td style="width:144px;">Roche</td>
			<td style="width:148px;">6366236001</td>
			<td>Highly recommended for its consistency. Bring to room temperature before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">FluoroMax 4</td>
			<td style="width:144px;">Horiba</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td>Use with FluorEssence V3.8 software</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:312px;">3-mm path length quartz cuvette</td>
			<td style="width:144px;">Starna</td>
			<td style="width:148px;">NC9729944(16.45F-Q-3/z8.5)</td>
			<td>May require cuvette holder/adaptor for use in Fluorometer, available from Starna</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Sc100-S3 Heated Circulating water bath pump</td>
			<td style="width:144px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:148px;">13-874-826</td>
			<td>Warm to 37 &#176;C before use</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:312px;">Thermomixer Heat Block</td>
			<td style="width:144px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:148px;">22670000</td>
			<td>Warm to 37 &#176;C before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Ultrapure DNA/RNAse free water</td>
			<td style="width:144px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:148px;">10977015</td>
			<td>Use at room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:312px;">D(+)-glucose, anhydrous</td>
			<td style="width:144px;">Sigma</td>
			<td style="width:148px;">G5767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">aprotinin from bovine lung</td>
			<td style="width:144px;">Sigma</td>
			<td style="width:148px;">A1153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">leupeptin hemisulfate</td>
			<td style="width:144px;">EMD</td>
			<td style="width:148px;">10-897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">L-ascorbic acid, reagent grade</td>
			<td style="width:144px;">Sigma</td>
			<td style="width:148px;">A0278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">(-)-isoproterenol (+)-bitartrate</td>
			<td style="width:144px;">Sigma</td>
			<td style="width:148px;">I2760</td>
			<td>Use fresh aliquot each experiment</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

g protein-selective gpcr conformations measured using fret sensors in a live cell suspension fluorometer assay

Fӧrster rezonans enerji transferi (FRET) çalışmaları GPCR sinyalizasyon soruşturma giderek daha yaygın hale gelmiştir tabanlı. Araştırma grubumuz Gα alt birimlerinin ve agonist stimülasyon takip eden canlı hücrelerde GPCRs arasındaki etkileşimi tespit etmek için bir intra-moleküler FRET sensörü geliştirdi. Burada, ayrıntılı 100 uM izoproterenol hidroklorür ile işlenmesi üzerine β 2-adrenerjik reseptörü ve Gαs C-terminali peptid arasında FRET değişiklikleri tespit etmek için protokol daha önce 1 karakterize edilen. Bizim FRET sensörü, tam uzunlukta bir GPCR, FRET akseptör-floroforu (mCitrine) seri olarak aşağıdakilerden oluşan tek bir polipeptid olup, bir ER / K SPASM (sistematik proteinin afinite gücü modülasyonu) bağlayıcı olarak, bir FRET verici florofor (mCerulean) ve Gα Cı terminal peptid. Bu protokol olacak detay hücre hazırlama, transfeksiyon koşulları, ekipman kurulumu, tahlil yürütme ve veri analizi. Bu deney tasarımı, küçük ch algılarAnges&#39;a FRET protein-protein etkileşimleri göstermektedir ve ayrıca ligandları ve GPCR G proteini eşleşmeleri arasında etkileşim gücünü karşılaştırmak için kullanılabilir. sinyal-gürültü bizim ölçümlerde geliştirmek için, bu protokol her adımda artan hassasiyet gerektirir ve tekrarlanabilir yürütülmesini sağlamak için sunulmuştur.

Deneyin bir genelleştirilmiş şematik kurmak ve yürütme Şekil 3&#39;te ayrıntılı olarak verilmiştir. Sensörün dar dinamik aralığındaki bir FRET değişikliği tespit etmek amacıyla, yapıştınlabilir sistemin nüansları uyması önemlidir. Hücre kalitesi örnekleme protein ekspresyonu ve tutarlılık için zorunludur. Optimal tutarlı bir tek tabaka (10X) büyüyen kültürlenmiş hücreler 1 özellikleri görüntüleri Şekil</stro...

Watch this Scientific Journal Video about G Protein-selective GPCR Conformations Measured Using FRET Sensors in a Live Cell Suspension Fluorometer Assay at JoVE.com

G Protein-selective GPCR Conformations Measured Using FRET Sensors in a Live Cell Suspension Fluorometer Assay

Simple methods to detect the selective activation of G proteins by G protein-coupled receptors remain an outstanding challenge in cell signaling. Here, F&#1255;rster resonance energy transfer (FRET) biosensors have been developed by pairwise tethering a GPCR to G protein peptides to probe conformational changes at controlled concentrations in live cells.

G Protein-seçici GPCR konformasyoları Canlı Hücre Süspansiyon Fluorometer Deneyinde FRET sensörleri kullanılarak ölçülebilir

F&#1255;rster resonance energy transfer (FRET)-based studies have become increasingly common in the investigation of GPCR signaling. Our research group ...

g-protein-selective-gpcr-conformations-measured-using-fret-sensors

Research

JoVE Journal

Biology

9.5K Görüntüleme.  University of Minnesota. Simple methods to detect the selective activation of G proteins by G protein-coupled receptors remain an outstanding challenge in cell signaling. Here, Fӧrster resonance energy transfer (FRET) biosensors have been developed by pairwise tethering a GPCR to G protein peptides to probe conformational changes at controlled concentrations in live cells.

Video: G Protein-selective GPCR Conformations Measured Using FRET Sensors in a Live Cell Suspension Fluorometer Assay

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes in cell surface area and cell height, and where cells undergo mitosis and migrate. Furthermore, epithelial cells can also regulate morphogenetic movements in adjacent tissues1. A traditional method to study epithelial cells and tissues involve chemical fixation and histological methods to determine cell morphology or localization of particular proteins of interest. These approaches continue to be useful and provide "snapshots" of cell shapes and tissue architecture, however, much remains to be understood about how cells acquire specific shapes, how various proteins move or localize to specific positions, and what paths cells follow toward their final differentiated fate. High resolution live imaging complements traditional methods and also allows more direct investigation into the dynamic cellular processes involved in the formation, maintenance, and morphogenesis of multicellular epithelial sheets. Here we demonstrate experimental methods from the isolation of animal cap tissues from Xenopus laevis embryos to confocal imaging of epithelial cells and simple measurement approaches that together can augment molecular and cellular studies of epithelial morphogenesis.

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Xenopus embryonic epithelia are an ideal model system to study cell behaviors such as polarity development and shape change during epithelial morphogenesis. Traditional histology of fixed samples is increasingly being complemented by live-cell confocal imaging. Here we demonstrate methods to isolate frog tissues and visualize live epithelial cells and their cytoskeleton using live-cell confocal microscopy.

Canlı hücre Görüntüleme ve Kantitatif Analiz Embriyonik Epitel Hücreleri Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Biyoloji

Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular environment. The Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay1 allows researchers to visualize protein-protein interactions in living cells and has become an essential research tool. This assay is based on the facilitated association of two fragments of a fluorescent protein (GFP) that are each fused to a potential interacting protein partner. The interaction of the two protein partners would facilitate the association of the N-terminal and C-terminal fragment of GFP, leading to fluorescence. For plant researchers, onion epidermal cells are an ideal experimental system for conducting the BiFC assay because of the ease in obtaining and preparing onion tissues and the direct visualization of fluorescence with minimal background fluorescence. The Helios Gene Gun (BioRad) is commonly used for bombarding plasmid DNA into onion cells. We demonstrate the use of Helios Gene Gun to introduce plasmid constructs for two interacting Arabidopsis thaliana transcription factors, SEUSS (SEU) and LEUNIG HOMOLOG (LUH)2 and the visualization of their interactions mediated by BiFC in onion epidermal cells.

Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

This article illustrates how to properly use the BioRad Helios Gene Gun to introduce plasmid DNA into onion epidermal cells and how to test for protein-protein interactions in onion cells based on the principle of Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC)

Helios Gen Tabancası kullanarak Soğan Hücrelerde Protein-Protein Etkileşimi Bimoleküler Floresan tamamlama (BiFC) Testi

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular ...

Imaging G-protein Coupled Receptor (GPCR)-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1. This guided cell migration is referred as chemotaxis, which is essential for various cells to carry out their functions such as trafficking of immune cells and patterning of neuronal cells 2, 3. A large family of G-protein coupled receptors (GPCRs) detects variable small peptides, known as chemokines, to direct cell migration in vivo 4. The final goal of chemotaxis research is to understand how a GPCR machinery senses chemokine gradients and controls signaling events leading to chemotaxis. To this end, we use imaging techniques to monitor, in real time, spatiotemporal concentrations of chemoattractants, cell movement in a gradient of chemoattractant, GPCR mediated activation of heterotrimeric G-protein, and intracellular signaling events involved in chemotaxis of eukaryotic cells 5-8. The simple eukaryotic organism, Dictyostelium discoideum, displays chemotaxic behaviors that are similar to those of leukocytes, and D. discoideum is a key model system for studying eukaryotic chemotaxis. As free-living amoebae, D. discoideum cells divide in rich medium. Upon starvation, cells enter a developmental program in which they aggregate through cAMP-mediated chemotaxis to form multicullular structures. Many components involved in chemotaxis to cAMP have been identified in D. discoideum. The binding of cAMP to a GPCR (cAR1) induces dissociation of heterotrimeric G-proteins into G&gamma; and G&beta;&gamma; subunits 7, 9, 10. G&beta;&gamma; subunits activate Ras, which in turn activates PI3K, converting PIP2 into PIP3 on the cell membrane 11-13. PIP3 serve as binding sites for proteins with pleckstrin Homology (PH) domains, thus recruiting these proteins to the membrane 14, 15. Activation of cAR1 receptors also controls the membrane associations of PTEN, which dephosphorylates PIP3 to PIP2 16, 17. The molecular mechanisms are evolutionarily conserved in chemokine GPCR-mediated chemotaxis of human cells such as neutrophils 18. We present following methods for studying chemotaxis of D. discoideum cells. 1. Preparation of chemotactic component cells. 2. Imaging chemotaxis of cells in a cAMP gradient. 3. Monitoring a GPCR induced activation of heterotrimeric G-protein in single live cells. 4. Imaging chemoattractant-triggered dynamic PIP3 responses in single live cells in real time. Our developed imaging methods can be applied to study chemotaxis of human leukocytes.

Imaging G-protein Coupled Receptor GPCR-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Here, we describe detailed live cell imaging methods for investigating chemotaxis. We present fluorescence microscopic methods to monitor spatiotemporal dynamics of signaling events in migrating cells. Measurement of signaling events permits us to further understand how a GPCR-signaling network achieves gradient sensing of chemoattractants and controls directional migration of eukaryotic cells.

Görüntüleme G-protein Coupled Reseptör (GPCR) aracılı Sinyal Olaylar Kontrolü Kemotaksis Diktiyostelyum diskodeyum</em

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1.  This guided cell migration is referred as ...

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring of biochemical and signaling events in live cells and tissues. Compared to classical biochemical methods, this novel technology is characterized by high temporal and spatial resolution. FRET experiments use various genetically-encoded biosensors which can be expressed and imaged over time in situ or in vivo1-2. Typical biosensors can either report protein-protein interactions by measuring FRET between a fluorophore-tagged pair of proteins or conformational changes in a single protein which harbors donor and acceptor fluorophores interconnected with a binding moiety for a molecule of interest3-4. Bimolecular biosensors for protein-protein interactions include, for example, constructs designed to monitor G-protein activation in cells5, while the unimolecular sensors measuring conformational changes are widely used to image second messengers such as calcium6, cAMP7-8, inositol phosphates9 and cGMP10-11. Here we describe how to build a customized epifluorescence FRET imaging system from single commercially available components and how to control the whole setup using the Micro-Manager freeware. This simple but powerful instrument is designed for routine or more sophisticated FRET measurements in live cells. Acquired images are processed using self-written plug-ins to visualize changes in FRET ratio in real-time during any experiments before being stored in a graphics format compatible with the build-in ImageJ freeware used for subsequent data analysis. This low-cost system is characterized by high flexibility and can be successfully used to monitor various biochemical events and signaling molecules by a plethora of available FRET biosensors in live cells and tissues. As an example, we demonstrate how to use this imaging system to perform real-time monitoring of cAMP in live 293A cells upon stimulation with a &beta;-adrenergic receptor agonist and blocker.

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy is a powerful technique for real-time monitoring of signaling events in live cells using various biosensors as reporters. Here we describe how to build a customized epifluorescence FRET imaging system from commercially available components and how to use it for FRET experiments.

Unimoleküler Biyosensörler kullanma Canlı Hücreler Olaylar Sinyal gerçek zamanlı izlenmesi için Mikroskopi FRET

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

Apoptotik hücresi Temizliği görüntülenmesi sırasında Canlı<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriyo

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling processes. Extracting sterol-enriched membrane microdomains from plant cells for proteomic analysis is a difficult task mainly due to multiple preparation steps and sources for contaminations from other cellular compartments. The plasma membrane constitutes only about 5-20% of all the membranes in a plant cell, and therefore isolation of highly purified plasma membrane fraction is challenging. A frequently used method involves aqueous two-phase partitioning in polyethylene glycol and dextran, which yields plasma membrane vesicles with a purity of 95% 1. Sterol-rich membrane microdomains within the plasma membrane are insoluble upon treatment with cold nonionic detergents at alkaline pH. This detergent-resistant membrane fraction can be separated from the bulk plasma membrane by ultracentrifugation in a sucrose gradient 2. Subsequently, proteins can be extracted from the low density band of the sucrose gradient by methanol/chloroform precipitation. Extracted protein will then be trypsin digested, desalted and finally analyzed by LC-MS/MS. Our extraction protocol for sterol-rich microdomains is optimized for the preparation of clean detergent-resistant membrane fractions from Arabidopsis thaliana cell cultures.
We use full metabolic labeling of Arabidopsis thaliana suspension cell cultures with K15NO3 as the only nitrogen source for quantitative comparative proteomic studies following biological treatment of interest 3. By mixing equal ratios of labeled and unlabeled cell cultures for joint protein extraction the influence of preparation steps on final quantitative result is kept at a minimum. Also loss of material during extraction will affect both control and treatment samples in the same way, and therefore the ratio of light and heave peptide will remain constant. In the proposed method either labeled or unlabeled cell culture undergoes a biological treatment, while the other serves as control 4.

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Here we describe a robust method for the fractionation of plant plasma membranes into detergent resistant and detergent soluble membranes based on a mixture of unlabeled and in vivo fully 15N labeled Arabidopsis thaliana cell cultures. The procedure is applied for comparative proteomic studies to understand signaling processes.

Mukayeseli Proteomik Analizi Metabolik Etiketleme ve Membran Fraksiyonasyon<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Süspansiyon Hücre Kültürleri

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling ...

Single-cell Microinjection for Cell Communication Analysis

Gap junctions are intercellular channels that allow the communication of neighboring cells. This communication depends on the contribution of a hemichannel by each neighboring cell to form the gap junction. In mammalian cells, the hemichannel is formed by six connexins, monomers with four transmembrane domains and a C and N terminal within the cytoplasm. Gap junctions permit the exchange of ions, second messengers, and small metabolites. In addition, they have important roles in many forms of cellular communication within physiological processes such as synaptic transmission, heart contraction, cell growth and differentiation. We detail how to perform a single-cell microinjection of Lucifer Yellow to visualize cellular communication via gap-junctions in living cells. It is expected that in functional gap junctions, the dye will diffuse from the loaded cell to the connected cells. It is a very useful technique to study gap junctions since you can evaluate the diffusion of the fluorescence in real time. We discuss how to prepare the cells and the micropipette, how to use a micromanipulator and inject a low molecular weight fluorescent dye in an epithelial cell line.

We describe here how to perform a single-cell microinjection of Lucifer Yellow to visualize cellular communication via gap-junctions in living cells, and provide some useful tips. We expect that this paper will help everyone to evaluate the degree of cellular coupling due to functional gap junctions. Everything described here could be, in principle, adapted to other fluorescent dyes with molecular weight below 1,000 Daltons.

Hücre Haberleşme Analizi İçin Tek hücreli Mikroenjeksiyon

Gap junctions are intercellular channels that allow the communication of neighboring cells. This communication depends on the contribution of a ...

LDL Cholesterol Uptake Assay Using Live Cell Imaging Analysis with Cell Health Monitoring

The regulation of LDL cholesterol uptake through LDLR-mediated endocytosis is an important area of study in various major pathologies including metabolic disorder, cardiovascular disease, and kidney disease. Currently, there is no available method to assess LDL uptake while simultaneously monitoring for health of the cells. The current study presents a protocol, using a live cell imaging analysis system, to acquire serial measurements of LDL influx with concurrent monitoring for cell health. This novel technique is tested in three human cell lines (hepatic, renal tubular epithelial, and coronary artery endothelial cells) over a four-hour time course. Moreover, the sensitivity of this technique is validated with well-known LDL uptake inhibitors, Dynasore and recombinant PCSK9 protein, as well as by an LDL uptake promoter, Simvastatin. Taken together, this method provides a medium-to-high throughput platform for simultaneously screening pharmacological activity as well as monitoring of cell morphology, hence cytotoxicity of compounds regulating LDL influx. The analysis can be used with different imaging systems and analytical software.

This protocol provides an efficient approach to measuring LDL cholesterol uptake with real time influx rates using a live cell imaging system in various cell types. This technique provides a platform to screen the pharmacological activity of compounds affecting LDL influx while monitoring for cell morphology and hence potential cytotoxicity.

LDL kolesterol alımını tahlil canlı hücre analizi ile hücre Imaging kullanarak sistem durumu izleme

The regulation of LDL cholesterol uptake through LDLR-mediated endocytosis is an important area of study in various major pathologies including metabolic ...

FLIM-FRET Measurements of Protein-Protein Interactions in Live Bacteria.

Protein-protein interactions (PPIs) control various key processes in cells. Fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) combined with F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) provide accurate information about PPIs in live cells. FLIM-FRET relies on measuring the fluorescence lifetime decay of a FRET donor at each pixel of the FLIM image, providing quantitative and accurate information about PPIs and their spatial cellular organizations. We propose here a detailed protocol for FLIM-FRET measurements that we applied to monitor PPIs in live Pseudomonas aeruginosa in the particular case of two interacting proteins expressed with highly different copy numbers to demonstrate the quality and robustness of the technique at revealing critical features of PPIs. This protocol describes in detail all the necessary steps for PPI characterization - starting from bacterial mutant constructions up to the final analysis using recently developed tools providing advanced visualization possibilities for a straightforward interpretation of complex FLIM-FRET data.

We describe here a protocol to characterize protein-protein interactions between two highly-differently expressed proteins in live Pseudomonas aeruginosa using FLIM-FRET measurements. The protocol includes bacteria strain constructions, bacteria immobilization, imaging and post-imaging data analysis routines.

Canlı Bakterilerde Protein-Protein Etkileşimlerinin FLIM-FRET Ölçümleri.

Protein-protein interactions (PPIs) control various key processes in cells. Fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) combined with F&#246;rster ...

Real-Time Monitoring of Aurora kinase A Activation using Conformational FRET Biosensors in Live Cells

Epithelial cancers are often hallmarked by the overexpression of the Ser/Thr kinase Aurora A/AURKA. AURKA is a multifunctional protein that activates upon its autophosphorylation on Thr288. AURKA abundance peaks in mitosis, where it controls the stability and the fidelity of the mitotic spindle, and the overall efficiency of mitosis. Although well characterized at the structural level, a consistent monitoring of the activation of AURKA throughout the cell cycle is lacking. A possible solution consists in using genetically-encoded F&#246;rster&#8217;s Resonance Energy Transfer (FRET) biosensors to gain insight into the autophosphorylation of AURKA with sufficient spatiotemporal resolution. Here, we describe a protocol to engineer FRET biosensors detecting Thr288 autophosphorylation, and how to follow this modification during mitosis. First, we provide an overview of possible donor/acceptor FRET pairs, and we show possible cloning and insertion methods of AURKA FRET biosensors in mammalian cells. Then, we provide a step-by-step analysis for rapid FRET measurements by fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) on a custom-built setup. However, this protocol is also applicable to alternative commercial solutions available. We conclude by considering the most appropriate FRET controls for an AURKA-based biosensor, and by highlighting potential future improvements to further increase the sensitivity of this tool.

The activation of the multifunctional Ser/Thr kinase AURKA is hallmarked by its autophosphorylation on Thr288. Fluorescent probes relying on FRET can discriminate between its inactive and activated states. Here, we illustrate some strategies for probe engineering, together with a rapid FRET protocol to follow the kinase activation throughout mitosis.

Aurora kinazının Gerçek Zamanlı İzlenmesi Canlı Hücrelerde Konformasyonsal FRET Biyosensörleri Kullanılarak Aktivasyon

Epithelial cancers are often hallmarked by the overexpression of the Ser/Thr kinase Aurora A/AURKA. AURKA is a multifunctional protein that activates upon ...