Yüksek Kapasiteli Manyetik Protein A veya Manyetik Protein G Boncuk üzerine 1. Antikor Yakalama <ol><li> Düzgün nazik sallayarak manyetik boncuk yeniden askıya. boncuk aliquoting Süspansiyon üniforma tutun. </li><li> 1.5 ml mikrosantrifüj tüpüne boncuk çamuru 50 ul ekle. 10 saniye boyunca manyetik stand koyun. Dikkatle depolama tamponu çıkarın. </li><li> Antikor bağlama tamponu, 250 ul ekleyin. </li><li> Mix ve 10 saniye manyetik stand koyun. Dikkatle bağlayıcı tampon kaldırmak. </li><li> tanelerine antikorun 50-100 ug ihtiva eden numune 1.0 ml ilave edilir. Numuneler, hücre ortamında antikorlar ya da antikor arıtılabilir. </li><li> vorteksli bir mikserde veya son aşırı uç mikser kullanılarak, oda sıcaklığında 60 dakika boyunca örnek karıştırın. </li><li> 10 saniye boyunca manyetik stand tüp yerleştirin ve süpernatant kaldırmak. </li><li> antikor bağlama / yıkama tamponu 250 ul ilave et ve karıştır. 10 saniye boyunca manyetik stand koyun ve bağlayıcı / yıkama tamponu çıkarın. Bu s tekrarlayınİki yıkar toplam TEP. </li><li> amin kimyası veya Bölüm 3 tiol kimyası kullanılarak etiketli antikorlar kullanılarak etiket antikorlara Bölüm 2&#39;ye geçin. </li></ol> Amin kimyası kullanılarak 2. Antikor etiketleme <ol><li> Konjuge Antikor <ol><li> Boncuklar amin konjugasyon tampon 100 ul ekle. </li><li> boyanın 1.0 mg dimetil sülfoksit (DMSO), 100 ul ekleyerek, 10 mg / ml&#39;de bir amin-reaktif floresan boyalar (AlexaFluor 532-K) içinde çözülür. vorteks ile karıştırın. Kullanımdan hemen önce bu çözüm olun. </li><li> antikorun, 100 ug amin-reaktif boya 2.5 ul ekle. Not: Genellikle reaktif boyanın 5-20 mol fazlası önerilir. Bununla birlikte, reaktif boyanın miktarı, reaksiyon ampirik antikor oranı ve içsel antikor özellikleri arzu edilen boya bağlı olarak optimize edilmesi gerekmektedir ilave edildi. </li><li> vorteksli bir mikserde veya son aşırı uç mikser kullanılarak, oda sıcaklığında 60 dakika boyunca örnek karıştırın. boncuk suspensio kalır emin olunn. </li><li> 10 saniye boyunca manyetik stand tüp yerleştirin ve süpernatant kaldırmak. </li><li> antikor bağlama / yıkama tamponu 250 ul ilave et ve karıştır. 10 saniye boyunca manyetik stand koyun. Çıkarın ve bağlayıcı / yıkama tamponu atın. İki yıkar toplam için bu adımı tekrarlayın. </li></ol></li><li> antikor Kurtarma <ol><li> tanelerine elüsyon tamponu 50 ul ekle. </li><li> vorteksli bir mikserde veya son aşırı uç mikser kullanılarak oda sıcaklığında 5 dakika boyunca karıştırın. boncuk süspansiyon kalır emin olun. </li><li> 10 saniye boyunca manyetik stand tüp yerleştirin. nötralizasyon tamponu 5 ul içeren yeni bir mikro-santrifüj tüpüne yıkandı örnek ve transfer çıkarın. </li><li> sürecini bir kez daha tekrarlayın ve yıkandı, örnekleri havuz. </li><li> antikor konsantrasyonunu ölçmek ve boya için antikor oranı Bölüm 4&#39;te tarif edildiği gibi. </li></ol></li></ol> Tiol kimyası kullanılarak 3. Antikor etiketleme <ol><li> antikor Azaltma <ol><li> 250 ul ekleyintiyol konjugasyon tampon ve karışımı. 10 saniye boyunca manyetik stand tüp yerleştirin. Çıkarın ve tampon atın. İki kez bu adımı yineleyin. </li><li> tiyol konjugasyon tampon 100 ul ekleyin. </li><li> 2.5 mM&#39;lik bir son konsantrasyona ditiyotreitol (DTT) ilave edilir. </li><li> vorteksli bir mikserde veya son aşırı uç mikser kullanılarak, oda sıcaklığında 60 dakika boyunca örnek karıştırın. boncuk süspansiyon kalır emin olun. </li><li> 10 saniye boyunca manyetik stand tüp yerleştirin ve tampon atın. </li><li> tiyol konjugasyon tampon 250 ul ekleyin ve karıştırın. 10 saniye boyunca manyetik stand tüp yerleştirin. Çıkarın ve tampon atın. İki yıkar toplam için bu adımı tekrarlayın. </li><li> tiyol konjugasyon tampon 100 ul ekleyin. </li></ol></li><li> Konjuge Antikor <ol><li> boyanın 1.0 mg DMSO, 100 ul ekleyerek / ml 10 mg tiol-reaktif boya çözülür. vorteks ile karıştırın. Kullanımdan hemen önce bu çözüm olun. </li><li> anti 100 ug için tiol-reaktif boya 2.5 ul eklevücut. Not: Genellikle reaktif boyanın 5-20 mol fazlası önerilir. Bununla birlikte, reaktif boyanın miktarı, reaksiyon ampirik antikor oranı ve içsel antikor özellikleri arzu edilen boya bağlı olarak optimize edilmesi gerekmektedir ilave edildi. </li><li> vorteksli bir mikserde veya son aşırı uç mikser kullanılarak, oda sıcaklığında 60 dakika boyunca örnek karıştırın. boncuk süspansiyon kalır emin olun. </li><li> 10 saniye boyunca manyetik stand tüp yerleştirin ve süpernatant kaldırmak. </li><li> tiyol konjugasyon tampon 250 ul ekleyin ve karıştırın. 10 saniye boyunca manyetik stand koyun ve tampon kaldırmak. İki yıkar toplam için bu adımı tekrarlayın. </li></ol></li><li> Zehir Antikor <ol><li> tanelerine elüsyon tamponu 50 ul ekle. </li><li> vorteksli bir mikserde veya son aşırı uç mikser kullanılarak oda sıcaklığında 5 dakika boyunca karıştırın. boncuk süspansiyon kalır emin olun. </li><li> 10 saniye boyunca manyetik stand tüp yerleştirin. neut 5 ul içeren yeni bir mikro-santrifüj tüpüne yıkandı örnek ve transfer çıkarınralization tamponu. </li><li> sürecini bir kez daha tekrarlayın ve yıkandı, örnekleri havuz. </li><li> antikor konsantrasyonunu ölçmek ve boya için antikor oranı Bölüm 4&#39;te tarif edildiği gibi. </li></ol></li></ol> 4. Hesapla Dye-to-Antikor Oranı <ol><li> 280 nm (A280) de ve boya (Amak) için Xmaks antikor boya birleşimine absorbansı ölçülür. </li><li> antikor konsantrasyonunu hesaplayın: Antikor konsantrasyonu (mg / ml) = A280 - (CF x A max) / 1.4 nerede CF (üretici tarafından sağlanan) boya = düzeltme faktörü. </li><li> boya-to-antikora oranı hesaplanır: Boya-to-antikor oranı (DAR) = (150,000 x A max) / Ab konsantrasyonu (mg / ml) x ε boyası burada, ε boya = sönüm absorbansı en fazla boyanın katsayısı ve antikorun molekül ağırlığı = 150.000 Da. </li></ol>

<ol>
	<li>Colwill, K., Graslund, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+roadmap+to+generate+renewable+protein+binders+to+the+human+proteome.">A roadmap to generate renewable protein binders to the human proteome.</a> Nat Methods. 8 (7), 551-558 (2011).</li><li>Silverstein, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeled+antigens+and+antibodies:+the+evolution+of+magic+markers+and+magic+bullets.">Labeled antigens and antibodies: the evolution of magic markers and magic bullets.</a> Nat Immunol. 5 (12), 1211-1217 (2004).</li><li>Day, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+modified+antibodies+as+diagnostic+imaging+agents.">Chemically modified antibodies as diagnostic imaging agents.</a> Curr Opin Chem Biol. 14 (6), 803-809 (2010).</li><li>Cunningham, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+flow+cytometry+and+fluorescent+probes+for+flow+cytometry.">Overview of flow cytometry and fluorescent probes for flow cytometry.</a> Methods Mol Biol. 588, 319-326 (2010).</li><li>Eaton, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+modern+quantitative+fluorescent+western+blotting+with+troubleshooting+strategies.">A guide to modern quantitative fluorescent western blotting with troubleshooting strategies.</a> J Vis Exp. (93), e52099 (2014).</li><li>Dundas, C. M., Demonte, D., Park, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptavidin-biotin+technology:+improvements+and+innovations+in+chemical+and+biological+applications.">Streptavidin-biotin technology: improvements and innovations in chemical and biological applications.</a> Appl Microbiol Biotechnol. 97 (21), 9343-9353 (2013).</li><li>Kraeber-Bodere, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radioimmunoconjugates+for+the+treatment+of+cancer.">Radioimmunoconjugates for the treatment of cancer.</a> Semin Oncol. 41 (5), 613-622 (2014).</li><li>Leal, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-drug+conjugates:+an+emerging+modality+for+the+treatment+of+cancer.">Antibody-drug conjugates: an emerging modality for the treatment of cancer.</a> Ann N Y Acad Sci. 1321, 41-54 (2014).</li><li>Drachman, J. G., Senter, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-drug+conjugates:+the+chemistry+behind+empowering+antibodies+to+fight+cancer.">Antibody-drug conjugates: the chemistry behind empowering antibodies to fight cancer.</a> Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2013, 306-310 (2013).</li><li>Hermanson, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bioconjugate Techniques. , 380-382 (1996).</li><li>Shrestha, D., Bagosi, A., Szollosi, J., Jenei, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+of+the+three+different+fluorophore+antibody+conjugation+strategies.">Comparative study of the three different fluorophore antibody conjugation strategies.</a> Anal Bioanal Chem. 404 (5), 1449-1463 (2012).</li><li>Vira, S., Mekhedov, E., Humphrey, G., Blank, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent-labeled+antibodies:+Balancing+functionality+and+degree+of+labeling.">Fluorescent-labeled antibodies: Balancing functionality and degree of labeling.</a> Anal Biochem. 402 (2), 146-150 (2010).</li><li>Isa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+system+to+identify+small+molecules+that+induce+internalization+and+degradation+of+HER2.">High-throughput screening system to identify small molecules that induce internalization and degradation of HER2.</a> ACS Chem Biol. 9 (10), 2237-2241 (2014).</li><li>Liao-Chan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assessment+of+antibody+internalization+with+novel+monoclonal+antibodies+against+Alexa+fluorophores.">Quantitative assessment of antibody internalization with novel monoclonal antibodies against Alexa fluorophores.</a> PLoS One. 10 (4), e0124708 (2015).</li><li>Riedl, T., van Boxtel, E., Bosch, M., Parren, P. W., Gerritsen, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+Screening+for+Internalizing+Antibodies+by+Homogeneous+Fluorescence+Imaging+of+a+pH-Activated+Probe.">High-Throughput Screening for Internalizing Antibodies by Homogeneous Fluorescence Imaging of a pH-Activated Probe.</a> J Biomol Screen. 21 (1), 12-23 (2016).</li><li>Nath, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homogeneous+plate+based+antibody+internalization+assay+using+pH+sensor+fluorescent+dye.">Homogeneous plate based antibody internalization assay using pH sensor fluorescent dye.</a> J Immunol Methods. 431, 11-21 (2016).</li><li>Lundberg, E., Sundberg, M., Graslund, T., Uhlen, M., Svahn, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+reproducible+fluorescent+labeling+of+small+amounts+of+antibodies+on+solid+phase.">A novel method for reproducible fluorescent labeling of small amounts of antibodies on solid phase.</a> J Immunol Methods. 322 (1-2), 40-49 (2007).</li><li>Strachan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid-phase+biotinylation+of+antibodies.">Solid-phase biotinylation of antibodies.</a> J Mol Recognit. 17 (3), 268-276 (2004).</li><li>Dezfouli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+bead+assisted+labeling+of+antibodies+at+nanogram+scale.">Magnetic bead assisted labeling of antibodies at nanogram scale.</a> Proteomics. 14 (1), 14-18 (2014).</li><li>Nath, N., Godat, B., Benink, H., Urh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On-bead+antibody-small+molecule+conjugation+using+high-capacity+magnetic+beads.">On-bead antibody-small molecule conjugation using high-capacity magnetic beads.</a> J Immunol Methods. 426, 95-103 (2015).</li><li>Lund, L. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+variation+in+binding+of+Protein+A+and+Protein+G+to+immunoglobulin+type+G+by+isothermal+titration+calorimetry.">Exploring variation in binding of Protein A and Protein G to immunoglobulin type G by isothermal titration calorimetry.</a> J Mol Recognit. 24 (6), 945-952 (2011).</li><li>Safarik, I., Safarikova, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+techniques+for+the+isolation+and+purification+of+proteins+and+peptides.">Magnetic techniques for the isolation and purification of proteins and peptides.</a> Biomagn Res Technol. 2 (1), 7 (2004).</li><li>Flygare, J. A., Pillow, T. H., Aristoff, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-drug+conjugates+for+the+treatment+of+cancer.">Antibody-drug conjugates for the treatment of cancer.</a> Chem Biol Drug Des. 81 (1), 113-121 (2013).</li><li>Shen, B. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conjugation+site+modulates+the+in+vivo+stability+and+therapeutic+activity+of+antibody-drug+conjugates.">Conjugation site modulates the in vivo stability and therapeutic activity of antibody-drug conjugates.</a> Nat Biotechnol. 30 (2), 184-189 (2012).</li><li>Acchione, M., Kwon, H., Jochheim, C. M., Atkins, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+linker+and+conjugation+chemistry+on+antigen+binding,+Fc+receptor+binding+and+thermal+stability+of+model+antibody-drug+conjugates.">Impact of linker and conjugation chemistry on antigen binding, Fc receptor binding and thermal stability of model antibody-drug conjugates.</a> MAbs. 4 (3), 362-372 (2012).</li></ol>

Authors are employees of Promega Corporation.

Bu çalışmanın amacı, küçük moleküllerin çeşitli, düşük konsantrasyonlarda, hücre ortamı içinde mevcut antikorları etiket için bir yöntem geliştirmektir. Antikor keşif erken safhalarında antikorların çok sayıda olanak sağlayacaktır bir yöntem olup, küçük moleküller ile işaretlenmiş olan bir biyolojik ilgili deneyi kullanılarak taranabilir için. Böyle bir deney, içselleştirme da benzer bağlanma afinitelerine sahip antikorlar arasında değişebilir reseptör aracılı antikor, geliştirilmiş içselleştirme deneyidir. Bu nedenle, geleneksel Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) tabanlı tarama ek olarak kendi içselleştirme özellikleri için, özellikle antikorları taramak için önemlidir. Erken antikor gelişme aşamasında antikorlar etiket yöntemi için temel gereksinimleri şunlardır: doğrudan hücre ortamından antikorlar etiketlemek için) yeteneği; b) hücre ortamında antikor konsantrasyonu 50 ug / ml olduğunda, örneğin, düşük konsantrasyonlarda mevcut antikorlar etiket kabiliyeti; c)işaretlenmiş antikor ve antikor konsantrasyonu saflığı alt uygulamalar ile uyumlu olmalıdır; d) yöntemi amin ve tiyol tabanlı konjugasyon kimyası ile uyumlu olmalıdır; e) yöntemi, aynı anda birden fazla numune işleme ile uyumlu olması gerekmektedir. Bu gereksinimleri göz önüne alındığında, biz yüksek kapasiteli manyetik Protein A ve Protein G boncuklar kullanarak bir on-boncuk antikor etiketleme ve saflaştırma yöntemi geliştirdi. Şekil 2&#39;de gösterildiği üzere, taneler, düşük özgül-olmayan bağlanma özelliklerine sahip hidrofilik selüloz bazlı ve oldukça saf bir antikor preparasyonu ile sonuçlanabilir edilmiştir. Boncuk yüksek kapasiteli tanelerin küçük bir miktar etkin medya ve antikorlar arasında antikorları yakalamak anlamına gelir dolayısıyla antikorlar konsantre küçük hacim içinde elüte edilebilir. Tablo 1 &#39;de, sadece 10 ul boncuk 1.0 mi örneklerinden antikorlar (beklenen konsantrasyonları 50-100 ug / ml), bir yakalamak için kullanılan yerleşmişD etiketli antikorlar 200-500 ug / ml arası konsantrasyonlarda 120 ul hacim içinde elüt edilmiştir. Bu konsantrasyonlar, tipik antikor konsantrasyonları 1.0 ug / ml ila 10 ng / ml arasında değişir 15,16 hücre temelli içselleştirme deneyleri ile uyumludur. On-boncuk etiketleme yöntemi amin ve tiol kimyaları ve etiketlenmiş antikorlar (Tablo 1) verimli bir şekilde geri ile elde edilebilir boya için antikor oranları geniş ile uyumludur. Deneyler üç kez yapıldı ve 12 numune önemli ölçüde işleme süresini azaltarak, elle paralel olarak ele alınmıştır. Etiketleme verimi ayrıca, manyetik boncuklar 19,22 kullanan diğer uygulamalarda gösterildiği gibi robot platformlar kullanılarak arttırılabilir. daha yüksek bir antikor miktarı ile yapılan deneylerde, antikor kazanımı ve markalama efficie korurken yakalama için kullanılan boncuk miktarını artırarak yerleştirilebilirNCY (Tablo 2). Çeşitli boya antikor konjügatları yapılabilir ki, boya için antikor oranları optimize edilmesi gerekir, bu nedenle bir yöntem, aynı zamanda birden fazla boya ile uyumludur. 2-4 antikor oranı boya 11,12 uygun olduğu tespit edilmiş ve onaylanmıştır ADC&#39;ler durumunda Antikor başına 3.5 ilaçların ortalama 23 bildirilmiştir. on-boncuk çekimi kimyası ile, alt uygulama gereksinimlerine bağlı olarak, antikor başına küçük molekülün optimum sayıda ayarlamak için nispeten kolaydır. Ayrıca, etiketleme için tiol ve amin kimyası, antijen ve reseptör bağlanmasının in vivo stabilite gösterildiği gibi ADC&#39;ler için kritik olan en iyi kimya seçeneği belirlemek için test edilebilir ve antikorun terapötik aktivite çekimi kimyası 24 bağlıdır 25. İyi antikor etiketleme ve iyileşme elde etmek için bazı temel faktörler vardır. Küçük molekül bir özellikleriAntikor oranı antikor kazanımı ve boya iki kritik sürücü yeniden. bir hidrofobik küçük moleküllü antikor oranı yüksek boya spesifik olmayan boncuk etiketli antikorun yapışmasını ve önemli ölçüde azaltılmış bir antikor kurtarma neden olur. Bazen, boya ve antikor özelliklerine bağlı olarak, biz bir boncuk dolayısıyla diğerinden daha iyi çalışabilir bulundu, optimizasyon sırasında her iki boncuk test yararlı olabilir. Protein A ve Protein G farklı türlerden antikorlar için uygun boncuk seçerken dikkate alınması gereken farklı alt, farklı benzerlikleri 21 var. Örneğin, protein A dolayısıyla Protein G taneler özellikle tavsiye edilir, fare IgG1 düşük afiniteye sahiptir. tiyol kimya, DTT ve TCEP indirgeyici ajanlar eşit derecede iyi çalışır. DTT, ancak bu nedenle tamamen yıkanarak kaldırılmalıdır maleimid reaksiyona müdahale edecek. 2.7 düşük pH, yıkama için tavsiye edilir, ancak 2.2 düşük pH etkin rec için gerekli olabilirBazı durumlarda, Overy. düşük bir pH değerinde denatüre olabilir etiketlenmiş antikorlar için verimli geri kazanımı ve antikor işlevselliği arasında bir denge ampirik bir şekilde tespit edilmesi gerekir. İyi markalama kimyası antikor-antijen bağlanma aktivitesi 11,23 etki edebildiği bilinmektedir, bu nedenle, istenen alt uygulamasını kullanarak etiketlendikten sonra antikor işlevselliği açısından test etmek için kesinlikle gereklidir. Özetle, biz herhangi bir ön arıtma adımlar olmadan hücre ortamından doğrudan floresan boyalar ile antikorlar etiketlemek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem, yüksek kapasiteli manyetik Protein A ve Protein G boncuk güçlendirir ve yüksek konsantrasyonlarda 10,11 de yüksek derecede saflaştırılmış antikorlar gerektiren çözüm odaklı etiketleme yöntemi üzerinde önemli bir gelişmedir. Manyetik boncuk kullanımı manyetik olmayan boncuk tabanlı etiketleme teknikleri 17,18 üzerinde bir avantaj olduğunu kılavuzu yanı sıra otomatik numune taşıma, sağlar. yüksek kapasiteli bea Son olarak, kullanımDS boncuk az miktarlarda mikrogram yüzlerce düşük mikrogram seviyelerinden Antikor etiketleme reaksiyon ölçeği olanak veren ve diğer manyetik boncuk esaslı etiketleme yöntemleri 19 bu yöntem ayırır. Burada sunulan protokol floresan boyalar ile antikor etiketleme tarif etmektedir, ancak yöntemi biyotin, sitotoksik ilaçlar ve muhtemelen enzimler dahil olmak üzere diğer etiketlere uzatılabilir.

Küçük moleküller ile etiketli antikorlar, belki de biyoloji 1,2 en yaygın olarak kullanılan reaktiflerdir. Floresan boyalar ve biyotin ile etiketlenmiş antikorlar yoğun diğer uygulamalar 3-6 arasında sitometrisi Western blot ve immüno-çökeltme, akış görüntüleme, bağışıklık kullanılır. Radyoaktif işaretli antikorlar 3,7 kanserlerin tedavisi için yeni seçenekler sunuyoruz, ve iki ADC zaten terapötik kullanım 8 için onaylanmıştır görüntüleme ve tedavi, sitotoksik ilaçlar (ADK) ile etiketlenmiş antikorlar yaygın kullanım bulmaktadır. Bunların yaygın kullanımı olmasına rağmen, etiketleme antikorlar için yöntemler şaşırtıcı değişmemiş ve tipik olarak çok sayıda reaksiyonlar içerir ve tuz giderme 9-12 aşama vardır. Çözüm yöntemleri sadece birkaç antikorlar etiketlenmesi gerekir ve yüksek konsantrasyonda yüksek arıtılmış formda mevcut olduğu durumlarda ve yeterli hacimlerde çok iyi çalışmaz. Ancak, ADK gibi yeni uygulamalar için, orada birBunlar, örneğin, reseptör aracılı antikor, geliştirilmiş içselleştirme 13-16 için, biyolojik olarak uygun özellikler için taranabilir erken böylece hibridom aşamasında antikorlar etiket gerekir. hibridom aşamada, numune hacimleri antikorlar düşük konsantrasyonlarda ifade numune sayısı dolayısıyla çözelti bazlı etiketleme yöntemleri uygun değildir, büyük olan, sınırlıdır. Basitleştirmek ve geleneksel antikor etiketleme yöntemleri verimini artırmak için, birkaç alternatif yaklaşımlar 17,18 önerilmiştir. Bir yaklaşım, etiketleme reaksiyonu ve etiketlenmiş, saflaştırılmış protein tasfiye edilir antikorları yakalamak için manyetik olmayan Proteini küçük sütunlarda paketlenmiş bir afinite taneleri kullanmaktır. Bu yöntem, hücre ortamı şirketinden antikorları etiketlemek için kullanılabilir, ancak sütun kullanımı zahmetli olabilir. Bir manyetik boncuk tabanlı bir yöntem son zamanlarda sütun kullanımını ortadan kaldırır ve hacmini fakat geliştirir 19 rapor edilmiştirboncuk bağlama kapasitesi, sınırlı antikora, alçak antikor mikrogram düzeylerindeki miktarlarda sadece nanogram etiketlenmiş olabilir. Biz son zamanlarda geliştirilen ve yüksek kapasitesi manyetik Protein A ve Protein G boncuk (&gt; İnsan IgG / yerleşik boncuk ml 20 mg) küçük moleküller 20 hücre medyada mevcut antikorları etiketlemek için kullanılır. tanelerin yüksek kapasiteli antikorun mikrogram On ila yüzlerce uygun etiketlenmesine izin verir ve boncuk hızlı bir manyetik müdahale paralel örneklerin çok sayıda taşıma ve işleme kolaylaştırır. Küçük moleküller için belirteç gibi floresan boyalar kullanarak, yöntem, bir amin ve tiyol markalama kimya ile uyumlu ve etiketlenmiş ve çok saf antikorların yüksek geri kazanımlar sahip olduğunu gösteriyor. Bu protokol ve beraberindeki bir video Manyetik Protein A ve Protein G boncuklar kullanılarak hücre medyada mevcut fare antikorları üzerinde boncuk etiketleme açıklar. protokoldürdört bölüme ayrılır: Bölüm 1 biyolojik örneklerden boncuk üzerine antikorların fethini şöyle anlatır. yakalanmasını takiben, amin kimyası kullanılarak veya tiyol kimya kullanılarak floresan boya ile antikor etiketleme sırasıyla 2 ve 3. bölümde tarif edilmektedir. Son olarak, bölüm 4 antikoru konsantrasyonu hesaplamalar ve antikor oranı boya için bir yöntem açıklanır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="592">
	<tbody>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Magne Protein A Beads</td>
			<td style="width:103px;">Promega Corporation</td>
			<td style="width:119px;">&#160;G8781</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Magne Protein G Beads</td>
			<td style="width:103px;">Promega Corporation&#160;</td>
			<td style="width:119px;">&#160;G7471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">AlexaFluor 532-SE (Succinimidyl Ester)</td>
			<td style="width:103px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">A20001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">AlexaFluor 532-ME (Malemide)</td>
			<td style="width:103px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">A10255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">AlexaFluor 647-ME (Maleimide)</td>
			<td style="width:103px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">A20347</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Fluorescein-ME (Maleimide)</td>
			<td style="width:103px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">F-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Magnetic Stand</td>
			<td style="width:103px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">Z5332</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

antibody labeling with fluorescent dyes using magnetic protein a and protein g beads

Floresan boyalar, sitotoksik ilaçlar ve radyoaktif iz gibi küçük moleküller ile işaretlenmiş olan antikorlar, esas biyomedikal araştırmalarda araçları, bağışıklıkla ilgili tanı ve daha yakın olarak terapötik maddelerdir. küçük moleküller ile markalama antikorlar için geleneksel yöntemler, nispeten yüksek bir konsantrasyonda antikor saflaştınldı birden diyaliz adımları içerir ve veri akışını sınırlı gerektirir. Ancak, Antikor İlaç Eşlenikleri (ADC) alanında olmak üzere çeşitli uygulamalar, hücre ortamından doğrudan antikorların etiketleme sağlayacak yeni yöntemler yararlanacaktır. Bu tür yöntemler antikorlar örneğin, biyolojik olarak uygun deneylerde taranabilir izin verebilir, ADC&#39;ler halinde reseptör aracılı antikor, geliştirilmiş içselleştirme deneyi. Burada, doğrudan hücre ortamından antikorlar küçük miktarlarda etiketleme sağlayan bir yöntem olup (on-boncuk yöntemi) tarif eder. Bu yaklaşım antikorları yakalamak için yüksek kapasiteli manyetik Protein A ve Protein G afinite boncuklar kullanıramin veya tiyol kimya ve etiketlenmiş antikorlar daha sonra elüsyon kullanılarak küçük moleküller ile etiketleme ve ardından hücre ortamından. küçük moleküller için suretler olarak floresan boyalar alırsak, biz doğrudan amin ve tiyol etiketleme kimyası her ikisini de kullanarak hücre medyadan üç farklı fare antikorları on-boncuk etiketleme göstermektedir. Protein A ve Protein G antikorların yüksek bağlanma afinitesi, yüksek geri kazanımlar olarak etiketlenmiş antikorların yüksek saflıkta sağlar. Buna ek olarak, manyetik boncuk kullanımı çoklu numuneler önemli oranda markalama verimliliği arttırır, elle kullanılmasına izin verir.

Yüksek kapasiteli manyetik Protein A ve Protein G boncuklar kullanılarak küçük moleküller ile antikor etiketleme için bir şeması, Şekil 1 &#39;de gösterilmiştir. Antikorlar etiketler amin kimyası kullanılarak, örneğin flüoresan boyalar, G boncuklar küçük moleküller ile etiketlenebilir manyetik Protein çekilen lizin amino asitler ya da antikor menteşe bölgesindeki düşük tiyoller etiketler, tiol kimya kullanılarak birincil aminlerdir. Antikorlar ve Protein G arasındaki bağlantılı etiketleme reaksiyonu sırasında antikorun minimum kayba yol 21 ve sonuçlar güçlüdür. Basit bir saflaştırma işlemine göre, bu floresan boyalar ile işaretlendikten sonra, üç farklı fare antikoru izotipleri (Tablo 1) etkin kurtarma (% 50-90) yansıtılır. (19 önce bildirilen benzer) etkin kurtarma Coomassie jeller de açıktır (Şekil 2) bant intensiSaflaştırılmış antikorların ağır ve hafif zincirlerinin bağları ve etiketli antikorlar Coomassie jel (Şekil 2) görüldüğü gibi, manyetik Protein G boncuk yüksek oranda saflaştırılmış antikorlar ile sonuçlanan düşük spesifik olmayan bağlanma özelliklerine sahiptir. Tablo 1 &#39;de verilen sonuçlar, yansıtır ve her iki ağır ve hafif zincirlerinin floresan (Şekil 2) olarak etiketlenmiştir. On-boncuk markalama manyetik Protein A boncuk yapılır ve antikor oranları (Tablo 2), yüksek geri kazanım ve iyi boya ile sonuçlanan çok sayıda floresan boyalar ile uyumlu olabilir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54545/54545fig1.jpg" /> Floresan moleküller ile antikorların üzerinde boncuk etiketleme Şekil 1. şematik. (A) Antikor etiketleme tiol kimyası kullanılarak. Antikorlar yüksek kapasiteli manyetik Protein A veya manyetik Protein G b yakalanırEADS DTT veya tris (2-karboksietil) fosfin (TCEP) gibi bir indirgeme maddeleri kullanılarak arası zincirli disülfit bağlarının indirgenmesiyle indirgenebilir. Floresan boyalar içeren tiol-reaktif maleimid etiketi antikorlar eklenir. Etiketli antikorlar düşük pH elüsyon ile geri kazanılmaktadır hemen nötralize edilir. (B) Antikor etiketleme amin kimyası kullanılarak. Yüksek kapasiteli manyetik Protein A ve Protein G Boncuk çekilen antikorlar lizinlerin birincil aminler de antikor etiket amin reaktif floresan boyalar ile birlikte reaksiyona sokulur. Etiketli antikorlar düşük pH yıkamayla yıkanır ve hemen nötralize edilir. Nath, N. ve ark. 20 uyarlanan <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54545/54545fig1large.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54545/54545fig2.jpg" /> Şekil 2. denatüre SÜç fare IgG DS-PAGE jeli görüntülerin-boncuk yöntemi kullanılarak saflaştırılmış ve AlexaFluor 532 ile etiketlenir izotipleri (A). Amin reaksiyonu (b) Tiyol reaksiyonu. tiol-reaktif boya ile işaretlenmiş antikorların jel ve görüntüler. Kuşak 1-6 Tablo 1 &#39;de gösterilen örneklere karşılık gelmektedir. Jeller ilk fluoresan tarayıcı kullanarak görüntülü ve tek AlexaFluor 532 etiketli antikor ağır ve hafif zincirlerine edildi. antikorlar sadece arıtılmış Numuneler görünmez. Jeller daha sonra etiketli antikorlar gibi saflaştırıldı antikorlardan ağır ve hafif zincirlerini gösteren Coomassie boyası ile boyandı. Nath, N. ve ark. 20 uyarlanan <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54545/54545fig2large.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td></td&gt; <td></td><td colspan="2"> Amin reaksiyon </td><td colspan="2"> tiyol Reaksiyon </td></tr><tr><td> İyi </td><td> izotip </td><td></td><td> Antikor Kurtarma (mikrogram) </td><td> Antikor oranı Boya </td><td> Antikor Kurtarma (mikrogram) </td><td> Antikor oranı Boya </td></tr><tr><td> 1 </td><td rowspan="2"> fare IgG1 </td><td> arıtma </td><td> 54.8 ± 1.8 </td><td> 0 </td><td> 49.2 ± 2.0 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> birleşme </td><td> 27.4 ± 3.2 </td><td> 4.2 ± 0.2 </td><td> 46.2 ± 3.5 </td><td> 1.6 ± 0.2 </td></tr><tr><td> 3 </td><td rowspan="2"> fare IgG2a </td><td> arıtma </td><td> 85.9 ± 6.4 </td><td> 0 </td><td> 75.3 ± 8.0 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> Conjugtirme </td><td> 60.7 ± 3.2 </td><td> 4.4 ± 0.1 </td><td> 61.5 ± 7.4 </td><td> 5.5 ± 0.4 </td></tr><tr><td> 5 </td><td rowspan="2"> fare IgG2b </td><td> arıtma </td><td> 79.9 ± 6.9 </td><td> 0 </td><td> 73.3 ± 1.4 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> 6 </td><td> birleşme </td><td> 66.7 ± 0.5 </td><td> 5.6 ± 0.1 </td><td> 55.7 ± 0.9 </td><td> 5.2 ± 0.5 </td></tr></tbody></table> Tablo 1:. Amin ve tiol kimyalar kullanılarak doğrudan hücre medya üç fare IgG izotiplerinin üzerinde boncuk markalama Her numune için, 1.0 ml hücre ortamının bir alikosu, sadece amin reaktif AlexaFluor 532 boya ile ilgili-boncuk etiketlenmesi için kullanılmıştır Manyetik Protein G, boncuk (50 ul bulamaç) ve ikinci kısım ile antikorların saflaştırılması için kullanılmıştır. Her iki durumda da antikor geri kazanımlar hesaplanmıştır (metinde anlatıldığı gibi), biretiketleme reaksiyonu sırasında antikor kayıpları belirlemek kıyasla d. Antikor oranı Boya her üç antikorlar için hesaplandı. Bütün reaksiyonlar, üç kopya halinde yapıldı. Nath, N. ve ark uyarlanmıştır. 20 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td></td><td colspan="2"> Manyetik Protein G Boncuk </td><td colspan="2"> Manyetik Protein A Boncuk </td></tr><tr><td></td><td></td><td> Antikor Kurtarma (mikrogram) </td><td> Antikor oranı Boya </td><td> Antikor Kurtarma (mikrogram) </td><td> Antikor oranı Boya </td></tr><tr><td> 1 </td><td> arıtma </td><td> 263,7 ± 10.4 </td><td> 0 </td><td> 269.4 ± 5.1 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> AlexaFluor532 </td><td> 182.9 ± 15.3 </td><td> 5.377; 0.04 </td><td> 189.1 ± 6.9 </td><td> 6.9 ± 0.2 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> AlexaFluor647 </td><td> 192.5 ± 2.9 </td><td> 3.3 ± 0.1 </td><td> 112.3 ± 11.4 </td><td> 3.6 ± 0.2 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> floresein </td><td> 179,5 ± 5.3 </td><td> 6.8 ± 0.1 </td><td> 201.5 ± 6.5 </td><td> 6.8 ± 0.1 </td></tr></tbody></table> Tablo 2:., Üç farklı tiol-reaktif floresan boyalar ile birlikte fare IgG2a On-boncuk markalama Konsantre hücre ortamı örnekleri bu yöntemi göstermek için bu deneyde kullanılan, aynı zamanda da, antikorun farklı bir miktarı için benimsenebilir. Buna ek olarak, konjugasyon reaksiyonları manyetik protein G gibi manyetik Protein G, boncuk (100 ul bulamaç) kullanılarak antikor saflaştırma için kullanılmıştır Hücre ortamı konsantre edildi, 1.0 ml&#39;lik manyetik Protein A kullanılarak bir kısım kullanılarak yapıldı. Diğer üç 1.0 mi tümbölenis etiketlenmiş ve tiol-reaktif AlexaFluor 532, AlexaFluor 647 ve floresein ile saflaştırılmıştır. (Metinde anlatıldığı gibi) ve çeşitli etiketleme etkileri karşılaştırılmıştır antikor geri kazanımlar hesaplanmıştır. Antikor oranı boya da, tüm üç flüoresan boyalar için hesaplandı. Benzer saflaştırma ve markalama Manyetik Protein A boncuk kullanılarak yapıldı. Bütün reaksiyonlar, üç kopya halinde yapıldı. Nath, N. ve ark uyarlanmıştır. &#39;20 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Tampon </td><td> Yorumlar / Açıklama </td></tr><tr><td> Amin konjügasyon tamponu (10 mM sodyum bikarbonat tampon maddesi, pH 8.5) </td><td> 1. 0.084 g sodyum bikarbonat 2. deiyonize su içinde çözülür. pH 8.5 ayarlayın. 3. deiyonize su ile 100 ml son ses seviyesini ayarlayın. </td></tr><tr><td> Tiol konjugasyon tamponu (1 mM EDTA, pH 7, 10 mM fosfat tampon maddesi.0) </td><td> 1. 0,0378 g sodyum fosfat, monobazik, monohidrat 2. 0.195 gr sodyum fosfat, dibazik, heptahidrat 3. deiyonize su içinde çözülür. 4. 1.0 mM&#39;lik nihai bir konsantrasyona kadar EDTA ekleyin. 5. pH&#39;ı 7 olarak ayarlamak. 6. deiyonize su ile 100 ml son ses seviyesini ayarlayın. </td></tr><tr><td> Antikor bağlanma / yıkama tamponu (10 mM fosfat tamponu, pH 7.0) </td><td> 1. 0,0378 g sodyum fosfat, monobazik, monohidrat 2. 0.195 gr sodyum fosfat, dibazik, heptahidrat 3. deiyonize su içinde çözülür. pH 7&#39;ye ayarlayın. 4. deiyonize su ile 100 ml son ses seviyesini ayarlayın. </td></tr><tr><td> Elüsyon tamponu (50 mM glisin tampon, pH 2.7) </td><td> 1. 0.188 gr glisin 2. deiyonize su içinde çözülür. HCl ile 2.7 pH ayarlayın. 3. deiyonize su ile 50 ml son ses seviyesini ayarlayın. </td></tr><tr><td> Nötralizasyon tamponu (2 M Tris tampon, pH 7.5) </td><td> 1. 0.472 grTrizma baz 2. 2.54 gr Trizma hidroklorür 3. deiyonize su içinde çözülür. pH 7.5 ayarlayın. 4. deiyonize su ile 10 ml nihai hacim ayarlayın. </td></tr></tbody></table> Tablo 3: Tampon kompozisyonlar.

Watch this Scientific Journal Video about Antibody Labeling with Fluorescent Dyes Using Magnetic Protein A and Protein G Beads at JoVE.com

Antibody Labeling with Fluorescent Dyes Using Magnetic Protein A and Protein G Beads

küçük moleküller ile antikorlar için etiketleme üzerine boncuk yöntem doğrudan hücre ortamından antikorlar, az miktarda etiketleme sağlar. Bu yöntem amin ve tiyol kimyası ile uyumlu ve paralel olarak çoklu örnekleri, elle veya otomatik platformları kullanarak işleyebilir.

Floresan Boyalar ile Antikor Etiketleme Manyetik Protein A ve Protein G Boncuk kullanma

Antibodies labeled with small molecules like fluorescent dyes, cytotoxic drugs, and radioactive tracers are essential tools in biomedical research, ...

antibody-labeling-with-fluorescent-dyes-using-magnetic-protein

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.8K Görüntüleme.  Promega Corporation.  küçük moleküller ile antikorlar için etiketleme üzerine boncuk yöntem doğrudan hücre ortamından antikorlar, az miktarda etiketleme sağlar. Bu yöntem amin ve tiyol kimyası ile uyumlu ve paralel olarak çoklu örnekleri, elle veya otomatik platformları kullanarak işleyebilir. 

Video: Antibody Labeling with Fluorescent Dyes Using Magnetic Protein A and Protein G Beads

Specific Marking of HIV-1 Positive Cells using a Rev-dependent Lentiviral Vector Expressing the Green Fluorescent Protein

Most of HIV-responsive expression vectors are based on the HIV promoter, the long terminal repeat (LTR). While responsive to an early HIV protein, Tat, the LTR is also responsive to cellular activation states and to the local chromatin activity where the integration has occurred. This can result in high HIV-independent activity, and has restricted the usefulness of LTR-based reporter to mark HIV positive cells 1,2,3. Here, we constructed an expression lentiviral vector that possesses, in addition to the Tat-responsive LTR, numerous HIV DNA sequences that include the Rev-response element and HIV splicing sites 4,5,6. The vector was incorporated into a lentiviral reporter virus, permitting highly specific detection of replicating HIV in living cell populations. The activity of the vector was measured by expression of the green fluorescence protein (GFP). The application of this vector as reported here offers a novel alternative approach to existing methods, such as in situ PCR or HIV antigen staining, to identify HIV-positive cells. The vector can also express therapeutic genes for basic or clinical experimentation to target HIV-positive cells.

We have developed a lentiviral vector that possesses, in addition to the Tat-responsive LTR, the Rev-response element (RRE) that can regulate reporter gene expression in an HIV-1 Tat- and Rev-dependent fashion. The vector permits the specific detection of replicating HIV in living cells via the expression of GFP.

Yeşil Floresan Protein ifade Rev-bağımlı lentiviral Vector kullanarak HIV-1 Olumlu Hücreler Özgül İşareti

Most of HIV-responsive expression vectors are based on the HIV promoter, the long terminal repeat (LTR). While responsive to an early HIV protein, Tat, ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito (Aedes aegypti) and Tick (Rhipicephalus microplus) G Protein-coupled Receptors

Arthropod hormone receptors are potential targets for novel pesticides as they regulate many essential physiological and behavioral processes. The majority of them belong to the superfamily of G protein-coupled receptors (GPCRs). We have focused on characterizing arthropod kinin receptors from the tick and mosquito. Arthropod kinins are multifunctional neuropeptides with myotropic, diuretic, and neurotransmitter function. Here, a method for systematic analyses of structure-activity relationships of insect kinins on two heterologous kinin receptor-expressing systems is described. We provide important information relevant to the development of biostable kinin analogs with the potential to disrupt the diuretic, myotropic, and/or digestive processes in ticks and mosquitoes.
The kinin receptors from the southern cattle tick, Boophilus microplus (Canestrini), and the mosquito Aedes aegypti (Linnaeus), were stably expressed in the mammalian cell line CHO-K1. Functional analyses of these receptors were completed using a calcium bioluminescence plate assay that measures intracellular bioluminescence to determine cytoplasmic calcium levels upon peptide application to these recombinant cells. This method takes advantage of the aequorin protein, a photoprotein isolated from luminescent jellyfish. We transiently transfected the aequorin plasmid (mtAEQ/pcDNA1) in cell lines that stably expressed the kinin receptors. These cells were then treated with the cofactor coelenterazine, which complexes with intracellular aequorin. This bond breaks in the presence of calcium, emitting luminescence levels indicative of the calcium concentration. As the kinin receptor signals through the release of intracellular calcium, the intensity of the signal is related to the potency of the peptide.
This protocol is a synthesis of several previously described protocols with modifications; it presents step-by-step instructions for the stable expression of GPCRs in a mammalian cell line through functional plate assays (Staubly et al., 2002 and Stables et al., 1997). Using this methodology, we were able to establish stable cell lines expressing the mosquito and the tick kinin receptors, compare the potency of three mosquito kinins, identify critical amino acid positions for the ligand-receptor interaction, and perform semi-throughput screening of a peptide library. Because insect kinins are susceptible to fast enzymatic degradation by endogenous peptidases, they are severely limited in use as tools for pest control or endocrinological studies. Therefore, we also tested kinin analogs containing amino isobutyric acid (Aib) to enhance their potency and biostability. This peptidase-resistant analog represents an important lead in the development of biostable insect kinin analogs and may aid in the development of neuropeptide-based arthropod control strategies.

A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito Aedes aegypti and Tick Rhipicephalus microplus G Protein-coupled Receptors

This protocol provides instructions for clonal-cell line selection and a calcium bioluminescence assay to analyze the structure-activity relationships of synthesized arthropod neuropeptides on their cognate GPCRs. This assay can be used for receptor deorphanization and structure-activity relationship studies for synthetic analog design and peptide/drug-lead discovery.

Sivrisinek Fonksiyonel Analiz için Kalsiyum Biyoparlaklık Testi ( Aedes aegypti) Ve Tick ( Rhipicephalus Microplus) G Protein-çiftli Reseptörler

Arthropod hormone receptors are potential targets for novel pesticides as they regulate many essential physiological and behavioral processes.  The ...

Colorectal Cancer Cell Surface Protein Profiling Using an Antibody Microarray and Fluorescence Multiplexing

The current prognosis and classification of CRC relies on staging systems that integrate histopathologic and clinical findings. However, in the majority of CRC cases, cell dysfunction is the result of numerous mutations that modify protein expression and post-translational modification1.
A number of cell surface antigens, including cluster of differentiation (CD) antigens, have been identified as potential prognostic or metastatic biomarkers in CRC. These antigens make ideal biomarkers as their expression often changes with tumour progression or interactions with other cell types, such as tumour-infiltrating lymphocytes (TILs) and tumour-associated macrophages (TAMs).
The use of immunohistochemistry (IHC) for cancer sub-classification and prognostication is well established for some tumour types2,3. However, no single &#x2018;marker&#x2019; has shown prognostic significance greater than clinico-pathological staging or gained wide acceptance for use in routine pathology reporting of all CRC cases. 
A more recent approach to prognostic stratification of disease phenotypes relies on surface protein profiles using multiple 'markers'. While expression profiling of tumours using proteomic techniques such as iTRAQ is a powerful tool for the discovery of biomarkers4, it is not optimal for routine use in diagnostic laboratories and cannot distinguish different cell types in a mixed population. In addition, large amounts of tumour tissue are required for the profiling of purified plasma membrane glycoproteins by these methods. 
In this video we described a simple method for surface proteome profiling of viable cells from disaggregated CRC samples using a DotScan CRC antibody microarray. The 122-antibody microarray consists of a standard 82-antibody region recognizing a range of lineage-specific leukocyte markers, adhesion molecules, receptors and markers of inflammation and immune response5, together with a satellite region for detection of 40 potentially prognostic markers for CRC. Cells are captured only on antibodies for which they express the corresponding antigen. The cell density per dot, determined by optical scanning, reflects the proportion of cells expressing that antigen, the level of expression of the antigen and affinity of the antibody6. 
For CRC tissue or normal intestinal mucosa, optical scans reflect the immunophenotype of mixed populations of cells. Fluorescence multiplexing can then be used to profile selected sub-populations of cells of interest captured on the array. For example, Alexa 647-anti-epithelial cell adhesion molecule (EpCAM; CD326), is a pan-epithelial differentiation antigen that was used to detect CRC cells and also epithelial cells of normal intestinal mucosa, while Phycoerythrin-anti-CD3, was used to detect infiltrating T-cells7. The DotScan CRC microarray should be the prototype for a diagnostic alternative to the anatomically-based CRC staging system.

We described a procedure for the disaggregation of colorectal cancer (CRC) to produce viable single cells, which are then captured on customized antibody microarrays recognizing surface antigens (DotScan CRC microarray). Sub-populations of cells bound to the microarray can be profiled by fluorescence multiplexing using monoclonal antibodies tagged with fluorescent dyes.

Kolorektal Kanser Hücre Yüzey Protein Profil Antikor Mikroarray ve Floresans Multiplexing

The current prognosis and classification of CRC relies on staging systems that integrate histopathologic and clinical findings. However, in the majority ...

Protein Misfolding Cyclic Amplification of Prions

Prions are infectious agents that cause the inevitably fatal transmissible spongiform encephalopathy (TSE) in animals and humans9,18. The prion protein has two distinct isoforms, the non-infectious host-encoded protein (PrPC) and the infectious protein (PrPSc), an abnormally-folded isoform of PrPC 8.
One of the challenges of working with prion agents is the long incubation period prior to the development of clinical signs following host inoculation13. This traditionally mandated long and expensive animal bioassay studies. Furthermore, the biochemical and biophysical properties of PrPSc are poorly characterized due to their unusual conformation and aggregation states.
PrPSc can seed the conversion of PrPC to PrPSc in vitro14. PMCA is an in vitro technique that takes advantage of this ability using sonication and incubation cycles to produce large amounts of PrPSc, at an accelerated rate, from a system containing excess amounts of PrPC and minute amounts of the PrPSc seed19. This technique has proven to effectively recapitulate the species and strain specificity of PrPSc conversion from PrPC, to emulate prion strain interference, and to amplify very low levels of PrPSc from infected tissues, fluids, and environmental samples6,7,16,23 .
This paper details the PMCA protocol, including recommendations for minimizing contamination, generating consistent results, and quantifying those results. We also discuss several PMCA applications, including generation and characterization of infectious prion strains, prion strain interference, and the detection of prions in the environment.

Protein misfolding cyclic amplification (PMCA) is an in vitro assay for the study of prion conversion and strain and species barriers. It can also be used as a prion detection assay.

Prionlar protein misfolding Döngüsel Amplifikasyon

Prions  are infectious agents that cause the inevitably fatal transmissible spongiform  encephalopathy (TSE) in animals and humans9,18. The prion protein ...

Monitoring Changes in Membrane Polarity, Membrane Integrity, and Intracellular Ion Concentrations in Streptococcus pneumoniae Using Fluorescent Dyes

Membrane depolarization and ion fluxes are events that have been studied extensively in biological systems due to their ability to profoundly impact cellular functions, including energetics and signal transductions. While both fluorescent and electrophysiological methods, including electrode usage and patch-clamping, have been well developed for measuring these events in eukaryotic cells, methodology for measuring similar events in microorganisms have proven more challenging to develop given their small size in combination with the more complex outer surface of bacteria shielding the membrane. During our studies of death-initiation in Streptococcus pneumoniae (pneumococcus), we wanted to elucidate the role of membrane events, including changes in polarity, integrity, and intracellular ion concentrations. Searching the literature, we found that very few studies exist. Other investigators had monitored radioisotope uptake or equilibrium to measure ion fluxes and membrane potential and a limited number of studies, mostly in Gram-negative organisms, had seen some success using carbocyanine or oxonol fluorescent dyes to measure membrane potential, or loading bacteria with cell-permeant acetoxymethyl (AM) ester versions of ion-sensitive fluorescent indicator dyes. We therefore established and optimized protocols for measuring membrane potential, rupture, and ion-transport in the Gram-positive organism S. pneumoniae. We developed protocols using the bis-oxonol dye DiBAC4(3) and the cell-impermeant dye propidium iodide to measure membrane depolarization and rupture, respectively, as well as methods to optimally load the pneumococci with the AM esters of the ratiometric dyes Fura-2, PBFI, and BCECF to detect changes in intracellular concentrations of Ca2+, K+, and H+, respectively, using a fluorescence-detection plate reader. These protocols are the first of their kind for the pneumococcus and the majority of these dyes have not been used in any other bacterial species. Though our protocols have been optimized for S. pneumoniae, we believe these approaches should form an excellent starting-point for similar studies in other bacterial species.

Monitoring Changes in Membrane Polarity, Membrane Integrity, and Intracellular Ion Concentrations in Streptococcus pneumoniae Using Fluorescent Dyes

Unlike that seen for eukaryotes, there is a paucity of studies that detail membrane depolarization and ion concentration changes in bacteria, primarily as their small size makes conventional methods of measurement difficult. Here, we detail protocols for monitoring such events in the significant Gram-positive pathogen Streptococcus pneumoniae utilizing fluorescence techniques.

Membran Kutup, Membran Dürüstlük ve Hücre içi İyon Konsantrasyonlarında İzleme değişiklikler<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Floresan boyalar kullanarak

Membrane depolarization and ion fluxes are events that have been studied extensively in biological systems due to their ability to profoundly impact ...

Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions of proteins with other macromolecules in a complex sample is called co-immunoprecipitation. The described co-immunoprecipitation protocol allows to demonstrate and further investigate the interaction between the antiviral myxovirus resistance protein 1 (Mx1) and one of its viral targets, the influenza A virus nucleoprotein (NP). The protocol starts with transfected mammalian cells, but it is also possible to use influenza A virus infected cells as starting material. After cell lysis, the viral NP protein is pulled-down with a specific antibody and the resulting immune-complexes are precipitated with protein G beads. The successful pull-down of NP and the co-immunoprecipitation of the antiviral Mx1 protein are subsequently revealed by western blotting. A prerequisite for successful co-immunoprecipitation of Mx1 with NP is the presence of N-ethylmaleimide (NEM) in the cell lysis buffer. NEM alkylates free thiol groups. Presumably this reaction stabilizes the weak and/or transient NP&#8211;Mx1 interaction by preserving a specific conformation of Mx1, its viral target or an unknown third component. An important limitation of co-immunoprecipitation experiments is the inadvertent pull-down of contaminating proteins, caused by nonspecific binding of proteins to the protein G beads or antibodies. Therefore, it is very important to include control settings to exclude false positive results. The described co-immunoprecipitation protocol can be used to study the interaction of Mx proteins from different vertebrate species with viral proteins, any pair of proteins, or of a protein with other macromolecules. The beneficial role of NEM to stabilize weak and/or transient interactions needs to be tested for each interaction pair individually.

This co-immunoprecipitation protocol allows to study the interaction between the influenza A virus nucleoprotein and the antiviral Mx1 protein in human cells. The protocol emphasizes the importance of N-ethylmaleimide for successful co-immunoprecipitation of Mx1 and influenza A virus nucleoprotein.

İnfluenza A virüsü nükleoproteini Fare MX1 Protein Co-immunopresipitasyonu

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions ...

Inoculating Anopheles gambiae Mosquitoes with Beads to Induce and Measure the Melanization Immune Response

The stimulation of immune responses is a common tool in invertebrate studies to examine the efficacy and the mechanisms of immunity. This stimulation is based on the injection of non-pathogenic particles into insects, as the particles will be detected by the immune system and will induce the production of immune effectors. We focus here on the stimulation of the melanization response in the mosquito Anopheles gambiae. The melanization response results in the encapsulation of foreign particles and parasites with a dark layer of melanin. To stimulate this response, mosquitoes are inoculated with beads in the thoracic cavity using microcapillary glass tubes. Then, after 24 hr, the mosquitoes are dissected to retrieve the beads. The degree of melanization of the bead is measured using image analysis software. Beads do not have the pathogenic effects of parasites, or their capacity to evade or suppress the immune response. These injections are a way to measure immune efficacy and the impact of immune stimulations on other life history traits, such as fecundity or longevity. It is not exactly the same as directly studying host-parasite interactions, but it is an interesting tool to study immunity and its evolutionary ecology.

Inoculating Anopheles gambiae Mosquitoes with Beads to Induce and Measure the Melanization Immune Response

Through inoculation with beads, the described technique enables the stimulation of the mosquito melanization response in the hemolymph circulating system. The amount of melanin covering the beads can be measured after dissection as a measure of the immune response.

aşılanması<em&gt; Anofel gambiae</emMelanization Bağışıklık Tepkisi tetikleyebilecek ve Tedbir Boncuk&gt; ile Sivrisinekler

The stimulation of immune responses is a common tool in invertebrate studies to examine the efficacy and the mechanisms of immunity. This stimulation is ...

Dissecting Multi-protein Signaling Complexes by Bimolecular Complementation Affinity Purification (BiCAP)

The assembly of protein complexes is a central mechanism underlying the regulation of many cell signaling pathways. A major focus of biomedical research is deciphering how these dynamic protein complexes act to integrate signals from multiple sources in order to direct a specific biological response, and how this becomes deregulated in many disease settings. Despite the importance of this key biochemical mechanism, there is a lack of experimental techniques that can facilitate the specific and sensitive deconvolution of these multi-molecular signaling complexes.
Here this shortcoming is addressed through the combination of a protein complementation assay with a conformation-specific nanobody, which we have termed Bimolecular Complementation Affinity Purification (BiCAP). This novel technique facilitates the specific isolation and downstream proteomic characterization of any pair of interacting proteins, to the exclusion of un-complexed individual proteins and complexes formed with competing binding partners. 
The BiCAP technique is adaptable to a wide array of downstream experimental assays, and the high degree of specificity afforded by this technique allows more nuanced investigations into the mechanics of protein complex assembly than is currently possible using standard affinity purification techniques.

Dissecting Multi-protein Signaling Complexes by Bimolecular Complementation Affinity Purification BiCAP

This manuscript describes the protocol for Bimolecular Complementation Affinity Purification (BiCAP). This novel method facilitates the specific isolation and downstream proteomic characterization of any two interacting proteins, while excluding un-complexed individual proteins as well as complexes formed with competing binding partners.

Bimolecular tamamlayıcı benzeşme arıtma (BiCAP) tarafından parçalanmış çok protein sinyal kompleksleri

The assembly of protein complexes is a central mechanism underlying the regulation of many cell signaling pathways. A major focus of biomedical research ...

A Protein Microarray Assay for Serological Determination of Antigen-specific Antibody Responses Following Clostridium difficile Infection

We provide a detailed overview of a novel high-throughput protein microarray assay for the determination of anti-Clostridium difficile antibody levels in human sera and in separate preparations of polyclonal intravenous immunoglobulin (IVIg). The protocol describes the methodological steps involved in sample preparation, printing of arrays, assay procedure, and data analysis. In addition, this protocol could be further developed to incorporate diverse clinical samples including plasma and cell culture supernatants. We show how protein microarray can be used to determine a combination of isotype (IgG, IgA, IgM), subclass (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2), and strain-specific antibodies to highly purified whole C. difficile toxins A and B (toxinotype 0, strain VPI 10463, ribotype 087), toxin B from a C. difficile toxin-B-only expressing strain (CCUG 20309), a precursor form of a B fragment of binary toxin, pCDTb, ribotype-specific whole surface layer proteins (SLPs; 001, 002, 027), and control proteins (tetanus toxoid and Candida albicans). During the experiment, microarrays are probed with sera from individuals with C. difficile infection (CDI), individuals with cystic fibrosis (CF) without diarrhea, healthy controls (HC), and from individuals pre- and post-IVIg therapy for the treatment of CDI, combined immunodeficiency disorder, and chronic inflammatory demyelinating polyradiculopathy. We encounter significant differences in toxin neutralization efficacies and multi-isotype specific antibody levels between patient groups, commercial preparations of IVIg, and sera before and following IVIg administration. Also, there is a significant correlation between microarray and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for antitoxin IgG levels in serum samples. These results suggest that microarray could become a promising tool for profiling antibody responses to C.difficile antigens in vaccinated or infected humans. With further refinement of antigen panels and a reduction in production costs, we anticipate that microarray technology may help optimize and select the most clinically useful immunotherapies for C. difficile infection in a patient-specific manner.

A Protein Microarray Assay for Serological Determination of Antigen-specific Antibody Responses Following Clostridium difficile Infection

This article describes a simple protein microarray method for profiling humoral immune responses to a 7-plex panel of highly purified Clostridium difficile antigens in human sera. The protocol can be extended for the determination of specific antibody responses in preparations of polyclonal intravenous immunoglobulin.

Bir Protein Mikroarray tahlil antijen spesifik antikor yanıt aşağıdaki Clostridium difficile enfeksiyon serolojik belirlenmesi için

We provide a detailed overview of a novel high-throughput protein microarray assay for the determination of anti-Clostridium difficile antibody levels in ...

TurboID-Based Proximity Labeling for In Planta Identification of Protein-Protein Interaction Networks

Proximity labeling (PL) techniques using engineered ascorbate peroxidase (APEX) or Escherichia coli biotin ligase BirA (known as BioID) have been successfully used for identification of protein-protein interactions (PPIs) in mammalian cells. However, requirements of toxic hydrogen peroxide (H2O2) in APEX-based PL, longer incubation time with biotin (16&#8211;24 h), and higher incubation temperature (37 &#176;C) in BioID-based PL severely limit their applications in plants. The recently described TurboID-based PL addresses many limitations of BioID and APEX. TurboID allows rapid proximity labeling of proteins in just 10&#8201;min under room temperature (RT) conditions. Although the utility of TurboID has been demonstrated in animal models, we recently showed that TurboID-based PL performs better in plants compared to BioID for labeling of proteins that are proximal to a protein of interest. Provided here is a step-by-step protocol for the identification of protein interaction partners using the N-terminal Toll/interleukin-1 receptor (TIR) domain of the nucleotide-binding leucine-rich repeat (NLR) protein family as a model. The method describes vector construction, agroinfiltration of protein expression constructs, biotin treatment, protein extraction and desalting, quantification, and enrichment of the biotinylated proteins by affinity purification. The protocol described here can be easily adapted to study other proteins of interest in Nicotiana and other plant species.

Described here is a proximity labeling method for identification of interaction partners of the TIR domain of the NLR immune receptor in Nicotiana benthamiana leaf tissue. Also provided is a detailed protocol for the identification of interactions between other proteins of interest using this technique in Nicotiana and other plant species.

Floresan Boyalar ile Antikor Etiketleme Manyetik Protein A ve Protein G Boncuk kullanma

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler