1. Peptid seri seyreltme <ol><li> deney tamponu hazırlayın: Hanks, 25 mM HEPES,% 0.1 BSA ve 0.5 mM 3-izobutil-1-metilksantin (IBMX), pH 7.4 ile takviye edilmiş tuz çözeltisi (HBSS) tamponlu. </li><li> sistematik beş 384-düşük hacimli deney plakalarının her çukuruna deney tamponu 5 ul bir hacim tepkin madde dağıtıcı kullanın. <ol><li> üreticinin talimatlarına göre 384 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 5 ul hacmi ilave edilmesi için bir dağıtma programı oluşturmak için iç yazılım kullanın. </li><li> deney tamponu ve prime sıvısında kaset boru dağıtım daldırın. </li><li> plaka taşıyıcısı üzerindeki 384 de düşük hacimli tahlil plaka koyun. </li><li> Başlata basınız. </li></ol></li><li> 100x peptid stokunun üretilmesi için deney tamponu içine ne olursa olsun, bir depolama aracı, her peptit örnekleri seyreltilir. Not: tarama gerektiren peptidlerdir örneğin, DMSO (w uygun görüldüğü şekilde fosfat-tamponlu salin (PBS) veya dimetil sülfoksit (DMSO) içinde temin edilebilirHasta bu PEGilasyon gibi sekonder değişikliklerin) sahip peptidler üzerinde zararlı bir etkiye sahiptir. </li><li> sütunlar akustik nitelikli 384-polipropilen mikroplaka 1-5 içine 25 ul 100x peptid stokları koyun. Bu plaka &#39;kaynak plaka A&#39; belirlenmiştir. bu kaynak plakaları olun, ancak hedef plakaları, düz dipli ve akustik enstrümanlar üreticisi tarafından tanımlanan belirli akustik toleranslar uygundur. </li><li> kuyular A23 içine 25 ul 100x referans kontrolü dağıtın ve kaynak plaka A. A24 </li><li> Kaynak plaka A. sütun 21-22 içine sütun 11-15 ve 30 ul tahlil tamponu içine 10 ul deney tamponu dağıtın </li><li> sütunlar ikinci akustik nitelikli 384 polipropilen mikroplaka 6-10 ve sütunları 16-20 içine 10 ul deney tamponu koyun. Bu plaka &#39;kaynak plaka B&#39; belirlenmiştir. </li><li> 1 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüjleyin kaynağı A ve B levhalarının. uygun bir denge levhasını içerir. </li><li> akustik flui kullanınKaynak A sütun 1 100x peptid stokları (deney tamponu içinde), 100, ara seyreltiler: D dağıtıcılar, sıralı üç 1 hazırlanması için bir otomatik robotlu sisteme entegre NOT: Programlama kaynak A ve kaynak B (plaka düzenleri için bakınız Şekil 1) arasında üç akustik transferlerine izin plaka yeniden biçimlendirme ve (akustik sıvı dağıtıcısının üreticisi tarafından sağlanan gibi) doz-yanıt yazılım gerektirir. Özellikle 1,9 ayrıntıları otomatik robot kontrolü altında bu laboratuvarda kullanılan sıvı dağıtıcıları kullanımı Adım (Malzeme Tablo bakınız): <ol><li> robotik plaka otel bölümünde yükleyin kaynak plakaları ve tahlil plakaları. </li><li> Açık, otomatik robotlu yazılım ve yük plakası yeniden biçimlendirme ve doz-yanıt programı genişletme protokolleri. &#39;Çalıştır&#39; düğmesine tıklayın. NOT: Otomasyon kaynak plakası B sütunları 6-10 içine kaynak plakası A sütunları 1-5 250 nl aktarmak için bir akustik sıvı dağıtıcı talimatı ve ikinci akustik birkarıştırmak için 15 ul deney tamponu ile doldurmak için büyük sıvı hacimlerini işleme yeteneğine c sıvı dağıtıcısı. Otomasyon sonra entegre santrifüj ve 1 dakika boyunca 300 xg&#39;de santrifüj (uygun bir denge plakası tüm santrifüj adımları dahildir) kaynak plakası B aktarır. Kaynak plaka B kaynak plakası A sütunları 11-15 içine kaynak plakası B sütunları 6-10 250 nl transferi için akustik sıvı dağıtıcı döndü ve karıştırmak için 15 ul deney tamponu ile dolgu edilir. Entegre santrifüj ve 1 dakika boyunca 300 xg&#39;de santrifüj Otomasyon transferleri kaynak plakası A. Kaynak levhası ardından kaynak plakası B sütunları 16-20 içine kaynak plakası A sütunları 11-15 250 nl transferi için akustik sıvı dağıtıcı döndü ve karıştırmak için 15 ul deney tamponu ile dolgu edilir. Otomasyon sonra 1 dakika boyunca 300 xg&#39;de entegre santrifüj ve santrifüjler kaynak plakası B aktarır. NOT: Son olarak doz tepki protokolü aktarmak için akustik dağıtılmasını yönlendirir(Kaynak levhasının ve kaynak plakası B hem de) 4 seri olarak seyreltilmiş, kaynak plakası kuyularının her biri gerekli hacmi deney plakalarında iki kez tam 11 noktalı eğri oluşturmak için (yukarıda Adım 1.2&#39;de 5 ul deney tamponu ile önceden doldurulmuş ). Otomasyon Entegre santrifüj transferler tahlil plaka ve santrifüjler 1 dakika boyunca 300 xg&#39;de. </li></ol></li></ol> 2. Hücre Hazırlanması <ol><li> 20 mi tayin tamponu içinde 37 ° C bir su banyosu ve tekrar süspansiyon hızla hedef fare, GLP-1 reseptörü eksprese eden çözülme dondurulan Çin hamsteri yumurtalık (CHO) hücreleri. </li><li> Oda sıcaklığında 200 xg (RT), 5 dakika boyunca santrifüj hücre süspansiyonu. uygun bir denge ekleyin. </li><li> Süpernatant atın ve 10 ml tahlil tamponu hücre pelletini. </li><li> Tripan mavi 1 ve otomatik bir hücre sayacı kullanılarak, canlı hücrelerin yoğunluğunu belirler: hücre stoku: 1 seyreltin. Wel 8.000 hücrelerine (eşdeğer, ml başına 1.6 x 10 6 hücre olarak tahlil tamponu içinde yeniden süspanse hücreleriDeney plakaları l). </li><li> 30 dakika boyunca oda sıcaklığında (5 ul deney tamponu içinde seri halinde seyreltilmiş peptid içeren) deney plakalarının her çukuruna hücre süspansiyonu 5 ul ve inkübasyona bir kütle reaktif dağıtıcı kullanın. </li></ol> 3. HTRF cAMP tespitinde <ol><li> kullanımdan önce, 30 dakika boyunca oda sıcaklığına HTRF cAMP tahlili kiti getirin. </li><li> (CAMP tarama deneyinde üreticisi tarafından sağlanan özel formülasyon) liziz tamponu içinde 1:20 seyreltide ayrı ayrı HTRF reaktif (cryptate ve D2) hazırlayın. NOT: DİKKAT: Lizis tampon potasyum zehirlidir florid (KF) ve teratojen 13 içerir. Atıkları, KF içeren tahlil tabak mühürlü ve yakılarak ve herhangi bir sıvı atık önce lavaboya aşağı elden su ile &lt;1 mg / L seyreltilmiş gerekmektedir edilmelidir. </li><li> deney plakalarının tüm oyuklara 5 ul kriptat reaktif ekleme bir kütle reaktif dağıtıcı kullanın. </li><li> colum 5 ul d2 reaktifi eklemek için toplu reaktif dağıtıcı kullanınns tahlil plakaları 1-22. </li><li> Hemen el ile spesifik olmayan bağlanma (NSB) kontrol kuyuları ve kuyu E23-P24 içinde D2 reaktif 5 ul elde deney plakaları kuyu A23-D24 içinde 5 ul lizis tamponu pipetle. </li><li> kuyu karıştırmak oda sıcaklığında 200 xg&#39;de 1 dakika için deney plakaları santrifüjleyin. </li><li> buharlaşma ve foto-ağartma en aza indirmek ve 1 saat boyunca oda sıcaklığında inkübe tahlil plakaları örtün. </li><li> 620 nm&#39;de bir plaka okuyucu kullanılarak 665 nm &#39;de 320 nm&#39; de bir eksitasyon ve emisyon ile flüoresan rezonans enerji transferi (FRET) sinyali ölçer. </li></ol> 4. Veri Analizi <ol><li> tüm kuyulardan arka plan çıkarmak için NSB ortalama kullanın. </li><li> aşağıdaki şekilde 665 nm / 620 nm oranından% Delta F hesaplanır: Oran = (A 665nm / A 620) 10 4 x Delta F = ((Numune Oranı - Oran NSB) / Oran NSB)) x 100 nerede Oran NSB hiçbir d2 reaktifi ile kuyu =. </li><li> % Activat hesaplayınaşağıda uyarılmamış hücrelerde ve hücreler arasında iyon maksimum GLP-1 ligand ile uyarılmış: % Aktivasyon = (% Delta Fsample -% DeltaFunstimulated hücreleri) / (% DeltaFGLP-1 uyarılan hücreler -% DeltaF uyarılmamış hücreler) x 100 </li><li> Referans kontrol 1 ile tanımlanan,% aktivasyonu gibi 4-parametreli lojistik analizi ve grafik ile konsantrasyon-tepki eğrileri analiz edin. </li></ol>

<ol>
	<li>Naylor, J., Rossi, A., Hornigold, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acoustic+Dispensing+Preserves+the+Potency+of+Therapeutic+Peptides+throughout+the+Entire+Drug+Discovery+Workflow.">Acoustic Dispensing Preserves the Potency of Therapeutic Peptides throughout the Entire Drug Discovery Workflow.</a> J.Lab.Autom. 21 (1), 90-96 (2016).</li><li>Campbell, J. E., Drucker, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacology,+physiology,+and+mechanisms+of+incretin+hormone+action.">Pharmacology, physiology, and mechanisms of incretin hormone action.</a> Cell.Metab. 17 (6), 819-837 (2013).</li><li>Hui, H., Farilla, L., Merkel, P., Perfetti, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+short+half-life+of+glucagon-like+peptide-1+in+plasma+does+not+reflect+its+long-lasting+beneficial+effects.">The short half-life of glucagon-like peptide-1 in plasma does not reflect its long-lasting beneficial effects.</a> Eur.J.Endocrinol. 146 (6), 863-869 (2002).</li><li>Harris, D., Olechno, J., Datwani, S., Ellson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gradient,+contact-free+volume+transfers+minimize+compound+loss+in+dose-response+experiments.">Gradient, contact-free volume transfers minimize compound loss in dose-response experiments.</a> J.Biomol.Screen. 15 (1), 86-94 (2010).</li><li>Ekins, S., Olechno, J., Williams, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dispensing+Processes+Impact+Apparent+Biological+Activity+as+Determined+by+Computational+and+Statistical+Analyses.">Dispensing Processes Impact Apparent Biological Activity as Determined by Computational and Statistical Analyses.</a> PLoS ONE. 8 (5), 62325 (2013).</li><li>Goebel-Stengel, M., Stengel, A., Tache, Y., Reeve, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+using+the+optimal+plasticware+and+glassware+in+studies+involving+peptides.">The importance of using the optimal plasticware and glassware in studies involving peptides.</a> Anal.Biochem. 414 (1), 38-46 (2011).</li><li>McDonald, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioactive+Contaminants+Leach+from+Disposable+Laboratory+Plasticware.">Bioactive Contaminants Leach from Disposable Laboratory Plasticware.</a> Science. 322 (5903), 917 (2008).</li><li>Belaiche, C., Holt, A., Saada, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonylphenol+ethoxylate+plastic+additives+inhibit+mitochondrial+respiratory+chain+complex+I.">Nonylphenol ethoxylate plastic additives inhibit mitochondrial respiratory chain complex I.</a> Clin Chem. 55 (10), 1883-1884 (2009).</li><li>Sackmann, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technologies+That+Enable+Accurate+and+Precise+Nano-+to+Milliliter-Scale+Liquid+Dispensing+of+Aqueous+Reagents+Using+Acoustic+Droplet+Ejection.">Technologies That Enable Accurate and Precise Nano- to Milliliter-Scale Liquid Dispensing of Aqueous Reagents Using Acoustic Droplet Ejection.</a> J.Lab.Autom. 21 (1), 166-177 (2016).</li><li>Grant, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Achieving+accurate+compound+concentration+in+cell-based+screening:+validation+of+acoustic+droplet+ejection+technology.">Achieving accurate compound concentration in cell-based screening: validation of acoustic droplet ejection technology.</a> J.Biomol.Screen. 14 (5), 452-459 (2009).</li><li>Turmel, M., Itkin, Z., Liu, D., Nie, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Innovative+Way+to+Create+Assay+Ready+Plates+for+Concentration+Response+Testing+Using+Acoustic+Technology.">An Innovative Way to Create Assay Ready Plates for Concentration Response Testing Using Acoustic Technology.</a> J.Lab.Autom. 15 (4), 297-305 (2010).</li><li>Butler, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+site-specific+retargeting+jump-in+platform+cell+line+to+support+biologic+drug+discovery.">Use of the site-specific retargeting jump-in platform cell line to support biologic drug discovery.</a> J.Biomol.Screen. 20 (4), 528-535 (2015).</li><li>Panchal, S., Verma, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+sodium+fluoride+in+maternal+and+offspring+rats+and+its+amelioration.">Effect of sodium fluoride in maternal and offspring rats and its amelioration.</a> Asian Pac.J.Reprod. 3 (1), 71-76 (2014).</li><li>Hanson, S. M., Ekins, S., Chodera, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+error+in+experimental+assays+using+the+bootstrap+principle:+understanding+discrepancies+between+assays+using+different+dispensing+technologies.">Modeling error in experimental assays using the bootstrap principle: understanding discrepancies between assays using different dispensing technologies.</a> J.Comput. Aided Mol.Des. 29 (12), 1073-1086 (2015).</li><li>Harris, D., Olechno, J., Datwani, S., Ellson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gradient,+Contact-Free+Volume+Transfers+Minimize+Compound+Loss+in+Dose-Response+Experiments.">Gradient, Contact-Free Volume Transfers Minimize Compound Loss in Dose-Response Experiments.</a> J.Biomol. Screen. 15 (1), 86-94 (2010).</li><li>Chan, G. K. Y., Wilson, S., Schmidt, S., Moffat, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unlocking+the+potential+of+high-throughput+drug+combination+assays+using+acoustic+dispensing.">Unlocking the potential of high-throughput drug combination assays using acoustic dispensing.</a> J.Lab.Autom. 21 (1), 125-132 (2016).</li><li>Roberts, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implementation+and+challenges+of+direct+acoustic+dosing+into+cell-based+assays.">Implementation and challenges of direct acoustic dosing into cell-based assays.</a> J.Lab.Autom. 21 (1), 76-89 (2016).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Bu protokol, seri örnek 1 &#39;den az ul gerektiren, 3 x 10 6 bir konsantrasyon aralığı üzerinde peptid örnekleri seyreltilmesi için otomatik bir akustik dağıtma başarılı bir uygulama açıklanmaktadır. Bu yöntemin en önemli avantajı, normal reaktif ve karıştırmak için gerekli olan deney kapları (örneğin, pipet uçları gibi) plasticware örneklerin düşük maruz kalma ile plasticware peptit adsorpsiyonu en aza indirmek suretiyle veri kalitesinin artırmaktır. akustik dağıtım tamamen plasticware kullanımını ekarte etmez iken, önemli ölçüde azaltmak gelmez. Bundan başka, uç-bazlı pipetleme uzaklaştırılması aynı zamanda örnek taşınmasını ortadan kaldırır ve hatalar konsantrasyon-yanıt eğrileri 14,15 hem güvenilir ve yeniden üretilebilen bir üretim sağlayan tüm seri seyreltme boyunca yayılır. Diğer gruplar için DMSO içinde çözünür hale test bileşiklerinin doğrudan akustik transfer bildirmiştirzaman 16,17 fazla deney plakası ve inkübasyon ters dışında gerektirmeyen karıştırma adımları uzun süreli deneyler (&gt; 48 saat) hücreler. DMSO yüksek kutupsal olan ve çok daha yumuşak hazırlanmış ve PBS içinde saklanmalıdır biyolojik örnekler daha sulu çözeltisi ile karıştırılması etmektir. Peptid numuneler akustik transferi için otomatik bir yöntem kabul ederken nedenle, doğru örnek seri seyreltme için izin bir karışım sağlamak için ek dolgu ve santrifüj aşamaları kullanmışlardır. Tecrübemiz &quot;ıslak transferi &#39;yöntemi bir 15 ul dolgu, ardından sulu tampon arasında olan bir 10 ul hacim içinde akustik transfer oluşan geliştirilmiş ve böylece sadece santrifüj sulu örneklerin tam karışımını sağlamak için yeterli olmadığını gösterir ve aynı sulu tampon. Olacak hızlı eva sulu bir peptit çözeltisi olarak, kuru bir kaynak plaka peptidler ateş ve ardından küçük moleküller için bir gücü olarak doldurmak için mümkün değildiryaygýnlaþsýn ve peptid geri dönüşümsüz kuru plastik plaka yapışır. Bu sulu örneklerin karıştırılması yardım etmez, ancak santrifüj hala akustik transferi için bir seviye numunesi menisküs sağlamak için gereklidir. daha az manuel örneklerin çok sayıda hazırlanması ve otomasyon kullanımı daha böylece denetimsiz verim sağlar, ancak birden fazla ara transfer, dolgu ve santrifüj adımları dahil, biraz zaman alıcıdır. Diğer 96-yuvalı plakalar 17 karıştırma el bileşik için gereksinim duyulmaktadır. Burada tam otomatik süreci ve DMSO kullanımı mümkün olmadığı durumlarda manuel müdahaleye gerek kaldırdık. enstrümantasyon ve sarf malzemesi maliyetleri bazı ortamlarda bu sürecin kullanımını sınırlamak olacaktır. Bu durumda ise, biz test numunesinin doğası bu (örneğin, sentetik peptidler) için uygun ise, uç-tabanlı seri seyreltileri, her zaman DMSO içinde gerçekleştirilir önerilir. Numuneler (DMSO ile tedavi edilemez ise, örneğin,PEG&#39;lenmiş peptidleri) gücü verileri yorumlanırken daha önce tamamen adsorpsiyonu 1 engellemez BSA artan konsantrasyonlarda bile dahil göstermiştir çünkü dikkatli kullanılmalıdır. Akustik, uç-az transferi genellikle hayvan veya insan biyolojik örnekler için olduğu gibi örnek / sonlu kıt ise esastır tahlil miniaturization ilişkin ek faydalar vardır ve biz daha önce giden hayvan örneklerinin hacminin azaltılması için potansiyel tanımlamışlardır çalışmanın 1 başına daha az hayvanlar için bir gereklilik. Peptidler biyolojik örnekler ve bu şekilde ele alınması gerektiğini hatırlamak önemlidir; kendi bütünlüğü tekrar donma-erime döngülerinden muhafaza edilmesi amacıyla kaçınılmalıdır. Biyolojik yeni terapötiklerin hızla büyüyen bir alandır, ve peptidlerin hazırlanması için otomatik yüksek verimli bir yöntem kolayca yeniden birleştirici proteinler ve antikorlar da dahil olmak üzere diğer biyolojik maddeler de uygulanabilir.

GLP-1 R tip 2 diyabet 2 tedavisinde kurulu bir ilacın bir hedeftir. Bu reseptör için yerli peptit agonisti, GLP-1, 2-3 dakika 3 bir in vivo yarı-ömrü vardır. adenilil siklaz aktivasyonuna doğal G protein bağlanması yoluyla ikinci haberci cAMP&#39;nin alt üretimindeki G protein bağlı hedef reseptör sonuçlarına GLP-1 bağlanması. biriken cAMP ölçümü sağlam bir tahlil reseptör aktivasyonunun izlemek ve tercih edilen bir fiziko-kimyasal özellikleri, aktif GLP-1 analogları taranması için içerir. Böyle bir deney, konsantrasyon-tepki eğrilerini oluşturmak için test numunelerinin seri seyreltme gerektirir ve peptid örnekleri teslim Bu, özellikle karmaşıktır. Ucu tabanlı seri seyreltme hazırlanmasından potansiyel hatalar, daha önce 1,4,5 tarif edilmiştir. Peptidler güvenilmez potens tahminlerinde sonuçlanan plasticware yapışır. Peptit kaybı t yoluyla minimize edilebilirO sığır serum tamponlarda albümini (BSA) ve silikonlu plasticware kullanımı, ama bağlayıcı proteinin eklenmesi düzensiz kalmaktadır. Özel olarak, deney kaplarına GLP-1 bağlanması değişim 6 tarif edilmiştir. Sulu tahlil tampon içine ipuçları ve mikrotiter plakaları liç ve protein fonksiyonu 7, 8 engelleyebilir laboratuvar plasticware kullanılan bu istikrar ajanlar daha da komplikasyon var. Bu nedenle, yöntemler plasticware maruziyeti azaltmak için ölçümlerin doğruluğunu artırmak için gereklidir. Akustik Sıvı dağıtıcıları bitişik tahlil plaka 9 içinde hassas nanolitre damlacıklarının ejeksiyon sonuçlanan bir sıvı numunesinin yüzeyi üzerine, yüksek frekanslı akustik sinyal odaklanır. Akustik ejeksiyon kullanımı hazırlanması ve büyük sentetik bileşik kütüphanelerinin taranması için ilaç endüstrisinde standart ve teknoloji de küçük Moleküller için valide edilmiştires 10. Bildiğimiz kadarıyla, rekombinant ve sentetik peptidlerin hazırlanması için akustik dağıtılmasını tanımlamak için birinci grup ve daha önce bilinen ucu tabanlı yöntem 1 ile karşılaştırıldığında geliştirilmiş doğruluk bildirmiştir. Bu makalede, bir tam otomatik plaka taşıma robotik sistem üzerine temassız akustik transferi ile peptid seri ve direkt dilüsyonları hazırlanması entegrasyonunu anlatmaktadır. Örneklerin akustik transfer kapsayan bir dizi yöntem, daha önce, 11 tarif edilmiştir. Bu, iki aşamalı bir yöntem, ara stok konsantrasyonları hazırlamak için ve seri olarak tam doz-tepki eğrisi oluşturacak şekilde peptit analoglarını seyreltmek için kullanmaktadır. hazırlanan peptidler, hedef hücreler, fare GLP-1R ifade ile inkübe edilir, ve peptid agonisti activ bir okuma olarak, bu hücreler içinde, cAMP birikiminin ölçülmesi için ticari olarak elde edilebilen homojen zaman çözümlü bir fluoresans (HTRF) deneyi kullanımıSığ. Deney sağlam ve yüksek verimli bir 384-gözlü formata müsait ve rutin olarak, her iki deney geliştirme tatbik edildi ve ilaç tarama 12 çıkıntı olan.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1339">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">Hanks&#8217; Balanced Salt solution</td>
			<td style="width:235px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H8264</td>
			<td style="width:517px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">HEPES</td>
			<td style="width:235px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:235px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">3-Isobutyl-1-methylxanthine</td>
			<td style="width:235px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">I7018</td>
			<td>Prepared as a 0.5 M stock in DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">GLP-1 (7-36) amide</td>
			<td style="width:235px;">Bachem</td>
			<td>H-6795</td>
			<td>Prepared as a 1 mg/ml stock in PBS, referred to as &#39;100X reference control&#39;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">Test peptides</td>
			<td style="width:235px;">Produced in-house at MedImmune</td>
			<td></td>
			<td>Supplied at various concentrations in DMSO or PBS as appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">100X peptide stock</td>
			<td style="width:235px;">Produced in-house at MedImmune</td>
			<td></td>
			<td>Test peptide diluted into assay buffer to 100X final required concentration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td style="width:235px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">Cedex XS Cell Analyzer</td>
			<td style="width:235px;">Innovatis</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">Corning 384 well plates, low volume</td>
			<td style="width:235px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">4514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">Echo Qualified 384-Well Polypropylene Microplate</td>
			<td style="width:235px;">Labcyte Inc.</td>
			<td style="width:119px;">P-05525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">Echo Qualified Reservoir</td>
			<td style="width:235px;">Labcyte Inc.</td>
			<td style="width:119px;">ER-0055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">Echo 550 Liquid Handler</td>
			<td style="width:235px;">Labcyte Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Droplet transfer volumes in increments of 2.5 nl</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">Echo 525 Liquid Handler</td>
			<td style="width:235px;">Labcyte Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Droplet transfer volumes in increments of 25 nl</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">ACell Benchtop Automation&#160;</td>
			<td style="width:235px;">HighRes Biosolutions</td>
			<td style="width:119px;">MC522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">Cellario Lab Automation Scheduling software for Life Science Robotics</td>
			<td style="width:235px;">HighRes Biosolutions</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">MultidropCombi Reagent Dispenser</td>
			<td style="width:235px;">ThermFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">5840300</td>
			<td>Referred to as &#39;bulk reagent dispenser&#39;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">HTRF cAMP Dynamic 2 kit</td>
			<td style="width:235px;">Cisbio Bioassays</td>
			<td style="width:119px;">62AM4PEJ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">EnVision Multilabel Reader</td>
			<td style="width:235px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated acoustic dispensing for the serial dilution of peptide agonists in potency determination assays

küçük moleküllü ilaç keşfi olduğu gibi, peptid agonistleri için eleme konsantrasyon-tepki eğrileri elde etmek peptidlerin seri seyreltme gerektirir. peptidler Tarama geleneksel uç tabanlı numune alma yöntemleri adsorpsiyon yoluyla peptid kaybı için artan bir fırsat sağlayarak, plasticware geniş bir yüzey alanına peptidler maruz olarak karmaşıklık ek bir katman tanıyor. Plasticware aşırı maruz kalma önlenmesi plastik bağlılık yoluyla peptid kaybını azaltır ve böylece gücü tahmininde yanlışlıklar en aza indirir, ve biz daha önce peptid agonistleri 1 in vitro yüksek verimli tarama için dağıtım temassız akustik faydalarını tarif var. Burada fare glukagon benzeri peptit-1 reseptörü (GLP-1 R) peptit agonistlerinin taranmasında örnek kullanılarak mikrotiter plakalarında peptid seri dilüsyonları temassız akustik hazırlanması için bir tam entegre bir otomasyon çözümü tartışılmıştır. Bizim yöntemler yüksek izin-throughput agonistlerinin taranmasında da tahlilleri hücre bazlı ve kolay bir şekilde yüksek bir numune test etme desteklemek için, ya da (daha fazla hedef hücre çizgilerinin bir panel için, örneğin) deney plakası kopya sayısında artış sağlamak için büyütülebilir.

<html> Biz rutin akustik havalesiyle peptidler sulandırmak için iki adımlı bir yöntemini kullanın. İlk adımda, otomasyon ile uyumlu bir akustik dağıtıcı iki kaynak plakalar arasındaki dört stok peptid ara dilüsyonları oluşturmak için kullanılır (Şekil 1a, b). İkinci adım olarak, biz daha fazla her test peptid (Şekil 1c) için 11 maddelik konsantrasyon aralığı oluşturmak için kaynak plakaları A ve B hisse senedi dilüsyonları sulandırmak için bir akustik dağıtıcı kullanın. Her bir peptid konsantrasyon aralığı 16 farklı peptit 384 gözlü esey plâkasının (Şekil 1c) göre taranır sağlayan, bir deney plakası soldan sağa doğru, iki kopya halinde harekete geçirilir. Tahlil tamponu dolgu deney plakası (Şekil 1d) üzerinde oyuk başına sabit bir hacim sağlamak üzere gerçekleştirilir. Referans peptid pozitif kontrolleri de maksimum etkili konsantrasyonda hedef plakalarına aktarılır. ent. &quot;fo: keep-together.within sayfa =&quot; 1 &quot;&gt; Plakalar gösterilmiştir (Şekil 2a) bir floresan plaka okuyucu ve iki nüsha halinde 16 peptitler içeren bir örnek plaka için bir ısı haritası ile okunduğunda cAMP birikimi tahlil kullanılan (mor olarak gösterilir), bir ters çevrilmiş bir rekabet deneyi, bu şekilde düşük değerler veri konsantrasyon-yanıt eğrileri ile ifade edilir, yinelenen nokta tekrarlanabilirliği belirgindir cAMP. yüksek bir konsantrasyon temsil (Şekil 2b). örnek 1 (A sırası, Şekil 2a) deney için pozitif kontrol etmektedir. Örnekler 2, 3 ve 4 (satırlar B, C ve sırasıyla, D, Şekil 2a) aktif olmayan ve Şekil 2b&#39;de, düz çizgiler eşit. Örnekler 5-16 (P sıraları e) bir etkin temsil Test peptidler. yöntemi, geniş bir etki gücü aralığında tam konsantrasyon-tepki eğrilerinin oluşturulması için izin verir. tüm iş akışını ayrıntılı bir Akış Şeması gösterilir <strong&gt; Şekil 3. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54542/54542fig1.jpg" /> Şekil 1:. Seri seyreltme yöntemi dağıtım akustik Plaka Düzenleri açıklaması. (A, b) 384 kaynağı plakalar bir Düzen ve dolgu için, 100 x pozitif kontrol, deney tamponu sadece oyuklara (kaynak plaka başına mümkün olan 80 peptidleri ile örnek) her bir peptidin 100x stok konsantrasyonu 25 ul ihtiva eden B ve üç 1: hem kaynak plakaları arasındaki otomatik akustik transferi ve dolgu tarafından hazırlanan her peptit 100 seri seyreltme. (C) Tek bir deney plakası düzeni plaka üzerinde iki kez 16 peptidler için 11 noktalı konsantrasyon aralığını gösteren. (D), 10 | il son deney hacminde, 11 noktalı bir konsantrasyon aralığı için tipik dağıtma protokolü. Tüm hedef kuyuları sabit nihai devir vo sağlamak için bir tahlil tampon dolgu var<html> 100 nl per ve lume iyi. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54542/54542fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54542/54542fig2.jpg" /> Şekil 2: ısı haritası ve doz-yanıt eğrileri A665 nm&#39;de floresans gösteren ısı haritası.. Plaka boyunca iki nüsha halinde 16 peptidler (a) 11-noktalı konsantrasyon aralığı. Menekşe cAMP (max) yüksek bir konsantrasyonu belirtir kırmızı cAMP (min), düşük bir konsantrasyonu belirtir. (B) hücreleri (16 bileşikleri) ifade fare GLP-1R karşı GLP-1 reseptör agonisti peptid bir dizi etkinlik gösteren tek bir plaka tahlil Temsilcisi peptit konsantrasyon-cevap eğrileri. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54542/54542fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> içerik &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54542/54542fig3.jpg" /> Şekil 3:.. Bütün iş akışının tarama süreci Detay Akış Şeması <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54542/54542fig3large.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Automated Acoustic Dispensing for the Serial Dilution of Peptide Agonists in Potency Determination Assays at JoVE.com

Automated Acoustic Dispensing for the Serial Dilution of Peptide Agonists in Potency Determination Assays

Peptide adsorption to plasticware during traditional tip-based serial dilutions can significantly impact potency determination and confound the understanding of structure-activity relationships used for lead identification and lead optimization phases of drug discovery. Here methods for automated acoustic non-contact serial dilution of peptide samples are described.

Etkili belirlenmesi tahlillerinde Peptit Agonistlerinin seri Seyreltme için Dağıtım Otomatik Akustik

As with small molecule drug discovery, screening for peptide agonists requires the serial dilution of peptides to produce concentration-response curves. ...

automated-acoustic-dispensing-for-serial-dilution-peptide-agonists

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

7.6K Görüntüleme.  MedImmune. Peptide adsorption to plasticware during traditional tip-based serial dilutions can significantly impact potency determination and confound the understanding of structure-activity relationships used for lead identification and lead optimization phases of drug discovery. Here methods for automated acoustic non-contact serial dilution of peptide samples are described. 

Video: Automated Acoustic Dispensing for the Serial Dilution of Peptide Agonists in Potency Determination Assays

Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography

Membrane proteins (MPs) are essential components of cellular membranes and primary drug targets. Rational drug design relies on precise structural information, typically obtained by crystallography; however MPs are difficult to crystallize. Recent progress in MP structural determination has benefited greatly from the development of lipidic cubic phase (LCP) crystallization methods, which typically yield well-diffracting, but often small crystals that suffer from radiation damage during traditional crystallographic data collection at synchrotron sources. The development of new-generation X-ray free-electron laser (XFEL) sources that produce extremely bright femtosecond pulses has enabled room temperature data collection from microcrystals with no or negligible radiation damage. Our recent efforts in combining LCP technology with serial femtosecond crystallography (LCP-SFX) have resulted in high-resolution structures of several human G protein-coupled receptors, which represent a notoriously difficult target for structure determination. In the LCP-SFX technique, LCP is recruited as a matrix for both growth and delivery of MP microcrystals to the intersection of the injector stream with an XFEL beam for crystallographic data collection. It has been demonstrated that LCP-SFX can substantially improve the diffraction resolution when only sub-10 &#181;m crystals are available, or when the use of smaller crystals at room temperature can overcome various problems associated with larger cryocooled crystals, such as accumulation of defects, high mosaicity and cryocooling artifacts. Future advancements in X-ray sources and detector technologies should make serial crystallography highly attractive and practicable for implementation not only at XFELs, but also at more accessible synchrotron beamlines. Here we present detailed visual protocols for the preparation, characterization and delivery of microcrystals in LCP for serial crystallography experiments. These protocols include methods for conducting crystallization experiments in syringes, detecting and characterizing the crystal samples, optimizing crystal density, loading microcrystal laden LCP into the injector device and delivering the sample to the beam for data collection.

We describe procedures for the preparation and delivery of membrane protein microcrystals in lipidic cubic phase for serial crystallography at X-ray free-electron lasers and synchrotron sources. These protocols can also be applied for incorporation and delivery of soluble protein microcrystals, leading to substantially reduced sample consumption compared to liquid injection.

Hazırlık ve Seri Femtosecond Kristalografi için lipidik Cubic Faz Protein mikro kristallerinin teslimi

Membrane proteins (MPs) are essential components of cellular membranes and primary drug targets. Rational drug design relies on precise structural ...

Biyokimya

Automated Protocols for Macromolecular Crystallization at the MRC Laboratory of Molecular Biology

When high quality crystals are obtained that diffract X-rays, the crystal structure may be solved at near atomic resolution. The conditions to crystallize proteins, DNAs, RNAs, and their complexes can however not be predicted. Employing a broad variety of conditions is a way to increase the yield of quality diffraction crystals. Two fully automated systems have been developed at the MRC Laboratory of Molecular Biology (Cambridge, England, MRC-LMB) that facilitate crystallization screening against 1,920 initial conditions by vapor diffusion in nanoliter droplets. Semi-automated protocols have also been developed to optimize conditions by changing the concentrations of reagents, the pH, or by introducing additives that potentially enhance properties of the resulting crystals. All the corresponding protocols will be described in detail and briefly discussed. Taken together, they enable convenient and highly efficient macromolecular crystallization in a multi-user facility, while giving the users control over key parameters of their experiments.

Automated systems and protocols for the routine preparation of a large number of screens and nanoliter crystallization droplets for vapor diffusion experiments are described and discussed.

MRC Laboratuvarı moleküler biyolojinin makromoleküllerin kristalizasyon için protokolleri otomatik

When high quality crystals are obtained that diffract X-rays, the crystal structure may be solved at near atomic resolution. The conditions to crystallize ...

Easy Manipulation of Architectures in Protein-based Hydrogels for Cell Culture Applications

Hydrogels are recognized as promising materials for cell culture applications due to their ability to provide highly hydrated cell environments. The field of 3D templates is rising due to the potential resemblance of those materials to the natural extracellular matrix. Protein-based hydrogels are particularly promising because they can easily be functionalized and can achieve defined structures with adjustable physicochemical properties. However, the production of macroporous 3D templates for cell culture applications using natural materials is often limited by their weaker mechanical properties compared to those of synthetic materials. Here, different methods were evaluated to produce macroporous bovine serum albumin (BSA)-based hydrogel systems, with adjustable pore sizes in the range of 10 to 70 &#181;m in radius. Furthermore, a method to generate channels in this protein-based material that are several hundred microns long was established. The different methods to produce pores, as well as the influence of pore size on material properties such as swelling ratio, pH, temperature stability, and enzymatic degradation behavior, were analyzed. Pore sizes were investigated in the native, swollen state of the hydrogels using confocal laser scanning microscopy. The feasibility for cell culture applications was evaluated using a cell-adhesive RGD peptide modification of the protein system and two model cell lines: human breast cancer cells (A549) and adenocarcinomic human alveolar basal epithelial cells (MCF7).

Different methods to manipulate three-dimensional architecture in protein-based hydrogels are evaluated here with respect to material properties. The macroporous networks are functionalized with a cell-adhesive peptide, and their feasibility in cell culture is evaluated using two different model cell lines.

Protein bazlı Hydrogels mimarilerde kolayca idare hücre kültür uygulamaları için

Hydrogels are recognized as promising materials for cell culture applications due to their ability to provide highly hydrated cell environments. The field ...

Analysis of Histone Antibody Specificity with Peptide Microarrays

Post-translational modifications (PTMs) on histone proteins are widely studied for their roles in regulating chromatin structure and gene expression. The mass production and distribution of antibodies specific to histone PTMs has greatly facilitated research on these marks. As histone PTM antibodies are key reagents for many chromatin biochemistry applications, rigorous analysis of antibody specificity is necessary for accurate data interpretation and continued progress in the field. This protocol describes an integrated pipeline for the design, fabrication and use of peptide microarrays for profiling the specificity of histone antibodies. The design and analysis aspects of this procedure are facilitated by ArrayNinja, an open-source and interactive software package we recently developed to streamline the customization of microarray print formats. This pipeline has been used to screen a large number of commercially available and widely used histone PTM antibodies, and data generated from these experiments are freely available through an online and expanding Histone Antibody Specificity Database. Beyond histones, the general methodology described herein can be applied broadly to the analysis of PTM-specific antibodies.

This manuscript describes methods for applying peptide microarray technology to specificity profiling of antibodies that recognize histones and their post-translational modifications.

Histon Antikor Özgüllüğünün Peptit Mikroarraylerle Analizi

Post-translational modifications (PTMs) on histone proteins are widely studied for their roles in regulating chromatin structure and gene expression. The ...

Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for peptide affinity reagent discovery for recognition of both biotic and abiotic targets. Peptide affinity reagents can be used for similar applications to antibodies, including sensing and therapeutics, but are more robust and able to perform in more extreme environments. Specific enrichment of peptide capture agents to a protein target of interest is enhanced using semi-automated sorting methods which improve binding and wash steps and therefore decrease the occurrence of false positive binders. A semi-automated sorting method is described herein for use with a commercial automated magnetic-activated cell sorting device with an unconstrained bacterial display sorting library expressing random 15-mer peptides. With slight modifications, these methods are extendable to other automated devices, other sorting libraries, and other organisms. A primary goal of this work is to provide a comprehensive methodology and expound the thought process applied in analyzing and minimizing the resulting pool of candidates. These techniques include analysis of on-cell binding using fluorescence-activated cell sorting (FACS), to assess affinity and specificity during sorting and in comparing individual candidates, and the analysis of peptide sequences to identify trends and consensus sequences for understanding and potentially improving the affinity to and specificity for the target of interest.

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for discovery of peptide affinity reagents, a robust alternative to antibodies. The semi-automated sorting method herein has streamlined biopanning to decrease the occurrence of false positives. Here we illustrate the thought process and techniques applied in evaluating candidates and minimizing downstream analysis.

Peptid benzeşme reaktif keşif ve elde edilen yalıtır analizi için bakteriyel ekran kütüphanelerin yarı otomatik Biopanning

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for peptide affinity reagent discovery for recognition of both biotic and abiotic targets. ...

Determination of the Glycogen Content in Cyanobacteria

Cyanobacteria accumulate glycogen as a major intracellular carbon and energy storage&#160;during photosynthesis. Recent developments in research have highlighted complex mechanisms of glycogen metabolism, including the diel cycle of biosynthesis and catabolism, redox regulation, and the involvement of non-coding RNA. At the same time, efforts are being made to redirect carbon from glycogen to desirable products in genetically engineered cyanobacteria to enhance product yields. Several methods are used to determine the glycogen contents in cyanobacteria, with variable accuracies and technical complexities. Here, we provide a detailed protocol for the reliable determination of the glycogen content in cyanobacteria that can be performed in a standard life science laboratory. The protocol entails the selective precipitation of glycogen from the cell lysate and the enzymatic depolymerization of glycogen to generate glucose monomers, which are detected by a glucose oxidase-peroxidase (GOD-POD) enzyme coupled assay. The method has been applied to Synechocystis sp. PCC 6803 and Synechococcus sp. PCC 7002, two model cyanobacterial species that are widely used in metabolic engineering. Moreover, the method successfully showed differences in the glycogen contents between the wildtype and mutants defective in regulatory elements or glycogen biosynthetic genes.

Here, we present a reliable and easy assay to measure the glycogen content in cyanobacterial cells. The procedure entails precipitation, selectable depolymerization, and the detection of glucose residues. This method is suitable for both wildtype and genetically engineered strains and can facilitate the metabolic engineering of cyanobacteria.

Siyanobakterlerde Glikojen İçeriğinin Belirlenmesi

Cyanobacteria accumulate glycogen as a major intracellular carbon and energy storage&#160;during photosynthesis. Recent developments in research have ...

Personalized Peptide Arrays for Detection of HLA Alloantibodies in Organ Transplantation

In organ transplantation, the function and longevity of the graft critically rely on the success of controlling immunological rejection reactivity against human leukocyte antigens (HLA). Histocompatibility guidelines are based on laboratory tests of anti-HLA immunity, which presents either as pre-existing or de novo generated HLA antibodies that constitute a major transplantation barrier. Current tests are built on a single-antigen beads (SAB) platform using a fixed set of ~100 preselected recombinant HLA antigens to probe transplant sera. However, in humans there exist a far greater variety of HLA types, with no two individuals other than identical twins who can share the same combination of HLA sequences. While advanced technologies for HLA typing and direct sequencing can precisely capture any mismatches in DNA sequence between a donor's and recipient's HLA, the SAB assay, due to its limited variety in sequence representation, is unable to precisely detect alloantibodies specifically against the donor HLA mismatches. We sought to develop a complementary method using a different technology to detect and characterize anti-donor HLA antibodies on a personalized basis. The screening tool is a custom peptide array of donor HLA-derived sequences for probing post-transplant sera of the organ recipient to assess the risk for antibody-mediated rejection. On a single array for one donor-recipient pair, up to 600 unique peptides are made based on the donor's HLA protein sequences, each peptide carrying at least one mismatched residue in a 15-amino acid sequence. In our pilot experiments to compare antigen patterns for pre- and post-transplant sera on these arrays, we were able to detect anti-HLA signals with the resolution that also allowed us to pinpoint the immune epitopes involved. These personalized antigen arrays allow high-resolution detection of donor-specific HLA epitopes in organ transplantation.

Mismatches in human leukocyte antigen (HLA) sequences between organ donor and recipient pairs are the major cause of antibody-mediated rejection in organ transplantation. Here we present the use of custom antigen arrays that are based on individual donors' HLA sequences to probe anti-donor HLA alloantibodies in organ recipients.

Peptid diziler HLA Alloantibodies Organ nakli olarak algılanması için kişiselleştirilmiş

In organ transplantation, the function and longevity of the graft critically rely on the success of controlling immunological rejection reactivity against ...

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

The automated crystallization device is a patented technique1 especially developed for monitoring protein crystallization experiments with the aim to precisely maneuver the nucleation and crystal growth towards desired sizes of protein crystals. The controlled crystallization is based on sample investigation with in situ Dynamic Light Scattering (DLS) while all visual changes in the droplet are monitored online with the help of a microscope coupled to a CCD camera, thus enabling a full investigation of the protein droplet during all stages of crystallization. The use of in situ DLS measurements throughout the entire experiment allows a precise identification of the highly supersaturated protein solution transitioning to a new phase &#8211; the formation of crystal nuclei. By identifying the protein nucleation stage, the crystallization can be optimized from large protein crystals to the production of protein microcrystals. The experimental protocol shows an interactive crystallization approach based on precise automated steps such as precipitant addition, water evaporation for inducing high supersaturation, and sample dilution for slowing induced homogeneous nucleation or reversing phase transitions.

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Here we present a protocol for controlled production of protein microcrystals. The process uses an automated device allowing controlled manipulation of several crystallization parameters. The protein crystallization is carried-out by controlled and automated addition of crystallization solutions while monitoring and investigating the radius distribution of particles in the crystallization droplet.

Situ dinamik ışık saçılma ile birleştiğinde kristalizasyon büyüyen Protein kristalleri kullanarak farklı boyutları ile otomatik

The automated crystallization device is a patented technique1 especially developed for monitoring protein crystallization experiments with the aim to ...

Enabling Real-Time Compensation in Fast Photochemical Oxidations of Proteins for the Determination of Protein Topography Changes

Fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) is a mass spectrometry-based structural biology technique that probes the solvent-accessible surface area of proteins. This technique relies on the reaction of amino acid side chains with hydroxyl radicals freely diffusing in solution. FPOP generates these radicals in situ by laser photolysis of hydrogen peroxide, creating a burst of hydroxyl radicals that is depleted on the order of a microsecond. When these hydroxyl radicals react with a solvent-accessible amino acid side chain, the reaction products exhibit a mass shift that can be measured and quantified by mass spectrometry. Since the rate of reaction of an amino acid depends in part on the average solvent accessible surface of that amino acid, measured changes in the amount of oxidation of a given region of a protein can be directly correlated to changes in the solvent accessibility of that region between different conformations (e.g., ligand-bound versus ligand-free, monomer vs. aggregate, etc.) FPOP has been applied in a number of problems in biology, including protein-protein interactions, protein conformational changes, and protein-ligand binding. As the available concentration of hydroxyl radicals varies based on many experimental conditions in the FPOP experiment, it is important to monitor the effective radical dose to which the protein analyte is exposed. This monitoring is efficiently achieved by incorporating an inline dosimeter to measure the signal from the FPOP reaction, with laser fluence adjusted in real-time to achieve the desired amount of oxidation. With this compensation, changes in protein topography reflecting conformational changes, ligand-binding surfaces, and/or protein-protein interaction interfaces can be determined in heterogeneous samples using relatively low sample amounts.

Fast photochemical oxidation of proteins is an emerging technique for the structural characterization of proteins. Different solvent additives and ligands have varied hydroxyl radical scavenging properties. To compare the protein structure in different conditions, real-time compensation of hydroxyl radicals generated in the reaction is required to normalize reaction conditions.

Protein Topografya Değişikliklerinin Belirlenmesinde Proteinlerin Hızlı Fotokimyasal Oksidasyonlarında Gerçek Zamanlı Telafinin Sağlanması

Fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) is a mass spectrometry-based structural biology technique that probes the solvent-accessible surface area ...

Optimizing the Growth of Endothiapepsin Crystals for Serial Crystallography Experiments

Here, a protocol is presented to facilitate the creation of large volumes (&#62; 100 &#181;L) of micro-crystalline slurries suitable for serial crystallography experiments at both synchrotrons and XFELs. The method is based upon an understanding of the protein crystal phase diagram, and how that knowledge can be utilized. The method is divided into three stages: (1) optimizing crystal morphology, (2) transitioning to batch, and (3) scaling. Stage 1 involves finding well diffracting, single crystals, hopefully but not necessarily, presenting in a cube-like morphology. In Stage 2, the Stage 1 condition is optimized by crystal growth time. This strategy can transform crystals grown by vapor diffusion to batch. Once crystal growth can occur within approximately 24 h, a morphogram of the protein and precipitant mixture can be plotted and used as the basis for a scaling strategy (Stage 3). When crystals can be grown in batch, scaling can be attempted, and the crystal size and concentration optimized as the volume is increased. Endothiapepsin has been used as a demonstration protein for this protocol. Some of the decisions presented are specific to endothiapepsin. However, it is hoped that the way they have been applied will inspire a way of thinking about this procedure that others can adapt to their own projects.

The aim of this article is to give the viewer a solid understanding of how to transform their small-volume, vapor-diffusion protocol, for growing large, single protein crystals, into a large-volume batch micro-crystallization method for serial crystallography.