This work was supported by core facilities of the Center for Translational Neuroscience supported by NIH award P20 GM103425 and P30 GM110702 to Dr. Garcia-Rill. This work was also supported by grants from FONCYT-Agencia Nacional de Promoci&#242;n Cient&#236;fica y Tecnol&#242;gica; BID 1728 OC.AR. PICT-2012-1769 and UBACYT 2014-2017 #20120130101305BA (to Dr. Urbano).

כל פרוטוקולי הניסוי אושרו על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים השתמש מאוניברסיטת ארקנסו למדעי הרפואה (# מספר פרוטוקול 3593) והם היו תמימי דעים עם ה- National Institutes of הנחיות בריאות לטיפול ולשימוש בחיות מעבדה. 1. הכנת הנוזל השדרתי תקן-מלאכותי (aCSF) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת מאגר הפתרון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 700 מ&quot;ל מים מזוקקים מבחנה 1 L נקי לפני הוספת כימיקלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תוך ערבוב נפח ברציפות של 500 מ&quot;ל, להוסיף 136.75 גרם של NaCl, 6.99 גרם של KCl, 2.89 גרם של MgSO 4, ו 2.83 גרם של לאא 2 PO 4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים מים מזוקקים יותר להגיע נפח סופי של 1 ל לאחר דילול, את הריכוז הסופי של כל המתחם הוא 117 מ&quot;מ NaCl, 4.69 מ&quot;מ KCl, 1.2 מ&quot;מ MgSO 4, ו 1.18 מ&quot;מ לאא 2 PO 4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשמור בקירור ב 4 ° C עד 2 שבועות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת מאגר הפתרון B <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 700 מ&quot;ל מים מזוקקים מבחנה 1L נקי לפני הוספת כימיקלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תוך ערבוב נפח ברציפות של 500 מ&quot;ל, להוסיף 41.45 גרם של D-גלוקוז 41.84 גרם של NaHCO 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים מים מזוקקים יותר להגיע נפח סופי של 1 ל לאחר דילול, את הריכוז הסופי של כל המתחם הוא 11.5 מ&quot;מ D- גלוקוז ו -24.9 מ&quot;מ NaHCO 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשמור בקירור ב 4 ° C עד 2 שבועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני כל תערובת הניסוי 50 מ&quot;ל של המניה עם 50 מ&quot;ל המניה B ומביאים 1 ליטר עם מים מזוקקים כדי להשיג פתרון aCSF הריכוז הסופי ולהשאיר ב RT בעוד ברציפות מחמצנים אותו עם carbogen (95% O 2 - 5% CO 2 תערובת) לפחות 30 דקות. כן aCSF לריכוז סופי רק בתחילת כל ניסוי וזורק בסוף היום. </li></ol></li></ol> 2. הכנת הנוזל השדרתי סוכרוז-מלאכותית(סוכרוז-aCSF) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת מאגר הפתרון C <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 700 מ&quot;ל מים מזוקקים מבחנה 1 L נקי לפני הוספת כימיקלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תוך ערבוב רציף 500 מ&quot;ל מים מזוקקים, להוסיף 240 גרם של סוכרוז, 6.55 גרם של 3 NaHCO, 0.671 גרם של KCl, 4.88 גרם של MgCl 2, 0.22 גר &#39;CaCl 2 ו 0.21 גרם של חומצה אסקורבית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים מים מזוקקים יותר להגיע נפח סופי של 1 ל לאחר דילול, את הריכוז הסופי של כל המתחם הוא סוכרוז 701.1 מ&quot;מ, 78 מ&quot;מ 3 NaHCO, 9 מ&quot;מ KCl, 24 מ&quot;מ MgCl 2, 1.5 מ&quot;מ CaCl 2 ו -1.2 מ&quot;מ חומצה אסקורבית . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור C פתרון המניה ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד שבוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני כל תערובת הניסוי 300 מ&quot;ל של 50 מ&quot;ל של C המניות עם 600 מ&quot;ל מים מזוקקים כדי להשיג את הפתרון סוכרוז-aCSF בריכוז הסופי ולהשאיר ב RT בעוד ברציפות מחמצנים אותו עם carbogen (95% O 2 - 5% CO 2 תערובת) לפחות 30 דקות. </li></ol&gt; </li></ol> 3. הכנת Slice <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים כוס נקי עם 100 מ&quot;ל תמיסת סוכרוז-aCSF בקרח תוך חמצון זה עם carbogen ולתקן את ה- pH 7.4 באמצעות מד pH תוך הוספת כמה טיפות של 0.1 פתרון M NaOH (כאשר pH &lt;7.4) או 0.1 פתרון M HCl (כאשר pH&gt; 7.4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו את תא חיתוך של vibratome עם-aCSF סוכרוז חמצן זה. הפעל את מערכת הקירור מבוסס גליצרול מצמידה את תא החיתוך ולחכות 15 דקות כדי לאפשר לו להתקרר ל 4 - 0 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים גורי חולדה (בגילאי 9 עד 12 ממבוגר מתוזמן בהריון חולדות Sprague-Dawley) עם קטמין (70 מ&quot;ג / ק&quot;ג, IP; באמצעות &lt;50 μl נפח סופי). כאשר הגור הוא רגוע, בדוק היטב כי רפלקס הזנב קמצוץ נעדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לערוף גורים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את עור ראש longitudinally מן מלפנים לאחור באמצעות סכין אזמל פלדת פחמן, ולמשוך את העור לצדדים באמצעות מלקחיים. חותכים את העצם המכסה את המוח הזזת SCissors רוחבית לחלוטין להסיר אותו כדי לחשוף את המוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ואז, במהירות להסיר את המוח בעזרת מרית (להציב תחילה תחת נורת חוש הריח כדי לדחוף את המוח בעדינות מן המקורי ביותר כלפי אזורי הזנב ביותר). דחף בעדינות את המוח לתוך הנוזל השדרתי מלאכותי סוכרוז מחומצן מקורר קרח (סוכרוז-aCSF). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצוע חתך parasagittal על האונה הימנית (הסרה כשליש האונה), ודבק בצד הגזוז של המוח על גבי דיסק מתכתי שייקבע מגנטי לתא החיתוך של vibroslicer לחתוך חלקי sagittal 400 מיקרומטר המכילים את גרעין pedunculopontine (PPN). שמור פרוסות של HBC ב RT במשך 45 דקות לפני הקלטות תיקון- clamp כל תא. </li></ol> 4. תנודות הקלטות גמא-band ב Slices של HBC <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת הפתרון תאי אשלגן גלוקונאט (High-K + פתרון) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים בקרח בכוס נקייה עם 10 מ&quot;ל מים מזוקקים. תוך ערבוב רציף להוסיף: K + -gluconate, 90.68 מ&quot;ג phosphocreatine di טריס מלח, 47.66 HEPES מ&quot;ג, 1.5 מ&quot;ג EGTA, 40.58 מ&quot;ג Mg 2+ -ATP, ו -4 מ&quot;ג Na + 2 -GTP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם ל- pH 7.3 עם KOH (100 מ&quot;מ במים מזוקקים). מוסיפים מים מזוקקים כדי להגיע נפח סופי של 20 מ&quot;ל. במידת הצורך, להתאים osmolarity עם סוכרוז (100 מ&quot;מ במים מזוקקים) להיות 280 - 290 mOsm. לאחר דילול, את הריכוז הסופי של כל המתחם הוא 124 מ&quot;מ K + -gluconate, 10 מ&quot;מ phosphocreatine di טריס מלח, 10 HEPES מ&quot;מ, 0.2 מ&quot;מ EGTA, 4 מ&quot;מ Mg 2+ -ATP, ו -0.3 מ&quot;מ Na + 2 -GTP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרונות תאיים Aliquot ב 1 מ&quot;ל צינורות ולהקפיא ב -20 ° C. השתמש aliquot אחד ליום ולשמור על 4 מעלות צלזיוס במהלך הניסויים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקלטות כל תא צמד תיקון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים פרוסות בתא טבילה ו perfuse אותם (1.5 מ&quot;ל / דקה) עם מחומצן(95% O 2 - 5% CO 2) aCSF המכיל את אנטגוניסטים לקולטן הבאים: אנטגוניסט לרצפטור NMDA סלקטיבית חומצה 2-אמינו-5-phosphonovaleric (APV, 40 מיקרומטר), תחרותי קולטן הגלוטמט AMPA / Kainate אנטגוניסט 6-cyano-7- nitroquinoxaline-2,3-Dione (CNQX, 10μM), סטריכנין אנטגוניסט לרצפטור גליצין (STR, 10 מיקרומטר), ה GABA ספציפית gabazine אנטגוניסט לקולטן (GBZ, 10 מיקרומטר), ו tetrodotoxin חוסם ערוץ נתרן (TTX, 3μM) הערה: התוצאות והדמויות, אנטגוניסטים אלה יכונו חוסמי הסינפטי כמו או SBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא את טפטפות תיקון הקלטה (התנגדות 2-7 MΩ; עשוי קבועות, זמין נימי זכוכית בורוסיליקט קיר עבות המסחרי של 1.0 מ&quot;מ קוטר חיצוני 0.6 מ&quot;מ קוטר פנימי) עם פתרון גבוה K + תאי באמצעות זמינים מסחריים תופסי תיקון- פיפטה עם מסנן פתרון. הכנס את פיפטה מחזיק של המגבר שלה. למרוח קופה קטנהלחץ itive באמצעות מזרק 1 מ&quot;ל מחובר לבעל פיפטה באמצעות צינורית סיליקון מחוברת שסתום משולשת. חבר את הגב של בעל פיפטה מגבר מהדק תיקון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזז את פיפטה הקלטה באמצעות micromanipulator מכני ליד הגרעין של HBC באמצעות המטרה 4X בשילוב לאופטיקה התערבות ההפרש לעומת זאת האינפרה-אדום הקרוב. הערה: הגרעין של HBC ניתן לצפות הגבי פרוסות אל peduncle המוח הקטן המעולה (SCP; הנצפה כמו צרור עבה של אקסונים). טפטפות הקלטה אותרו PPN pars compacta, הנמצא מיד הגב עד הסוף האחורי של peduncle. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תביא פיפטה ההקלטה במגע עם הנוירון של HBC בעוד דמיין באמצעות עדשת טבילה במים 40X, במהירות להחיל יניקה שלילית כדי ליצור חותם עם התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בתוכנה חותמת מתח- clamp לפקח התנגדות פיפטה במהלך יניקה שלילית באמצעות הפרוטוקול של היצרן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר s שליליuction הוא גדל לאט ערכי התנגדות יושבים וקוראים ליד צג תיקון- clamp על קצה פיפטה להגיע 80 - 100 mOhm, במהירות לשנות את פוטנציאל ההחזקה כדי -50 mV ולשחרר את הלחץ השלילי. התחל ברציפויות החלת יניקה שלילית עד פקיעת גישת הקרום והחשמלי של נוירון מושגת בתצורת כל התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם ערכי התנגדות הגישה נמדדו על ידי התוכנה חותם מתח- הידוק 10 mOhm ומעלה, ואז להמשיך וליישם יניקה שלילית בכמויות קטנות יותר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפצות קיבול (כלומר, הארעיים איטיים ומהירים ציינו לאחר פקיעת הקרום של התא) והתנגדות סדרה במצב מתח- clamp. חלף מצב הקלטת מהדק נוכחי, ולפצות ערכי גשר במהירות (למשל, להעביר ידית מגבר או לחץ על תפריט הפיצוי האוטומטי באמצעות עכבר computer&#39;s). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפקח באופן רציף פוטנציאל הממברנה במנוחה של נוירון PPN מוקלט uלשיר פרוטוקול של היצרן. אם נחים משמרת פוטנציאל הממברנה לערכים depolarizing או hyperpolarizing, אז השתמשו בכמות קטנה של זרם חשמלי קבוע (עד 100 PA) כדי לשמור על הערך הסופי אופטימלי -50 mV. הערה: שמור נוירונים של HBC רק עם פוטנציאל הממברנה המנוחה יציבה (RMP) של -48 mV או יותר hyperpolarized (כלומר, RMP &lt;-48 mV). </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Profice, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurophysiological+evaluation+of+the+pedunculopontine+nucleus+in+humans.">Neurophysiological evaluation of the pedunculopontine nucleus in humans.</a> J. Neural. Transm (Vienna). 118 (10), 1423-1429 (2011).</li><li>Steriade, M., Datta, S., Pare, D., Oakson, G., Curro Dossi, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+activities+in+brain-stem+cholinergic+nuclei+related+to+tonic+activation+processes+in+thalamocortical+systems.">Neuronal activities in brain-stem cholinergic nuclei related to tonic activation processes in thalamocortical systems.</a> J. Neurosci. 10 (8), 2541-2559 (1990).</li><li>Steriade, M., Dossi, R. C., Pare, D., Oakson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+oscillations+(20-40+Hz)+in+thalamocortical+systems+and+their+potentiation+by+mesopontine+cholinergic+nuclei+in+the+cat.">Fast oscillations (20-40 Hz) in thalamocortical systems and their potentiation by mesopontine cholinergic nuclei in the cat.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88 (10), 4396-4400 (1991).</li><li>Deurveilher, S., Hennevin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lesions+of+the+pedunculopontine+tegmental+nucleus+reduce+paradoxical+sleep+(PS)+propensity:+evidence+from+a+short-term+PS+deprivation+study+in+rats.">Lesions of the pedunculopontine tegmental nucleus reduce paradoxical sleep (PS) propensity: evidence from a short-term PS deprivation study in rats.</a> Eur. J. Neurosci. 13 (10), 1963-1976 (2001).</li><li>Steriade, M., Pare, D., Datta, S., Oakson, G., Curro Dossi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+cellular+types+in+mesopontine+cholinergic+nuclei+related+to+ponto-geniculo-occipital+waves.">Different cellular types in mesopontine cholinergic nuclei related to ponto-geniculo-occipital waves.</a> J. Neurosci. 10 (8), 2560-2579 (1990).</li><li>Steckler, T., Inglis, W., Winn, P., Sahgal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pedunculopontine+tegmental+nucleus:+a+role+in+cognitive+processes?.">The pedunculopontine tegmental nucleus: a role in cognitive processes?.</a> Brain Res. Brain Res. Rev. 19 (3), 298-318 (1994).</li><li>Garcia-Rill, E., Simon, C., Smith, K., Kezunovic, N., Hyde, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pedunculopontine+tegmental+nucleus:+from+basic+neuroscience+to+neurosurgical+applications:+arousal+from+slices+to+humans:+implications+for+DBS.">The pedunculopontine tegmental nucleus: from basic neuroscience to neurosurgical applications: arousal from slices to humans: implications for DBS.</a> J. Neural. Transm. 118 (10), 1397-1407 (2011).</li><li>Mazzone, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implantation+of+human+pedunculopontine+nucleus:+a+safe+and+clinically+relevant+target+in+Parkinson's+disease.">Implantation of human pedunculopontine nucleus: a safe and clinically relevant target in Parkinson's disease.</a> Neuroreport. 16 (17), 1877-1881 (2005).</li><li>Simon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gamma+band+unit+activity+and+population+responses+in+the+pedunculopontine+nucleus.">Gamma band unit activity and population responses in the pedunculopontine nucleus.</a> J. Neurophysiol. 104 (1), 463-474 (2010).</li><li>Kezunovic, N., Urbano, F. J., Simon, C., Hyde, J., Smith, K., Garcia-Rill, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+behind+gamma+band+activity+in+pedunculopontine+nucleus+(PPN).">Mechanism behind gamma band activity in pedunculopontine nucleus (PPN).</a> Eur. J. Neurosci. 34 (3), 404-415 (2011).</li><li>Hyde, J. R., Kezunovic, N., Urbano, F. J., Garcia-Rill, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+properties+of+high+speed+calcium+oscillations+in+the+pedunculopontine+nucleus.">Spatiotemporal properties of high speed calcium oscillations in the pedunculopontine nucleus.</a> J. Appl. Physiol (1985). 115 (9), 1402-1414 (2013).</li><li>Llinas, R. R., Leznik, E., Urbano, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+binding+via+cortical+coincidence+detection+of+specific+and+nonspecific+thalamocortical+inputs:+a+voltage-dependent+dye-imaging+study+in+mouse+brain+slices.">Temporal binding via cortical coincidence detection of specific and nonspecific thalamocortical inputs: a voltage-dependent dye-imaging study in mouse brain slices.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (1), 449-454 (2002).</li><li>Boucetta, S., Cisse, Y., Mainville, L., Morales, M., Jones, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discharge+profiles+across+the+sleep-waking+cycle+of+identified+cholinergic,+gabaergic,+and+glutamatergic+neurons+in+the+pontomesencephalic+tegmentum+of+the+rat.">Discharge profiles across the sleep-waking cycle of identified cholinergic, gabaergic, and glutamatergic neurons in the pontomesencephalic tegmentum of the rat.</a> J. Neurosci. 34 (13), 4708-4727 (2014).</li><li>Datta, S., Siwek, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+activity+patterns+of+pedunculopontine+tegmentum+neurons+across+the+sleep-wake+cycle+in+the+freely+moving+rats.">Single cell activity patterns of pedunculopontine tegmentum neurons across the sleep-wake cycle in the freely moving rats.</a> J. Neurosci. Res. 70 (4), 79-82 (2002).</li><li>Datta, S., Siwek, D. F., Stack, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+cholinergic+and+non-cholinergic+neurons+in+the+pons+expressing+phosphorylated+cyclic+adenosine+monophosphate+response+element-binding+protein+as+a+function+of+rapid+eye+movement+sleep.">Identification of cholinergic and non-cholinergic neurons in the pons expressing phosphorylated cyclic adenosine monophosphate response element-binding protein as a function of rapid eye movement sleep.</a> Neuroscience. 163 (1), 397-414 (2009).</li><li>Kayama, Y., Ohta, M., Jodo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Firing+of+'possibly'+cholinergic+neurons+in+the+rat+laterodorsal+tegmental+nucleus+during+sleep+and+wakefulness.">Firing of 'possibly' cholinergic neurons in the rat laterodorsal tegmental nucleus during sleep and wakefulness.</a> Brain Res. 569 (2), 210-220 (1992).</li><li>Sakai, K., El Mansari, M., Jouvet, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+by+carbachol+microinjections+of+presumptive+cholinergic+PGO-on+neurons+in+freely+moving+cats.">Inhibition by carbachol microinjections of presumptive cholinergic PGO-on neurons in freely moving cats.</a> Brain Res. 527 (2), 213-223 (1990).</li><li>Lindsley, D. B., Bowden, J. W., Magoun, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+upon+the+EEG+of+acute+injury+to+the+brainstem+activating+system.">Effect upon the EEG of acute injury to the brainstem activating system.</a> Electroenceph. Clin. Neurophysiol. 1 (4), 475-486 (1949).</li><li>Moruzzi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sleep-waking+cycle.">The sleep-waking cycle.</a> Ergeb. Physiol. 64, 1-165 (1972).</li><li>Moruzzi, G., Magoun, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+stem+reticular+formation+and+activation+of+the+EEG.">Brain stem reticular formation and activation of the EEG.</a> Electroenceph. Clin. Neurophysiol. 1 (4), 455-473 (1949).</li><li>Steriade, M., Constantinescu, E., Apostol, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlations+between+alterations+of+the+cortical+transaminase+activity+and+EEG+patterns+of+sleep+and+wakefulness+induced+by+brainstem+transections.">Correlations between alterations of the cortical transaminase activity and EEG patterns of sleep and wakefulness induced by brainstem transections.</a> Brain Res. 13 (1), 177-180 (1969).</li><li>Ishibashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orexin+receptor+activation+generates+gamma+band+input+to+cholinergic+and+serotonergic+arousal+system+neurons+and+drives+an+intrinsic+Ca2++-dependent+resonance+in+LDT+and+PPT+cholinergic+neurons.">Orexin receptor activation generates gamma band input to cholinergic and serotonergic arousal system neurons and drives an intrinsic Ca2+ -dependent resonance in LDT and PPT cholinergic neurons.</a> Frontiers Neurol. 6, e120 (2015).</li><li>Brown, R. E., Winston, S., Basheer, R., Thakkar, M. M., McCarley, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+characterization+of+neurons+in+the+dorsolateral+pontine+REM+sleep+induction+zone+of+the+rat:+intrinsic+membrane+properties+and+responses+to+carbachol+and+orexins.">Electrophysiological characterization of neurons in the dorsolateral pontine REM sleep induction zone of the rat: intrinsic membrane properties and responses to carbachol and orexins.</a> Neuroscience. 143 (3), 739-755 (2006).</li><li>Goetz, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+role+of+the+pedunculopontine+nucleus+and+mesencephalic+reticular+formation+in+locomotion+in+non-human+primates.">On the role of the pedunculopontine nucleus and mesencephalic reticular formation in locomotion in non-human primates.</a> J. Neurosci. 36 (18), 4917-4929 (2016).</li><li>Fraix, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pedunculopontine+nucleus+area+oscillations+during+stance,+stepping+and+freezing+in+Parkinson's+disease.">Pedunculopontine nucleus area oscillations during stance, stepping and freezing in Parkinson's disease.</a> PLOS ONE. 8 (12), e83919 (2013).</li><li>Luster, B., Hyde, J., D'Onofrio, S., Urbano, F. J., Garcia-Rill, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+behind+gamma+band+activity+in+the+pedunculopontine+nucleus+(PPN).">Mechanisms behind gamma band activity in the pedunculopontine nucleus (PPN).</a> Abstr Soc Neurosci. 38, 257.20 (2014).</li><li>Luster, B., D'Onofrio, S., Urbano, F. J., Garcia-Rill, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-threshold+Ca2++channels+behind+gamma+band+activity+in+the+pedunculopontine+nucleus+(PPN).">High-threshold Ca2+ channels behind gamma band activity in the pedunculopontine nucleus (PPN).</a> Physiol. Rep. 3 (6), e12431 (2015).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

יש PPN נוירונים נכסים מהותיים המאפשרים להם לירות פוטנציאל פעולה בתדרי להקה בטא / גמא במהלך הקלטות vivo ב מחיות שהן ערות או במהלך שנת רע&quot;מ, אבל לא בזמן שנת גל איטי 2,3,5,13-17. חוקרים אחרים הראו transections גזע המוח כי יותר רמות קדמיות מאשר PPN מופחת תדרי גמא במהלך הקלטות EEG. עם זאת, כאשר נגעים בגזע המוח אחוריים שבו גרעין זה ממוקם, הגירוי הישיר של HBC מותר הביטוי של פעילות גמא קליפת מוח על EEG 2,3,5,18-21. הלהקה גמא פעילות עצבית דווחה העכבר של HBC במבחנה 22, באזור שינה אינדוקציה עכברוש REM (שאליו PPN פרויקטים 23), אצל החתול in vivo 3, באזור של HBC אצל פרימטים כאשר locomoting 24, ו באזור של של HBC בבני אדם במהלך דריכה 25. כלומר, יש מספיק ראיות עבור i פעילות הלהקה גמאn את PPN פני מינים. פרוטוקול הניסוי הזה המפורט כאן מותר בתיאור תנודות גמא נוכחים בכל סוגי תאי עכברוש מאת HBC 10. למעשה, תנודות גמא בסיסיות מנגנונים מהותיים תוארו להיות נוכח בכל נוירון של HBC (בעוד תאים ברחבי PPN אינם חולקים רכוש), ללא קשר וסיווגים קודמים או סוג משדר הסינפטי: סוג I, II או III, או משדר סוג, כולינרגית, glutamatergic או GABAergic חולקים את אותה הלהקה גמא ן המניב 10. שימוש רמפות נוכחיות יש ההגבלה של הדורשים ניטור רציף של פוטנציאל הממברנה במנוחה, ופיצוי גשר קבוע לאורך הניסוי. במקרים מסוימים, רמפות קצרות יותר מאשר 1 שניות נצפו לא להפעיל באופן מלא את ערוצי סידן מתח מגודר, בעוד משכי רמפה של 5 שניות או יותר ביאה לשינויי התנגדות הממברנה כי יישארו ללא פיצוי במהלך הניסוי. במקרה no תנודות גמא נצפו, התאמות קטנות משך רמפה יכולות לשפר אמפליטודות תנודת להקת גמא. שילוב depolarizing-רמפות נוכחיות עם רעלים ספציפיים שתארנו כי ולהעניק להן משקל חשוב של תאים של HBC (~ 50%) חסימת N-ו-ע / Q-type (הוא באמצעות ω-CgTx ו ω-אגא) ערוצי סידן ערוצי תנודת גמא מופחתים משרעת, אשר מאפשרים לנו מסווג אותם P / Q- ותאים מסוג n. בתאים אחרים (20%), תנודות גמא הושפעו רק על ידי ω-אגא, דבר המצביע על כך שתאים אלה באים לידי ביטוי רק P / ערוצי Q-type. בשאר התאים (30%) רק ω-CgTx חסם אותם, דבר המצביע על אלה נוירונים של HBC היו ערוצי N-סוג בלבד. תוצאות אלו אישרו את נוכחותם של תאים של HBC כי להפגין תנודות הלהקה גמא דרך הביטוי של תעלות סידן מתח מגודרת שונים 26,27. פרוטוקול חדש זה יכול להיחשב גם כלי מרכזי שאפשר ההקדמה של typ הסלולרי החדש של HBCסיווג דואר לשדה. למעשה, הוצע כי N הקלד נוירונים של HBC יורים רק במהלך שנת REM ( &quot;REM-על&quot;), P / Q הקלד בזמן ערות ( &quot;Wake-on&quot;), או מסוג n + P / Q-type במהלך שתי ערות לשינה REM ( &quot;שרות / REM-על&quot;) 26,27. יתר על כן, פרוטוקול זה יכול לשמש בניסויים עתידיים לתאר פעילות תנודתית ב אזורי מוח אחרים וכדי להדגים את מאפייני הפנימי מפעיל אותם.

גרעין של HBC כלול אנטומית של tegmentum mesencephalic הזנב. PPN הוא מרכיב מרכזי של RAS 1. PPN משתתף בשמירה על מדינות מופעלות התנהגותיות (כלומר, להעיר, רע&quot;מ) 2. גירוי חשמלי של PPN in vivo המושרה תנודה מהירה (20 - 40 Hz) ב EEG קליפת המוח 3, בעוד נגעים של HBC הבילטרלי עכברוש צומצמו או בוטלו רע&quot;מ 4. בעוד שרוב הנוירונים של HBC לירות פוטנציאל פעולה ב בטא / תדר גמא-band (20 - 80 הרץ), כמה נוירונים מוצגים שיעורים נמוכים של ירי ספונטני (&lt;10 Hz) 5. יתר על כן, של HBC נראה מעורב בהיבטים אחרים של התנהגות כגון מוטיבציה ותשומת לב 6. בתדירות גבוהה ישיר (40 - 60 Hz) 7 גירוי חשמלי של הגרעין של HBC בחיות decerebrate יכול לקדם תנועה. בשנים האחרונות, גירוי מוחי עמוק (DBS) של HBC כבר המשמשת לטיפול בחולים הסובלים הלוך ושובהפרעות מ מעורבים גירעונות הילוך כגון מחלת פרקינסון (PD) 8. דיווחים קודמים הראו כי כמעט כל הנוירונים של HBC יכולים לפטר פוטנציאל פעולה בתדר להקת גמא כאשר depolarized באמצעות 9 פולסים נוכחיים רבועים. בגלל ההפעלה דרסטי של תעלות אשלגן מתח מגודרת במהלך depolarizations פולסים מרובע עד או תחת -25 mV. כתוצאה מכך, אין תנודות גמא חזקות נצפו לאחר חסימת דור פוטנציאל פעולה באמצעות tetrodotoxin 10. במאמץ לעקוף בעיה כזאת, 1 - 2 שניות ארוכות depolarizing רמפות נוכחיות היו בשימוש. רמפות depolarized פוטנציאל הממברנה בהדרגה נח ערכים של עד 0 mV, בעוד inactivating חלקית תעלות אשלגן מתח מגודרת. תנודות קרום להקת גמא נקה ניכרו בתוך חלון תלות מתח ערוצי סידן סף גבוה (כלומר, בין -25 mV ו -0 mV) 10. לסיכום, להקת גמא פעילויותיוty נצפתה בנוירונים של HBC 9, ושניהם P / Q- ו- N-סוג מתח מגודר ערוצי סידן צריכות להיות מופעל כדי ליצור תנודות להקת גמא ב PPN 10. בסדרת מחקרים קבעו את המיקום של תעלות סידן סף גבוה בנוירונים HBC. הזרקת השילוב של צבעים, דימות פלואורסצנטי ratiometric הראתה ארעי סידן דרך תעלות סידן מתח מגודר אשר מופעלות דנדריטים שונים כאשר depolarized באמצעות רמפות נוכחיות 11. נכסים מהותיים של נוירונים של HBC הוצעו כדי לאפשר הפעלה בו זמנית של תאים אלה בזמן הערות ושנת REM, ובכך גרימת פעילות עצבית תנודתית בתדירות גבוהה בין RAS ולולאות thalamocortical. אינטראקציה כזו לכת ארוכה נחשבת תומכת במדינת מוח מסוגלת להעריך את העולם באופן מהימן סביבנו על בסיס מתמשך 12. כאן אנו מתארים את הניסויתנאים אל צורך ליצור ולתחזק תנודת להקה גמא בתאים של HBC במבחנה. פרוטוקול זה לא תואר בעבר, ויעזור מספר הקבוצות ללמוד תכונות הממברנה פנימיות בתיווך פעילות להקת גמא ב אזורי מוח אחרים. יתר על כן, צעדים נוכחיים עשויים להוביל למסקנה המוטעית כי פעילות להקת גמא לא יכולה להיוצר בתאים אלה.

<table><tbody><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8501</td><td>C&lt;sub&gt;12&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;22&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;11&lt;/sub&gt;, molecular weight = 342.30</td></tr><tr><td>Sodium Bicarbonate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6014</td><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;, molecular weight = 84.01</td></tr><tr><td>Potassium Chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td>KCl, molecular weight = 74.55</td></tr><tr><td>Magnesium Chloride Hexahydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9272</td><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; &amp;middot; 6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, molecular weight =&amp;nbsp; 203.30</td></tr><tr><td>Calcium Chloride Dihydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3881</td><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; &amp;middot; 2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, molecular weight =147.02</td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5767</td><td>C&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;12&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;, molecular weight = 180.16</td></tr><tr><td>L-Ascorbic Acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5960</td><td>C&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;8&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;, molecular weight =176.12</td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Acros Organics</td><td>327300025</td><td>NaCl, molecular weight =&amp;nbsp; 58.44</td></tr><tr><td>Potassium Gluconate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4500</td><td>C&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;11&lt;/sub&gt;KO&lt;sub&gt;7&lt;/sub&gt;, molecular weight =&amp;nbsp; 234.25</td></tr><tr><td>Phosphocreatine di(tris) salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1937</td><td>C&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;10&lt;/sub&gt;N&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;5&lt;/sub&gt;P &amp;middot; 2C&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;11&lt;/sub&gt;NO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;, molecular weight =&amp;nbsp; 453.38</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td>C&lt;sub&gt;8&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;18&lt;/sub&gt;N&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;S, molecular weight = 238.30</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E0396</td><td>[-CH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;OCH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;CH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;N(CH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;H)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;]&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, molecular weight = 380.40</td></tr><tr><td>Adenosine 5&#039;-triphosphate magnesium salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9187</td><td>&amp;nbsp;C&lt;sub&gt;10&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;16&lt;/sub&gt;N&lt;sub&gt;5&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;13&lt;/sub&gt;P&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; &amp;middot; xMg2+, molecular weight = 507.18</td></tr><tr><td>Guanosine 5&#039;-triphosphate sodium salt hydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8877</td><td>C&lt;sub&gt;10&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;16&lt;/sub&gt;N&lt;sub&gt;5&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;14&lt;/sub&gt;P&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; &amp;middot; xNa+, molecular weight = 523.18</td></tr><tr><td>Tetrodotoxin citrate</td><td>Alomone Labs</td><td>T-550</td><td>C&lt;sub&gt;11&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;17&lt;/sub&gt;N&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;8&lt;/sub&gt;, molecular weight = 319.27</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;DL-2-Amino-5-Phosphonovaleric Acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5282</td><td>&amp;nbsp;C&lt;sub&gt;5&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;12&lt;/sub&gt;NO&lt;sub&gt;5&lt;/sub&gt;P, molecular weight = 197.13</td></tr><tr><td>CNQX disodium salt hydrate&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C239</td><td>C&lt;sub&gt;9&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;N&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; &amp;middot; xH2O, molecular weight = 276.12</td></tr><tr><td>Strychnine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0532</td><td>C&lt;sub&gt;21&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;22&lt;/sub&gt;N&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, molecular weight = 334.41</td></tr><tr><td>Mecamylamine hydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9020</td><td>&amp;nbsp;C&lt;sub&gt;11&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;21&lt;/sub&gt;N &amp;middot; HCl, molecular weight = 203.75</td></tr><tr><td>Gabazine (SR-95531)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S106</td><td>C&lt;sub&gt;15&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;18&lt;/sub&gt;BrN&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;, molecular weight = 368.23</td></tr><tr><td>Ketamine hydrochloride</td><td>Mylan</td><td>67457-001-00</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Nikon</td><td>Eclipse E600FN</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Sutter Instruments</td><td>ROE-200</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Sutter Instruments</td><td>MPC-200</td><td></td></tr><tr><td>Amplifier</td><td>Molecular Devices</td><td>Multiclamp 700B</td><td></td></tr><tr><td>A/D converter</td><td>Molecular Devices</td><td>Digidata 1440A</td><td></td></tr><tr><td>Heater</td><td>Warner Instruments</td><td>TC-324B</td><td></td></tr><tr><td>Pump</td><td>Cole-Parmer</td><td>Masterflex L/S 7519-20</td><td></td></tr><tr><td>Pump cartridge</td><td>Cole-Parmer</td><td>Masterflex 7519-85</td><td></td></tr><tr><td>Pipette puller</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Camera</td><td>Q-Imaging</td><td>RET-200R-F-M-12-C</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica Biosystems</td><td>&amp;nbsp;Leica VT1200 S</td><td></td></tr><tr><td>Refrigeration system</td><td>Vibratome Instruments</td><td>900R</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>microscope</td><td>Nikon</td><td>Eclipse E600FN</td><td></td></tr><tr><td>micromanipulator</td><td>Sutter Instruments</td><td>ROE-200</td><td></td></tr><tr><td>micromanipulator</td><td>Sutter Instruments</td><td>MPC-200</td><td></td></tr><tr><td>amplifier</td><td>Molecular Devices</td><td>Multiclamp 700B</td><td></td></tr><tr><td>A/D converter</td><td>Molecular Devices</td><td>Digidata 1440A</td><td></td></tr><tr><td>heater</td><td>Warner Instruments</td><td>TC-324B</td><td></td></tr><tr><td>pump</td><td>Cole-Parmer</td><td>Masterflex L/S 7519-20</td><td></td></tr><tr><td>pump cartridge</td><td>Cole-Parmer</td><td>Masterflex 7519-85</td><td></td></tr><tr><td>pipette puller</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>camera</td><td>Q-Imaging</td><td>RET-200R-F-M-12-C</td><td></td></tr></tbody></table>

recording gamma band oscillations in pedunculopontine nucleus neurons

Efferents Synaptic מן PPN ידועים לווסת את הפעילות העצבית של כמה אזורים התלמוס intralaminar (למשל, centrolateral / parafascicular; גרעין Cl / PF). הפעלתי גם את HBC או גרעיני Cl / Pf in vivo תואר לנצל את השפעתה על העוררות של חית תוספת בפעילות להקת גמא ב אלקטרואנצפלוגרם קליפת המוח (EEG). המנגנונים התאיים עבור הדור של תנודות להקת גמא ב רשתי מערכת הפעלה (RAS) נוירונים זהים לאלה שנמצאו ליצור תנודות להקה גמא בגרעיני מוחות אחרים. במהלך הקלטה נוכחיים מהדקים של נוירונים של HBC (מ פרוסות parasagittal מן 9 - 25 יום בן חולדות), שימוש depolarizing צעדים מרובעים מופעל במהירות תעלות אשלגן מתח תלוי שמנעו נוירונים של HBC מלהיות depolarized מעבר -25 mV. הזרקת 1 - 2 שניות ארוכות depolarizing רמפות נוכחיות depolarized בהדרגת הקרום של HBC מיל הפוטנציאלטינג ערכי כלפי 0 mV. עם זאת, פולסים מרובעים depolarizing הזרקה שנוצרו תנודות גמא-band של פוטנציאל הממברנה שהראו להיות קטן משרעת לעומת התנודות שנוצרו על ידי רמפות. כל הניסויים בוצעו בנוכחות תעלות נתרן מתח מגודרת וחוסמים קולטניים הסינפטי מהר. הוכח כי הפעלת ערוצי סידן תלוי מתח גבוה-סף ביסוד פעילות תנודתית גמא-band בנוירונים HBC. התערבויות מתודולוגיים תרופתיות ספציפיות מתוארות כאן, מתן הכלים הדרושים כדי לעודד ו לקיים PPN תנודת להקת גמא התת במבחנה.

בתחילה, תנודות גמא היו עוררות באמצעות פולסים נוכחי רבוע. הקלטת מהדק הנוכחית של נוירונים של HBC בנוכחות חוסמי הסינפטי TTX הייתה פיקוח רציף על מנת להבטיח כי פוטנציאל הממברנה נח נשמר יציבות ב ~ -50 mV (איור 1 א). שני פולסים נוכחיים שניים ארוכים מרובעים הוזרקו intracellularly ידי מהדק תיקון המגבר דרך פיפטה ההקלטה, הגדלת המשרעת שלהם בין 200 PA 600 PA (איור 1 א). פוטנציאל ממברנה היה depolarized לרמות מתח קרוב ל -20 mV כאשר 600 PA, וכתוצאה מכך תנודות גמא משרעת קטנה. ספקטרה סמכויות תנודות גמא מוצגת ערכים משרעת קטנים מאוד (כלומר, &lt;0.01; איור 1B). מצד השני, שתי רמפות נוכחיות השני depolarizing הוזרקו intracellularly ידי המגבר מהדק תיקון דרך פיפטה ההקלטה, יצירת תנודות גמא חזקות(איור 2 א) כי הציג הרבה אמפליטודות כוח עליון (איור 2 ב). עבודות קודמות 10 מצאו קשר בין הבדלים בין כיכר כבש פרוטוקולים נוכחיים למחרוזת ההפעלה של תעלות אשלגן מתח מגודרת במהלך שלילת קוטביות הפתאומית של לשעבר. רמפות depolarizing איטיות אולי במקום להיות inactivating תעלות אשלגן. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54685/54685fig1.jpg" /> איור 1. תנודות ממברנה ב-שלמות תא קלטות נוירונים של HBC באמצעות נוכח כיכר קטניות של הגדלה משרעת. (א) תגובות פוטנציאל נציג קרום depolarizing 2 שניות ארוכות צעדים מרובעים של משרעת הגדלת מוזרק intracellularly ידי מהדק תיקון המגבר דרך פיפטה ההקלטה, בנוכחות חוסמי הסינפטי TTX. (ב) חופפיםאמפליטודות ספקטרום כוח עבור תנודות שהושגו באמצעות פולסים מרובעים שמוצגים א כוח הספקטרום התקבלו באמצעות פונקצית חלון המינג לאחר 20 - 60 הרץ תנודות סינון bandpass שנוצרו על ידי צעדי depolarizing. נוירון PPN נרשם תצורה נוכחית מהדק שילוב גבוה K + פתרון תאי וחוסמי הסינפטי + TTX המתואר בפרוטוקול. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54685/54685fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54685/54685fig2.jpg" /> איור 2. גמא Band תנודות ממברנה ב-שלמות תא קלטות נוירונים של HBC באמצעות רמפות נוכחיות לגבי אפשרות לתגבר משרעת. (א) תגובות פוטנציאל נציג קרום depolarizing 2 שניות רמפות ארוכות מוזרקות על ידי מגבר צמד תיקון intracellularly דרך פיפטה הקלטה, להראות. ing הגדלת המשרעת בנוכחות חוסמי הסינפטי TTX (B) חופף אמפליטודות ספקטרום כוח עבור תנודות שהושגו באמצעות רמפות שמוצגות א כוח הספקטרום התקבלה באמצעות פונקצית חלון המינג לאחר 20 - 60 הרץ תנודות סינון bandpass שנוצרו על ידי רמפת depolarizing . נוירון PPN נרשם תצורה נוכחית מהדק שילוב גבוה K + פתרון תאי וחוסמי הסינפטי + TTX המתואר בפרוטוקול. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54685/54685fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Recording Gamma Band Oscillations in Pedunculopontine Nucleus Neurons at JoVE.com

Recording Gamma Band Oscillations in Pedunculopontine Nucleus Neurons

גרעין pedunculopontine (PPN) ממוקם בגזע המוח ונוירונים שלה מופעלים מקסימאלי בזמן ערות לבין תנועות עיניים מהירות (REM) מצבי השינה המוח. עבודה זו מתארת ​​את הגישה הניסויית לרשום תנודת קרום התת להקה גמא במבחנה בנוירונים HBC.

תנודות Band גמא הקלטה Pedunculopontine Nucleus נוירונים

Synaptic efferents from the PPN are known to modulate the neuronal activity of several intralaminar thalamic regions (e.g., the ...

recording-gamma-band-oscillations-in-pedunculopontine-nucleus-neurons

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.6K Views.  University of Buenos Aires.  גרעין pedunculopontine (PPN) ממוקם בגזע המוח ונוירונים שלה מופעלים מקסימאלי בזמן ערות לבין תנועות עיניים מהירות (REM) מצבי השינה המוח. עבודה זו מתארת ​​את הגישה הניסויית לרשום תנודת קרום התת להקה גמא במבחנה בנוירונים HBC. 

Video: Recording Gamma Band Oscillations in Pedunculopontine Nucleus Neurons

Dual Somatic Recordings from Gonadotropin-Releasing Hormone (GnRH) Neurons Identified by Green Fluorescent Protein (GFP) in Hypothalamic Slices

Gonadotropin-Releasing Hormone (GnRH) is a small neuropeptide that regulates pituitary release of luteinizing hormone (LH) and follicle-stimulating hormone (FSH). These gonadotropins are essential for the regulation of reproductive function. The GnRH-containing neurons are distributed diffusely throughout the hypothalamus and project to the median eminence where they release GnRH from their axon terminals into the hypophysiotropic portal system (1). In the portal capillaries, GnRH travels to the anterior pituitary gland to stimulate release of gonadotropins into systemic circulation. GnRH release is not continuous but rather occurs in episodic pulses. It is well established that the intermittent manner of GnRH release is essential for reproduction (2, 3).
Coordination of activity of multiple GnRH neurons probably underlies GnRH pulses. Total peptide content in GnRH neurons is approximately 1.0 pg/cell (4), of which 30% likely comprises the releasable pool. Levels of GnRH during a pulse (5, 6), suggest multiple GnRH neurons are probably involved in neurosecretion. Likewise, single unit activity extracted from hypothalamic multi-unit recordings during LH release indicates changes in activity of multiple neurons (7). The electrodes with recorded activity during LH pulses are associated with either GnRH somata or fibers (8). Therefore, at least some of this activity arises from GnRH neurons.
The mechanisms that result in synchronized firing in hypothalamic GnRH neurons are unknown. Elucidating the mechanisms that coordinate firing in GnRH neurons is a complex problem. First, the GnRH neurons are relatively few in number. In rodents, there are 800-2500 GnRH neurons. It is not clear that all GnRH neurons are involved in episodic GnRH release. Moreover, GnRH neurons are diffusely distributed (1). This has complicated our understanding of coordination of firing and has made many technical approaches intractable. We have optimized loose cell-attached recordings in current-clamp mode for the direct detection of action potentials and developed a recording approach that allows for simultaneous recordings from pairs of GnRH neurons.

Dual Somatic Recordings from Gonadotropin-Releasing Hormone GnRH Neurons Identified by Green Fluorescent Protein GFP in Hypothalamic Slices

Activity in neuronal systems often requires synchronous action potential discharges from neurons within a specific population. For example, pulses of gonadotropin-releasing hormone (GnRH) likely require coordinated activity between GnRH neurons. We present our methodological approach for reliably obtaining simultaneous electrophysiological recordings from the diffusely distributed GnRH neurons.

Dual סומטיים הקלטות מ-שחרור גונדוטרופין (GnRH) הורמון נוירונים מזוהה על ידי חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) ב Slices ההיפותלמוס

Gonadotropin-Releasing Hormone (GnRH) is a small neuropeptide that regulates pituitary release of luteinizing hormone (LH) and follicle-stimulating ...

Manufacturing and Using Piggy-back Multibarrel Electrodes for In vivo Pharmacological Manipulations of Neural Responses

In vivo recordings from single neurons allow an investigator to examine the firing properties of neurons, for example in response to sensory stimuli. Neurons typically receive multiple excitatory and inhibitory afferent and/or efferent inputs that integrate with each other, and the ultimate measured response properties of the neuron are driven by the neural integrations of these inputs. To study information processing in neural systems, it is necessary to understand the various inputs to a neuron or neural system, and the specific properties of these inputs. A powerful and technically relatively simple method to assess the functional role of certain inputs that a given neuron is receiving is to dynamically and reversibly suppress or eliminate these inputs, and measure the changes in the neuron's output caused by this manipulation. This can be accomplished by pharmacologically altering the neuron's immediate environment with piggy-back multibarrel electrodes. These electrodes consist of a single barrel recording electrode and a multibarrel drug electrode that can carry up to 4 different synaptic agonists or antagonists. The pharmacological agents can be applied iontophoretically at desired times during the experiment, allowing for time-controlled delivery and reversible reconfiguration of synaptic inputs. As such, pharmacological manipulation of the microenvironment represents a powerful and unparalleled method to test specific hypotheses about neural circuit function.
Here we describe how piggy-back electrodes are manufactured, and how they are used during in vivo experiments. The piggy-back system allows an investigator to combine a single barrel recording electrode of any arbitrary property (resistance, tip size, shape etc) with a multibarrel drug electrode. This is a major advantage over standard multi-electrodes, where all barrels have more or less similar shapes and properties. Multibarrel electrodes were first introduced over 40 years ago 1-3, and have undergone a number of design improvements 2,3 until the piggy-back type was introduced in the 1980s 4,5. Here we present a set of important improvements in the laboratory production of piggy-back electrodes that allow for deep brain penetration in intact in vivo animal preparations due to a relatively thin electrode shaft that causes minimal damage. Furthermore these electrodes are characterized by low noise recordings, and have low resistance drug barrels for very effective iontophoresis of the desired pharmacological agents.

Manufacturing and Using Piggy-back Multibarrel Electrodes for In vivo Pharmacological Manipulations of Neural Responses

Iontophoresis of neural agonists and antagonists during extracellular in vivo recordings is a powerful way to manipulate a neuron&#x2019;s microenvironment. These manipulations can most easily be done via piggy-back multibarrel electrodes. Here we describe how to manufacture them and use them during auditory recordings.

ייצור והשימוש פיגי גב Multibarrel אלקטרודות ל<em&gt; בחי</em&gt; מניפולציות תרופתיות של תגובות עצביות

In vivo recordings from single neurons allow an investigator to examine the firing properties of neurons, for example in response to sensory stimuli. ...

Generation of Local CA1 &#947; Oscillations by Tetanic Stimulation

Neuronal network oscillations are important features of brain activity in health and disease and can be modulated by a range of clinically used drugs. A protocol is provided to generate a model for studying CA1 &#947; oscillations (20 - 80 Hz). These &#947; oscillations are stable for at least 30 min&#160;and depend upon excitatory and inhibitory synaptic activity in addition to activation of pacemaker currents. Tetanically stimulated oscillations have a number of reproducible and easily quantifiable characteristics including spike count, oscillation duration, latency and frequency that report upon the network state. The advantages of the electrically stimulated oscillations include stability, reproducibility and episodic acquisition enabling robust characterization of network function. This model of CA1 &#947; oscillations can be used to study cellular mechanisms and to systematically investigate how neuronal network activity is altered in disease and by drugs. Disease state pharmacology can be readily incorporated by the use of brain slices from genetically modified or interventional animal models to enable selection of drugs that specifically target disease mechanisms.

Oscillations are fundamental network properties and are modulated by disease and drugs. Studying brain-slice oscillations allows characterization of isolated networks under controlled conditions. Protocols are provided for the preparation of acute brain slices for evoking CA1 &#947; oscillations.

דור של תנודות γ CA1 מקומיות על ידי גירוי Tetanic

Neuronal network oscillations are important features of brain activity in health and disease and can be modulated by a range of clinically used drugs. A ...

Tuning in the Hippocampal Theta Band In Vitro: Methodologies for Recording from the Isolated Rodent Septohippocampal Circuit

This protocol outlines the procedures for preparing and recording from the isolated whole hippocampus, of WT and transgenic mice, along with recent improvements in methodologies and applications for the study of theta oscillations. A simple characterization of the isolated hippocampal preparation is presented whereby the relationship between internal hippocampal theta oscillators is examined together with the activity of pyramidal cells, and GABAergic interneurons, of the cornu ammonis-1 (CA1) and subiculum (SUB) areas. Overall, we show that the isolated hippocampus is capable of generating intrinsic theta oscillations in vitro and that rhythmicity generated within the hippocampus can be precisely manipulated by optogenetic stimulation of parvalbumin-positive (PV) interneurons. The in vitro isolated hippocampal preparation offers a unique opportunity to use simultaneous field and intracellular patch-clamp recordings from visually-identified neurons to better understand the mechanisms underlying theta rhythm generation.

Tuning in the Hippocampal Theta Band In Vitro: Methodologies for Recording from the Isolated Rodent Septohippocampal Circuit

Here, we present a protocol for recording rhythmic neuronal network theta and gamma oscillations from an isolated whole hippocampal preparation. We describe the experimental steps from extraction of the hippocampus to details of field, unitary and whole-cell patch clamp recordings as well as optogenetic pacing of the theta rhythm.

כוונון להקת הטטה בהיפוקמפוס<em&gt; במבחנה</em&gt; מתודולוגיות להקלטת מכרסמת מבודדת מעגל ספוטוהיפוקמפוס

This protocol outlines the procedures for preparing and recording from the isolated whole hippocampus, of WT and transgenic mice, along with recent ...

Acute In Vivo Electrophysiological Recordings of Local Field Potentials and Multi-unit Activity from the Hyperdirect Pathway in Anesthetized Rats

Converging evidence shows that many neuropsychiatric diseases should be understood as disorders of large-scale neuronal networks. To better understand the pathophysiological basis of these diseases, it is necessary to precisely characterize in which way the processing of information is disturbed between the different neuronal parts of the circuit. Using extracellular in vivo electrophysiological recordings, it is possible to accurately delineate neuronal activity within a neuronal network. The application of this method has several advantages over alternative techniques, e.g., functional magnetic resonance imaging and calcium imaging, as it allows a unique temporal and spatial resolution and does not rely on genetically engineered organisms. However, the use of extracellular in vivo recordings is limited since it is an invasive technique that cannot be universally applied. In this article, a simple and easy to use method is presented with which it is possible to simultaneously record extracellular potentials such as local field potentials and multiunit activity at multiple sites of a network. It is detailed how a precise targeting of subcortical nuclei can be achieved using a combination of stereotactic surgery and online analysis of multi-unit recordings. Thus, it is demonstrated, how a complete network such as the hyperdirect cortico-basal ganglia loop can be studied in anesthetized animals in vivo.

Acute In Vivo Electrophysiological Recordings of Local Field Potentials and Multi-unit Activity from the Hyperdirect Pathway in Anesthetized Rats

In this study, the methodology is presented on how to perform multi-site in vivo electrophysiological recordings from the hyperdirect pathway under urethane anesthesia.

חַד<em&gt; בויבו</em&gt; הקלטות אלקטרו של הפוטנציאל שדה מקומי פעילות מרובת יחידות מן מסלול Hyperdirect ב חולדות הרדמה

Converging evidence shows that many neuropsychiatric diseases should be understood as disorders of large-scale neuronal networks. To better understand the ...

Optogenetic Entrainment of Hippocampal Theta Oscillations in Behaving Mice

Extensive data on relationships of neural network oscillations to behavior and organization of neuronal discharge across brain regions call for new tools to selectively manipulate brain rhythms. Here we describe an approach combining projection-specific optogenetics with extracellular electrophysiology for high-fidelity control of hippocampal theta oscillations (5-10 Hz) in behaving mice. The specificity of the optogenetic entrainment is achieved by targeting channelrhodopsin-2 (ChR2) to the GABAergic population of medial septal cells, crucially involved in the generation of hippocampal theta oscillations, and a local synchronized activation of a subset of inhibitory septal afferents in the hippocampus. The efficacy of the optogenetic rhythm control is verified by a simultaneous monitoring of the local field potential (LFP) across lamina of the CA1 area and/or of neuronal discharge. Using this readily implementable preparation we show efficacy of various optogenetic stimulation protocols for induction of theta oscillations and for the manipulation of their frequency and regularity. Finally, a combination of the theta rhythm control with projection-specific inhibition addresses the readout of particular aspects of the hippocampal synchronization by efferent regions.

We describe the use of optogenetics and electrophysiological recordings for selective manipulations of hippocampal theta oscillations (5-10 Hz) in behaving mice. The efficacy of the rhythm entrainment is monitored using local field potential. A combination of opto- and pharmacogenetic inhibition addresses the efferent readout of hippocampal synchronization.

Optogenetic Entrainment התנודות תטא בהיפוקמפוס ב מתנהג עכברים

Extensive data on relationships of neural network oscillations to behavior and organization of neuronal discharge across brain regions call for new tools ...

Recording Spatially Restricted Oscillations in the Hippocampus of Behaving Mice

The local field potential (LFP) emerges from ion movements across neural membranes. Since the voltage recorded by LFP electrodes reflects the summed electrical field of a large volume of brain tissue, extracting information about local activity is challenging. Studying neuronal microcircuits, however, requires a reliable distinction between truly local events and volume-conducted signals originating in distant brain areas. Current source density (CSD) analysis offers a solution for this problem by providing information about current sinks and sources in the vicinity of the electrodes. In brain areas with laminar cytoarchitecture such as the hippocampus, one-dimensional CSD can be obtained by estimating the second spatial derivative of the LFP. Here, we describe a method to record multilaminar LFPs using linear silicon probes implanted into the dorsal hippocampus. CSD traces are computed along individual shanks of the probe. This protocol thus describes a procedure to resolve spatially restricted neuronal network oscillations in the hippocampus of freely moving mice.

This protocol describes the recording of local field potentials with multi-shank linear silicon probes. Conversion of the signals using current source density analysis allows the reconstruction of local electrical activity in the mouse hippocampus. With this technique, spatially restricted brain oscillations can be studied in freely moving mice.

הקלטה במרחב מוגבל תנודות בהיפוקמפוס מתנהגים באופן עכברים

The local field potential (LFP) emerges from ion movements across neural membranes. Since the voltage recorded by LFP electrodes reflects the summed ...

Photodiode-Based Optical Imaging for Recording Network Dynamics with Single-Neuron Resolution in Non-Transgenic Invertebrates

The development of transgenic invertebrate preparations in which the activity of specifiable sets of neurons can be recorded and manipulated with light represents a revolutionary advance for studies of the neural basis of behavior. However, a downside of this development is its tendency to focus investigators on a very small number of &#8220;designer&#8221; organisms (e.g., C. elegans and Drosophila), potentially negatively impacting the pursuit of comparative studies across many species, which is needed for identifying general principles of network function. The present article illustrates how optical recording with voltage-sensitive dyes in the brains of non-transgenic gastropod species can be used to rapidly (i.e., within the time course of single experiments) reveal features of the functional organization of their neural networks with single-cell resolution. We outline in detail the dissection, staining, and recording methods used by our laboratory to obtain action potential traces from dozens to ~150 neurons during behaviorally relevant motor programs in the CNS of multiple gastropod species, including one new to neuroscience &#8211; the nudibranch Berghia stephanieae. Imaging is performed with absorbance voltage-sensitive dyes and a 464-element photodiode array that samples at 1,600 frames/second, fast enough to capture all action potentials generated by the recorded neurons. Multiple several-minute recordings can be obtained per preparation with little to no signal bleaching or phototoxicity. The raw optical data collected through the methods described can subsequently be analyzed through a variety of illustrated methods. Our optical recording approach can be readily used to probe network activity in a variety of non-transgenic species, making it well suited for comparative studies of how brains generate behavior.

This protocol presents a method for imaging neuronal population activity with single-cell resolution in non-transgenic invertebrate species using absorbance voltage-sensitive dyes and a photodiode array. This approach enables a rapid workflow, wherein imaging and analysis can be pursued over the course of a single day.

הדמיה אופטית מבוססת פוטודיודה להקלטת דינמיקה ברשת עם רזולוציית נוירון יחיד בבלתי חוליות לא מהונדסים

The development of transgenic invertebrate preparations in which the activity of specifiable sets of neurons can be recorded and manipulated with light ...

Biology

Recording Gamma Band Oscillations From Pedunculopontine Nucleus Neurons in a Brain Slice

Source: Urbano, F. J., et al. <a href="https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/54685">Recording Gamma Band Oscillations in Pedunculopontine Nucleus Neurons.</a> J. Vis. Exp. (2016).
The video demonstrates the method to record gamma-band oscillations in PPN neurons. Using a sagittal brain section with synaptic blockers in aCSF, it employs positive current pulses via a patch pipette to open calcium channels, inducing crucial subthreshold activity for wakefulness.

הקלטת תנודות פס גמא מתאי עצב של גרעין פדונקולופונטין בפרוסת מוח

All procedures involving animal models have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review board.
1. ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neurophysiology

Electrophysiology Techniques

In Vivo Electrophysiological Recordings of Brain Activities from Multiple Sites in Rats

Source: Haumesser, J. K., et al. <a href="https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/55940">Acute In Vivo Electrophysiological Recordings of Local Field Potentials and Multi-unit Activity from the Hyperdirect Pathway in Anesthetized Rats.</a> J. Vis. Exp.(2017).
This video demonstrates the detailed procedure for preparing an anesthetized rat for electrophysiological recordings of brain activity from multiple sites. The scalp is dissected to access the skull, and holes are drilled at precise locations to install and secure electrodes. Tungsten microwire electrodes are then inserted into the targeted location to record the data.

תנודות Band גמא הקלטה Pedunculopontine Nucleus נוירונים

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

Dual סומטיים הקלטות מ-שחרור גונדוטרופין (GnRH) הורמון נוירונים מזוהה על ידי חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) ב Slices ההיפותלמוס

ייצור והשימוש פיגי גב Multibarrel אלקטרודות ל

דור של תנודות γ CA1 מקומיות על ידי גירוי Tetanic

כוונון להקת הטטה בהיפוקמפוס

חַד

Optogenetic Entrainment התנודות תטא בהיפוקמפוס ב מתנהג עכברים

הקלטה במרחב מוגבל תנודות בהיפוקמפוס מתנהגים באופן עכברים

הדמיה אופטית מבוססת פוטודיודה להקלטת דינמיקה ברשת עם רזולוציית נוירון יחיד בבלתי חוליות לא מהונדסים

הקלטת תנודות פס גמא מתאי עצב של גרעין פדונקולופונטין בפרוסת מוח

In Vivo רישומים אלקטרופיזיולוגיים של פעילויות מוחיות מאתרים מרובים בחולדות