1.抗体は大容量磁気プロテインAまたはプロテインG磁気ビーズ上に捕獲<ol><li>一様に穏やかに振盪することにより磁気ビーズを再懸濁します。ビーズを小分けするときサスペンションを均一に保ちます。 </li><li> 1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブにビーズスラリー50μlのを追加します。 10秒間磁気スタンドに置きます。大切に保管してバッファを削除します。 </li><li>抗体結合緩衝液の250μlのを追加します。 </li><li>混合し、10秒間磁気スタンドに置きます。慎重に結合緩衝液を除去します。 </li><li>ビーズに抗体の50-100μgのを含む試料の1.0ミリリットルを追加します。試料は、細胞培地中の抗体または抗体を精製することができます。 </li><li>ボルテックスミキサーまたは転倒型ミキサーを用いて室温で60分間、サンプルを混ぜます。 </li><li> 10秒間、磁気スタンドにチューブを置き、上清を除去します。 </li><li>抗体結合/洗浄緩衝液の250μLを加え、混合します。 10秒間マグネチックスタンドに置き、結合/洗浄緩衝液を除去します。このSを繰り返し2回の洗浄の合計のためのTEP。 </li><li>アミン化学を用いてラベル抗体に対する第2に、またはチオール化学を用いてラベル抗体と第3節に進んでください。 </li></ol>アミン化学を使用した2抗体ラベリング<ol><li>コンジュゲート抗体<ol><li>ビーズにアミン結合緩衝液の100μlのを追加します。 </li><li>染料の1.0 mgのジメチルスルホキシド（DMSO）100μlを加えることによっての10mg / mlのアミン反応性蛍光色素（のAlexaFluor 532-SE）を溶解します。ボルテックスで混和します。使用直前にこのソリューションを行います。 </li><li>抗体100μgのためにアミン反応性色素の2.5μlを添加します。 注意：一般的に反応染料の5-20モル過剰が推奨されます。しかし、反応性染料の量は、経験的に、抗体の比と固有の抗体の特性に所望の染料に応じて最適化する必要がある反応物に添加しました。 </li><li>ボルテックスミキサーまたは転倒型ミキサーを用いて室温で60分間、サンプルを混ぜます。ビーズがサスペンシオに残っていることを確認しますn個。 </li><li> 10秒間、磁気スタンドにチューブを置き、上清を除去します。 </li><li>抗体結合/洗浄緩衝液の250μLを加え、混合します。 10秒間磁気スタンドに置きます。削除し、結合/洗浄緩衝液を廃棄します。 2回の洗浄の合計に対して、この手順を繰り返します。 </li></ol></li><li>抗体の回復<ol><li>ビーズに溶出緩衝液50μlを追加します。 </li><li>ボルテックスミキサーまたは転倒型ミキサーを用いて室温で5分間混合します。ビーズは懸濁液中に残っていることを確認してください。 </li><li> 10秒間磁気スタンドにチューブを置きます。溶出されたサンプルを削除し、中和バッファーを5μlを含む新しいマイクロ遠心チューブに移します。 </li><li>プロセスをもう一度繰り返し、溶出されたサンプルをプールします。 </li><li>抗体濃度を定量し、色素と抗体の比率項4に記載の方法。 </li></ol></li></ol>チオール化学を使用した3抗体ラベリング<ol><li>抗体削減<ol><li> 250μLを追加チオール結合緩衝液と混合します。 10秒間磁気スタンドにチューブを置きます。バッファを削除し、破棄します。二回、この手順を繰り返します。 </li><li>チオール結合緩衝液の100μlのを追加します。 </li><li> 2.5mMの最終濃度までジチオスレイトール（DTT）を加えます。 </li><li>ボルテックスミキサーまたは転倒型ミキサーを用いて室温で60分間、サンプルを混ぜます。ビーズは懸濁液中に残っていることを確認してください。 </li><li> 10秒間、磁気スタンドにチューブを配置し、バッファーを捨てます。 </li><li>チオール結合緩衝液の250μLを加え、混合します。 10秒間磁気スタンドにチューブを置きます。バッファを削除し、破棄します。 2回の洗浄の合計に対して、この手順を繰り返します。 </li><li>チオール結合緩衝液の100μlのを追加します。 </li></ol></li><li>コンジュゲート抗体<ol><li>染料の1.0 mgの100μlのDMSOを添加することによって、/ミリリットルの10mgでチオール反応性染料を溶解させます。ボルテックスで混和します。使用直前にこのソリューションを行います。 </li><li>抗100μgのためのチオール反応性色素の2.5μLを追加体。 注意：一般的に反応染料の5-20モル過剰が推奨されます。しかし、反応性染料の量は、経験的に、抗体の比と固有の抗体の特性に所望の染料に応じて最適化する必要がある反応物に添加しました。 </li><li>ボルテックスミキサーまたは転倒型ミキサーを用いて室温で60分間、サンプルを混ぜます。ビーズは懸濁液中に残っていることを確認してください。 </li><li> 10秒間、磁気スタンドにチューブを置き、上清を除去します。 </li><li>チオール結合緩衝液の250μLを加え、混合します。 10秒間マグネチックスタンドに置き、バッファを削除します。 2回の洗浄の合計に対して、この手順を繰り返します。 </li></ol></li><li>溶出抗体<ol><li>ビーズに溶出緩衝液50μlを追加します。 </li><li>ボルテックスミキサーまたは転倒型ミキサーを用いて室温で5分間混合します。ビーズは懸濁液中に残っていることを確認してください。 </li><li> 10秒間磁気スタンドにチューブを置きます。溶出されたサンプルを削除し、NEUTの5μLを含む新しいマイクロ遠心チューブに移しますralizationバッファ。 </li><li>プロセスをもう一度繰り返し、溶出されたサンプルをプールします。 </li><li>抗体濃度を定量し、色素と抗体の比率項4に記載の方法。 </li></ol></li></ol> 4.計算色素と抗体比<ol><li> 280 nmの（A280）で色素（Amaxの）のためのλmaxでの抗体 - 色素複合体の吸光度を測定します。 </li><li>抗体濃度を計算します。 抗体濃度（mg / mlで）= A280 - （CF× 最大 ）/ 1.4 CFは、（製造者によって提供される）色素の補正係数=場所。 </li><li>色素と抗体の比率を計算します。 色素と抗体比（DAR）=（15万×MAX）/抗体濃度（mg / ml）×ε 色素 ここで、ε 色素は 、その吸収極大および抗体=15万ダの分子量で、色素の吸光係数を=。 </li></ol>

<ol>
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Authors are employees of Promega Corporation.

この研究の目的は、小分子の様々な、低濃度で細胞培地中に存在する抗体を標識する方法を開発することでした。抗体発見の初期段階で多数の抗体を可能にするような方法では、小分子で標識され、生物学的に関連するアッセイを用いてスクリーニングすることができます。 1つのこのようなアッセイは内在化があっても同様の結合親和性を有する抗体の間で変動し得る受容体が媒介する抗体の内在化アッセイです。したがって、従来の酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）ベースのスクリーニングに加えて、それらの内在化特性について具体的に抗体をスクリーニングすることが重要です。初期の抗体開発段階で抗体を標識する方法のための重要な要件は次のとおりです。直接細胞培地から抗体を標識するa）の能力。 b）細胞培地中の抗体濃度は、を50μg/ mlである場合、例えば、低濃度で存在する抗体を標識する能力。 C）標識抗体および抗体濃度の純度は、下流のアプリケーションとの互換性を保つ必要があります。 d）の方法は、アミンおよびチオールベースの​​結合化学の両方と互換性があります。 e）の方法は、複数のサンプルを同時に処理すると互換性があります。 これらの要件を考慮すると、我々は高容量の磁気プロテインA及びプロテインGビーズを使用して、ビーズ上の抗体標識および精製方法を開発しました。これらのビーズは、低非特異的結合特性を有する親水性セルロースに基づき、 図2に示すように、高純度の抗体調製物をもたらしている。ビーズの大容量ビーズ少量の効率的なメディアおよび抗体由来の抗体を捕捉することができることを意味します従って、抗体を濃縮少量で溶出します。 表1において、唯一の10μlをANビーズを1.0 mlのサンプル（予想濃度50-100 / mlの）からの抗体を捕獲するために使用された沈降しましたD標識された抗体は、200-500 / mlの間の濃度で120μlの容量で溶出しました。これらの濃度は、典型的な抗体濃度は1.0μgの/ mlのから10ng / mLの15,16の範囲でセルベースの内在化実験と互換性があります。ビーズ上の標識方法は、アミン及びチオールの化学的性質の両方と互換性があり、色素と抗体の比率の広い範囲は、標識された抗体（ 表1）の効率的な回収に伴って達成することができます。実験は三連で行われた、最大12サンプルがかなりの処理時間を短縮する、手動で並列に処理されました。標識化のスループットはさらに、磁気ビーズ19,22を使用する他のアプリケーションに示されているように、ロボットプラットフォームを使用することによって増加することができます。 抗体の回収及び標識efficieを維持しつつ、高い抗体量の試料を容易に捕捉するために使用されるビーズの量を増加させることによって対応することができますNCY（ 表2）。種々の染料抗体コンジュゲートを作製することができることが、色素と抗体の比率を最適化する必要があるので、この方法は、複数の染料と互換性があります。 2-4の抗体比染料11,12最適であると決定され、承認されたADCの場合には、抗体当たり3.5薬物の平均23が報告されています。上のビーズ結合化学によれば、抗体当たり小分子の最適な数は、下流側のアプリケーションの要件に応じて調整することは比較的容易です。また、標識のためのチオールとアミンの化学的性質の両方は、 インビボ安定性、すなわち抗原および受容体結合が示されているようにADCの重要で最良化学オプションを決定するために試験することができ、抗体の治療活性は、コンジュゲーション化学24に依存します、25。 良好な抗体標識と回復を達成するためのいくつかの重要な要因があります。小分子aのプロパティ抗体比に対する抗体の回復と色素の両方のための重要なドライバの再。疎水性小分子、抗体比が高い色素は、ビーズと大幅に減少した抗体の回収に標識抗体の非特異的付着を原因となります。時には、色素と抗体特性に応じて、我々は1ビーズが故に、他のより良い仕事得ることを見出し、最適化中のビーズの両方のテストが有用である可能性があります。プロテインA及びプロテインGは、異なる種由来の抗体のために、適切なビーズを選択する際に考慮すべきである異なるサブタイプの異なる親和性21を有しています。例えば、プロテインAは、したがって、プロテインGビーズが強く推奨されているマウスIgG1との親和性が低いです。チオール化学のために、DTT及びTCEP還元剤は同様に良好に動作します。 DTTは、しかしそれ故に完全に洗浄することにより除去されるべきであるマレイミド反応を阻害します。 2.7の低pHは、溶出のために推奨されていますが、2.2の低いpHは、効率的なRECのために必要とすることができますいくつかのケースではオーヴェリー。低pHで変性することができる標識された抗体を効率的に回収し、抗体の機能性とのバランスは、経験的に決定されなければなりません。よく標識化学は、抗体-抗原結合活性11,23に影響を与えることが知られている、したがって、所望の下流側のアプリケーションを使用して標識した後、抗体の機能性をテストするために絶対に必要です。 要約すると、我々は、任意の前の精製工程なしで直接細胞培地から蛍光色素を有する抗体を標識する方法について説明します。この方法は、高容量の磁気プロテインA及びプロテインGビーズを活用し、高濃度10,11で高度に精製された抗体を必要とするソリューションベースの標識方法を超える有意な改善です。磁気ビーズの使用は、非磁 ​​性ビーズに基づく標識法17,18よりも有利で ​​あるマニュアルだけでなく、自動化された試料の取り扱いを可能にします。大容量の最後に、使用BEADSは、ビーズの少量を使用して、マイクログラムから数百低いマイクログラムレベルからの抗体の標識反応のスケールアップを可能にし、他の磁気ビーズに基づく標識方法19からこのメソッドを区別します。ここで紹介するプロトコルは、蛍光色素で抗体を標識が記載されているが、この方法は、ビオチン、細胞傷害性薬物およびおそらく酵素を含む他のラベルに拡張することができます。

小分子で標識された抗体は、おそらく生物学1,2で最も一般的に使用される試薬です。蛍光色素とビオチンで標識された抗体広範囲撮像に使用される、免疫アッセイ、フローサイトメトリー、ウエスタンブロット、およびその他のアプリケーション3-6間の免疫沈降。放射性標識した抗体3,7イメージングおよび治療 ​​における広範な使用を見出す、細胞毒性薬（のADC）で標識した抗体は、癌の治療に新たな選択肢を提供している、と2個のADCは、既に治療的使用の8のために承認されています。その広範な使用にもかかわらず、抗体を標識するための方法は、驚くほど変化しないままで、通常は複数の反応を伴い、脱塩が9-12ステップしています。解決方法は、わずか数抗体が標識される必要があり、高濃度で高度に精製された形態で利用可能である場合には、十分なボリュームで非常にうまく機能します。しかし、ADCのような新しいアプリケーションのために、そこにあります例えば、それらは生物学的に関連する特性についてスクリーニングすることができるように、初期のハイブリドーマ段階で抗体を標識する必要があり、受容体媒介性抗体の内在13-16。ハイブリドーマ段階で、サンプル容量は限られている抗体が低濃度で発現され、サンプルの数は、従って、溶液ベースの標識方法は適していない、大きいです。 従来の抗体標識法のスループットを簡素化し、改善するために、いくつかの代替的なアプローチは、17,18提案されています。一つのアプローチは、標識および精製されたタンパク質の標識反応と溶出した抗体を捕捉するために、非磁性タンパク質小さなカラムに充填親和性ビーズを使用することです。この方法は、細胞培地から直接抗体を標識するために使用することができるが、列の使用が面倒であることができます。磁気ビーズに基づく方法は、最近のカラムの使用を排除し、スループットが、原因を改善すること19が報告されていますビーズの結合能力を制限された抗体には、抗体の低マイクログラム量にのみナノグラムを標識することができました。 我々は最近開発され、小分子20と細胞培地中に存在する抗体を標識するために、高容量の磁気プロテインA及びプロテインGビーズ（落ち着いたビーズのヒトIgG / mlでの&gt; 20 mg）を使用しました。ビーズの高容量は、抗体のマイクログラム数十〜数百が便利に標識することを可能にし、ビーズの迅速な磁気応答は、並列に多数のサンプルの取り扱いおよび処理を簡素化します。小分子の代替物として蛍光色素を使用して、我々は、この方法は、アミンおよびチオール標識化学と互換性があり、標識され、非常に純粋な抗体の高い回収率を提供していますことを示しています。 このプロトコルおよび付随するビデオは、磁気プロテインA及びプロテインGビーズを用いて細胞培地中に存在するマウス抗体のビーズ上の標識を説明します。プロトコルです4つのセクションに分かれて：第1節では、生物学的サンプルからビーズへの抗体の取り込みについて説明します。捕捉に続いて、アミン化学を用いて、またはチオール化学を用いて蛍光色素を有する抗体の標識は、それぞれ、セクション2およびセクション3に記載されています。最後に、セクション4は、抗体濃度の計算および抗体比染料のための方法が記載されています。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="592">
	<tbody>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Magne Protein A Beads</td>
			<td style="width:103px;">Promega Corporation</td>
			<td style="width:119px;">&#160;G8781</td>
			<td style="width:155px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Magne Protein G Beads</td>
			<td style="width:103px;">Promega Corporation&#160;</td>
			<td style="width:119px;">&#160;G7471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">AlexaFluor 532-SE (Succinimidyl Ester)</td>
			<td style="width:103px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">A20001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">AlexaFluor 532-ME (Malemide)</td>
			<td style="width:103px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">A10255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">AlexaFluor 647-ME (Maleimide)</td>
			<td style="width:103px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">A20347</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Fluorescein-ME (Maleimide)</td>
			<td style="width:103px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">F-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Magnetic Stand</td>
			<td style="width:103px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">Z5332</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

antibody labeling with fluorescent dyes using magnetic protein a and protein g beads

蛍光染料のような小分子、細胞毒性薬、および放射性トレーサーで標識した抗体は、本質的な生物医学研究のツール、免疫診断およびより最近の治療薬としてあります。小分子を用いて抗体を標識するための従来の方法は、比較的高い濃度で精製された抗体を必要とする複数の透析工程を含み、スループットが制限されています。しかし、抗体薬剤コンジュゲート（ADC）ですの分野を含むいくつかのアプリケーションでは、細胞培地から直接抗体の標識化を可能にする新しい方法の恩恵を受ける。このような方法は、例えば、抗体は、生物学的に関連するアッセイにおいてスクリーニングされるADCの場合の受容体媒介性抗体内在化アッセイを可能にすることができます。ここでは、直接細胞培地から抗体の少量の標識化を可能にする方法（オン・ビーズ法）を説明します。このアプローチは、抗体を捕捉するために、高容量の磁気プロテインA及びプロテインG親和性ビーズを利用しますアミン又はチオール化学および標識抗体のその後の溶出のいずれかを使用して小分子で標識することにより、続いて細胞培地から。小分子の代替物として蛍光色素を取って、我々は、アミンおよびチオール標識化学の両方を用いて細胞培地から直接三つの異なるマウス抗体のビーズの標識を示します。プロテインA及びプロテインGに対する抗体の高い結合親和性は高い回収率だけでなく、標識抗体の高純度を保証します。また、磁性ビーズの使用が著しく標識スループットを向上させる、複数のサンプルを手動で処理することを可能にします。

高容量の磁気プロテインAおよびプロテインGビーズを使用して小分子と抗体を標識するための概略図を図1に示す磁気プロテインGビーズ上に捕捉された抗体は、ラベルアミン化学のいずれかを用いて、蛍光色素、例えば、小分子で標識することができます一次リジンアミノ酸のアミンまたは抗体のヒンジ領域中の還元チオールでラベルチオール化学を用いて。抗体とプロテインGとの間の親和性は、標識反応時の抗体の損失を最小限に21、結果強いです。これは、単純な精製に比べて蛍光色素で標識した後、三つの異なるマウス抗体アイソタイプの効率的な回収率（50％〜90％）（ 表1）に反映されています。 （19の前に報告されたものと同様の）効率的な回収がクマシーゲルでも明らかである（ 図2）バンドintensi精製された抗体および標識抗体の重鎖および軽鎖の関係を表1に報告された結果を反映する。クマシーゲル（ 図2）に見られるような磁気プロテインGビーズは高度に精製された抗体をもたらす低非特異的結合特性を有し、両方の重鎖および軽鎖は、蛍光（ 図2）標識されています。ビーズ上の標識は、磁気プロテインAビーズで行われ、抗体の比（ 表2）の高回収率と良好な色素を生じる複数の蛍光色素と適合性であることができます。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54545/54545fig1.jpg" /> 蛍光分子を有する抗体のビーズ上の標識の図1の回路図。 （A）抗体標識チオール化学を用いて。抗体は、高容量の磁気プロテインAまたは磁気プロテインG Bに捕捉されますDTTまたはトリス（2-カルボキシエチル）ホスフィン（TCEP）などの還元剤を用いて鎖間ジスルフィド結合の還元、続いてEADS。蛍光染料を含有するチオール反応性マレイミドは、抗体を標識するために添加されます。標識抗体は、低pH溶出によって回収し、すぐに中和されます。 （B）抗体標識アミン化学を使用して。高容量の磁気プロテインA及びプロテインGビーズ上に捕捉された抗体は、リジンの第一級アミンで抗体を標識するためにアミン反応性蛍光色素と反応させます。標識抗体は、低pH溶出により溶出し、直ちに中和されます。ナス、N. ら20から適応<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54545/54545fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54545/54545fig2.jpg" /> 図2. 変性Sマウスを3 IgGのDS-PAGEゲルの画像上のビーズ法を用いて、精製し、のAlexaFluor 532で標識したアイソタイプ（A）アミン反応物（B）チオール反応。チオール反応性色素で標識された抗体のゲル画像。レーン1-6は、 表1に示したサンプルに対応する。ゲルは、第一の蛍光スキャナを用いて画像化し、のみのAlexaFluor 532標識抗体の重鎖および軽鎖を示しました。抗体のみを精製したサンプルは表示されません。ゲルは、その後、標識した抗体と同様に精製した抗体からの重鎖および軽鎖を表示するにはクマシー染色で染色しました。ナス、N. ら 20から適応<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54545/54545fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td></td&gt; <td></td><td colspan="2"> アミン反応 </td><td colspan="2"> チオール反応 </td></tr><tr><td> よく </td><td> アイソタイプ </td><td></td><td> 抗体リカバリ（μgの） </td><td> 抗体比の染料 </td><td> 抗体リカバリ（μgの） </td><td> 抗体比の染料 </td></tr><tr><td> 1 </td><td rowspan="2">マウスIgG1 </td><td>精製</td><td> 54.8±1.8 </td><td> 0 </td><td> 49.2±2.0 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> 2 </td><td>共役</td><td> 27.4±3.2 </td><td> 4.2±0.2 </td><td> 46.​​2±3.5 </td><td> 1.6±0.2 </td></tr><tr><td> 3 </td><td rowspan="2">マウスIgG2a </td><td>精製</td><td> 85.9±6.4 </td><td> 0 </td><td> 75.3±8.0 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> Conjugエーション</td><td> 60.7±3.2 </td><td> 4.4±0.1 </td><td> 61.5±7.4 </td><td> 5.5±0.4 </td></tr><tr><td> 5 </td><td rowspan="2">マウスのIgG2b </td><td>精製</td><td> 79.9±6.9 </td><td> 0 </td><td> 73.3±1.4 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> 6 </td><td>共役</td><td> 66.7±0.5 </td><td> 5.6±0.1 </td><td> 55.7±0.9 </td><td> 5.2±0.5 </td></tr></tbody></table> 表1は三つのマウスIgGのビーズ上の標識は、アミンおよびチオール化学を用いて細胞培地から直接アイソタイプ各サンプルについて、。 1.0 mlのCell培地の1つのアリコートを、単にアミン反応性のAlexaFluor 532色素でのビーズの標識のために使用した磁気プロテインGビーズ（50μlのスラリー）と第二のアリコートを用いて抗体を精製するために使用しました。両方の場合において、抗体回収率を算出した（本文参照）ANDは、標識反応中に抗体の損失を決定するために比較しました。抗体比染料は、すべての3つの抗体について計算しました。全ての反応を三連で行いました。ナス、N. らから適応。20 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td></td><td colspan="2"> 磁気プロテインGビーズ </td><td colspan="2"> 磁気プロテインAビーズ </td></tr><tr><td></td><td></td><td> 抗体リカバリ（μgの） </td><td> 抗体比染料 </td><td> 抗体リカバリ（μgの） </td><td> 抗体比染料 </td></tr><tr><td> 1 </td><td>精製</td><td> 263.7±10.4 </td><td> 0 </td><td> 269​​.4±5.1 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> AlexaFluor532 </td><td> 182.9±15.3 </td><td> 5.377; 0.04 </td><td> 189.1±6.9 </td><td> 6.9±0.2 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> AlexaFluor647 </td><td> 192.5±2.9 </td><td> 3.3±0.1 </td><td> 112.3±11.4 </td><td> 3.6±0.2 </td></tr><tr><td> 4 </td><td>フルオレセイン</td><td> 179.5±5.3 </td><td> 6.8±0.1 </td><td> 201.5±6.5 </td><td> 6.8±0.1 </td></tr></tbody></table> 表2：3つの異なるチオール反応性蛍光色素とマウスIgG2aのオンビーズ標識濃縮細胞培地のサンプルがその方法を示すためにこの実験に使用したが、抗体の異なる量を採用することができます。また、コンジュゲーション反応は、磁気プロテインG、並びに磁気プロテインGビーズ（100μlのスラリー）を用いて抗体の精製に使用した細胞培地濃縮1.0 mlに磁気プロテインA Oneアリコートを用いて行きました。他の三つの1.0ミリリットルのアリコートsがチオール反応性のAlexaFluor 532、のAlexaFluor 647およびフルオレセインで標識し、精製しました。抗体回収率を算出した（本文参照）および種々の標識反応を比較しました。抗体比染料はまた、3つすべての蛍光色素について計算しました。同様の精製および標識は、磁気プロテインAビーズを用いて行きました。全ての反応を三連で行いました。ナス、N. らから適応。」20 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> バッファ </td><td> コメント/説明 </td></tr><tr><td>アミン結合緩衝液（10mM重炭酸ナトリウム緩衝液、pH 8.5） </td><td> 1. 0.084グラムの重炭酸ナトリウム 2.脱イオン水に溶解します。 pH8.5に調整します。 3.脱イオン水で100ミリリットルへの最終的な音量を調整します。 </td></tr><tr><td>チオール結合緩衝液（1mMのEDTA、pH7の10 mMリン酸緩衝液。0） </td><td> 1. 0.0378グラムのリン酸ナトリウム、一塩基性、一水和物 2. 0.195グラムのリン酸ナトリウム、二塩基性、七水和物 3.脱イオン水に溶解します。 4. 1.0ミリモルの最終濃度にEDTAを追加します。 5. pHを7に調整します。 6.脱イオン水で100ミリリットルへの最終的な音量を調整します。 </td></tr><tr><td>抗体結合/洗浄緩衝液（10mMリン酸緩衝液、pH 7.0） </td><td> 1. 0.0378グラムのリン酸ナトリウム、一塩基性、一水和物 2. 0.195グラムのリン酸ナトリウム、二塩基性、七水和物 3.脱イオン水に溶解します。 pHを7に調整します。 4.脱イオン水で100ミリリットルへの最終的な音量を調整します。 </td></tr><tr><td>溶出緩衝液（50mMのグリシン緩衝液、pH 2.7） </td><td> 1. 0.188グラムのグリシン 2.脱イオン水に溶解します。 HClで2.7にpHを調整します。 3.脱イオン水で50ミリリットルへの最終的な音量を調整します。 </td></tr><tr><td>中和緩衝液（2 Mトリス緩衝液、pH 7.5） </td><td> 1. 0.472グラムトリズマベース 2. 2.54グラムのトリズマ塩酸塩 3.脱イオン水に溶解します。 pH7.5に調整します。 4.脱イオン水で10ミリリットルへの最終的な音量を調整します。 </td></tr></tbody></table> 表3：バッファー成分。

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Antibody Labeling with Fluorescent Dyes Using Magnetic Protein A and Protein G Beads

小分子を有する抗体を標識するためにビーズ法は、細胞培地から直接抗体の少量の標識化を可能にします。この方法は、アミンおよびチオール化学と互換性があり、手動または自動化されたプラットフォームを使用して、並行して複数のサンプルを処理することができます。

磁気プロテインA及びプロテインGビーズを用いた蛍光色素で抗体ラベリング

Antibodies labeled with small molecules like fluorescent dyes, cytotoxic drugs, and radioactive tracers are essential tools in biomedical research, ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.8K ビュー.  Promega Corporation. 小分子を有する抗体を標識するためにビーズ法は、細胞培地から直接抗体の少量の標識化を可能にします。この方法は、アミンおよびチオール化学と互換性があり、手動または自動化されたプラットフォームを使用して、並行して複数のサンプルを処理することができます。 

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Specific Marking of HIV-1 Positive Cells using a Rev-dependent Lentiviral Vector Expressing the Green Fluorescent Protein

Most of HIV-responsive expression vectors are based on the HIV promoter, the long terminal repeat (LTR). While responsive to an early HIV protein, Tat, the LTR is also responsive to cellular activation states and to the local chromatin activity where the integration has occurred. This can result in high HIV-independent activity, and has restricted the usefulness of LTR-based reporter to mark HIV positive cells 1,2,3. Here, we constructed an expression lentiviral vector that possesses, in addition to the Tat-responsive LTR, numerous HIV DNA sequences that include the Rev-response element and HIV splicing sites 4,5,6. The vector was incorporated into a lentiviral reporter virus, permitting highly specific detection of replicating HIV in living cell populations. The activity of the vector was measured by expression of the green fluorescence protein (GFP). The application of this vector as reported here offers a novel alternative approach to existing methods, such as in situ PCR or HIV antigen staining, to identify HIV-positive cells. The vector can also express therapeutic genes for basic or clinical experimentation to target HIV-positive cells.

We have developed a lentiviral vector that possesses, in addition to the Tat-responsive LTR, the Rev-response element (RRE) that can regulate reporter gene expression in an HIV-1 Tat- and Rev-dependent fashion. The vector permits the specific detection of replicating HIV in living cells via the expression of GFP.

緑色蛍光タンパク質を発現するリビジョンに依存するレンチウイルスベクターを用いたHIV - 1陽性細胞の特定のマーキング

Most of HIV-responsive expression vectors are based on the HIV promoter, the long terminal repeat (LTR). While responsive to an early HIV protein, Tat, ...

免疫・感染学

A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito (Aedes aegypti) and Tick (Rhipicephalus microplus) G Protein-coupled Receptors

Arthropod hormone receptors are potential targets for novel pesticides as they regulate many essential physiological and behavioral processes. The majority of them belong to the superfamily of G protein-coupled receptors (GPCRs). We have focused on characterizing arthropod kinin receptors from the tick and mosquito. Arthropod kinins are multifunctional neuropeptides with myotropic, diuretic, and neurotransmitter function. Here, a method for systematic analyses of structure-activity relationships of insect kinins on two heterologous kinin receptor-expressing systems is described. We provide important information relevant to the development of biostable kinin analogs with the potential to disrupt the diuretic, myotropic, and/or digestive processes in ticks and mosquitoes.
The kinin receptors from the southern cattle tick, Boophilus microplus (Canestrini), and the mosquito Aedes aegypti (Linnaeus), were stably expressed in the mammalian cell line CHO-K1. Functional analyses of these receptors were completed using a calcium bioluminescence plate assay that measures intracellular bioluminescence to determine cytoplasmic calcium levels upon peptide application to these recombinant cells. This method takes advantage of the aequorin protein, a photoprotein isolated from luminescent jellyfish. We transiently transfected the aequorin plasmid (mtAEQ/pcDNA1) in cell lines that stably expressed the kinin receptors. These cells were then treated with the cofactor coelenterazine, which complexes with intracellular aequorin. This bond breaks in the presence of calcium, emitting luminescence levels indicative of the calcium concentration. As the kinin receptor signals through the release of intracellular calcium, the intensity of the signal is related to the potency of the peptide.
This protocol is a synthesis of several previously described protocols with modifications; it presents step-by-step instructions for the stable expression of GPCRs in a mammalian cell line through functional plate assays (Staubly et al., 2002 and Stables et al., 1997). Using this methodology, we were able to establish stable cell lines expressing the mosquito and the tick kinin receptors, compare the potency of three mosquito kinins, identify critical amino acid positions for the ligand-receptor interaction, and perform semi-throughput screening of a peptide library. Because insect kinins are susceptible to fast enzymatic degradation by endogenous peptidases, they are severely limited in use as tools for pest control or endocrinological studies. Therefore, we also tested kinin analogs containing amino isobutyric acid (Aib) to enhance their potency and biostability. This peptidase-resistant analog represents an important lead in the development of biostable insect kinin analogs and may aid in the development of neuropeptide-based arthropod control strategies.

A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito Aedes aegypti and Tick Rhipicephalus microplus G Protein-coupled Receptors

This protocol provides instructions for clonal-cell line selection and a calcium bioluminescence assay to analyze the structure-activity relationships of synthesized arthropod neuropeptides on their cognate GPCRs. This assay can be used for receptor deorphanization and structure-activity relationship studies for synthetic analog design and peptide/drug-lead discovery.

蚊の機能解析のためのカルシウムの生物発光アッセイ（ネッタイシマカ）とダニ（ Rhipicephalus microplus）Gタンパク質共役受容体

Arthropod hormone receptors are potential targets for novel pesticides as they regulate many essential physiological and behavioral processes.  The ...

Colorectal Cancer Cell Surface Protein Profiling Using an Antibody Microarray and Fluorescence Multiplexing

The current prognosis and classification of CRC relies on staging systems that integrate histopathologic and clinical findings. However, in the majority of CRC cases, cell dysfunction is the result of numerous mutations that modify protein expression and post-translational modification1.
A number of cell surface antigens, including cluster of differentiation (CD) antigens, have been identified as potential prognostic or metastatic biomarkers in CRC. These antigens make ideal biomarkers as their expression often changes with tumour progression or interactions with other cell types, such as tumour-infiltrating lymphocytes (TILs) and tumour-associated macrophages (TAMs).
The use of immunohistochemistry (IHC) for cancer sub-classification and prognostication is well established for some tumour types2,3. However, no single &#x2018;marker&#x2019; has shown prognostic significance greater than clinico-pathological staging or gained wide acceptance for use in routine pathology reporting of all CRC cases. 
A more recent approach to prognostic stratification of disease phenotypes relies on surface protein profiles using multiple 'markers'. While expression profiling of tumours using proteomic techniques such as iTRAQ is a powerful tool for the discovery of biomarkers4, it is not optimal for routine use in diagnostic laboratories and cannot distinguish different cell types in a mixed population. In addition, large amounts of tumour tissue are required for the profiling of purified plasma membrane glycoproteins by these methods. 
In this video we described a simple method for surface proteome profiling of viable cells from disaggregated CRC samples using a DotScan CRC antibody microarray. The 122-antibody microarray consists of a standard 82-antibody region recognizing a range of lineage-specific leukocyte markers, adhesion molecules, receptors and markers of inflammation and immune response5, together with a satellite region for detection of 40 potentially prognostic markers for CRC. Cells are captured only on antibodies for which they express the corresponding antigen. The cell density per dot, determined by optical scanning, reflects the proportion of cells expressing that antigen, the level of expression of the antigen and affinity of the antibody6. 
For CRC tissue or normal intestinal mucosa, optical scans reflect the immunophenotype of mixed populations of cells. Fluorescence multiplexing can then be used to profile selected sub-populations of cells of interest captured on the array. For example, Alexa 647-anti-epithelial cell adhesion molecule (EpCAM; CD326), is a pan-epithelial differentiation antigen that was used to detect CRC cells and also epithelial cells of normal intestinal mucosa, while Phycoerythrin-anti-CD3, was used to detect infiltrating T-cells7. The DotScan CRC microarray should be the prototype for a diagnostic alternative to the anatomically-based CRC staging system.

We described a procedure for the disaggregation of colorectal cancer (CRC) to produce viable single cells, which are then captured on customized antibody microarrays recognizing surface antigens (DotScan CRC microarray). Sub-populations of cells bound to the microarray can be profiled by fluorescence multiplexing using monoclonal antibodies tagged with fluorescent dyes.

抗体マイクロアレイと蛍光多重を用いた大腸癌の細胞表面タンパク質のプロファイリング

The current prognosis and classification of CRC relies on staging systems that integrate histopathologic and clinical findings. However, in the majority ...

Protein Misfolding Cyclic Amplification of Prions

Prions are infectious agents that cause the inevitably fatal transmissible spongiform encephalopathy (TSE) in animals and humans9,18. The prion protein has two distinct isoforms, the non-infectious host-encoded protein (PrPC) and the infectious protein (PrPSc), an abnormally-folded isoform of PrPC 8.
One of the challenges of working with prion agents is the long incubation period prior to the development of clinical signs following host inoculation13. This traditionally mandated long and expensive animal bioassay studies. Furthermore, the biochemical and biophysical properties of PrPSc are poorly characterized due to their unusual conformation and aggregation states.
PrPSc can seed the conversion of PrPC to PrPSc in vitro14. PMCA is an in vitro technique that takes advantage of this ability using sonication and incubation cycles to produce large amounts of PrPSc, at an accelerated rate, from a system containing excess amounts of PrPC and minute amounts of the PrPSc seed19. This technique has proven to effectively recapitulate the species and strain specificity of PrPSc conversion from PrPC, to emulate prion strain interference, and to amplify very low levels of PrPSc from infected tissues, fluids, and environmental samples6,7,16,23 .
This paper details the PMCA protocol, including recommendations for minimizing contamination, generating consistent results, and quantifying those results. We also discuss several PMCA applications, including generation and characterization of infectious prion strains, prion strain interference, and the detection of prions in the environment.

Protein misfolding cyclic amplification (PMCA) is an in vitro assay for the study of prion conversion and strain and species barriers. It can also be used as a prion detection assay.

プリオンのタンパク質のミスフォールディングサイクリック増幅

Prions  are infectious agents that cause the inevitably fatal transmissible spongiform  encephalopathy (TSE) in animals and humans9,18. The prion protein ...

Monitoring Changes in Membrane Polarity, Membrane Integrity, and Intracellular Ion Concentrations in Streptococcus pneumoniae Using Fluorescent Dyes

Membrane depolarization and ion fluxes are events that have been studied extensively in biological systems due to their ability to profoundly impact cellular functions, including energetics and signal transductions. While both fluorescent and electrophysiological methods, including electrode usage and patch-clamping, have been well developed for measuring these events in eukaryotic cells, methodology for measuring similar events in microorganisms have proven more challenging to develop given their small size in combination with the more complex outer surface of bacteria shielding the membrane. During our studies of death-initiation in Streptococcus pneumoniae (pneumococcus), we wanted to elucidate the role of membrane events, including changes in polarity, integrity, and intracellular ion concentrations. Searching the literature, we found that very few studies exist. Other investigators had monitored radioisotope uptake or equilibrium to measure ion fluxes and membrane potential and a limited number of studies, mostly in Gram-negative organisms, had seen some success using carbocyanine or oxonol fluorescent dyes to measure membrane potential, or loading bacteria with cell-permeant acetoxymethyl (AM) ester versions of ion-sensitive fluorescent indicator dyes. We therefore established and optimized protocols for measuring membrane potential, rupture, and ion-transport in the Gram-positive organism S. pneumoniae. We developed protocols using the bis-oxonol dye DiBAC4(3) and the cell-impermeant dye propidium iodide to measure membrane depolarization and rupture, respectively, as well as methods to optimally load the pneumococci with the AM esters of the ratiometric dyes Fura-2, PBFI, and BCECF to detect changes in intracellular concentrations of Ca2+, K+, and H+, respectively, using a fluorescence-detection plate reader. These protocols are the first of their kind for the pneumococcus and the majority of these dyes have not been used in any other bacterial species. Though our protocols have been optimized for S. pneumoniae, we believe these approaches should form an excellent starting-point for similar studies in other bacterial species.

Monitoring Changes in Membrane Polarity, Membrane Integrity, and Intracellular Ion Concentrations in Streptococcus pneumoniae Using Fluorescent Dyes

Unlike that seen for eukaryotes, there is a paucity of studies that detail membrane depolarization and ion concentration changes in bacteria, primarily as their small size makes conventional methods of measurement difficult. Here, we detail protocols for monitoring such events in the significant Gram-positive pathogen Streptococcus pneumoniae utilizing fluorescence techniques.

メンブレン極性膜完全性、細胞内イオン濃度の監視の変更<em&gt;肺炎球菌</em&gt;蛍光染料を使用

Membrane depolarization and ion fluxes are events that have been studied extensively in biological systems due to their ability to profoundly impact ...

Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions of proteins with other macromolecules in a complex sample is called co-immunoprecipitation. The described co-immunoprecipitation protocol allows to demonstrate and further investigate the interaction between the antiviral myxovirus resistance protein 1 (Mx1) and one of its viral targets, the influenza A virus nucleoprotein (NP). The protocol starts with transfected mammalian cells, but it is also possible to use influenza A virus infected cells as starting material. After cell lysis, the viral NP protein is pulled-down with a specific antibody and the resulting immune-complexes are precipitated with protein G beads. The successful pull-down of NP and the co-immunoprecipitation of the antiviral Mx1 protein are subsequently revealed by western blotting. A prerequisite for successful co-immunoprecipitation of Mx1 with NP is the presence of N-ethylmaleimide (NEM) in the cell lysis buffer. NEM alkylates free thiol groups. Presumably this reaction stabilizes the weak and/or transient NP&#8211;Mx1 interaction by preserving a specific conformation of Mx1, its viral target or an unknown third component. An important limitation of co-immunoprecipitation experiments is the inadvertent pull-down of contaminating proteins, caused by nonspecific binding of proteins to the protein G beads or antibodies. Therefore, it is very important to include control settings to exclude false positive results. The described co-immunoprecipitation protocol can be used to study the interaction of Mx proteins from different vertebrate species with viral proteins, any pair of proteins, or of a protein with other macromolecules. The beneficial role of NEM to stabilize weak and/or transient interactions needs to be tested for each interaction pair individually.

This co-immunoprecipitation protocol allows to study the interaction between the influenza A virus nucleoprotein and the antiviral Mx1 protein in human cells. The protocol emphasizes the importance of N-ethylmaleimide for successful co-immunoprecipitation of Mx1 and influenza A virus nucleoprotein.

インフルエンザAウイルス核を持つマウスMx1のタンパク質の共免疫沈降

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions ...

Inoculating Anopheles gambiae Mosquitoes with Beads to Induce and Measure the Melanization Immune Response

The stimulation of immune responses is a common tool in invertebrate studies to examine the efficacy and the mechanisms of immunity. This stimulation is based on the injection of non-pathogenic particles into insects, as the particles will be detected by the immune system and will induce the production of immune effectors. We focus here on the stimulation of the melanization response in the mosquito Anopheles gambiae. The melanization response results in the encapsulation of foreign particles and parasites with a dark layer of melanin. To stimulate this response, mosquitoes are inoculated with beads in the thoracic cavity using microcapillary glass tubes. Then, after 24 hr, the mosquitoes are dissected to retrieve the beads. The degree of melanization of the bead is measured using image analysis software. Beads do not have the pathogenic effects of parasites, or their capacity to evade or suppress the immune response. These injections are a way to measure immune efficacy and the impact of immune stimulations on other life history traits, such as fecundity or longevity. It is not exactly the same as directly studying host-parasite interactions, but it is an interesting tool to study immunity and its evolutionary ecology.

Inoculating Anopheles gambiae Mosquitoes with Beads to Induce and Measure the Melanization Immune Response

Through inoculation with beads, the described technique enables the stimulation of the mosquito melanization response in the hemolymph circulating system. The amount of melanin covering the beads can be measured after dissection as a measure of the immune response.

接種<em&gt;ハマダラカ</emメラニン免疫応答を誘導し、測定するためにビーズと&gt;蚊

The stimulation of immune responses is a common tool in invertebrate studies to examine the efficacy and the mechanisms of immunity. This stimulation is ...

Dissecting Multi-protein Signaling Complexes by Bimolecular Complementation Affinity Purification (BiCAP)

The assembly of protein complexes is a central mechanism underlying the regulation of many cell signaling pathways. A major focus of biomedical research is deciphering how these dynamic protein complexes act to integrate signals from multiple sources in order to direct a specific biological response, and how this becomes deregulated in many disease settings. Despite the importance of this key biochemical mechanism, there is a lack of experimental techniques that can facilitate the specific and sensitive deconvolution of these multi-molecular signaling complexes.
Here this shortcoming is addressed through the combination of a protein complementation assay with a conformation-specific nanobody, which we have termed Bimolecular Complementation Affinity Purification (BiCAP). This novel technique facilitates the specific isolation and downstream proteomic characterization of any pair of interacting proteins, to the exclusion of un-complexed individual proteins and complexes formed with competing binding partners. 
The BiCAP technique is adaptable to a wide array of downstream experimental assays, and the high degree of specificity afforded by this technique allows more nuanced investigations into the mechanics of protein complex assembly than is currently possible using standard affinity purification techniques.

Dissecting Multi-protein Signaling Complexes by Bimolecular Complementation Affinity Purification BiCAP

This manuscript describes the protocol for Bimolecular Complementation Affinity Purification (BiCAP). This novel method facilitates the specific isolation and downstream proteomic characterization of any two interacting proteins, while excluding un-complexed individual proteins as well as complexes formed with competing binding partners.

解離性個体の親和性の浄化 (BiCAP) によって多蛋白質シグナリング複合体

The assembly of protein complexes is a central mechanism underlying the regulation of many cell signaling pathways. A major focus of biomedical research ...

A Protein Microarray Assay for Serological Determination of Antigen-specific Antibody Responses Following Clostridium difficile Infection

We provide a detailed overview of a novel high-throughput protein microarray assay for the determination of anti-Clostridium difficile antibody levels in human sera and in separate preparations of polyclonal intravenous immunoglobulin (IVIg). The protocol describes the methodological steps involved in sample preparation, printing of arrays, assay procedure, and data analysis. In addition, this protocol could be further developed to incorporate diverse clinical samples including plasma and cell culture supernatants. We show how protein microarray can be used to determine a combination of isotype (IgG, IgA, IgM), subclass (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2), and strain-specific antibodies to highly purified whole C. difficile toxins A and B (toxinotype 0, strain VPI 10463, ribotype 087), toxin B from a C. difficile toxin-B-only expressing strain (CCUG 20309), a precursor form of a B fragment of binary toxin, pCDTb, ribotype-specific whole surface layer proteins (SLPs; 001, 002, 027), and control proteins (tetanus toxoid and Candida albicans). During the experiment, microarrays are probed with sera from individuals with C. difficile infection (CDI), individuals with cystic fibrosis (CF) without diarrhea, healthy controls (HC), and from individuals pre- and post-IVIg therapy for the treatment of CDI, combined immunodeficiency disorder, and chronic inflammatory demyelinating polyradiculopathy. We encounter significant differences in toxin neutralization efficacies and multi-isotype specific antibody levels between patient groups, commercial preparations of IVIg, and sera before and following IVIg administration. Also, there is a significant correlation between microarray and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for antitoxin IgG levels in serum samples. These results suggest that microarray could become a promising tool for profiling antibody responses to C.difficile antigens in vaccinated or infected humans. With further refinement of antigen panels and a reduction in production costs, we anticipate that microarray technology may help optimize and select the most clinically useful immunotherapies for C. difficile infection in a patient-specific manner.

A Protein Microarray Assay for Serological Determination of Antigen-specific Antibody Responses Following Clostridium difficile Infection

This article describes a simple protein microarray method for profiling humoral immune responses to a 7-plex panel of highly purified Clostridium difficile antigens in human sera. The protocol can be extended for the determination of specific antibody responses in preparations of polyclonal intravenous immunoglobulin.

蛋白質のマイクロ アレイの試金抗原特異的抗体の応答次のクロストリジウム ・ ディフィシル感染症の血清学的定量

We provide a detailed overview of a novel high-throughput protein microarray assay for the determination of anti-Clostridium difficile antibody levels in ...

TurboID-Based Proximity Labeling for In Planta Identification of Protein-Protein Interaction Networks

Proximity labeling (PL) techniques using engineered ascorbate peroxidase (APEX) or Escherichia coli biotin ligase BirA (known as BioID) have been successfully used for identification of protein-protein interactions (PPIs) in mammalian cells. However, requirements of toxic hydrogen peroxide (H2O2) in APEX-based PL, longer incubation time with biotin (16&#8211;24 h), and higher incubation temperature (37 &#176;C) in BioID-based PL severely limit their applications in plants. The recently described TurboID-based PL addresses many limitations of BioID and APEX. TurboID allows rapid proximity labeling of proteins in just 10&#8201;min under room temperature (RT) conditions. Although the utility of TurboID has been demonstrated in animal models, we recently showed that TurboID-based PL performs better in plants compared to BioID for labeling of proteins that are proximal to a protein of interest. Provided here is a step-by-step protocol for the identification of protein interaction partners using the N-terminal Toll/interleukin-1 receptor (TIR) domain of the nucleotide-binding leucine-rich repeat (NLR) protein family as a model. The method describes vector construction, agroinfiltration of protein expression constructs, biotin treatment, protein extraction and desalting, quantification, and enrichment of the biotinylated proteins by affinity purification. The protocol described here can be easily adapted to study other proteins of interest in Nicotiana and other plant species.

Described here is a proximity labeling method for identification of interaction partners of the TIR domain of the NLR immune receptor in Nicotiana benthamiana leaf tissue. Also provided is a detailed protocol for the identification of interactions between other proteins of interest using this technique in Nicotiana and other plant species.

磁気プロテインA及びプロテインGビーズを用いた蛍光色素で抗体ラベリング

要約

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緑色蛍光タンパク質を発現するリビジョンに依存するレンチウイルスベクターを用いたHIV - 1陽性細胞の特定のマーキング

蚊の機能解析のためのカルシウムの生物発光アッセイ（ネッタイシマカ）とダニ（ Rhipicephalus microplus）Gタンパク質共役受容体

抗体マイクロアレイと蛍光多重を用いた大腸癌の細胞表面タンパク質のプロファイリング

プリオンのタンパク質のミスフォールディングサイクリック増幅

メンブレン極性膜完全性、細胞内イオン濃度の監視の変更

インフルエンザAウイルス核を持つマウスMx1のタンパク質の共免疫沈降

接種

解離性個体の親和性の浄化 (BiCAP) によって多蛋白質シグナリング複合体

蛋白質のマイクロアレイの試金抗原特異的抗体の応答次のクロストリジウム・ディフィシル感染症の血清学的定量

タンパク質相互作用ネットワークのインプランタ同定のためのTurboIDベースの近接標識

磁気プロテインA及びプロテインGビーズを用いた蛍光色素で抗体ラベリング

要約

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緑色蛍光タンパク質を発現するリビジョンに依存するレンチウイルスベクターを用いたHIV - 1陽性細胞の特定のマーキング

蚊の機能解析のためのカルシウムの生物発光アッセイ（ネッタイシマカ）とダニ（ Rhipicephalus microplus）Gタンパク質共役受容体

抗体マイクロアレイと蛍光多重を用いた大腸癌の細胞表面タンパク質のプロファイリング

プリオンのタンパク質のミスフォールディングサイクリック増幅

メンブレン極性膜完全性、細胞内イオン濃度の監視の変更

インフルエンザAウイルス核を持つマウスMx1のタンパク質の共免疫沈降

接種

解離性個体の親和性の浄化 (BiCAP) によって多蛋白質シグナリング複合体

蛋白質のマイクロ アレイの試金抗原特異的抗体の応答次のクロストリジウム ・ ディフィシル感染症の血清学的定量

タンパク質相互作用ネットワークのインプランタ同定のためのTurboIDベースの近接標識

蛋白質のマイクロアレイの試金抗原特異的抗体の応答次のクロストリジウム・ディフィシル感染症の血清学的定量