RUM wurde von der American Heart Association Pre-Doc-Stipendium finanziert (14PRE18560010). Forschung wurde von der American Heart Association Scientist Entwicklung Grant (13SDG14270009) &amp; NIH (1DP2 CA186752-01 &amp; 1-R01-GM-105646-01-A1) finanziert SS

1. DNA-Präparation <ol><li> Design-Sensor konstruiert ein modulares Klonens Schema verwendet. Beziehen Sie sich auf den β 2 -AR Sensordesign zuvor 1 beschrieben. </li><li> Bereiten Sie DNA nach Handels Minipräparationskit Protokoll und eluieren in 2 mM Tris-HCl - Lösung, pH 8, bei einer Konzentration von ≥ 750 ng / &amp; mgr; l, A 260 / A 280 von 1,7-1,9, A 260 / A 230 von 2,0 bis 2,29. </li></ol> 2. Zellkultur Vorbereitung <ol><li> Kultur HEK-293T-Flp-n-Zellen in DMEM, das 4,5 g / L D-Glucose, supplementiert mit 10% FBS (hitzeinaktiviert) (v / v), 1% L-Glutamin zu ergänzen, 20 mM HEPES, pH 7,5 bei 37 ° C in angefeuchteter Atmosphäre mit 5% CO 2. Griff Zellen in biologischen Schutzhaube für den nachfolgenden Schritten. </li><li> Lassen Zellen zu einer konfluenten Monoschicht zu wachsen , bevor Passagierung in Sechs-Well - Gerichte. Zeit Konfluenz zu erreichen, hängt von anfänglichen Plattierungsdichte. Verwenden Platten, diekommen zu Konfluenz in 1 - 2 Tage Plattierung für Sechs-Well-Beschichtung. Eine konfluente 10 cm Gewebekultur-behandelte Schale hat Zelldichte von etwa 4 x 10 6 Zellen / ml. Siehe Abbildung 1 für Bild von Zellkulturwachstum. </li><li> Waschen Sie die Zellen mit 10 ml PBS und trypsinize mit 0,25% Trypsin (siehe Diskussion, Absatz 2). Platte 8 x 10 5 Zellen / Vertiefung in 2 ml Medium in Gewebekultur-behandelten sechs - Well - Schalen und ermöglichen 16 anhaften - 20 Stunden. </li></ol> 3. Transfektionsbedingungen <ol><li> Stagger Transfektionen für Konstrukte, die unterschiedliche Mengen an Zeit erfordern eine optimale Expression zu erreichen (zwischen 20 - 36 h). Synchronisieren Sie Bedingungen für eine einheitliche Versuchszeit. Auch haben eine nicht-transfizierte Kontrollvertiefung bei äquivalenten Zelldichte für die Hintergrundgeräusche und Streu Subtraktion während der Analyse verwendet werden. </li><li> Bringen Sie Transfektionsreagenzien auf Raumtemperatur: reduzierte Serum Medien, DNA, Transfektionsreagenz. </li><li> In einembiologische Schutzhaube Reagenzien in einem sterilen Mikrozentrifugenröhrchen in der folgenden Reihenfolge kombinieren: mit 100 &amp; mgr; l reduziert Serum Medien 2 ug DNA mischen. Spike 6 ul Transfektionsreagenz in Medium / DNA-Gemisch ohne Oberfläche Mischung zu berühren oder die Seite des Röhrchens. Richten Sie eine Transfektionsreaktion pro Vertiefung. Transfektionsbedingungen können (1 - 4 &amp; mgr; g DNA, 3 - 6 ul Transfektionsreagenz) optimiert werden konsistente Expressionsniveaus zu erreichen. Siehe Tabelle 1 für weitere optimierte Verhältnisse. </li><li> Inkubieren Mischung bei RT in biologischen Schutzhaube für 15 - 30 min. Nicht Reaktion verwenden, wenn länger als 30 min inkubiert. </li><li> In Reaktion auf die Zellen in einer tropfenweise Art und Weise über gut und sanft schütteln sechs Vertiefungen Durchmischung zu gewährleisten. In einer Reaktion pro Vertiefung. </li><li> unter Verwendung von Gewebekulturfluoreszenzmikroskop Nach 20 Stunden des Ausdrucks, Monitor Fluoreszenz. Beurteilen Bevölkerung Ausdruck mit 10X-Objektiv und Proteinlokalisierung in einer Zelle bei 40X. Observe für die Proteinexpression in der Plasmamembran (PM). Wenn wesentliche Internalisierung festgestellt wird, überwachen die Transfektion, bis eine signifikante Expression bei PM erfasst wird. </li></ol> 4. Reagenz und Vorbereitung der Ausrüstung <ol><li> Bereiten 100 mM Pharma - Aktien und bei -80 ° C: Isoproterenol Bitartrat (100 mM in dH 2 O , enthaltend 300 mM Ascorbinsäure). Machen Sie auf Eis / in kalten Raum, und Flash-Freeze sofort. Aliquots können bis zu einem Jahr hergestellt und verwendet werden. </li><li> Bereiten Sie Zellenpuffer (~ 2 ml / Zustand) und Speicher in einem 37 ° C Wasserbad. Machen Sie jeden Tag frisch. Referenztabelle 2 für Zellenpuffer Bestandteile. </li><li> Bereiten Drug-Puffer (10 ml) und bei Raumtemperatur lagern. Referenztabelle 2 für Drogen Buffer Bestandteile. </li><li> Waschen mit Säure Küvetten konzentrierter HCl. Neutralisieren mit einer schwachen Base (1 M KOH) und gründlich waschen Küvetten mit dH 2 O. </li><li> Bereiten Sie Arbeitsstation um Fluorometer mit mehrerenKisten von 10, 200 und 1000 ul Pipettenspitzen, einem Timer mit 10 Minuten Countdown, eine zugängliche Vakuumleitung mit Tipps für Küvetten - Reinigung, heikle Aufgabe Tüchern und Spritzflasche mit Reinstwasser H 2 O eingestellt </li><li> Wärmebad externe Wasser für Fluorometer und Wärmeblock auf 37 ° C. </li><li> Schalten Sie Fluorometers; Fluoreszenzerfassungsprogramm für GFP Sammlung Set 430 nm bis Anregung, Bandpass 8 nm; Emissionsbereich von 450 nm - 600 nm, Bandpass 4 nm. Für YFP Sammlung nur als Sensorsteuerung (siehe Diskussion) Satz Anregung auf 490 nm, Bandpass 8 nm, Emissionsbereich von 500 bis 600 nm, Bandpass 4 nm. GFP Sammlung Einstellungen werden verwendet, um ein FRET-Spektrum in diesem Experiment zu erwerben. </li><li> Legen Sie zwölf 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen in Wärmeblock , wie in Abbildung 2 gezeigt. Diese Rohre sind Halterungen für die Zell aliquoten Rohre (500 &amp; mgr; l-Mikrozentrifugenröhrchen.) Legen Sie ein kleines Stück Gewebe in Haltern 1 und 7, um die Küvetten hier platziert abzufedern. Hinweis: Verwenden Sie getrennte Küvetten für unbehandelten Zustand und Drogen Zustand eine Kreuzkontamination zu vermeiden. </li></ol><img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54696/54696fig2.jpg" /> Abbildung 2. Microcentrifuge Gefäß Einrichten und Position Referenz in Wärmeblock Cuvette für unbehandelten Proben ist in Position . 1; Zelle aliquoten Rohre sind in den Positionen 2 - 6. Cuvette für Proben Medikament behandelt in der Position 7; Zelle aliquoten Rohre sind in den Positionen 8 - 12. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54696/54696fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54696/54696fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <ol start="9"><li> Füllen Halter 2 bis 6 und 8 bis 12 mit ~ 750 &amp; mgr; l Wasser mit einer mini 37 ° C Wasserbad zu schaffen. </li><li> Legen Sie zehn 500 ul-Mikrozentrifugenröhrchen für Zellaliquote in Mini-Wasserbäder (Halter 2 - 6, 8 bis 12). Jedes Rohr wird eine einzelne Wiederholung der Bedingung (5 untreated, 5 Arzneimittel behandelt). </li><li> Überwachen Sie Zellen für die Expression (siehe Schritt 3.6). </li></ol> 5. Experiment &amp; Data Collection <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54696/54696fig3.jpg" /> Abbildung 3. Experimentelle Schematic. Eine ausführliche schrittweise Anleitung für experimentelle Aufbau und Ausführung. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54696/54696fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54696/54696fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <ol><li> Referenz 3 für experimentelle Schema. Wenn Zellen bereit sind, geerntet werden, bezogen auf die Proteinexpression mit Fluoreszenzmikroskop nachgewiesen werden (siehe Diskussion, Absatz 4): in der Haube biologische Sicherheit, sanft entfernen ~ 1 ml Medium, resuspendieren Zellen in ihrer Kultur mit einem P1,000 und übertragen Aufwirbelung in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Hinweis: Vermeiden unter Verwendung von Trypsin, wie es die N-Terminus verdauen und /oder Bindungstasche des GPCR-Sensor. </li><li> Zählen von Zellen geeignete Zelldichte in Resuspension zu gewährleisten. Optimieren Resuspensionsvolumen für 4 x 10 6 Zellen / ml. </li><li> Spin-Zellen in Schwingbecherzentrifuge bei Raumtemperatur 290 g für 3 min. Überstand entfernen nach der Zentrifugation. </li><li> GENTLY Zellen in 1 ml Zellpuffer (gelagert bei 37 ° C) und wiederholen Sie Schritt 5.3 resuspendieren. Während zweite Spin, sammeln 100 mM Medikament Lager aliquoten von -80 ° C. Machen Sie 1: 100 Verdünnung in Drug-Puffer für 1 mM Arbeits Lager und halten bei RT. </li><li> Nach der zweiten Zentrifugation entfernen Überstand und vorsichtig in 1 ml der Zellenpuffer resuspendieren Zellen (4 x 10 6 Zellen / ml). Maßnahme OD 600 der Probe in dem Spektrophotometer unter Verwendung von 1 ml der Zellen und 1 ml der Zellenpuffer als Rohling. Dispense-Zellen in einer Einweg-Kunststoff-Küvetten und Transfer zurück zu einem Mikrozentrifugenröhrchen unmittelbar nach Spektrophotometrie. </li><li> Für eine Kontrolle untransfizierten cell Zustand Spektrum, sanft untransfizierten Zellen in 1 ml Zellenpuffer mit P1,000 Pipette resuspendieren, fügen Sie 90 ul der Zellen FRET-Spektrum bei Anregung 430 nm, Bandpass 8 nm, Emission 450 bis Küvette und erwerben - 600 nm, Bandpass 4 nm. Sammeln Sie 3 bis 5 wiederholen Spektren mit frischen 90 &amp; mgr; l der Zellen. Halten Sie Lager von Zellen bei 37 ° C zwischen specs, resuspendieren sanft mit P1,000 zwischen jedem Probenaliquothandhabungsvorrichtung und spülen Küvette mit Reinstwasser H 2 O zwischen den Proben. </li><li> Für Versuchsbedingungen aliquote 90 ul von transfizierten Zellen zu jeder der 500 &amp; mgr; l Röhrchen in Halter 2 bis 6, 8 bis 12 in dem Heizblock. resuspendieren vorsichtig Lager von Zellen mit P1,000 pipettieren zwischen jedem aliquoten Teil. </li><li> Nachdem die Zellen aliquotiert werden, fügen Sie 10 ul Drug Buffer 2 Röhren - 6 für unbehandelten Zustand Proben. </li><li> Beginnen Experiment durch Zugabe von 10 ul 1 mM Wirkstofflösung in das Rohr 8, starten Sie den Timer von 10 Minuten mit dem Countdown, und vorsichtig mischen Rohr mit P200 pipettieren. Schließen Rohr und Rückkehr zu 37° C Wärmeblock. </li><li> Pick sofort bis Rohr 2, vorsichtig mischen mit P200 (eine neue Spitze verwenden), fügen Sie 90 ul der Zellsuspension in unbehandeltem Zustand Küvetten und in Fluorometer. </li><li> Erwerben FRET-Spektrum bei Anregung 430 nm, Bandpass 8 nm, Emission 450 bis 600 nm, Bandpass 4 nm. </li><li> Bei 9 min - 10 sec, Spike Rohr 9 mit 10 ul 1 mM Wirkstofflösung, vorsichtig mit einem P200 (verwenden Sie neue Spitze) mischen, und das Rückrohrblock zu erhitzen. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 5,10-5,11 mit Rohr 3 und 5.12 mit Rohr 10. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 5,10-5,13 in 1 - Minuten - Intervallen (8.10, 7.10, etc.) bis Spektren für alle unbehandelten Zustand Proben gesammelt werden, und Droge wurde auf alle Arzneimittel Zustand Proben hinzugefügt. Verwenden Sie eine frische Spitze für jeden Pipetten Schritt eine Kreuzkontamination zu verhindern. </li><li> Bei 5 min - 10 sec, beginnen Mischrohr 8 (drug Zustand) sanft mit P200 pipettieren, fügen Sie 90 ul der Zellsuspension in getrennten Küvetten für Arzneimittel behandelten Probe und in Fluorometer. </li><li> erwerben FRET-Spektrum (siehe Schritt 5.11 für Einstellungen). </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 5,15-5,16 in 1 - Minuten - Intervallen (04.10, 03.10, etc.) für die verbleibenden Arzneimittel Zustand Proben (Rohre 9 bis 12). </li><li> Nach dem Ende des Tests Projektdateien zu speichern, gründlich Küvetten mit Reinstwasser H 2 O waschen und für den nächsten Zustand Röhren-Lager wieder. Achten Sie darauf, eine Kreuzkontamination in dem Waschschritt zu verhindern. Ändern Sie die Spitze auf dem H 2 O - Flasche sowie auf der Vakuumleitung zwischen Wäschen. </li></ol> 6. Datenanalyse <ol><li> Speichern und Exportieren von Daten-Dateien in SPC formatiert werden für die Analyse verwendet werden. Analyseprogramme sind zum Download auf der Sivaramakrishnan Lab Veröffentlichung Website zur Verfügung. </li><li> Erstellen Sie Pfad-Dateien für Analyse-Software, die die Analyseprogramme (v9, v15) umfassen, untransfizierten Proben Dateien (siehe Schritt 5.6 für untransfizierten Zelle Spektrum-Sammlung), OUTPUT Datendatei, und durch Komma getrennte Werte (CSV) Dateien für die Dateneingabe. </li><li> Geben Sie folgende Informationenin CSV - Datei und benennen jeweiligen Bedingungen für jede Probe (Probe in Tabelle 3 zu sehen), einschließlich: Dateiname - individuelle SPC Graph-Dateien Rezeptor - designierter Konstrukt , das GPCR wurde getestet (zB Β2) Binder - bezeichnen , die Peptidvariante des Konstrukts wurde untersucht (beispielsweise S) Agonist - bezeichnen unbehandelten (N) oder Arzneimittel behandelt (D) Bedingungen Directory - der Pfad Ordner, in dem SPC-Dateien gespeichert werden, in der Regel nach Datum sortiert OD - aufgezeichnet optische Dichte der Probe aus Spektrophotometer </li><li> Geben Sie Dateinamen für untransfizierten Proben (Schritt 5.6) Puffer zu subtrahieren und Streuungsrauschen von Proben. </li><li> Geben Sie Bedingungen in Analyseprogramm. </li><li> Ausführen von Programmen zu analysieren Proben innerhalb der einzelnen Bedingungen (v9) und über Bedingungen (v15). </li><li> Ausschließen Beispieldateien, die offensichtlich Ausreißer im Datensatz sind, oder für die Subtraktion einstellen durch Erhöhen oder Verringern OD-Wert von indiviDual-Dateien. </li><li> Exportieren von Daten in der Ausgabedatei für den Zugriff auf berechneten FRET-Verhältnisse (525 nm / 475 nm). </li><li> Berechnen ΔFRET, indem die durchschnittliche FRET-Verhältnis für unbehandelten Zustand aus den einzelnen FRET-Verhältnisse für behandelt (Arzneimittel) Bedingungen abzieht. </li></ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben.

Die enge Dynamikbereich von FRET-Messungen in diesem System verstärkt die Notwendigkeit, sensible Qualitätskontrolle bei jedem Schritt dieses Protokolls. Die wichtigsten Schritte ein erfolgreiches FRET Experiment sind 1) die Zellkultur, 2) Transfektion 3) Proteinexpression und 4) zeitnah, präzise Koordination während des Testausführung zu gewährleisten. Zell Gesundheit und Pflege / Beschichtung Qualität kann einen erheblichen Einfluss auf das Signal-zu-Rausch des experimentellen Systems und schlechter Zellgesundheit kann es unmöglich machen, jede konsequente Änderung der FRET zu erkennen. Konservativ, sind Zellen für etwa 20 Passagen gesundeste, obwohl dies auf Zelllinie variieren können, Handhabung und Kulturbedingungen. Sobald Zellen haben wachsende Schwierigkeiten als konfluenter Monolayer oder beginnen konsequent in mehr dendritische Muster wachsen (siehe Abbildung 1 (b)), werden experimentelle Hintergrundgeräusche beeinträchtigt werden. Eine sorgfältige Zelle Wartung, einschließlich Routine media ändert und regelmäßig nicht adhärenten Zellen und Ablagerungen von Wartungsplatten zu entfernen, wird die Qualität der Zellen für die Sechs-Well-Plattierung und Transfektionen verbessern. Zellklumpen, die sich negativ auf die Transfektionseffizienz beeinflussen, kann wirksam in einzelne Zellen durch Trypsinisierung von Wartungsplatten getrennt werden: 10 cm konfluenten Geschirr für 30 sec mit 10 ml 0,25% Trypsin behandelt, Trypsin entfernen, aber etwa 200 &amp; mgr; l, place dish in 37 verlassen ° C Inkubator für 2 - 3 min. Die Zellen kommen aus Schale sehr leicht und sind weniger anfällig für Verklumpen. Es ist wichtig, die Transfektionsschritt für dieses Experiment zu optimieren. Six-Brunnen müssen idealerweise 60 bis 80% konfluent für eine effiziente Transfektion und eine optimale Expression. Wenn zu wenige Zellen anhaften (&lt;60%), Wartezeit von ca. 2 - 6 Stunden zu transfizieren, oder bis mindestens 70% der Zellen anhaften. Six-Brunnen, die älter als konfluente (&gt; 80%) wird auch die Transfektionseffizienz verringern. Transfizieren bei niedrigerenZellkonfluenz erhöht Zelltod Rate. DNA-Konzentration und Reinheit sind auch entscheidend (siehe Schritt 1.2). Mit geringer Konzentration und / oder DNA schlechte Qualität Präparate negativ Transfektionseffizienz Transfection Bedingungen beeinflussen können pro Konstrukt eingestellt werden, siehe Tabelle 1 für weitere Informationen. Genaue und konsistente Überwachung der Proteinexpression einer Gewebekultur-Fluoreszenzmikroskop ist ein weiterer entscheidender Schritt in diesem Prozess. Obwohl dieser Schritt für einzelne Beurteilungsgegenstands ist, ist es möglich, andere Techniken, wie Mikroskopie zu verwenden, quantitativ Expression im Laufe der Zeit zu überwachen, obwohl sie hier nicht detailliert werden. Für Konstrukte wir erfolgreich in unserem System getestet haben, nimmt Ausdruck ca. 18-36 h eine optimale Expression zu erreichen. Nach unserer Erfahrung konstruiert, dass Display schlechte Expression während dieses Zeitfensters selten nach 40 Stunden zu verbessern. Die Konstrukte haben wir veröffentlicht mit haben keine Anzeichen von degradatio gezeigtn, aber dies kann ein Problem für einige GPCRs sein. In unseren Tests ist Sensorverschlechterung möglich Transfektionsdauer über 30 Stunden. Sensor Integrität kann mit YFP / CFP-Verhältnissen getestet werden: 525 nm Lesen aus dem YFP erregter (490 nm) Spektrum und 475 nm Lesen von GFP-angeregten (430 nm) Spektrum. Einstellungen siehe Schritt 4.6. Empfohlene YFP / CFP-Verhältnisse liegen im Bereich von 1,7 bis 2,0, mit einem idealen Verhältnis von 1,8. Dieser Wert ist abhängig von der ungefähren zweifach größere Helligkeit von YFP relativ zu CFP14. Ein integraler Sensor mit minimaler Verschlechterung wird daher beide Fluorophore enthalten und YFP: CFP-Verhältnis von etwa 2: 1. Nach dem Sensor Qualität bestätigt wurde, ist es wichtig, Proteinlokalisierung und Ausdruck an der Plasmamembran zu bestätigen. Signifikante intrazelluläre Expression könnte ein Ergebnis entweder Proteinabbau, die Internalisierung oder laufenden Handel des Proteins sein. -Monitor baut im Laufe der Zeit zu sehen, ob die Expression an der Plasmamembran verbessert. Die nächste kritsche Herausforderung bei der Expression ist die Transfektionseffizienz. Etwa 70% + Transfektionseffizienz ist notwendig für adäquates Signal-Rausch-Detektions in diesem Fluorometer System. Wenn weniger Zellen transfiziert werden, kann die Menge an Signal-zu-Rausch noch nachweisbar sein, sondern zwischen den Proben in einem FRET Experiment viel weniger kohärent sein. Dadurch wird eine genaue Datenanalyse innerhalb des engen Dynamikbereich des Systems behindern. Expressionsniveaus präsentieren auch eine bedeutende Hürde reichlich Signal-to-noise zu erreichen während des Experiments. Für Expressionsniveaus nachweisbar durch das Fluorometer, das Verhältnis des Signals zwischen 475 nm und 450 nm (Zellstreuung) von 1,5 ausreichend ist, um eine Änderung in FRET Erfassung wird jedoch eine optimale Expression ungefähr ein Verhältnis von 2.0+ haben. Als Referenz, die β2-AR - Daten werden in einem Signal-Rausch - Bereich von 4 x 10 5 CPS (450 nm) bis 1 x 10 6 CPS (475 nm), Signal-Rausch - Verhältnis von 2,5 gesammelt. Dieses Verhältnis wird dazu beitragen, die Menge an variabi reduzierenkeit zwischen den Proben, die auch die Datenanalyse beeinflussen können. Diese Expressionsniveaus sind ebenfalls Gegenstand der Empfindlichkeit und eine optimale Ausrichtung der Optik Fluorometer; Andere Systeme können verschiedene Parameter für adäquates Signal-zu-Rausch-Optimierung erfordern. Zellen sind extrem empfindlich gegenüber Zeit und Temperatur. Sobald das experimentelle Verfahren wurde sanft begonnen, Handhabung ist wichtig, den Zelltod zu verhindern. Spezifische logistische Maßnahmen können ergriffen werden, um den Prozess zu beschleunigen und rechtzeitig Fehler zu vermeiden, einschließlich der Arbeitsstation ausgearbeitet, wobei alle Geräte einwandfrei funktioniert, und die Ziele im Vorfeld des Experiments Planung aus. Es ist ideal Zellen innerhalb von 30 Minuten nach der Ernte zu verwenden, und in unserem System, wird dieses Protokoll innerhalb von 20 Minuten durchgeführt. Sobald die Technik beherrscht wird, und zwar Transfektion Optimierung und die manuelle Geschicklichkeit der Übung selbst kann dieses Experiment verwendet werden, um verschiedene Konstrukte gegeneinander zu vergleichen, erzeugen Dosis-reKurven antwortet nicht, und der Sensor kann auf die Volllängen-G-Protein erweitert werden. Obwohl die hier verwendeten FRET-Sensor eine einzigartige Entwicklung in GPCR FRET-Sensoren ist, wird diese spezifische experimentelle Aufbau detailliert als gut charakterisierten Assay für die Durchführung des Sensors. Das Fluorometer basierten Assay erlaubt eine große Population von Zellen in jedem Experiment bewertet werden und beruht nicht auf gereinigtes Protein oder Membran preps daher eine in vivo - Umgebung beibehalten wird . Dieser Versuchsaufbau hat sich auch sehr kleine Änderungen optimiert in dem System auf Agonist Stimulation des GPCR gesehen zu detektieren.

G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) sind sieben-Transmembran-Rezeptoren. Das menschliche Genom enthält etwa 800 allein Gene kodierend für GPCRs, die durch eine Vielzahl von Liganden, einschließlich Licht, Geruchsstoffe, Hormone, Peptide, Arzneimittel und andere kleine Moleküle aktiviert werden. Fast 30% aller Arzneimittel auf dem Markt Ziel GPCRs , weil sie eine große Rolle spielen bei vielen Krankheitszuständen 2. Trotz jahrzehntelanger intensiver Arbeit an dieser Rezeptorfamilie getan, gibt es weiterhin erhebliche offene Fragen auf dem Gebiet, vor allem im Hinblick auf die molekularen Mechanismen, die GPCR-Effektor-Wechselwirkung fahren. Bis heute hat nur eine hochauflösende Kristallstruktur veröffentlicht worden sind , einen Einblick in die Wechselwirkung zwischen dem β 2 -adrenergen Rezeptor Bereitstellung (β 2 -AR) und das Gs - Protein 3. Zusammen mit den umfangreichen Forschung in den letzten drei Jahrzehnten, wiederholt sie eine spezifische strukturelle Komponente, die in dieser kritischen istInteraktion: der C-Terminus G &amp; agr; -Untereinheit. Diese Struktur ist wichtig für die G - Protein - Aktivierung durch den GPCR 4 und G - Protein - Auswahl 5-6. Daher stellt die G &amp; agr; C-Terminus eine entscheidende Verbindung zwischen Ligand Stimulation des GPCR und selektive Protein-Aktivierung G. Forschung im letzten Jahrzehnt legt nahe, dass GPCRs eine breite Konformationsänderungen Landschaft bevölkern, mit Ligand-bindenden Untergruppen von GPCR Konformationen zu stabilisieren. Während verschiedene Techniken, einschließlich Kristallographie, NMR und Fluoreszenzspektroskopie und Massenspektrometrie sind verfügbar , um die GPCR Konformationsänderung Landschaft zu untersuchen, gibt es einen Mangel von Ansätzen ihre funktionelle Bedeutung in Effektor Auswahl 7 zu erläutern. Hier beschreiben wir eine Fӧrster Resonanzenergietransfer (FRET) -basierte Ansatz G-Protein-selektive GPCR Konformationen zu erkennen. FRET stützt sich auf die Nähe und die parallele Ausrichtung von zwei Fluorophore mit überlappenden Emissions (Donor) einnd Anregung (Akzeptor) Spektren 8. Als Donor und Akzeptor - Fluorophore kommen einander näher als Ergebnis entweder Konformationsänderung im Protein oder ein Protein-Protein - Wechselwirkung erhöht die FRET zwischen ihnen, und 8 mit einer Reihe von Verfahren gemessen werden. FRET-basierten Biosensoren wurden 9 ausführlich in der GPCR - Bereich eingesetzt. Sie wurden durch Einfügen Donor und Akzeptor in der dritten intrazellulären Schleife und GPCR C-Terminus in der GPCR Sonde Konformationsänderungen verwendet; Sensoren wurden durch getrennte Markierung des GPCR und Effektorzellen (G - Protein - Untereinheiten / Arrestine) mit einem FRET - Paar 10 zur Sonde GPCR und Effektor - Wechselwirkung entwickelt; Einige Sensoren auch Konformationsänderungen in dem G - Protein 11 erfassen. Diese Biosensoren haben das Feld aktiviert eine Vielzahl von offenen Fragen zu stellen , einschließlich Konformationsänderungen in der GPCR und Effektorzellen, GPCR-Effektor - Wechselwirkung Kinetik und allosterische Liganden 12. Unsere Gruppewar besonders daran interessiert, einen Biosensor zu schaffen, die G-Protein-spezifischen GPCR Konformationen unter Agonisten getriebenen Bedingungen erkennen konnte. Dieser Biosensor beruht auf einer neu entwickelten Technologie SPASM (systematische Protein - Affinitätsstärke Modulation) 13 genannt. SPASM beinhaltet Tethering die Interaktion Proteindomänen ein ER / K-Linker mit, die ihre wirksamen Konzentrationen kontrolliert. Flankierend den Linker mit einem FRET - Paar von Fluorophoren schafft ein Werkzeug , das den Zustand der Wechselwirkung zwischen Proteinen 12 mitteilen. Zuvor 1 wurde das SPASM Modul verwendet , um die G &amp; agr; C-Terminus mit einem GPCR anbinden und überwachen ihre Wechselwirkungen mit FRET Fluorophore, mCitrine (bezeichnet in diesem Protokoll , das von seiner allgemein bekannten Variante Yellow Fluorescent Protein (YFP), Anregungs- / Emissions - Peak bei 490/525 nm) und mCerulean (bezeichnet in diesem Protokoll, das von seiner allgemein bekannten Variante Cyan Fluorescent Protein (GFP), Anregungs- / Emissions-Peak 430/475 nm). Vom N- zum C-Terminus, tseine genetisch kodierte einzelnes Polypeptid enthält: ein in voller Länge GPCR, FRET-Akzeptor (mCitrine / YFP), 10 nm ER / K-Linker, FRET-Donor (mCerulean / CFP) und der G &amp; agr; C-Terminus-Peptid. In dieser Studie Sensoren sind als GPCR-Linker-Länge-G &amp; agr; Peptid abgekürzt. Alle Komponenten werden von einer unstrukturierten (Gly-Ser-Gly) 4 Linker getrennt , die eine freie Drehung jeder Domäne ermöglicht. Die detaillierte Charakterisierung solcher Sensoren wurde durchgeführt , die zuvor zwei prototypische GPCRs mit: β 2 -AR und Opsin 1. Dieser Sensor ist transfiziert transient in HEK-293T-Zellen und Fluorometer basierten lebenden Zellen Experimente messen Fluoreszenzspektren des FRET-Paares in willkürlichen Einheiten der Zählungen pro Sekunde (CPS) in Gegenwart oder Abwesenheit eines Liganden. Diese Messungen werden verwendet , um ein FRET - Verhältnis zwischen den Fluorophoren (YFP max / CFP max) zu berechnen. Eine Änderung in der FRET (ΔFRET) wird dann durch Subtraktion des durchschnittlichen FRET-Verhältnis berechnetder unbehandelten Proben aus dem FRET Verhältnis von Ligand behandelten Proben. ΔFRET kann über Konstrukte (β 2 -AR-10 nm-Gαs Peptid im Vergleich zu ß 2 -AR-10 nm-kein Peptid) verglichen werden. Hier stellen wir ausführlich das Protokoll, um diese Sensoren in Live-HEK-293T-Zellen exprimieren, überwachen deren Ausdruck und die Einrichtung, Durchführung und Analyse des Fluorometers-basierten Live-Cell-FRET-Messung für unbehandelte gegen Arzneimittel-behandelten Bedingungen. Während dieses Protokoll für den β 2 -AR-10 nm-Gαs Peptidsensor mit 100 &amp; mgr; M Isoproterenol Bitartrat spezifisch ist, kann es für verschiedene GPCR-G &amp; agr; Paare und Liganden optimiert werden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1151">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:312px;">B2-AR-10 nm- Gas peptide sensor</td>
			<td style="width:144px;">Addgene</td>
			<td style="width:148px;">47438</td>
			<td style="width:547px;">https://www.addgene.org/Sivaraj_Sivaramakrishnan/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">GeneJET Plasmid Miniprep Kit</td>
			<td style="width:144px;">Fermentas/Fisher Sci</td>
			<td style="width:148px;">FERK0503</td>
			<td>Elute in 2 mM Tris elution buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:312px;">HEK-293T-Flp-n cells</td>
			<td style="width:144px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:148px;">R78007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Trypsin (0.25%)</td>
			<td style="width:144px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:148px;">25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">DMEM- high glucose</td>
			<td style="width:144px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:148px;">11960-044</td>
			<td>Warm in&#160; 37 &#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">FBS, certified, Heat inactivated, US origin</td>
			<td style="width:144px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:148px;">10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:312px;">Glutamax I 100x</td>
			<td style="width:144px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:148px;">35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">HEPES</td>
			<td style="width:144px;">Corning</td>
			<td style="width:148px;">MT25060CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Opti-MEM</td>
			<td style="width:144px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:148px;">31985-070</td>
			<td>Reduced serum media; Bring to room temperature before use</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:312px;">XtremeGene HP transfection reagenet</td>
			<td style="width:144px;">Roche</td>
			<td style="width:148px;">6366236001</td>
			<td>Highly recommended for its consistency. Bring to room temperature before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">FluoroMax 4</td>
			<td style="width:144px;">Horiba</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td>Use with FluorEssence V3.8 software</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:312px;">3-mm path length quartz cuvette</td>
			<td style="width:144px;">Starna</td>
			<td style="width:148px;">NC9729944(16.45F-Q-3/z8.5)</td>
			<td>May require cuvette holder/adaptor for use in Fluorometer, available from Starna</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Sc100-S3 Heated Circulating water bath pump</td>
			<td style="width:144px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:148px;">13-874-826</td>
			<td>Warm to 37 &#176;C before use</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:312px;">Thermomixer Heat Block</td>
			<td style="width:144px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:148px;">22670000</td>
			<td>Warm to 37 &#176;C before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Ultrapure DNA/RNAse free water</td>
			<td style="width:144px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:148px;">10977015</td>
			<td>Use at room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:312px;">D(+)-glucose, anhydrous</td>
			<td style="width:144px;">Sigma</td>
			<td style="width:148px;">G5767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">aprotinin from bovine lung</td>
			<td style="width:144px;">Sigma</td>
			<td style="width:148px;">A1153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">leupeptin hemisulfate</td>
			<td style="width:144px;">EMD</td>
			<td style="width:148px;">10-897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">L-ascorbic acid, reagent grade</td>
			<td style="width:144px;">Sigma</td>
			<td style="width:148px;">A0278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">(-)-isoproterenol (+)-bitartrate</td>
			<td style="width:144px;">Sigma</td>
			<td style="width:148px;">I2760</td>
			<td>Use fresh aliquot each experiment</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

g protein-selective gpcr conformations measured using fret sensors in a live cell suspension fluorometer assay

Fӧrster Resonanzenergietransfer (FRET) -basierte Studien immer häufiger bei der Untersuchung von GPCR-Signal geworden sind. Unsere Arbeitsgruppe entwickelte ein intramolekularen FRET-Sensor die Wechselwirkung zwischen Ga-Untereinheiten und GPCRs in lebenden Zellen nach Agonist Stimulation zu erkennen. Hier stellen wir ausführlich das Protokoll für die Veränderungen in der FRET zwischen dem β 2 -adrenergen Rezeptor und dem Gαs C-Terminus - Peptid bei der Behandlung mit 100 &amp; mgr; M Isoproterenolhydrochlorid Erfassen gekennzeichnet zuvor 1. Unsere FRET-Sensor ist ein einzelnes Polypeptid, das aus seriell von einer Volllängen-GPCR, einem FRET-Akzeptor-Fluorophor (mCitrine), eine ER / K SPASM (systematische Protein-Affinitätsstärke modulation) Linker, einem FRET-Donor-Fluorophor (mCerulean) und eine G &amp; agr; C -terminalen Peptid. Dieses Protokoll wird ausführlich Zellpräparation, Transfektionsbedingungen, Geräte-Setup, Testausführung und Datenanalyse. Dieses experimentelle Design erkennt kleine changes in FRET indikativ für Protein-Protein-Wechselwirkungen und kann auch verwendet werden, die Stärke der Interaktion zwischen den Liganden und GPCR-G-Protein-Paarungen zu vergleichen. Um das Signal-Rausch-in unseren Messungen zu verbessern, Dieses Protokoll erfordert erhöhte Präzision in allen Schritten, und wird hier präsentiert, um reproduzierbare Durchführung ermöglichen.

Eine verallgemeinerte schematische Darstellung des Versuchsaufbau und die Ausführung ist in Abbildung 3 beschrieben. Um eine FRET Änderung in dem schmalen Dynamikbereich des Sensors zu erfassen, ist es entscheidend für die Nuancen des Systems anhaften einzuhalten. Zellqualität ist zwingend notwendig , um die Proteinexpression sowie die Konsistenz bei der Probenahme. Abbildung 1 zeigt Bilder von kultivierten Zellen in einer konsistenten einschichtigen (10X) wachsen , die optimal ist für sechs Vertiefungen Plattierung und Transfektion 1 (a) und Zellen in verklumpten Muster wächst dass führen zu dendritischen Formen 1 (b) , die nicht für eine konsistente Plattieren empfohlen. Transfection Bedingungen können auch optimiert werden, um reproduzierbare Ausdruck zu erreichen. Mehrere Bedingungen wurden verwendet , hier für die empfohlene Transfektionsreagenz optimiert. Tabelle 1 Details diese Bedingungen für reduzierte Serum - Medien. DNA und Transfektion reagent Verhältnisse. Sobald alle Daten gesammelt und Daten eingegeben in die CSV - Datei für die Analyse (siehe Beispiel in Tabelle 3), die generierten Ergebnisse werden die Raw FRET - Spektren Daten in Abbildung 4 (a) und die normalisierte ähneln, mittlere FRET - Spektren in Abbildung gezeigt 4 (b). In Abbildung 4 sind die rot - Spektren sind die unbehandelten Proben und die blau sind die Arzneimittel - behandelten Proben. Das gesamte rohe FRET - Spektren in Abbildung 4 (a) eine ausreichende Signal-Rausch - Bereich für die Analyse konsistente Daten (dh., CPS bei 450 nm bei 475 nm zu CPS verglichen). Mit diesem Bereich sind die Spektren glatter und die Wasserspitze aus der Probe (Raman-Peak bei 500 nm) ist ebenfalls minimal. Niedrige Expressionsniveaus führen in exponierter Wasserspitze, die mit der Datenanalyse stört. Daten werden bei 475 nm normalisiert, die CPS dieser Wert auf 1,0 einstellen (4 (b)). In diesem Datensatz für die β 2 -AR-10 Nm-Gαs Peptidsensor, gibt es eine signifikante Änderung im nm 525 zwischen unbehandelten (rot) zu lesen und behandelt (blau) Proben. Die ΔFRET Änderung wird von den FRET-Verhältnisse (525 nm / 475 nm) dieser Datensätze berechnet und sind über die Ausgabedatei. Wenn die Proteinexpression niedrig ist, ist es schlechte Transfektionseffizienz oder niedrigen Zelldichte in der Küvette für Fluoreszenzmesswert, Spektren verrauschter erscheinen, wie in Figur 5 gezeigt ist . Im Vergleich auf Figur 4 (a) , um das Signal-Rausch - Bereich für diese Datensatz ist nicht ideal, bei etwa 1,0 -. 1.6, mit CPS max von 4 x 10 5 Dieser niedrige Expressionsniveau an den gezackten Spektren im Rohdaten 5 (a) gesehen trägt, aber die Daten sind eng und in der Lage zu sein , normalisierten Abbildung 5 (b). Obwohl die Wasserspitzen (~ 500 nm) auf einer Linie nicht vollständig zwischen Datensätzen Abbildung 5 (b) dieses experiment ist noch brauchbar für die Analyse. 6 ist repräsentativ für ein Experiment , das für die Analyse nicht ausreicht. Während das Signal-Rausch - der Probe beträgt etwa 2 - 3 für behandelte (blau) und unbehandelten (rot) Proben in der Küvette über Proben Zelldichte zu niedrig ist (450 nm - Wert von 1 x 10 5) 6 ( a). Dies schafft ein Problem in Untergrundsubtraktion und Normalisierung 6 (b) und die Spektren nicht übereinander ausrichten. Subtraktion kann für Proben eingestellt werden durch Erhöhen oder Verringern OD in Tabelle 3. Jedoch auch bei geringer Zelldichte, die Wasserspitze (~ 500 nm) wird wesentlich größer und verrauschter Figur 6 (c) und hemmt diesen Datensatz aus der weiteren Analyse. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54696/54696fig1.jpg" /> Abbildung 1. Beispiel Kultivierte Zellwachstum. Die Zellen in einer Monoschicht wächst (a) Sind für eine konsistente Beschichtung und Transfektion ideal. Zellen , die die Platte in sechs Brunnen möglicherweise nicht konsequent in Klumpen oder mit dendritischen Muster (b) zu wachsen scheinen, können eine schlechte Transfektionseffizienz, anzuzeigen und zu Inkonsistenzen in der Amplitude des FRET - Spektrum erzeugen können. Maßstabsbalken = 100 &amp; mgr; m. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54696/54696fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54696/54696fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/54696/54696fig4.jpg" /> Abbildung 4. Repräsentative Datenanalyse für β 2 -AR-10 nm-Gαs Peptid ± Drug. Repräsentative Bild von Rohdaten (a) und der normierten, gemittelten Daten (b) gesammelt , mit dem β 2 -AR-10 nm-Gαs Peptidsensor mit unbehandelten (rot) Proben und behandelt (blau) sspiele nach 5-minütiger Inkubation mit 100 &amp; mgr; M Isoproterenol Bitartrat. CFP max Emission bei 475 nm, YFP max Emission bei 525 nm. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54696/54696fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54696/54696fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/54696/54696fig5.jpg" /> Abbildung 5. Die Analyse der Schlechte Protein Expression mit Raw und normalisierten Daten. Lautes Rohdatenspektren (a) sind eine Folge der niedrigen Expressionsniveaus, niedrige Zelldichte pro Probe und / oder schlechte Transfektionseffizienz von Konstrukt. Dieser Datensatz ist noch interpretierbar als normiert (b), obwohl es nicht ideal ist. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54696/54696fig5large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54696/54696fig5large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Abbildung 6. Analyse der Low Zelldichte in Fluorometer Cuvette mit Raw und normalisierten Daten - Sets. Die geringe Zelldichte pro Probe, in Rohdaten gesehen (a) verkompliziert Wasser / Untergrundsubtraktion (b, c) und macht diesen Datensatz nicht interpretierbar. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54696/54696fig6large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54696/54696fig6large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Bedingung </td><td> 0.5x </td><td> 0.7x </td><td> 1x </td><td> 2x </td><td> 2x * </td></tr><tr><td> DNA </td><td> 1 &amp; mgr; g </td><td> 1,4 ug </td><td> 2 ug </td><td> 4 &amp; mgr; g </td><td> 4 &amp; mgr; g </td&gt; </tr><tr><td> Reduzierte Serum Medien </td><td> 100 ul </td><td> 70 ul </td><td> 100 ul </td><td> 100 ul </td><td> 200 ul </td></tr><tr><td> Transfektionsreagenz </td><td> 3 ul </td><td> 4,2 ul </td><td> 6 ul </td><td> 6 ul </td><td> 12 ul </td></tr><tr><td colspan="6"> * Anmerkung: Empfohlen für außerordentlich schwierig Konstrukt. Vorsicht muss genommen werden, da diese Bedingung Tod hohe Zelle induziert. </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Transfektionsbedingungen. Diese Tabelle enthält die optimierten Bedingungen von Reagenzien für die Transfektion in 2 ml Brunnen von HEK-293T - Zellen unter Verwendung der empfohlenen Transfektionsreagenz. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="2"> Zellenpuffer </td><td></td></tr><tr><td> Volumen </td><td> Reagens </td><td> Bemerkungen </td></tr><tr><td> 9 ml </td><td> Reinst-DNase / RNase freies Wasser </td><td></td></tr><tr><td> 1 ml </td><td> HBS (10x), pH 7,4, bei 4 ° C: </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 200 mM HEPES </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 50 mM KCl </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 450 mM NaCl </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 20 mM CaCl 2 - H 2 O </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 10 mM MgCl 2 - H 2 O </td><td></td></tr><tr><td> 100 ul </td><td> 20% D-Glucose </td><td></td></tr><tr><td> 15 ul </td><td> Aprotinin (1 mg / ml in dH 2 O) </td><td> verhindern Abbau </td></tr><tr><td> 15 ul </td><td> Leupeptin (1 mg / ml in dH 2 O) </td><td> verhindern Abbau </td&gt; </tr><tr><td> 100 ul </td><td> Ascorbinsäure (100 mM in dH 2 O) * </td><td> stabilisieren Agonisten </td></tr><tr><td></td><td> * In unmittelbar vor dem Test beginnen </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Drug Buffer </td><td></td></tr><tr><td> Volumen </td><td> Reagens </td><td> Bemerkungen </td></tr><tr><td> 9 ml </td><td> Reinst-DNase / RNase freies Wasser </td><td></td></tr><tr><td> 1 ml </td><td> HBS (10x), pH 7,4, bei 4 ° C: </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 200 mM HEPES </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 50 mM KCl </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 450 mM NaCl </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 20 mM CaCl 2 - H 2 O </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 10 mM MgCl &lt;sub&gt; 2 - H 2 O </td><td></td></tr><tr><td> 100 ul </td><td> Ascorbinsäure (100 mM in dH 2 O) * </td><td> stabilisieren Agonisten </td></tr><tr><td></td><td> * In unmittelbar vor dem Test beginnen </td><td></td></tr></tbody></table> Tabelle 2. Buffer Bestandteile enthalten. Diese Tabelle führt die Reagenzien verwendet , um sowohl die Zellenpuffer and Drug Puffer für im Experiment Gebrauch machen. Machen Sie beide Puffer frisch jeden Tag des Experiments; store Zellenpuffer bei 37 ° C und Drug Puffer bei Raumtemperatur. <img alt="Tabelle 3" src="/files/ftp_upload/54696/54696tbl3.jpg" /> Tabelle 3. Beispiel CSV Datei zur Analyse. Diese Beispieldatendatei hebt den Eintrag gesetzt , nachdem ein Experiment. Mehrere Experimente können in die gleiche CSV-Datei eingegeben werden und können unter dem &quot;Zusatzstoff&quot; Säule bei Bedarf zu erkennen. JederZeile muss mit folgenden Informationen ausgefüllt werden: Dateiname - individuelle SPC Graph Dateien Receptor - bezeichnen , die GPCR - Konstrukt getestet wurde (zB Β2) Binder - bezeichnen , die Peptidvariante des Konstrukts wurde untersucht (beispielsweise S) Agonist - bezeichnen unbehandelten (N) oder Arzneimittel behandelt (D) Bedingungen Directory - der Pfad Ordner, in dem SPC-Dateien gespeichert werden, in der Regel nach Datum sortiert OD - aufgezeichnet optische Dichte der Probe in Spektrophotometer <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54696/54696tbl3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54696/54696tbl3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Tabelle anzuzeigen.</a>

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G Protein-selective GPCR Conformations Measured Using FRET Sensors in a Live Cell Suspension Fluorometer Assay

Simple methods to detect the selective activation of G proteins by G protein-coupled receptors remain an outstanding challenge in cell signaling. Here, F&#1255;rster resonance energy transfer (FRET) biosensors have been developed by pairwise tethering a GPCR to G protein peptides to probe conformational changes at controlled concentrations in live cells.

G-Protein-selektive GPCR Konformationen gemessen mit FRET-Sensoren in einer Live Cell Suspension Fluorometer Assay

F&#1255;rster resonance energy transfer (FRET)-based studies have become increasingly common in the investigation of GPCR signaling. Our research group ...

g-protein-selective-gpcr-conformations-measured-using-fret-sensors

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

9.5K Aufrufe.  University of Minnesota. Simple methods to detect the selective activation of G proteins by G protein-coupled receptors remain an outstanding challenge in cell signaling. Here, Fӧrster resonance energy transfer (FRET) biosensors have been developed by pairwise tethering a GPCR to G protein peptides to probe conformational changes at controlled concentrations in live cells.

Serie: G Protein-selective GPCR Conformations Measured Using FRET Sensors in a Live Cell Suspension Fluorometer Assay

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes in cell surface area and cell height, and where cells undergo mitosis and migrate. Furthermore, epithelial cells can also regulate morphogenetic movements in adjacent tissues1. A traditional method to study epithelial cells and tissues involve chemical fixation and histological methods to determine cell morphology or localization of particular proteins of interest. These approaches continue to be useful and provide "snapshots" of cell shapes and tissue architecture, however, much remains to be understood about how cells acquire specific shapes, how various proteins move or localize to specific positions, and what paths cells follow toward their final differentiated fate. High resolution live imaging complements traditional methods and also allows more direct investigation into the dynamic cellular processes involved in the formation, maintenance, and morphogenesis of multicellular epithelial sheets. Here we demonstrate experimental methods from the isolation of animal cap tissues from Xenopus laevis embryos to confocal imaging of epithelial cells and simple measurement approaches that together can augment molecular and cellular studies of epithelial morphogenesis.

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Xenopus embryonic epithelia are an ideal model system to study cell behaviors such as polarity development and shape change during epithelial morphogenesis. Traditional histology of fixed samples is increasingly being complemented by live-cell confocal imaging. Here we demonstrate methods to isolate frog tissues and visualize live epithelial cells and their cytoskeleton using live-cell confocal microscopy.

Live-Cell-Imaging und Quantitative Analyse der embryonalen Epithelzellen in Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Forschung

Biologie

Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular environment. The Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay1 allows researchers to visualize protein-protein interactions in living cells and has become an essential research tool. This assay is based on the facilitated association of two fragments of a fluorescent protein (GFP) that are each fused to a potential interacting protein partner. The interaction of the two protein partners would facilitate the association of the N-terminal and C-terminal fragment of GFP, leading to fluorescence. For plant researchers, onion epidermal cells are an ideal experimental system for conducting the BiFC assay because of the ease in obtaining and preparing onion tissues and the direct visualization of fluorescence with minimal background fluorescence. The Helios Gene Gun (BioRad) is commonly used for bombarding plasmid DNA into onion cells. We demonstrate the use of Helios Gene Gun to introduce plasmid constructs for two interacting Arabidopsis thaliana transcription factors, SEUSS (SEU) and LEUNIG HOMOLOG (LUH)2 and the visualization of their interactions mediated by BiFC in onion epidermal cells.

Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

This article illustrates how to properly use the BioRad Helios Gene Gun to introduce plasmid DNA into onion epidermal cells and how to test for protein-protein interactions in onion cells based on the principle of Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC)

Bimolekularen Fluoreszenz Komplementation (BIFC) Assay für Protein-Protein-Wechselwirkungen in Onion Zellen unter Verwendung des Helios Gene Gun

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular ...

Imaging G-protein Coupled Receptor (GPCR)-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1. This guided cell migration is referred as chemotaxis, which is essential for various cells to carry out their functions such as trafficking of immune cells and patterning of neuronal cells 2, 3. A large family of G-protein coupled receptors (GPCRs) detects variable small peptides, known as chemokines, to direct cell migration in vivo 4. The final goal of chemotaxis research is to understand how a GPCR machinery senses chemokine gradients and controls signaling events leading to chemotaxis. To this end, we use imaging techniques to monitor, in real time, spatiotemporal concentrations of chemoattractants, cell movement in a gradient of chemoattractant, GPCR mediated activation of heterotrimeric G-protein, and intracellular signaling events involved in chemotaxis of eukaryotic cells 5-8. The simple eukaryotic organism, Dictyostelium discoideum, displays chemotaxic behaviors that are similar to those of leukocytes, and D. discoideum is a key model system for studying eukaryotic chemotaxis. As free-living amoebae, D. discoideum cells divide in rich medium. Upon starvation, cells enter a developmental program in which they aggregate through cAMP-mediated chemotaxis to form multicullular structures. Many components involved in chemotaxis to cAMP have been identified in D. discoideum. The binding of cAMP to a GPCR (cAR1) induces dissociation of heterotrimeric G-proteins into G&gamma; and G&beta;&gamma; subunits 7, 9, 10. G&beta;&gamma; subunits activate Ras, which in turn activates PI3K, converting PIP2 into PIP3 on the cell membrane 11-13. PIP3 serve as binding sites for proteins with pleckstrin Homology (PH) domains, thus recruiting these proteins to the membrane 14, 15. Activation of cAR1 receptors also controls the membrane associations of PTEN, which dephosphorylates PIP3 to PIP2 16, 17. The molecular mechanisms are evolutionarily conserved in chemokine GPCR-mediated chemotaxis of human cells such as neutrophils 18. We present following methods for studying chemotaxis of D. discoideum cells. 1. Preparation of chemotactic component cells. 2. Imaging chemotaxis of cells in a cAMP gradient. 3. Monitoring a GPCR induced activation of heterotrimeric G-protein in single live cells. 4. Imaging chemoattractant-triggered dynamic PIP3 responses in single live cells in real time. Our developed imaging methods can be applied to study chemotaxis of human leukocytes.

Imaging G-protein Coupled Receptor GPCR-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Here, we describe detailed live cell imaging methods for investigating chemotaxis. We present fluorescence microscopic methods to monitor spatiotemporal dynamics of signaling events in migrating cells. Measurement of signaling events permits us to further understand how a GPCR-signaling network achieves gradient sensing of chemoattractants and controls directional migration of eukaryotic cells.

Imaging G-Protein-gekoppelten Rezeptor (GPCR)-vermittelten Signaltransduktion, die Steuerung der Chemotaxis Dictyostelium discoideum</em

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1.  This guided cell migration is referred as ...

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring of biochemical and signaling events in live cells and tissues. Compared to classical biochemical methods, this novel technology is characterized by high temporal and spatial resolution. FRET experiments use various genetically-encoded biosensors which can be expressed and imaged over time in situ or in vivo1-2. Typical biosensors can either report protein-protein interactions by measuring FRET between a fluorophore-tagged pair of proteins or conformational changes in a single protein which harbors donor and acceptor fluorophores interconnected with a binding moiety for a molecule of interest3-4. Bimolecular biosensors for protein-protein interactions include, for example, constructs designed to monitor G-protein activation in cells5, while the unimolecular sensors measuring conformational changes are widely used to image second messengers such as calcium6, cAMP7-8, inositol phosphates9 and cGMP10-11. Here we describe how to build a customized epifluorescence FRET imaging system from single commercially available components and how to control the whole setup using the Micro-Manager freeware. This simple but powerful instrument is designed for routine or more sophisticated FRET measurements in live cells. Acquired images are processed using self-written plug-ins to visualize changes in FRET ratio in real-time during any experiments before being stored in a graphics format compatible with the build-in ImageJ freeware used for subsequent data analysis. This low-cost system is characterized by high flexibility and can be successfully used to monitor various biochemical events and signaling molecules by a plethora of available FRET biosensors in live cells and tissues. As an example, we demonstrate how to use this imaging system to perform real-time monitoring of cAMP in live 293A cells upon stimulation with a &beta;-adrenergic receptor agonist and blocker.

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy is a powerful technique for real-time monitoring of signaling events in live cells using various biosensors as reporters. Here we describe how to build a customized epifluorescence FRET imaging system from commercially available components and how to use it for FRET experiments.

FRET-Mikroskopie zur Echtzeit-Überwachung der Signalisierung Events in lebenden Zellen mit unimolekularen Biosensors

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

Live-Imaging von apoptotischen Ausverkauf während<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryogenese

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling processes. Extracting sterol-enriched membrane microdomains from plant cells for proteomic analysis is a difficult task mainly due to multiple preparation steps and sources for contaminations from other cellular compartments. The plasma membrane constitutes only about 5-20% of all the membranes in a plant cell, and therefore isolation of highly purified plasma membrane fraction is challenging. A frequently used method involves aqueous two-phase partitioning in polyethylene glycol and dextran, which yields plasma membrane vesicles with a purity of 95% 1. Sterol-rich membrane microdomains within the plasma membrane are insoluble upon treatment with cold nonionic detergents at alkaline pH. This detergent-resistant membrane fraction can be separated from the bulk plasma membrane by ultracentrifugation in a sucrose gradient 2. Subsequently, proteins can be extracted from the low density band of the sucrose gradient by methanol/chloroform precipitation. Extracted protein will then be trypsin digested, desalted and finally analyzed by LC-MS/MS. Our extraction protocol for sterol-rich microdomains is optimized for the preparation of clean detergent-resistant membrane fractions from Arabidopsis thaliana cell cultures.
We use full metabolic labeling of Arabidopsis thaliana suspension cell cultures with K15NO3 as the only nitrogen source for quantitative comparative proteomic studies following biological treatment of interest 3. By mixing equal ratios of labeled and unlabeled cell cultures for joint protein extraction the influence of preparation steps on final quantitative result is kept at a minimum. Also loss of material during extraction will affect both control and treatment samples in the same way, and therefore the ratio of light and heave peptide will remain constant. In the proposed method either labeled or unlabeled cell culture undergoes a biological treatment, while the other serves as control 4.

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Here we describe a robust method for the fractionation of plant plasma membranes into detergent resistant and detergent soluble membranes based on a mixture of unlabeled and in vivo fully 15N labeled Arabidopsis thaliana cell cultures. The procedure is applied for comparative proteomic studies to understand signaling processes.

Metabolische Markierung und Membran Fraktionierung für Vergleichende Proteomanalyse von<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Fahrwerk Zellkulturen

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling ...

Single-cell Microinjection for Cell Communication Analysis

Gap junctions are intercellular channels that allow the communication of neighboring cells. This communication depends on the contribution of a hemichannel by each neighboring cell to form the gap junction. In mammalian cells, the hemichannel is formed by six connexins, monomers with four transmembrane domains and a C and N terminal within the cytoplasm. Gap junctions permit the exchange of ions, second messengers, and small metabolites. In addition, they have important roles in many forms of cellular communication within physiological processes such as synaptic transmission, heart contraction, cell growth and differentiation. We detail how to perform a single-cell microinjection of Lucifer Yellow to visualize cellular communication via gap-junctions in living cells. It is expected that in functional gap junctions, the dye will diffuse from the loaded cell to the connected cells. It is a very useful technique to study gap junctions since you can evaluate the diffusion of the fluorescence in real time. We discuss how to prepare the cells and the micropipette, how to use a micromanipulator and inject a low molecular weight fluorescent dye in an epithelial cell line.

We describe here how to perform a single-cell microinjection of Lucifer Yellow to visualize cellular communication via gap-junctions in living cells, and provide some useful tips. We expect that this paper will help everyone to evaluate the degree of cellular coupling due to functional gap junctions. Everything described here could be, in principle, adapted to other fluorescent dyes with molecular weight below 1,000 Daltons.

Einzellige Mikroinjektions für Zellkommunikationsanalyse

Gap junctions are intercellular channels that allow the communication of neighboring cells. This communication depends on the contribution of a ...

LDL Cholesterol Uptake Assay Using Live Cell Imaging Analysis with Cell Health Monitoring

The regulation of LDL cholesterol uptake through LDLR-mediated endocytosis is an important area of study in various major pathologies including metabolic disorder, cardiovascular disease, and kidney disease. Currently, there is no available method to assess LDL uptake while simultaneously monitoring for health of the cells. The current study presents a protocol, using a live cell imaging analysis system, to acquire serial measurements of LDL influx with concurrent monitoring for cell health. This novel technique is tested in three human cell lines (hepatic, renal tubular epithelial, and coronary artery endothelial cells) over a four-hour time course. Moreover, the sensitivity of this technique is validated with well-known LDL uptake inhibitors, Dynasore and recombinant PCSK9 protein, as well as by an LDL uptake promoter, Simvastatin. Taken together, this method provides a medium-to-high throughput platform for simultaneously screening pharmacological activity as well as monitoring of cell morphology, hence cytotoxicity of compounds regulating LDL influx. The analysis can be used with different imaging systems and analytical software.

This protocol provides an efficient approach to measuring LDL cholesterol uptake with real time influx rates using a live cell imaging system in various cell types. This technique provides a platform to screen the pharmacological activity of compounds affecting LDL influx while monitoring for cell morphology and hence potential cytotoxicity.

LDL-Cholesterin-Aufnahme-Assay mit Live Cell Imaging-Analyse mit Zelle Systemüberwachung

The regulation of LDL cholesterol uptake through LDLR-mediated endocytosis is an important area of study in various major pathologies including metabolic ...

FLIM-FRET Measurements of Protein-Protein Interactions in Live Bacteria.

Protein-protein interactions (PPIs) control various key processes in cells. Fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) combined with F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) provide accurate information about PPIs in live cells. FLIM-FRET relies on measuring the fluorescence lifetime decay of a FRET donor at each pixel of the FLIM image, providing quantitative and accurate information about PPIs and their spatial cellular organizations. We propose here a detailed protocol for FLIM-FRET measurements that we applied to monitor PPIs in live Pseudomonas aeruginosa in the particular case of two interacting proteins expressed with highly different copy numbers to demonstrate the quality and robustness of the technique at revealing critical features of PPIs. This protocol describes in detail all the necessary steps for PPI characterization - starting from bacterial mutant constructions up to the final analysis using recently developed tools providing advanced visualization possibilities for a straightforward interpretation of complex FLIM-FRET data.

We describe here a protocol to characterize protein-protein interactions between two highly-differently expressed proteins in live Pseudomonas aeruginosa using FLIM-FRET measurements. The protocol includes bacteria strain constructions, bacteria immobilization, imaging and post-imaging data analysis routines.

FLIM-FRET Messungen von Protein-Protein-Wechselwirkungen in lebenden Bakterien.

Protein-protein interactions (PPIs) control various key processes in cells. Fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) combined with F&#246;rster ...

Real-Time Monitoring of Aurora kinase A Activation using Conformational FRET Biosensors in Live Cells

Epithelial cancers are often hallmarked by the overexpression of the Ser/Thr kinase Aurora A/AURKA. AURKA is a multifunctional protein that activates upon its autophosphorylation on Thr288. AURKA abundance peaks in mitosis, where it controls the stability and the fidelity of the mitotic spindle, and the overall efficiency of mitosis. Although well characterized at the structural level, a consistent monitoring of the activation of AURKA throughout the cell cycle is lacking. A possible solution consists in using genetically-encoded F&#246;rster&#8217;s Resonance Energy Transfer (FRET) biosensors to gain insight into the autophosphorylation of AURKA with sufficient spatiotemporal resolution. Here, we describe a protocol to engineer FRET biosensors detecting Thr288 autophosphorylation, and how to follow this modification during mitosis. First, we provide an overview of possible donor/acceptor FRET pairs, and we show possible cloning and insertion methods of AURKA FRET biosensors in mammalian cells. Then, we provide a step-by-step analysis for rapid FRET measurements by fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) on a custom-built setup. However, this protocol is also applicable to alternative commercial solutions available. We conclude by considering the most appropriate FRET controls for an AURKA-based biosensor, and by highlighting potential future improvements to further increase the sensitivity of this tool.

The activation of the multifunctional Ser/Thr kinase AURKA is hallmarked by its autophosphorylation on Thr288. Fluorescent probes relying on FRET can discriminate between its inactive and activated states. Here, we illustrate some strategies for probe engineering, together with a rapid FRET protocol to follow the kinase activation throughout mitosis.

Echtzeitüberwachung der Aktivierung der Aurora-Kinase A mit konformationellen FRET-Biosensoren in lebenden Zellen

Epithelial cancers are often hallmarked by the overexpression of the Ser/Thr kinase Aurora A/AURKA. AURKA is a multifunctional protein that activates upon ...