Development of this protocol was supported by an operating grant from CIHR (MOP97807) to SED.

No conflicts of interest to disclose.

Burada L. EGD suşu kadın veya erkek C57BL / 6J farelerde 25 monocytogenes ile temel deneysel enfeksiyon yürütmek için nasıl bir protokol açıklar. Bu protokol, in vivo 31 doğal ve kazanılmış lenfositler tarafından IFN-γ üretimi üzerinde yeni küçük moleküllü IS001 etkisini incelemek amacıyla kuruldu. bakteriyel temizleme ve hayatta kalma sonrası enfeksiyon izleyerek, anlayışlar IFN-y bu değişikliklerin enfeksiyon kontrol etme konağın yeteneğini nasıl etkilediğini içine elde edilmiştir. Protokolde kritik Hususlar Bu tür bir araştırmada tasarımında önemli bir husus, her deney, yeterli güç ve uygun kontrol edilebilir olmasıdır. Enfeksiyon nedeniyle bağışıklık tepkisi biyolojik varyasyona (bakınız Şekil 4 ve 6) göre, n = 4 önerilir - grup başına 5 fare başlangıçta olan bağışıklık çalışmalar için kullanılmalıdır. Eğer birfter verilerde bir eğilim, ancak gruplar arasında belirgin anlamlı bir fark yoktur bu çalışmaların bir güç hesaplaması istatistiksel olarak anlamlı elde etmek için daha sonraki çalışmalarda gerekli hayvanların en az sayısını belirlemek için yapılabilir. kontroller ile ilgili olarak, bağışıklık çalışmalar ve araç tedavisi uygulanmasıyla ilişkili stres tedavisinin etkisini ayırt yardımcı kontrol için temel IFN-γ yanıtlarının belirlenmesi için bulaşmamış kontrolleri dahil etmek önemlidir. Bir diğer önemli husus tedavi zamanlaması olduğunu. L. monocytogenes Doğal yanıt çok hızlı olduğu için, birinci işlem ya da reaktif olduğu için, terapötik seviyeleri sağlamak için aşılama, aynı zamanda önce elde edilecek önceden günde tatbik edilmesi önerilir doğuştan gelen bağışıklık tepkisinin başlatılması. Yine diğer bir önemli mesele, patojen doz infectio için kullanılacak olann. Bu patojen bakterilerin daha doğru sayım sağlayan, dalak ve karaciğer içinde konsantre edildi olasılığını arttırır yana öldürücü dozu bakteri yükünün ölçülmesi tavsiye edilir. Bir öldürücü doz, hayvan en yüksek T hücre genişlemesinin süresi öncesinde listeriya teslim olmayan sağlamak için uyarlanabilir lenfosit IFN-γ yanıtları numaralandırma için tavsiye edilir. Bunun aksine, daha yüksek bir enfeksiyon dozu, bu hücreler tarafından IFN-γ üretimini maksimize etmek için 24 saat sonra erken bir NK ve NKT hücresi tepkisinin ölçümü için kullanılması önerilmektedir. Klasik LD50 farelerin% 50 öldürücülüğü sonuçlanan patojenin dozdur. listeriosis birçok belirtiler bir hayvan bir enfeksiyon yenik olasılığı olup olmadığını tahmin edebilirsiniz çünkü ölüm bizim kurumda kabul edilebilir bir son nokta değildi ve bu yana, bizim çalışmalarda bir son nokta olarak tanımlanan bir klinik bulguların listesini yerine ölümü kullanılır. usiBu yöntem ng, modifiye LD 50 8 haftalık erkek 10 5 CFU ve 8 haftalık dişi C57BL / 6J fareler 31 için 1.5 x 10 5 CFU olduğu tespit edilmiştir. Bu LD 50 doz, her grup için N = 8 fare ihtiva ettiğini (N = toplam 5 çalışma) adım adım doz arttırma çalışmalarında son noktalar farelerin yüzde hayatta kalma ölçülerek belirlenmiştir (örneğin, fareler 10,000 CFU ilk enfekte edildi daha sonra 20.000 CFU, vs.) ile ikinci parti. Userwww.sfsu.edu/efc/classes/biol710/probit~~pobj: LD 50 Hesaplama hayatta kalma yüzdesi değerleri (y-ekseni) (web probit karşı log bir regresyon arsa (CFU) (x-ekseni) belirlendi /ProbitAnalysis.pdf). L. monocytogenes aynı suşu ile enfekte fareler bile laboratuarımızda tespit modifiye LD 50 dozu başka laboratuvarda farklı olabilir unutmayın. Bu değişkenlik Bölüm öznel doğası o ilgili olabilirf ölüm daha mutlak bitiş noktasına kıyasla listeriosis klinik belirtilerini izlemek. Ek değişkenlik, fare diyet veya Mikrobiyota veya laboratuarlar arası inokulum hazırlanması farklılıklar gibi çevresel faktörlere farklılıklardan kaynaklanabilir. Nedenle, dişi fareler (n = 8 fare / grup), L. monocytogenes aynı gerginlik 1.5 x 10 5 CFU bulaşmış burada kullanılan önceden herhangi bir Hayatta kalma çalışmalarında başlamadan için bir pilot çalışma yapıldı önerilir çalışma ve bu doz gerçekten uç noktalara% 50 hayatta kalma sonuçları ise izlenen semptomlar belirlemek için. Hayatta bu CFU daha düşük ya da% 50 daha yüksek ise, adım adım doz artırımına ya da doz de-eskalasyon çalışmaları hızla LD 50 dozu daraltmak için yapılabildi. Bir diğer önemli husus enfeksiyon çalışmaları için kullanılan farelerin zorlanma ya da alt türünün olduğunu. Bu protokol yaygın olarak kullanılan kendilenmiş fare suşu C57BL / 6J enfeksiyonunu açıklar. Bu<html> soyu Bu fare suşu 33 Th1 eğilimli olduğu düşünülmektedir çünkü, IFN-γ yanıtların ölçümü için çok uygun bir sonuç olarak, L. oldukça dayanıklı BALB / gibi Th2 eğilimli fare suşlarının göre enfeksiyon (monocytogenes olduğu c) 34,35. Diğer fare suşları için bu protokolü uyarlanması belirli suşu için patojenin bulaşıcı dozu hakkında bilgi gerektirir. Aynı zamanda model kurma katılan sorunsuz çekim miktarını azaltmak için bu protokolde belirtildiği gibi aynı yaş, cinsiyet fareler ve satıcı kullanılması tavsiye edilir. Örneğin, C57BL / 6 fareleri (ör C57BL / 6NTac), başka bir satıcıdan 36 sipariş C67BL / 6 farelerden daha genetik farklılıkları sergileyebilir bir satıcı (ör C57BL / 6J) sipariş. Buna ek olarak, bağırsak Mikrobiyota C57BL arasındaki fare 37 Th1 ve Th17 yanıtlarının dengesini etkileyebilir farklı satıcılardan elde edilen / 6 substrains farklıdır. Tekniğe ove_title &quot;&gt; Potansiyel Değişiklikler mide bağırsak sistemi boyunca olan insanlarda enfeksiyona doğal yoldan, karşıt olarak fareler en sık damar içinden ip aşılanır veya edilir. L. monocytogenes standart suşları verimsiz farelerin 38 intestinal epitel enfekte çünkü Ağız enfeksiyonları daha az görülür. Lısterıal invazyon proteini ile E-kadherin tanınması kaybı ile sonuçlanan, insan E-kadherin fare E-kadherin dizisinde, tek bir amino asit değişimi A (Inia) 39 ınternalın var olmasıdır. Bu engeli aşmak için, araştırmacılar insan E-kadherin proteini için transgenik olan ve WT EGD aynı afinite fare E-kadherin bağlanan Inia (Inia MUT) mutasyona uğramış bir sekansı ifade etmek üzere tasarlanmış olan Listeria kullanımı fareler kullanmak insan E-kadherin 40. Böylece, bu tekniğin bir değişiklik, ağız yoluyla fareleri enfekte olan. Okuyucu Oral aşılama yöntemleri 38 açıklanır başka vallahi yayına denir. enfeksiyon modunu değiştirerek bulaşıcı dozu yanı sıra patojenin yayılması kinetik etkileyeceğini unutmayın. Bu protokol, CD4 + ve CD8 + T hücreleri tarafından IFN-γ üretimini ortaya çıkarmak için ısı ile öldürülmüş Listeria ile açıklanmaktadır. Isı ile öldürülmüş L. monocytogenes bu antijen ucuz olduğu için, bizim çalışmalarda bir uyarıcı olarak seçilmiş ve bizim laboratuar patojene CD4 + T hücre yanıtları öncelikle ilgi çünkü. Bir sınırlama ısı ile öldürülmüş bakterilerin etkin bir şekilde, in vitro 41 ya da in vivo 42,43 enfeksiyon ya birinci CD8 + T hücresi tepkilerini kalmamasıdır. Böylece, enfeksiyonun tepe hasat splenositler tarafından gözlenen CD8 + T hücre IFN-γ üretimi (yani, Şekil 6) büyük olasılıkla kalıntı tepki olaraksplenosit kültürleri içinde mevcut veya sitokin-kaynaklı sitokin sonucu açığa çıkarıldı canlı bakteri 41 bırakın. Alternatif listeria öldürülmüş ısı gelince, bir de listerial proteinler üzerinde epitopları kodlayan peptitler T hücrelerini teşhir ederek IFN-γ yanıtları ex vivo ortaya olabilir. Gerçekten de, immünodominant MHC Sınıf listeriolisin O ve p60 hidrolaz için epitoplar II kısıtlı ve BALB / C 44 için tarif edilmiştir C57BL / 6 ve Balb / C fareler ve immünodominant MHC sınıf I epitoplar için tarif edilmiştir. Diğer bir yaklaşım, antijene özgü numaralandırmak için MHC Sınıf I- ve MHC Sınıf II-tetramer reaktifler, mevcut yararlanmak üzere bu ovalbümin veya viral antijenleri gibi model antijenleri ifade etmek üzere tasarlanmış olan L. monocytogenes suşları ile fareleri enfekte olan enfekte edilen farelerin 45,46 T hücreleri. Protokolün diğer Sınırlamalar Bu modelin bir diğer kısıtlılığı öyle o olduğunudalakta bağışıklık hücreleri tarafından nly önlemler IFN-γ üretimi. Burada tarif edilen boyama panel akış sitometrisi (ovalbümin sentezleyen L. monocytogenes varyantlarının) antijene spesifik T hücreleri saymak tetramerleri kullanımına ek olarak kolayca TNF ya da IL-2 ya da başka sitokinlerin üretimini ölçmek için modifiye edilebilir CD8 T hücresi veya bu tür ek olarak perforin ya granzim B olarak patojen NK-aracılı öldürme katılmak efektör molekülleri, bu protokol, aynı zamanda, karaciğer bağışıklık hücreleri tarafından üretilen IFN-y incelemek için uyarlanabilir. gelecek Uygulamaları Bu protokol, hakim sonra, Th1 ve hücresel bağışıklık üzerindeki çeşitli maddelerin ya da gen etkisini taranması için bir in vivo model basit olarak hizmet edebilir.

IFN-γ, hücre içi patojenlere karşı bağışıklık aracılık edecek ve tümör büyümesini 5 kontrol edilmesi için önemli olan bir sitokindir. Bakteriyel direnç, bu sitokinin önemi IFN-γ sinyalleme yolağında mutasyonlar mikobakteriler ve Salmonella 6 ile enfeksiyona karşı oldukça hassas olan sahip insanlar gözlem belirgindir. Aynı şekilde, fare IFN-y ya da L 10,11 monocytogenes dahil olmak üzere, mikobakteriler 7-9 ve diğer hücre içi patojenlere dirençte, IFN-γ reseptör sergi kusurlar ya Layişmanya majör 12, Salmonella typhimurium 13, ve bazı virüsler 11 eksikliği olan. Mücadele patojenlere ek olarak, IFN-γ tümörlere 14 karşı konak savunma önemli bir rol oynar. IFN-y ve yüksek üretim enfeksiyon ya da kanser bağlamında faydalı olmasına rağmen, bu sitokinin uzun süreli üretim t bağlantılıdırObez olmayan diyabetik fare modelinde 18 sistemik otoimmün 15-17 geliştirilmesi ve Çeşidi hızlandırılmasına O I diyabet. IFN-y önemli kaynaklar, NK hücreleri, NKT hücreleri, γδ T hücrelerini, T yardımcı-1 (Th1) hücreler ve sitotoksik T lenfositler (CTL), 5,19,20 içerir. IFN-γ ile doğal ve kazanılmış bağışıklığı hem de geliştirir: (1) yukarı-regüle (3) arttırıcı makrofaj, (2) antijen sunan hücrelerde ko-stimülatör moleküllerinin ekspresyonunu arttırarak, majör histo-uyumluluk kompleksi (MHC) sınıf I ve II ifadesini fagositoz ve pro-inflamatuar sitokinlerin üretimi ve mikrop öldürücü etkenler (örneğin, nitrik oksit ve reaktif oksijen türleri), (4) (5) (immünoglobülin antikor sınıfı anahtarlama teşvik Th1 efektör hücrelere naif CD4 + T hücrelerinin farklılaşmasını teşvik Ig) 2a ve farede IgG3 (), (6) kemokinlerin üretimini indükleyen I sitelerine immün hücreleri işenfection, ve (7), NK hücreleri ve CTL karşılıklarını 5,19 artar. Patojenler ve tümörlere yanıtta IFN-y hayati önemi göz önüne alındığında, rekombinant IFN-γ (19 gözden) çeşitli enfeksiyonlara ve habis için bir tedavi olarak test edilmiştir. IFN-y ya da Th1 teşvik sitokin interlökin-12 (IL-12) ve sistemik uygulama yan etkileri ile ilişkili olan ve dozla ilişkili toksisite 19,21 olduğu için, ancak, IFN-γ üretimi artırmak için alternatif stratejiler geliştirilmesinde ilgi vardır immün hücreleri. Yeni biyolojik ve küçük moleküllerin geliştirilmesi, bu tür maddeler, bir immün tepkisi sırasında IFN-γ üretimini artırmak olmadığını test etmek için in vivo tarama araçları gerektirir olup, bu, hayvan hayatta kalma arttıkça anlamlı bir biyolojik etki anlamına gelir. Gram-pozitif bakteri L. monocytogenes ile farelerin deneysel enfeksiyon için bir enstrümantal model olmuşturhücre içi patojenlere 1,22 karşı konak-bağışıklık IFN-y rolünü deşifre. patojen intravenöz veya intraperitoneal (ip) ile farelerin enfeksiyonu günlerce sonrası 3 ila 4 oluşan dalak zirve bakteriyel yükleri ile ikamet makrofajlar ve hepatositler tarafından içselleştirilmiş hale dalak ve karaciğer, bakterilerin hızla yayılmasına yol açar enfeksiyon 1,3,22. NK hücreleri ile IFN-y üretimi, makrofaj aktivasyonu ve patojen 3 karşı erken direnç için de önemlidir, Bununla birlikte, yüksek enfeksiyon dozlardaki, IFN-y üretimi, aynı zamanda patojen açıklık 23 için zararlı olabilir. NKT hücreleri, aynı zamanda patojen 2,24 erken kontrolü sırasında dalak ve karaciğerdeki IFN-y kaynağı ve bu üretim, NK hücreleri 2 dahil olmak üzere başka hücre tipleri tarafından IFN-γ üretimini yükseltmek için gösterilmiştir. Parti Diğer yandan, uyum sağlayıcı T lenfositler, daha sonra etkili, CD8 + T hücrelerivasküler, patojen temizlenmesini aracılık yeniden enfeksiyon 1,4,22 karşı koruma sağlamak için önemlidir. Bu enfeksiyon modeli (1 gözden) bir takım nedenlerden araştırmacılar için cazip olmuştur. İlk olarak, patojen enfeksiyonu yüksek tekrarlanabilir ve Th1 ve güçlü hücresel bağışıklık tepkisi oluşturur. İkinci olarak, öldürücü enfeksiyon sırasında, bakteri yükü kolayca ölçülebilir karaciğer ve dalakta konsantre edilir. Üçüncü olarak, patojen güvenle Biyogüvenlik Seviyesi 2 (BSL2) koşullar altında ele alınabilir. Dördüncüsü, organizma ve bağışıklık tepkisi bu kapsamlı karakterize edilmiştir üretir olduğunu. Son olarak, mutant ve genetik olarak modifiye edilmiş suşların çeşitli kullanım için uygun olduğu geliştirilmiştir. L. EGD suşu ile C57BL / 6J fareler aşılama için temel protokol, burada 25 monositogenlerinden olarak tanımlayan ve IFN ölçüm - γ yenidenNK, NKT ve adaptif lenfositler sonrası enfeksiyon tarafından leflimleri. Ayrıca açıklanan öldürücü enfeksiyon sonrası bakteri dalak yükü ve karaciğer ölçmek ve patojenin değiştirilmiş LD 50 dozu ile enfeksiyondan sonra hayatta kalma çalışmaları yürütmek için nasıl. Son olarak, Örnek veriler, bu protokol, L. monocytogenesin IFN-γ yanıtları ve fare hayatta kalma ile ilgili yeni tedavilerin etkisini taranması için kullanılabilir nasıl gösterilmiştir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="923">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Brain Heart Infusion Broth, Modified</td>
			<td style="width:191px;">BD</td>
			<td style="width:107px;">299070</td>
			<td style="width:273px;">any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agar</td>
			<td>BD</td>
			<td style="width:107px;">214010</td>
			<td>any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:107px;">X100</td>
			<td>any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">1xPBS</td>
			<td style="width:191px;">Sigma</td>
			<td style="width:107px;">D8537</td>
			<td>any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">TissueLyser II</td>
			<td style="width:191px;">Qiagen</td>
			<td style="width:107px;">85300</td>
			<td>any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Ammonium Chloride (NH3Cl)</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">KHCO3</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Na2EDTA</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:191px;">Gibco</td>
			<td style="width:107px;">22400089</td>
			<td>any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Fetal Bovine Serum&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Gibco</td>
			<td style="width:107px;">12483</td>
			<td>Before use, heat-inactivate at 56 &#176;C for 30 min</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:191px;">Gibco</td>
			<td style="width:107px;">25030</td>
			<td>any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Non-essential amino acids</td>
			<td style="width:191px;">Gibco</td>
			<td style="width:107px;">11140</td>
			<td>any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:191px;">Gibco</td>
			<td style="width:107px;">15140</td>
			<td>any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:353px;">GolgiStop Protein Transport Inhibitor (containing Monensin)</td>
			<td style="width:191px;">BD</td>
			<td style="width:107px;">554724</td>
			<td>Use 4 &#956;l in 6 ml cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:353px;">16% Paraformaledehye</td>
			<td style="width:191px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:107px;">15710</td>
			<td>Dilute to 4% PFA in ddH20 or 1xPBS</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:353px;">10 x Perm/Wash buffer</td>
			<td style="width:191px;">BD</td>
			<td style="width:107px;">554723</td>
			<td>Dilute 10x in ddH20</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Fc block, Anti-Mouse CD16/CD32 Purified</td>
			<td style="width:191px;">eBioscience</td>
			<td style="width:107px;">14-0161</td>
			<td>Dilute 1:50</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Fixable Viability Dye eFluor 506</td>
			<td style="width:191px;">eBioscience</td>
			<td style="width:107px;">65-0866</td>
			<td>Dilute 1:1000 (we have also used viability dyes from Molecular Probes)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">anti-Mouse CD4-PE-Cy5 (GK1.5)</td>
			<td style="width:191px;">eBioscience</td>
			<td style="width:107px;">15-0041</td>
			<td>Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">anti-Mouse CD8-FITC (53-6.7)</td>
			<td style="width:191px;">eBioscience</td>
			<td style="width:107px;">11-0081</td>
			<td>Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">PBS57/mCD1d tetramer-APC</td>
			<td style="width:191px;">NIH Tetramer Core Facility</td>
			<td style="width:107px;">N/A</td>
			<td>Obtained as a gift from the facility</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-Mouse TCR&#946;-PE-Cy7 (H56-597)</td>
			<td style="width:191px;">eBioscience</td>
			<td style="width:107px;">25-5961</td>
			<td>Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-Mouse NKp46-APC-eFluor780 (29A1.4)</td>
			<td style="width:191px;">eBioscience</td>
			<td style="width:107px;">47-3351</td>
			<td>Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">anti-Mouse CD45 PE-Cyanine7 (30-F11)</td>
			<td style="width:191px;">eBioscience</td>
			<td style="width:107px;">25-0451</td>
			<td>Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">anti-Mouse IFN gamma-PE (XMG1.2)</td>
			<td style="width:191px;">eBioscience</td>
			<td style="width:107px;">12-7311</td>
			<td>Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">OneComp eBeads</td>
			<td style="width:191px;">eBioscience</td>
			<td style="width:107px;">01-1111</td>
			<td>Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Mouse IFN gamma ELISA kit</td>
			<td style="width:191px;">eBioscience</td>
			<td>88-7314</td>
			<td>Used for measuring the interferon gamma in the culture supernatant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">50 mL vented tubes for culture</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>Used for culturing the bacteria, any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">1.5 ml microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">bacterial petri dishes</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">2 ml cyrovials</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">UV spectrometer</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">safety engineered needles</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">C57BL6/J</td>
			<td style="width:191px;">Jackson laboratories</td>
			<td style="width:107px;">Stock#000664</td>
			<td>Order for arrival at 7 wks</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Bleach</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>For decontamination</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">70% Ethanol</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>For decontamination</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Glass beads</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>rotor, buckets, bucket covers.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Microcentrifuge</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Sterile Glycerol</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Pipette Tips</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Pipette</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Surgical instruments</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">70 micron strainers</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">3 ml syringe</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Pipette gun</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Filtration Units</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Trypan Blue</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>Dilute 1 to 9 in ddH20, any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Hemocytometer</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Round bottomed plates</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">FACs tubes</td>
			<td style="width:191px;">BD</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">BD LSR II</td>
			<td style="width:191px;">BD</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>Any flow cytometer could be used for acquisition that has an appropriate laser configuration and filter set to discriminate the fluorochormes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Flowjo software</td>
			<td style="width:191px;">Treestar</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>Used for data analysis. Other types of data analysis software will also be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Multichannel pipettor (0-300 &#181;l)</td>
			<td style="width:191px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>Used for washing cells and adding antibodies during flow cytometry staining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Acetic Acid</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>Used for washing glass beads, any brand should be appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Microbank Bacterial Preservation System</td>
			<td style="width:191px;">Pro-lab Diagnositics</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td>Used as an alternative to glycerol stocks for long-term storage of bacteria</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

experimental infection with listeria monocytogenes as a model for studying host interferon-&#947; responses

L. monocytogenes, insanlarda gıda kaynaklı bir hastalık nedeni olan gram pozitif bir bakteridir. Bu patojenin farelerin deneysel enfeksiyon hücre içi patojenlere karşı konak bağışıklık doğal ve kazanılmış bağışıklık hücreleri ve belirli sitokinler rolü son derece bilgilendirici olmuştur. L. monositogenleri öldürücü enfeksiyon sırasında doğal hücreler tarafından IFN-y üretimi, makrofajları ve patojen 1-3 erken harekete geçirilmesi için çok önemlidir. Buna ek olarak, uyarlanır bellek lenfositler tarafından IFN-γ üretimi yeniden enfeksiyona 4 üzerine doğal hücrelerinin aktivasyonunu kullanıma hazırlanması için çok önemlidir. L. böylece enfeksiyon modeli monocytogenes IFN-γ üretimini artırmak için tasarlanmış yeni tedaviler in vivo IFN-γ yanıtları üzerinde bir etkiye sahip ve bu tür bakteriyel açıklık artan ya da fare sağ kalımı iyileştirmek gibi üretken biyolojik etkilere sahip olup olmadığını araştırmak için harika bir araç olarak hizmet vermektedir itibarenenfeksiyon. L. monocytogenes EGD suşu ile C57BL / 6J fareler intraperitoneal enfeksiyonları yapmak için ve akış sitometrisi ile NK hücreleri, NKT hücreleri ve adaptif lenfosit IFN-γ üretimini ölçmek için nasıl temel protokol, aşağıda tarif edilmiştir. (1) büyür ve aşılama için bakteri hazırlanması (2) uç noktalara dalak ve karaciğer, ve (3) ölçüsü, hayvan yaşam bakteri yükünü ölçmek: Buna ek olarak, prosedür tarif edilmektedir. Örnek verileri, bu enfeksiyon modeli L. monocytogenes ve bu enfeksiyonun farelerin hayatta kalması için, IFN-γ yanıtları belirli maddelerin etkisini test etmek için nasıl kullanılabileceğini göstermek için verilmiştir.

Şekil 3 patojenin 10 5 CFU ile 24 saat sonrası enfeksiyon dalak NK ve NKT hücrelerinin IFN-y boyanması sitometri bazı tipik akışı sunar. Bu şekil, aynı zamanda, Tablo 2&#39;de tarif edilen boyama paneli geçit stratejisini göstermektedir. Şekil 4, 10 5 CFU L. monositogenleri enfekte erkek fare PPARa antagonisti IS001 ya da vasıta ile tedavi edilen tek bir deneyde elde edilen bazı temsili verileri göstermektedir, ve daha sonra 24 saat sonra NK ve NKT hücreleri IFN-y için incelenmiştir . Bu rakam IS001 ile tedavi patojenle enfeksiyondan sonra IFN-γ NKT hücreleri tarafından yanıtları, ancak NK hücrelerini artırdığını göstermektedir. Şekil 5, ısı ile öldürülmüş PA ile yeniden uyarma ex vivo sonra 7 gün sonrası enfeksiyon dalak CD4 + ve CD8 + T hücrelerinde IFN-y için örnek boyamasını göstermektedirthogen. Bu şekil, aynı zamanda, Tablo 3&#39;te tarif edilen boyama paneli geçit stratejisini gösterir. Şekil 6, Enfeksiyondan 7 gün sonra, erkek fare PPARa antagonisti IS001 ya da vasıta ile günlük olarak tedavi edilmiş bir deneyde elde edilen L. monositogenleri bir öldürücü olmayan bir dozu ile enfekte edildi ve analiz edildi Örnek verileri gösterir. Bu deney, IS001 ile tedavi, CD4 + ve CD8 + lenfositleri, hem IFN-γ tepkileri gelişmiş olduğunu göstermektedir. Şekil 7 patojenin modifiye LD 50 dozu ile enfeksiyondan sonra uç noktalara fare sağkalım üzerine PPARa antagonisti IS001 etkisi araştırılmıştır bir çalışmada temsilcisi verileri gösterir. Çizilen zaman sonrası enfeksiyona karşı farelerin yüzde hayatta kalma olduğunu. Bu rakam IS001 ile tedavi uç noktalarının bir erkek farelerin hayatta kalma arttığını göstermektedir. Bu veriler birlikte, bu model araştırmak için nasıl uygulanabileceğini göstermektedirBu immün değişiklikler enfeksiyondan hayvan hayatta kalma nasıl etkilediğini IFN-γ yanıtları in vivo ve yeni ilaçlar veya tedavilerin etkileri keşfetmek için. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54554/54554fig1.jpg" /> Enfekte farelerden dalakları Diseksiyon Şekil 1.. Bu fotoğraf serisi ölü fare dalak incelemek için nasıl gösterir. (a) sağ tarafta fare Lie ve% 70 etanol ile cilt aşağı sprey. (b) aseptik veya steril forseps ve sert kesimli makas kullanarak, sadece göğüs kafesinin alt altında cilt insizyon. (c)% 70 etanol ile maruz kas tabakası aşağı püskürtün. dalak kas tabakası (açık ok başı) altında görünür olmalıdır. aseptik veya steril forseps ve ince makas kullanarak (d), dalak ortaya çıkarmak için kas tabakası insizyon. (e) yavaşça forseps ve u dalak kapmakse ince makas bağ dokusunu çevreleyen uzak dalak kesmek için. (f) steril 1x PBS içeren 15 ml konik bir tüp içinde dalak yerleştirin. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54554/54554fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54554/54554fig2.jpg" /> Şekil hemasitometre kullanarak 2. Sayma Splenositler. (a) hemasitometre merkezi ızgara gösterir. (b) (her biri 16 küçük kareler içeren) 25 büyük kareler içeren merkezi bir ızgara büyütülmüş bir görünümünü göstermektedir. sayımı için kullanılan beş büyük kareler gri (4 köşe kareler artı merkezi ızgara merkez meydanında) vurgulanır. (c) büyük gri kareler birinin büyütülmüş bir görünümünü göstermektedir. 10 6 / ml, ilk sayısında hücre hacmi belirlemek içinbeş büyük gri kareler içindeki tüm canlı hücreler. Gösterilen örnekte, bu sayı 215. sayma, yalnızca ızgarasının sağındaki ve altındaki çift çizgiler dokunmadan olanlar dahil net (non-mavi) tüm hücreleri, saymak emin olmaktır. ızgara ve solunda üstünde çift çizgiler dokunmadan hücreleri saymayın. Toplam beş kare sayısını alın ve 10 6 / ml hücre sayısını elde etmek için 10 bölün. Örnek olarak, 10 bölü 215 21.5 x 10 6 hücre / ml &#39;dir. tripan mavisi 1: Bu hesaplamalar sadece vurgulanan gibi büyük kareler 5 sayım eğer çalışmak ve hücreler 1 sulandırmak unutmayın. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54554/54554fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54554/54554fig3.jpg" /> IFN-Tespiti için Şekil 3. Ayırıcı StratejisiNK ve NKT hücreleri y üretimi. SSC-A arsa ile FSC-A lenfositlerin ilk kapısı. Sonra FSC-H / FSC-A arsa üzerinde diyagonal üzerinde olan bu olaylar üzerine kapısı. Bunlar mayoları vardır. Sonra canlı (AmCyan -) üzerine kapı ve CD8 - hücreler. Sonra TCRβ karşı tetramer boyama arsa. NKT hücreleri çift pozitif nüfus içinde ve NK hücreleri çift negatif nüfus içindedir. çift ​​pozitif hücreler üzerinde Kapısı ve FSC karşı komplo NKp46. NKT hücreleri NKp46 negatif nüfus üzerinde Kapısı (bu kapı NK hücresi arsa iki nüfus bölünme noktası bularak ayarlanabilir). TCRβ - - NKp46 + popülasyonu NK hücreleri tetramer vardır. NK ve NKT hücre kapıları içinde, PE kanalında IFN-γ + hücreler FMO denetimine dayalı bir kapı ayarladıktan sonra tespit edilir. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54554/54554fig3large.jpg" target="_blank">lütfen tıklayın</a>Burada bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/54554/54554fig4.jpg" /> Şekil 4. Temsilcisi Veri 24 saat sonrası enfeksiyon IFN-y + NK ve NKT Hücrelerinin Frekanslar için elde edildi. Bu deneyde, erkek C57BL / 6J fareleri (n = 3-4 / grup), 10 5 CFU L. monositogenleri enfekte IP olduğunu ya da un ile enfekte kalmıştı. Fareler ayrıca aşılama ve daha sonra 12 saat arasında, aynı zamanda, ilaç IS001 veya taşıyıcı (% 0.5 karboksimetil selüloz) uygulanmıştır. Yirmi dört saat aşılamadan sonra, fareler öldürüldü ve dalakları çıkarıldı ve ayrı ayrı işlenmiş ve akış sitometrisi için boyandı. IFN-y + NK hücreleri SEM frekans ortalama ± gösterilir: (a) ya da NKT hücresi kapıları, (b) bir araç ya da ilaç IS001 ile muamele edildikten sonra enfekte edilmemiş ve enfekte edilmiş farelerin. * belirtiniziki kuyruklu t-testi ile araç kontrolünden sa fark (P &lt;0.05). Veri İmmünoloji Dergisi (hacim 195, s. 5189-5202, 2015) izniyle 31 re-yazdırılır. Telif Hakkı 2015 immünolojistler Amerikan Derneği, Inc. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54554/54554fig4large.jpg" target="_blank">, bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/54554/54554fig5.jpg" /> Şekil 5. CD4 ve CD8 hücrelerinde IFN-γ Üretiminin Belirlenmesi için Yolluk Stratejisi. SSC-A araziler tarafından FSC-A lenfositlerin ilk kapısı. Sonra FSC-H / FSC-A arsa üzerinde diyagonal üzerinde olan bu olaylar üzerine kapısı. Bunlar mayoları vardır. Bu kapının içinde, canlı (AmCyan -) üzerinde kapı CD45 + hücreler. Sonra CD8 + veya CD4 + ya popülasyonlar üzerinde geçit. Her kapı içinde, IFN-γ +PE kanal hücreleri FMO kontrol boyama karşılaştırarak belirlenmektedir. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54554/54554fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 6," src="/files/ftp_upload/54554/54554fig6.jpg" /> Şekil 6. Örnek veri L. monositogenleri 7 gün Enfeksiyondan (EGD suşu) de IFN-y + CD4 + ve CD8 + T hücrelerinin frekanslar için, elde edildi. Bu deneyde, erkek C57BL / 6J fareler, 2 x 10 4 CFU L. monocytogenes (n = 7 / grup) IP olarak enfekte edilmiştir ve enfekte edilmemiş (n = 3 / grup), kalmıştı. Fareler ayrıca aşılama gününde ilaç IS001 veya taşıyıcı (% 0.5 karboksimetil selüloz), günde iki kez başlangıç ​​tatbik edilmiştir. Yedi gün sonra fareler öldürüldü ve dalakları çıkarıldı ve ayrı ayrı için işlendihücre kültürü. Splenosit mononükleer hücreler kültür son 4 saat ilave önleyici protein taşıma ısı ile öldürülmüş L. monositogenleri 24 saat boyunca uyarıldı. Hücreler daha sonra akım sitometrisi için boyandı. IFN-y, bir taşıyıcı (% 0.5 karboksimetil selüloz) ile muamele edildikten sonra CD4 + (a) veya enfekte olmamış ya da enfekte olmuş farelerde CD8 + hücresi kapıları (b) + hücrelerinin ya da ilaç IS001 SEM frekans ortalama ± gösterilmiştir. * Iki kuyruklu t testi ile tespit edildiği üzere, araç kontrol muadili bir fark (P &lt;0.05) göstermektedir. Veri İmmünoloji Dergisi (hacim 195, s. 5189-5202, 2015) .Copyright 2015 immünolojistler Amerikan Derneği izni ile 31 den yeniden basılmış, Inc. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54554/54554fig6large.jpg" target="_blank">, bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Şekil 7. Temsilcisi Veri L. monocytogenes ile Erkek C57BL / 6J Fareler (EGD suşu) ve Enfeksiyon sonra endpointi Fare Survival bir PPARa rakip 1S001 Etkisini karşılaştırıldığında bir deneyde sırasında elde edildi. Bu deneyde, erkek C57BL / 6J farelerine (N = 10 fare / grup), L. monocytogenes patojenin değiştirilmiş LD 50 dozunun (10 5 CFU) ile enfekte IP edildi. Fareler ayrıca aşılama gününde ilaç IS001 veya taşıyıcı (% 0.5 karboksimetil selüloz), günde iki kez başlangıç ​​tatbik edilmiştir. Fareler klinik belirtiler için günlük olarak takip edilmiş ve insancıl uç noktaları karşılandı eğer ötenazi edildi. Log-Rank testi (P ​​&lt;0.05) ile saptandığı haliyle zaman * içinde son noktalar farelerin hayatta kalma yüzdesi gruplar arasında hayatta kalma bir fark gösterir gösterilmektedir. Veri Dergi o izni ile 31 re-yazdırılırf İmmünoloji (hacim 195, s. 5189-5202, 2015). Telif Hakkı 2015 immünolojistler Amerikan Derneği, Inc. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54554/54554fig7large.jpg" target="_blank">, bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="tablo 1" src="/files/ftp_upload/54554/54554table1.jpg" /> Tablo 1: Gündüz kültüründen bir tam bölen CFU belirlenmesi için bazı Örnek hesaplamaları gösterir. Bu örnekte, günlük kültür ul&#39;lik bir alikuot alınmış ve tamponu 1: BHI ortamı ile 1. Bu seyreltilmiş numunenin OD&#39;si 600 0.84 olduğu tespit edildi. Buna ek olarak, 100 ul alikosu CFU belirlenmesi için alınmıştır. Bu örnek, BHI ortamı 900 ul (10 -1) ile seyreltildi ve yıkandı ve 1 ml BHI içinde yeniden süspanse edilmiştir. Bu örnek bir 10-kat seyreltme serisi (10 -2 -9 10) elde edilmiştir ve seyreltilmiş numune, BHI aga ekildir plakaları (10 -4 -9 10 için yalnızca değerleri gösterilir). Ertesi gün koloniler sayılmıştır. 30-300 arasında koloni sayıları vardı sadece o plakalar (yani, 10 -6 levha, sarı vurgulanan) hesaplaması için kabul edildi. Bu plaka (70) üzerindeki kolonilerin sayısı daha sonra seyreltilmiş örnek CFU / ml elde etmek için 0.1 (kaplama mi hacim) ile bölünmüştür. Bu değer daha sonra, seyreltilmemiş kültür CFU / mL değerini elde etmek için seyreltme faktörü (10 6) ile çarpıldı. TMTC saymak için çok =. <img alt="Tablo 2" src="/files/ftp_upload/54554/54554table2.jpg" /> Tablo 2: NK ve NKT Hücrelerde Algılama IFN-gamma için boyama Paneli. panel ya da CD4 antikoru klonu GK1.1 çeşitli florokrom alternatifler ile boyanmış splenositler kullanılan akış antikor ile boyandı dengeleme boncuk ya tek pozitif kontrol olarak kullanılabilir unutmayın. <img alt="Tablo 3" src="/files/ftp_upload/54554/54554table3.jpg" /> Tablo 3: CD4 + ve CD8 + hücrelerinde algılama IFN-y için boyama panel. panel ya da CD4 antikoru klonu GK1.1 çeşitli florokrom alternatifler ile boyanmış splenositler kullanılan akış antikor ile boyandı ya da dengeleme boncuklar tek pozitif kontrol olarak kullanılabilir unutmayın.

Watch this Scientific Journal Video about Experimental Infection with Listeria monocytogenes as a Model for Studying Host Interferon-ÃŽÂ³ Responses at JoVE.com

Experimental Infection with Listeria monocytogenes as a Model for Studying Host Interferon-&#947; Responses

Bu protokol, Listeria monocytogenes EGD suşu ile (L. monocytogenes) C57BL / 6J fareleri aşılamak için ve doğal öldürücü (NK) hücreleri, doğal katil T (NKT) hücreler tarafından interferon-y (IFN-γ) tepkilerini ölçmek açıklamaktadır ve adaptif T sonrası enfeksiyon lenfosit. Bu protokol ayrıca patojen modifiye LD 50 dozu ile enfeksiyondan sonra farelerde hayatta kalma çalışmaları yürütmek açıklamaktadır.

Deneysel Enfeksiyon<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Ana İnterferon-γ Yanıtları incelenmesi için Bir Model Olarak

L. monocytogenes is a gram-positive bacterium that is a cause of food borne disease in humans. Experimental infection of mice with this pathogen has been ...

experimental-infection-with-listeria-monocytogenes-as-model-for

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.5K Görüntüleme.  University of Toronto.  Bu protokol, Listeria monocytogenes EGD suşu ile (L. monocytogenes) C57BL / 6J fareleri aşılamak için ve doğal öldürücü (NK) hücreleri, doğal katil T (NKT) hücreler tarafından interferon-y (IFN-γ) tepkilerini ölçmek açıklamaktadır ve adaptif T sonrası enfeksiyon lenfosit. Bu protokol ayrıca patojen modifiye LD 50 dozu ile enfeksiyondan sonra farelerde hayatta kalma çalışmaları yürütmek açıklamaktadır. 

Video: Experimental Infection with Listeria monocytogenes as a Model for Studying Host Interferon-γ Responses

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of Listeria, which results in systemic infection2. After injection, Listeria quickly disseminates to the spleen and liver due to uptake by CD8&alpha;+ dendritic cells and Kupffer cells3,4. Once phagocytosed, various bacterial proteins enable Listeria to escape the phagosome, survive within the cytosol, and infect neighboring cells5. During the first three days of infection, different innate immune cells (e.g. monocytes, neutrophils, NK cells, dendritic cells) mediate bactericidal mechanisms that minimize Listeria proliferation. CD8+ T cells are subsequently recruited and responsible for the eventual clearance of Listeria from the host, typically within 10 days of infection6.
Successful clearance of Listeria from infected mice depends on the appropriate onset of host immune responses6	. There is a broad range of sensitivities amongst inbred mouse strains7,8. Generally, mice with increased susceptibility to Listeria infection are less able to control bacterial proliferation, demonstrating increased bacterial load and/or delayed clearance compared to resistant mice. Genetic studies, including linkage analyses and knockout mouse strains, have identified various genes for which sequence variation affects host responses to Listeria infection6,8-14. Determination and comparison of infection kinetics between different mouse strains is therefore an important method for identifying host genetic factors that contribute to immune responses against Listeria. Comparison of host responses to different Listeria strains is also an effective way to identify bacterial virulence factors that may serve as potential targets for antibiotic therapy or vaccine design.
We describe here a straightforward method for measuring bacterial load (colony forming units [CFU] per tissue) and preparing single-cell suspensions of the liver and spleen for FACS analysis of immune responses in Listeria-infected mice. This method is particularly useful for initial characterization of Listeria infection in novel mouse strains, as well as comparison of immune responses between different mouse strains infected with Listeria. We use the Listeria monocytogenes EGD strain15 that, when cultured on blood agar, exhibits a characteristic halo zone around each colony due to &beta;-hemolysis1 (Figure 1). Bacterial load and immune responses can be determined at any time-point after infection by culturing tissue homogenate on blood agar plates and preparing tissue cell suspensions for FACS analysis using the protocols described below. We would note that individuals who are immunocompromised or pregnant should not handle Listeria, and the relevant institutional biosafety committee and animal facility management should be consulted before work commences.

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a model organism for studying immune responses and genetic susceptibility to intracellular bacteria in mice. This method enables one to measure bacterial load and generate single-cell suspensions of the liver and spleen from mice for FACS analysis to determine changes in immune cells due to Listeria infection.

Ile Enfekte Fare Bakteriyel Yük ve Bağışıklık Yanıtları Ölçüm Listeria monocytogenes</em

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

Bakteriyel Yapışma Çalışma Kesme Stres Tanıtımı

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

The Citrobacter rodentium Mouse Model: Studying Pathogen and Host Contributions to Infectious Colitis

This protocol outlines the steps required to produce a robust model of infectious disease and colitis, as well as the methods used to characterize Citrobacter rodentium infection in mice. C. rodentium is a gram negative, murine specific bacterial pathogen that is closely related to the clinically important human pathogens enteropathogenic E. coli and enterohemorrhagic E. coli. Upon infection with C. rodentium, immunocompetent mice suffer from modest and transient weight loss and diarrhea. Histologically, intestinal crypt elongation, immune cell infiltration, and goblet cell depletion are observed. Clearance of infection is achieved after 3 to 4 weeks. Measurement of intestinal epithelial barrier integrity, bacterial load, and histological damage at different time points after infection, allow the characterization of mouse strains susceptible to infection.
The virulence mechanisms by which bacterial pathogens colonize the intestinal tract of their hosts, as well as specific host responses that defend against such infections are poorly understood. Therefore the C. rodentium model of enteric bacterial infection serves as a valuable tool to aid in our understanding of these processes. Enteric bacteria have also been linked to Inflammatory Bowel Diseases (IBDs). It has been hypothesized that the maladaptive chronic inflammatory responses seen in IBD patients develop in genetically susceptible individuals following abnormal exposure of the intestinal mucosal immune system to enteric bacteria. Therefore, the study of models of infectious colitis offers significant potential for defining potentially pathogenic host responses to enteric bacteria. C. rodentium induced colitis is one such rare model that allows for the analysis of host responses to enteric bacteria, furthering our understanding of potential mechanisms of IBD pathogenesis; essential in the development of novel preventative and therapeutic treatments.

The Citrobacter rodentium Mouse Model: Studying Pathogen and Host Contributions to Infectious Colitis

Citrobacter rodentium infection provides a valuable model to study enteric bacterial infections as well as host immune responses and colitis in mice. This protocol outlines the measurement of barrier integrity, pathogen load and histological damage allowing for the thorough characterization of pathogen and host contributions to murine infectious colitis.

<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; Mouse Model: Bulaşıcı Kolit için çalışılması Patojen ve Host Katılımlar

This protocol  outlines the steps required to produce a robust model of infectious disease and  colitis, as well as the methods used to characterize ...

Oral Transmission of Listeria monocytogenes in Mice via Ingestion of Contaminated Food

L. monocytogenes are facultative intracellular bacterial pathogens that cause food borne infections in humans. Very little is known about the gastrointestinal phase of listeriosis due to the lack of a small animal model that closely mimics human disease. This paper describes a novel mouse model for oral transmission of L. monocytogenes. Using this model, mice fed L. monocytogenes-contaminated bread have a discrete phase of gastrointestinal infection, followed by varying degrees of systemic spread in susceptible (BALB/c/By/J) or resistant (C57BL/6) mouse strains. During the later stages of the infection, dissemination to the gall bladder and brain is observed. The food borne model of listeriosis is highly reproducible, does not require specialized skills, and can be used with a wide variety of bacterial isolates and laboratory mouse strains. As such, it is the ideal model to study both virulence strategies used by L. monocytogenes to promote intestinal colonization, as well as the host response to invasive food borne bacterial infection.

Oral Transmission of Listeria monocytogenes in Mice via Ingestion of Contaminated Food

This paper describes a novel method for oral infection of mice using Listeria monocytogenes-contaminated food. The protocol can readily be adapted for use with other food borne bacterial pathogens.

Sözlü İletim<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Kirlenmiş Gıda Yutma ile Farelerde

L. monocytogenes are facultative intracellular bacterial pathogens that cause food borne infections in humans. Very little is known about the ...

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and replicates within alveolar macrophages. Its virulence depends on the Dot/Icm type IV secretion system (T4SS), which is essential to establish a replication permissive vacuole known as the Legionella containing vacuole (LCV). L. pneumophila infection can be modeled in mice however most mouse strains are not permissive, leading to the search for novel infection models. We have recently shown that the larvae of the wax moth Galleria mellonella are suitable for investigation of L. pneumophila infection. G. mellonella is increasingly used as an infection model for human pathogens and a good correlation exists between virulence of several bacterial species in the insect and in mammalian models. A key component of the larvae&#39;s immune defenses are hemocytes, professional phagocytes, which take up and destroy invaders. L. pneumophila is able to infect, form a LCV and replicate within these cells. Here we demonstrate protocols for analyzing L. pneumophila virulence in the G. mellonella model, including how to grow infectious L. pneumophila, pretreat the larvae with inhibitors, infect the larvae and how to extract infected cells for quantification and immunofluorescence microscopy. We also describe how to quantify bacterial replication and fitness in competition assays. These approaches allow for the rapid screening of mutants to determine factors important in L. pneumophila virulence, describing a new tool to aid our understanding of this complex pathogen.

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

The larva of the wax moth Galleria mellonella was recently established as an in vivo model to study Legionella pneumophila infection. Here, we demonstrate fundamental techniques to characterize the pathogenesis of Legionella in the larvae, including inoculation, measurement of bacterial virulence and replication as well as extraction and analysis of infected hemocytes.

Kullanımı<em&gt; Galleria mellonella</em&gt; Bir Model Organizma olarak Eğitim için<em&gt; Legionella pneumophila</em&gt; Enfeksiyon

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and ...

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Bacterial intracellular pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling cascades due to their capacity to exquisitely manipulate and subvert cell functions which are required for the infection of host target tissues. Among these bacterial pathogens, Listeria monocytogenes is a Gram positive microorganism that has been used as a paradigm for intracellular parasitism in the characterization of cellular immune responses, and which has played instrumental roles in the discovery of molecular pathways controlling cytoskeletal and membrane trafficking dynamics. In this article, we describe a robust microscopical assay for the detection of late cellular infection stages of L. monocytogenes based on the fluorescent labeling of InlC, a secreted bacterial protein which accumulates in the cytoplasm of infected cells; this assay can be coupled to automated high-throughput small interfering RNA screens in order to characterize cellular signaling pathways involved in the up- or down-regulation of infection.

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram positive bacterial pathogen frequently used as a major model for the study of intracellular parasitism. Imaging late L. monocytogenes infection stages within the context of small-interfering RNA screens allows for the global study of cellular pathways required for bacterial infection of target host cells.

Bakteriyel Patojen Hücresel Enfeksiyon Soruşturma inlc salgılanmasına Görüntüleme<em&gt; Listeria monocytogenes</em

Bacterial intracellular  pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling  cascades due to their capacity to exquisitely ...

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

Anaerobic bacteria far outnumber aerobes in many human niches such as the gut, mouth, and vagina. Furthermore, anaerobic infections are common and frequently of indigenous origin. The ability of some anaerobic pathogens to invade human cells gives them adaptive measures to escape innate immunity as well as to modulate host cell behavior. However, ensuring that the anaerobic bacteria are live during experimental investigation of the events may pose challenges. Porphyromonas gingivalis, a Gram-negative anaerobe, is capable of invading a variety of eukaryotic non-phagocytic cells. This article outlines how to successfully culture and assess the ability of P. gingivalis to invade human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). Two protocols were developed: one to measure bacteria that can successfully invade and survive within the host, and the other to visualize bacteria interacting with host cells. These techniques necessitate the use of an anaerobic chamber to supply P. gingivalis with an anaerobic environment for optimal growth.
The first protocol is based on the antibiotic protection assay, which is largely used to study the invasion of host cells by bacteria. However, the antibiotic protection assay is limited; only intracellular bacteria that are culturable following antibiotic treatment and host cell lysis are measured. To assess all bacteria interacting with host cells, both live and dead, we developed a protocol that uses fluorescent microscopy to examine host-pathogen interaction. Bacteria are fluorescently labeled with 2&#39;,7&#39;-Bis-(2-carboxyethyl)-5-(and-6)-carboxyfluorescein acetoxymethyl ester (BCECF-AM) and used to infect eukaryotic cells under anaerobic conditions. Following fixing with paraformaldehyde and permeabilization with 0.2% Triton X-100, host cells are labeled with TRITC phalloidin and DAPI to label the cell cytoskeleton and nucleus, respectively. Multiple images taken at different focal points (Z-stack) are obtained for temporal-spatial visualization of bacteria. Methods used in this study can be applied to any cultivable anaerobe and any eukaryotic cell type.

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

This article presents two protocols: one to measure anaerobic bacteria that can successfully invade and survive within the host, and the other to visualize anaerobic bacteria interacting with host cells. This study can be applied to any cultivable anaerobe and any eukaryotic cell type.

Ana Hücreleri ile Anaerobik Bakteriler Etkileşim değerlendirilmesi için bir model organizma olarak Porphyromonas gingivalis

Anaerobic bacteria far outnumber aerobes in many human niches such as the gut, mouth, and vagina. Furthermore, anaerobic infections are common and ...

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. However, isolating bacterial RNA from infected cells or tissues is a challenging task, since mammalian RNA mostly dominates the lysates of infected cells. Here we describe an optimized method for RNA isolation of Listeria monocytogenes bacteria growing within bone marrow derived macrophage cells. Upon infection, cells are mildly lysed and rapidly filtered to discard most of the host proteins and RNA, while retaining intact bacteria. Next, bacterial RNA is isolated using hot phenol-SDS extraction followed by DNase treatment. The extracted RNA is suitable for gene transcription analysis by multiple techniques. This method is successfully employed in our studies of Listeria monocytogenes gene regulation during infection of macrophage cells 1-4. The protocol can be easily modified to study other bacterial pathogens and cell types.

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

Here we describe a method for bacterial RNA isolation from Listeria monocytogenes bacteria growing inside murine macrophages. This technique can be used with other intracellular pathogens and mammalian host cells.

RNA Arıtma Hücre içindeki dan Yetiştirilen<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Makrofaj

Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. ...

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and resilience of Bacillus subtilis biofilms. First, methods are presented that select for small molecule inhibitors with biofilm-specific targets in order to separate the effect of the small molecule inhibitors on planktonic growth from their effect on biofilm formation. Next, we focus on how inoculation conditions affect the sensitivity of multicellular, floating B. subtilis cultures to small molecule inhibitors. The results suggest that discrepancies in the reported effects of such inhibitors such as D-amino acids are due to inconsistent pre-culture conditions. Furthermore, a recently developed protocol is described for evaluating the contribution of small molecule treatments towards biofilm resistance to antibacterial substances. Lastly, scanning electron microscopy (SEM) techniques are presented to analyze the three-dimensional spatial arrangement of cells and their surrounding extracellular matrix in a B. subtilis biofilm. SEM facilitates insight into the three-dimensional biofilm architecture and the matrix texture. A combination of the methods described here can greatly assist the study of biofilm development in the presence and absence of biofilm inhibitors, and shed light on the mechanism of action of these inhibitors.

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

This study presents the development of reproducible methodologies to study biofilm inhibitors and their effects on Bacillus subtilis multicellularity.

Araştırma yöntemleri<em&gt; B. subtilis</emKüçük Molekül Biyofilm İnhibitörleri Karakterizasyonu için Bir Model Olarak&gt; Biyofilmler

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and ...

Listeria monocytogenes Infection of the Brain

Listeria monocytogenes is an intracellular bacterial pathogen that is frequently associated with food-borne infection. The ability of&#160;L. monocytogenes to cross the blood-brain barrier (BBB) is concerning as it can lead to life-threatening meningitis and encephalitis. The BBB protects the brain microenvironment from various toxic metabolites and microbial pathogens found in the blood following infection, and therefore supports brain homeostasis. The mechanisms by which L. monocytogenes present in the bloodstream cross the BBB to cause brain infections are not fully understood and there is also a lack of a robust model system to study brain infections by L. monocytogenes. Here, we present a simple mouse infection model to determine whether bacteria have crossed the BBB and to quantitate the burden of bacteria that have colonized the brain in vivo. In this method, animals were infected intravenously with L. monocytogenes and were humanely euthanized by exposure to CO2 followed by cervical dislocation. Cardiac perfusion of the animals was performed prior to harvesting infected organs. Blood was collected before perfusion and the number of bacteria per organ or mL of blood was determined by plating dilutions of the blood or organ homogenates on agar plates and counting the number of colonies formed. This method can be used to study novel receptor-ligand interactions that enhance infection of the brain by L. monocytogenes and can be easily adapted for the study of multiple bacterial pathogens.

Listeria monocytogenes Infection of the Brain

During infection, Listeria monocytogenes is capable of crossing the blood-brain barrier to colonize the brain. In this protocol, we demonstrate how to assess bacterial colonization of organs following infection of mice. A procedure to perform whole organ perfusion for specific determination of bacterial numbers in the brain parenchyma is provided.