This work was supported by awards from the National Institutes of Health, National Heart, Lung and Blood Institute to K.C.V. HL128996, HL113039, and HL116263. This work was also supported by awards from the American Heart Association to K.C.V. CSA2066001, D.L.M POST26630003, and R.M.A. POST25710170.

1. HDL saflaştırma (~ 5.5 gün) <ol><li> Yoğunluk-Gradient Ultrasantrifügasyon (DGUC, ~ 5 gün) <ol><li> Taze toplardamar kanından izole plazma 9 ml 100x, anti-oksidanlar, 90 uL ekleyin. </li><li> Aşama 1.1.1 (0,0278 g / ml KBr plazma) plazma 9 mL 0.251 gr KBr eklenerek 1.025 g / mL, 1.006 g / ml arasında KBr plazma yoğunluğunu ayarlar. tüm tuz, oda sıcaklığında çözülür ve tüpler ultrasantrifüjdeki ve tüm kabarcıklar üste çıkar sağlamak transfer edilene kadar plazma sallayın. </li><li> Bend ucundan 90 ° 1 cm 18 G iğne ucu, konik tarafı yukarı bakacak. Bir şırınga ve 18-gauge iğne kullanılarak, dikkatli bir plazma (Tablo 1) üzerinde bindirme çözüm # 1 3 mL yerleştirin. NOT: bükük iğne tüm VLDL / IDL, LDL sağlar ve HDL kalıbı ile karışmadan kaldırılır. </li><li> tüp ve dikkatli bir şekild üstüne menisküs 3 mm boşluk - 2 bırakarak üstünde kabarcıklar çoğunluğu, kaldırLly SW-40Ti kova tüpleri yerleştirin. </li><li> dengesine (kapakları) her kova tartılır ve tam tersi kova (kova + kapak) ile denge: # 5 ve # 3 # 6 # 4, # 2 # 1. NOT: Bu kovalar dengeli ve her zaman uyumlu olması gerekir. </li><li> (Malzeme Listesi) ultrasantrifüjdeki rotor yerleştirin. bir # 4, ara fren 4 ° C&#39;de 24 saat boyunca 274.400 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Dikkatle kovalar rotor kova ve tüpler kaldırın. </li><li> Dikkatli bir şırınga ve bükülmüş iğne kullanarak bindirmenin üst tabakadan 2 mL çıkarın. Bu 4 ° C&#39;de saklanabilir VLDL / IDL kısmını oluşturmaktadır ° C veya -80 ° C. </li><li> VLDL / IDL fraksiyonu çıkardıktan sonra, numune (plazma) kalan 7 mL toplamak ve bir 15 ml konik tüp içine yerleştirin. Bindirme çözüm # 2 (Tablo 1) ile 9 mL numune hacmi getirin. </li><li> 1.080 g 1.025 g / ml örnek yoğunluğunu ayarlayın / KBr ile ml kullanarak9 ml numune ya da 0,0828 g yaklaşık 0.746 gr KBr / numunenin ml KBr. Tüm KBr (yaklaşık 20 dakika) içinde çözülür ve sağlanması kabarcıklar üstüne yükselir ise tüp ultrasantrifüjdeki aktarmak kadar yavaşça örnek sallayın. </li><li> Şırınga ve iğne ile, dikkatli bir şekilde örnek (Tablo 1) bindirme çözeltisi 3. 3 mL yerleştirin. tüpün üstüne menisküs 3 mm boşluk - 2 bırakın. </li><li> tüpün üst kısmında kalan kabarcıkların çoğunluğu kaldırmak ve dikkatle SW-40Ti kova dolu ultrasantrifüjdeki tüpleri yerleştirin. </li><li> dengesine (kapakları) her kova tartılır ve tam 1.1.5 gibi, karşıt kova + kapaklı denge. </li><li> ultrasantrifüjdeki Rotoru yerleştirin (Malzeme listesi bakınız). bir # 4, ara fren 4 ° C&#39;de 24 saat boyunca 274.400 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Dikkatle kovalar rotor kova ve tüpler kaldırın. </li><li> Dikkatle bir şırınga kullanarak bindirmenin üst tabakadan 2 mL çıkarın ve olmaknt iğne. Bu 4 ° C&#39;de saklanabilir LDL fraksiyonu olacaktır ° C veya -80 ° C. </li><li> LDL fraksiyonu çıkardıktan sonra, numune (plazma) kalan yaklaşık 7 ml toplamak ve yeni bir 15 ml konik tüp içine yerleştirin. 1.080 g / ml solüsyon # 4 (Tablo 1) 9 mL kadar örneği (plazma) hacminin getirin. </li><li> 1.30 g 1,080 g / ml örnek yoğunluğunu ayarlayın / KBr örneğin her mL için KBr 9 mL örnek (plazma) içinde 3.33 g KBr kullanarak ya da 0.37 g ml. Kaya veya hafifçe tüm KBr (tuz) eriyene kadar numuneyi ajitasyon ve tüp ultrasantrifüjdeki aktarın. </li><li> Şırınga ve iğne ile, dikkatli bir şekilde örnek (Tablo 1) bindirme çözeltisi 5. 3 mL yerleştirin. </li><li> tüpün üstüne menisküs 2- 3 mm boşluk bırakarak, tüpün üstünde kalan kabarcıkların çoğunluğu kaldırmak ve dikkatle SW-40Ti kova dolu ultrasantrifüjdeki tüpleri yerleştirin. </li><li> (Her kova tartılırdenge üzerine kapaklar), ve tam ile 1.1.5 gibi karşıt kova + kapaklı denge. </li><li> ultrasantrifüjdeki Rotoru yerleştirin (Malzeme listesi bakınız). Bir 4. fren 4 ° C &#39;de 48 saat boyunca 274.400 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Dikkatle kovalar rotor kova ve tüpler kaldırın. </li><li> Dikkatli bir şırınga ve bükülmüş iğne kullanılarak bindirme üst tabakasının yaklaşık 2 mL çıkarın. Bu, 4 ° C ya da -80 ° C&#39;de muhafaza edilebilir HDL fraksiyonu vardır. NOT: DGUC HDL ardından yüksek tuz çözüm kaldırmak için diyalize edilebilir. </li><li> kapalı bir diyaliz kovanı (10.000 mw cut-off) toplanan HDL fraksiyonu koyun ve 1 L 1x PBS gecede dialyze, diyaliz. Değişim diyaliz tamponu (1x PBS) 24 saat boyunca 3 kez. Manyetik bir karıştırma-bar ile PBS nazik pertürbasyon diyaliz artıracaktır. </li><li> Bir BCA yöntemi 8 kullanarak DGUC-HDL protein konsantrasyonu belirleyin. </li></ol></li><li> Hızlı protein sıvı chromatography (FPLC) ya da boyut-dışlama kromatografisi (~ 6 saat) <ol><li> 0.22 mikron mikro santrifüj filtre ile 500 mcL DGUC-HDL (toplam protein) 1.2 mg Filtre enjeksiyondan hemen önce, (Malzeme listesi bakınız). Not: 0.22 um&#39;lik bir filtreden önce 0.45 um mikro santrifüj filtre ile DGUC HDL numunenin ilave filtreleme Bazı örnekler için gerekli olabilir. </li><li> , Süzülmüş DGUC-HDL örnek toplamak FPLC (dolgu) enjeksiyon şırınga yükleyin ve şırınga hiçbir kabarcıklar FPLC içine enjekte önce olmamasına dikkat edin. </li><li> 2.6 MPa bir basınç sınırı 0.3 mL / dak FPLC akış hızını ayarlayın. enjeksiyon örnek önce tampon 0.2 kolon hacmi (yaklaşık 15 mL) ile sütun dengelenmesi. FPLC (enjeksiyon döngü mü?) Aracı haline tampon 3 mL numune enjekte edilir ve çalışma başlatmak. 72 fraksiyonların toplam 1.5 ml&#39;lik kesirleri toplayın. </li></ol></li></ol> 2. Yüksek verim Küçük RNAArdışık (sRNAseq, ~ 9 gün) <ol><li> RNA İzolasyon (~ 1 gün) <ol><li> üreticinin talimatlarına uygun olarak kolorimetrik bir kit kullanılarak total kolesterol seviyelerinin belirlenmesiyle DGUC HDL tekabül FPLC fraksiyonlar tanımlar. DGUC-HDL içeren 7 FPLC kesirler - Bu FPLC set-up kullanarak, 6 bulmak için bekliyoruz. </li><li> DGUC HDL FPLC fraksiyonlardan tüm hacmi (yaklaşık 8 -1 0 ml Havuz 1.45 mL fraksiyonunun hacim) toplayın ve kullanılarak konsantre 10 kDa mw kesim santrifüj filtre üniteleri, 1 saat boyunca 4000 x g&#39;de, 4 ° C&#39;de veya HDL konsantre kadar yaklaşık 100 ml. </li><li> HDL konsantre toplayın ve BCA yöntemi 8 kullanarak HDL total protein konsantrasyonu ölçmek. </li><li> kümesindeki her örnekten aliquoted edilebilir en fazla 1 mg HDL toplam proteinin en yüksek konsantrasyon, belirleyin. Örneğin, her bir örnek için, HDL toplam proteinin aynı miktarda RNA izole eder. </li><li> kullanarak RNA izolasyonu gerçekleştirmekdeğiştirilmiş bir protokol (Malzeme listesi bakınız). <ol><li> 1 dakika boyunca fenol parçalama reaktifi (Malzeme listesi bakınız) örnek ve vorteks 10x hacim ekleyin. </li><li> 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir. </li><li> kloroform (adım 2.1.5.1 kullanılan fenol liziz reaktifi hacminin% 20) ilave edilir ve 15 saniye boyunca kuvvetli bir şekilde çalkalanır. </li><li> 3 dakika - 2, oda sıcaklığında inkübe edilir. </li><li> soğutulmuş bir santrifüj içinde 4 ° C&#39;de 12,000 x g&#39;de 15 dakika boyunca santrifüj. </li><li> interfaz kaçınarak yeni bir tüpe, üst sulu faz transfer. </li><li> 1 dakika için sulu faz ve vorteks% 100 etanol 1.5x hacim. </li><li> en az 1 saat ya da gece boyunca -80 ° C&#39;de saklayın örnekleri. </li><li> sağlanan küçük sütunlar kullanılarak RNA izolasyon protokolü ile devam edin. </li><li> 30 mL RNaz içermeyen H2O ile elüte İlk 2 dakika süreyle düşük hızda (2000 xg) frit, spin doğrudan 15 uL H 2 O ekleyin veDaha sonra 1 dakika boyunca yüksek hızda (max) dönerler. H 2 O ek 15 ul ile bu adımı tekrarlayın </li></ol></li><li> Hemen -80 ° C&#39;de Srna kütüphane nesil ya da mağazaya geçin. </li></ol></li><li> Kütüphane Oluşturma (~ 6 saat) <ol><li> Aşağıda ayrıntılı olarak açıklandığı gibi PCR amplifikasyonu için bir değişiklik ile, üretici talimatlarına uygun olarak, Srna Kütüphane oluşturma kiti protokolü kullanılarak Srna cDNA kütüphaneleri hazırlayın. <ol><li> 0.5 mL DNaz / RNaz ücretsiz H 2 O içeren buz üzerinde PCR MasterMix hazırlayın, 15 uL PCR Mix (PML) ve 1 uL RNA PCR Primer (RP1) numune başına (hata pipetle için ek bir% 10 dahil). </li><li> PCR 16.5 uL her (cDNA) örnek karıştırın ekleyin. </li><li> çoğullama için her bir örnek için bir dizin / barkod numarası atamak ve örnek (ilgili numaraya) 1 uL PCR Primer Endeksi ekleyin. </li><li> mikrofuge&#39;de kullanarak hızlı bir spin gerçekleştirin. NOT: Toplam hacim gerekirŞimdi örnek başına 30 uL olacak. </li><li> Tablo 2 ve 3&#39;te açıklandığı gibi PCR amplifikasyonu için döngü şartları yerine. </li></ol></li></ol></li><li> Boyut Srna Kütüphane Adaptörü çıkarmak için seçin: Adaptörler (~ 1.5 saat) <ol><li> Hedef: aşağıdaki boyut parametreleri ile üreticinin talimatlarına göre otomatik DNA boyutu seçici kullanarak kütüphane boyut seçimi gerçekleştirmek 156 bp Başlangıç: 135 bp, End: 177 bp, Menzil Flag: Geniş. </li></ol></li><li> DNA Clean Up (~ 0.5 saat) <ol><li> temizlemek boyut seçimine, üreticinin talimatlarına uygun olarak Srna cDNA. </li><li> Temiz Zehir ve 2 x 7 uL DNaz / RNaz ücretsiz H2O ile Srna cDNA konsantre </li></ol></li><li> Ölçmek ve değerlendirmek Srna cDNA Library Verim ve Kalite (~ 1 saat) <ol><li> İmalat başına (Malzeme Listesi) bir Bioanalyzer üzerinde yüksek hassasiyetli DNA çip kullanan Srna cDNA kütüphanesi kalitesini ve boyutunu değerlendirmekÜrer talimatları. </li><li> üreticinin talimatlarına göre, yüksek hassasiyetli DNA tahlili (Malzeme Listesi) kullanarak bireysel Srna cDNA kütüphanesi konsantrasyonlarını ölçmek. NOT: Bu akış hücresi mümkünse aynı kulvarda çalıştırılacak farklı endeksleri tüm örnekleri olması tavsiye edilir. Birden fazla şeritli gerekli ise, uygun bir durumda, kontrol numuneleri karıştırın. </li></ol></li><li> Yüksek verimli Srna Dizi (~ 7 gün) <ol><li> Havuz bireysel denk molar konsantrasyonlarda dayalı Srna kütüphaneleri endeksli. </li><li> 2.5.2 - Ekran Bioanalyzer yüksek hassasiyetli DNA çip kullanan ve 2.5.1 gibi kütüphane DNA konsantrasyonunu belirlemek kalite Srna kütüphaneleri toplanmış. </li><li> üreticinin talimatlarına (Malzeme listesi) göre dizi kütüphanesi qPCR Niceleme Kiti kullanılarak uygun sıralama derinliğini sağlamak için bağdaştırıcı içeriği kantitatif PCR (qPCR) uygulayın. </li><li> Tek bir okuma kullanarak sıralamayı gerçekleştirmek, 50 b25 M üreticinin talimatlarına göre, / örnek okur - p protokolü yaklaşık 20 derinliğe ulaşmak için. </li></ol></li></ol> 3. Veri Analizi (~ 1 gün) <ol><li> çoklaması örneklerin önişlem ham fastq dosyaları (Malzeme listesi) kullanım kılavuzu talimatlarına göre, bcl2fastq2 kullanın. </li><li> Adaptörleri 9 Döşeme ve kaldırmak için Cutadapt kullanın &lt;okur kullanım kılavuzu talimatlarına (Malzeme Listesi) göre uzunluğu 16 nükleotid (NTS). </li><li> Kullanım kılavuzu talimatlarına (Malzeme Listesi) uyarınca, NGSPERL çerçevesinde removeSequenceInFastq işlevini kullanarak ve adaptör carry-over (CTACAGTCCGACGATC): stop çözüm dizisi de dahil olmak üzere Srna kütüphaneler, mevcut kirlilik dizileri (CCACGTTCCCGTGG STP) sökün. </li><li> Kullanım kılavuzu talimatlarına (Malzeme Listesi) uyarınca, FastQC Sayısal Bilimler Merkezi (CQS) araçlarını kullanarak kalite kontrol ölçümleri gerçekleştirin. </li><li> &quot;Özdeş&quot; olmayan gereksiz liste oluşturmak (çökme redunda okurnt okur) ve kayıt kopya sayıları kullanım kılavuzunun talimatları Malzeme (Liste) uyarınca, CQSTools kullanarak. </li><li> Kullanım kılavuzu talimatlarına (Malzeme Listesi) uyarınca, (-a -m 100 --best --strata -v 1 seçenekleri) hizalayın Bowtie1.1.2 1 uyumsuzluğu izin kullanarak insan genomuna okur. </li><li> hizalama, sayma okuma gerçekleştirmek ve kullanım kılavuzu talimatına göre, NGSPERL kullanarak özetleme görevleri sonuçlanır. </li><li> Bir tablo dosyasına ihraç sayım tabloya dönüştür. </li><li> Başına Haritalı miRNA (RPMM) okur olarak o sınıfın (örn miRNA&#39;lar sayısı okur) ve rapor sinyalleri için okur Normale toplam sayısı belirli bir sınıfın (örn miRNA&#39;ların) okur. (Örneğin, RPMM = (miR-X / miRNA toplam # * 1000000) okur). </li><li> düşük seviye ve üst düzey diferansiyeli için yazılımı içine jenerik tek renk teknolojisi olarak girdi normalize sayım tablosu kullanım kılavuzu talimatlarına (Malzeme Listesi) göre analiz eder. NOT: Şu anda, hiçbir iyi karakterize temizlik genler vardır / SRNHDL-Srna gelince. Bir başak-kontrol kullanılabilir, ancak sorunlu olabilir. toplam protein giriş veya hacim HDL normalize tavsiye edilir. En önemlisi, gerçek zamanlı PCR veya kantitatif PCR kullanılarak miRNA&#39;lar ve sRNAs ölçmek için çeşitli stratejiler biri tarafından sıralama sonuçlarını doğrulamak için tavsiye edilir. </li></ol>

<ol>
	<li>Vickers, K. C., Roteta, L. A., Hucheson-Dilks, H., Han, L., Guo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mining+diverse+small+RNA+species+in+the+deep+transcriptome.">Mining diverse small RNA species in the deep transcriptome.</a> Trends Biochem Sci. 40, 4-7 (2015).</li><li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=+MicroRNAs:+genomics,+biogenesis,+mechanism,+and+function."> MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function.</a> Cell. 116, 281-297 (2004).</li><li>Haussecker, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+tRNA-derived+small+RNAs+in+the+global+regulation+of+RNA+silencing.">Human tRNA-derived small RNAs in the global regulation of RNA silencing.</a> RNA. 16, 673-695 (2010).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+terminal+and+asymmetric+processing+of+small+RNAs+from+rRNAs,+snoRNAs,+snRNAs,+and+tRNAs.">Extensive terminal and asymmetric processing of small RNAs from rRNAs, snoRNAs, snRNAs, and tRNAs.</a> Nucleic Acids Res. 40, 6787-6799 (2012).</li><li>Martens-Uzunova, E. S., Olvedy, M., Jenster, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+microRNA--novel+RNAs+derived+from+small+non-coding+RNA+and+their+implication+in+cancer.">Beyond microRNA--novel RNAs derived from small non-coding RNA and their implication in cancer.</a> Cancer Lett. 340, 201-211 (2013).</li><li>Maute, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=tRNA-derived+microRNA+modulates+proliferation+and+the+DNA+damage+response+and+is+down-regulated+in+B+cell+lymphoma.">tRNA-derived microRNA modulates proliferation and the DNA damage response and is down-regulated in B cell lymphoma.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 1404-1409 (2013).</li><li>Vickers, K. C., Palmisano, B. T., Shoucri, B. M., Shamburek, R. D., Remaley, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+are+transported+in+plasma+and+delivered+to+recipient+cells+by+high-density+lipoproteins.">MicroRNAs are transported in plasma and delivered to recipient cells by high-density lipoproteins.</a> Nat Cell Biol. 13, 423-433 (2011).</li><li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid.">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Anal Biochem. 150, 76-85 (1985).</li><li>Chen, C., Khaleel, S. S., Huang, H., Wu, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Software+for+pre-processing+Illumina+next-generation+sequencing+short+read+sequences.">Software for pre-processing Illumina next-generation sequencing short read sequences.</a> Source Code Biol Med. 9, 8 (2014).</li><li>Vickers, K. C., Remaley, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid-based+carriers+of+microRNAs+and+intercellular+communication.">Lipid-based carriers of microRNAs and intercellular communication.</a> Curr Opin Lipidol. 23, 91-97 (2012).</li><li>Greening, D. W., Xu, R., Ji, H., Tauro, B. J., Simpson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+exosome+isolation+and+characterization:+evaluation+of+ultracentrifugation,+density-gradient+separation,+and+immunoaffinity+capture+methods.">A protocol for exosome isolation and characterization: evaluation of ultracentrifugation, density-gradient separation, and immunoaffinity capture methods.</a> Methods Mol Biol. 1295, 179-209 (2015).</li><li>Sung, B. H., Ketova, T., Hoshino, D., Zijlstra, A., Weaver, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directional+cell+movement+through+tissues+is+controlled+by+exosome+secretion.">Directional cell movement through tissues is controlled by exosome secretion.</a> Nat Commun. 6, 7164 (2015).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2(-Delta+Delta+C(T))+Method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25, 402-408 (2001).</li><li>Jung, R., Lubcke, C., Wagener, C., Neumaier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversal+of+RT-PCR+inhibition+observed+in+heparinized+clinical+specimens.">Reversal of RT-PCR inhibition observed in heparinized clinical specimens.</a> Biotechniques. 23, (1997).</li><li>Johnson, M. L., Navanukraw, C., Grazul-Bilska, A. T., Reynolds, L. P., Redmer, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heparinase+treatment+of+RNA+before+quantitative+real-time+RT-PCR.">Heparinase treatment of RNA before quantitative real-time RT-PCR.</a> Biotechniques. 35, 1140-1142 (2003).</li><li>Garcia, M. E., Blanco, J. L., Caballero, J., Gargallo-Viola, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anticoagulants+interfere+with+PCR+used+to+diagnose+invasive+aspergillosis.">Anticoagulants interfere with PCR used to diagnose invasive aspergillosis.</a> J Clin Microbiol. 40, 1567-1568 (2002).</li><li>Yokota, M., Tatsumi, N., Nathalang, O., Yamada, T., Tsuda, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+heparin+on+polymerase+chain+reaction+for+blood+white+cells.">Effects of heparin on polymerase chain reaction for blood white cells.</a> J Clin Lab Anal. 13, 133-140 (1999).</li><li>Bai, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictive+value+of+quantitative+PCR-based+viral+burden+analysis+for+eight+human+herpesviruses+in+pediatric+solid+organ+transplant+patients.">Predictive value of quantitative PCR-based viral burden analysis for eight human herpesviruses in pediatric solid organ transplant patients.</a> J Mol Diagn. 2, 191-201 (2000).</li><li>McShine, R. L., Sibinga, S., Brozovic, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+between+the+effects+of+EDTA+and+citrate+anticoagulants+on+platelet+count+and+mean+platelet+volume.">Differences between the effects of EDTA and citrate anticoagulants on platelet count and mean platelet volume.</a> Clin Lab Haematol. 12, 277-285 (1990).</li><li>Fichtlscherer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+microRNAs+in+patients+with+coronary+artery+disease.">Circulating microRNAs in patients with coronary artery disease.</a> Circ Res. 107, 677-684 (2010).</li><li>Pritchard, C. C., Cheng, H. H., Tewari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+profiling:+approaches+and+considerations.">MicroRNA profiling: approaches and considerations.</a> Nat Rev Genet. 13, 358-369 (2012).</li><li>Kirschner, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haemolysis+during+sample+preparation+alters+microRNA+content+of+plasma.">Haemolysis during sample preparation alters microRNA content of plasma.</a> PLoS One. 6, e24145 (2011).</li><li>Kannan, M., Atreya, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+profiling+of+human+red+blood+cells+during+storage+for+52+selected+microRNAs.">Differential profiling of human red blood cells during storage for 52 selected microRNAs.</a> Transfusion. 50, 1581-1588 (2010).</li><li>Chen, S. Y., Wang, Y., Telen, M. J., Chi, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genomic+analysis+of+erythrocyte+microRNA+expression+in+sickle+cell+diseases.">The genomic analysis of erythrocyte microRNA expression in sickle cell diseases.</a> PLoS One. 3, e2360 (2008).</li><li>Balzano, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRNA+Stability+in+Frozen+Plasma+Samples.">miRNA Stability in Frozen Plasma Samples.</a> Molecules. 20, 19030-19040 (2015).</li><li>Redgrave, T. G., Roberts, D. C., West, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+plasma+lipoproteins+by+density-gradient+ultracentrifugation.">Separation of plasma lipoproteins by density-gradient ultracentrifugation.</a> Anal Biochem. 65, 42-49 (1975).</li><li>Cheung, M. C., Wolf, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effect+of+ultracentrifugation+on+apolipoprotein+A-I-containing+lipoprotein+subpopulations.">Differential effect of ultracentrifugation on apolipoprotein A-I-containing lipoprotein subpopulations.</a> J Lipid Res. 29, 15-25 (1988).</li><li>Kunitake, S. T., Kane, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+affecting+the+integrity+of+high+density+lipoproteins+in+the+ultracentrifuge.">Factors affecting the integrity of high density lipoproteins in the ultracentrifuge.</a> J Lipid Res. 23, 936-940 (1982).</li><li>Laurent, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meeting+report:+discussions+and+preliminary+findings+on+extracellular+RNA+measurement+methods+from+laboratories+in+the+NIH+Extracellular+RNA+Communication+Consortium.">Meeting report: discussions and preliminary findings on extracellular RNA measurement methods from laboratories in the NIH Extracellular RNA Communication Consortium.</a> J Extracell Vesicles. 4, 26533 (2015).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Bu protokol, yüksek derecede saf HDL, yüksek verimli sekanslama ya da gerçek-zamanlı PCR ile miRNA&#39;lar ve sRNAs ölçmek için tasarlanmıştır. Herhangi bir yaklaşımla olduğu gibi, özel durumlar arındırıcı HDL ve RNA sürecinde her adımda verilen ve daha sonra sRNAs ölçülmesi gerekir. Bu protokol, plazma ≥ 2 mL başlayarak projeler için tasarlanmıştır. Bununla birlikte, yüksek kalitede RNA analizleri başarılı afinite kromatografisi kullanılarak, insan ya da fare plazması az 80, uL saflaştırılmış HDL ile tamamlanabilir; Ancak, büyük bir başlangıç ​​plazma hacimleri Burada sunulan yöntemleri kullanarak daha iyi veri üretir. Numune işleme ve ekstraksiyon yöntemleri büyük ölçüde miRNA / Srna kalitesini ve verimini değiştirebilir. antikoagülan kullanımı, plazma koleksiyonu için gerekli süre, muhtemelen aşağı çıkarma etkiler. Örneğin, heparin kolayca RNA ekstraksiyonu 14,15 sırasında kaldırılır ve PCR 16-18 kullanılan alt baş enzimleri inhibe edebilir. Buna ek olarak, inciere sodyum sitrat da EDTA örneklerinden miRNA&#39;lar sodyum sitrat örneklerinin 16,19,20 kıyasla ifade profili düzeldi gösterilir qPCR ölçümlerine müdahale edebilir dair raporlar vardır. bir antikoagülan seçerken bu çalışmalar dikkatli bir değerlendirme ihtiyacını ortaya koymaktadır. Ayrıca, pıhtılaşma esnasında hücre liziz için artan potansiyeli nedeniyle serum örnekleri yapay lipoproteinler ile ilişkilendirebilir lize hücresel miRNA&#39;lar olarak tavsiye edilmez. Benzer şekilde, plazma ideal lize lökositlerin dahil olmak üzere, diğer periferal kan hücreleri, kirlenmeyi önlemek için tam kan hemen izole edilir. Soğuk sıcaklık yaygın trombosit aktivasyonu etkilediği bilinmektedir gibi, bütün kan numuneleri, oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 3000 x g&#39;de eritrosit, lökosit ve platelet uzak döndürülür. Rüptüre eritrositler de miRNA sonucunu 21,22 etkilemeye bildirilmiştir onlar hemol sırasında dökmek olabilir miRNA&#39;lar içerdiğinden Hemoliz de kötü, tavsiye edilirSalman kararı 23,24. Plazma sonra 2 için 4 ° C&#39;de muhafaza edilebilir - 4 hafta ya da alternatif plazma miRNA içeriği kısa vadeli ve uzun süreli saklama (maksimum 4 yıl) 25 hem de istikrarlı ve yaşayabilir -80 ° C&#39;de donmuş olabilir. Bugünkü bilgilerimize, plazma numuneleri donma HDL-miRNA&#39;lar ve donmuş plazma örnekleri analiz etmek için uygundur zarar tahmin edilmez. lipoproteinler ve diğer bütün kan bileşenleri gıda alımı etkilenebilir olarak, açlık kan alma tercih edilmektedir. Yukarıda belirtildiği gibi, HDL DGUC, FPLC ve apoA-I&#39;e karşı afinite kromatografisi de dahil olmak üzere, standart yöntemler, bir numara ile izole edilebilir. . Redgraves tarafından tarif edildiği gibi KBr kullanılarak DGUC plazma lipoproteinlerinin izolasyonu ve diğ 26, VLDL ayıran (D = 0,94-1,006 gr / ml), LDL (D = 1,006-1,063 g / mL) ve HDL (D = 1,063-1,21 Örnek başına 60 ml) - g / ml) ve plazma (2 büyük miktarlar için ideal bir yöntemdir. sınırlamaSadece bu yaklaşım kullanarak eksozomlar ve EVs içeren diğer MiRNA HDL benzer yoğunluğa sahip olduğu rapor edilmiştir ve DGUC HDL (Şekil 2A) içinde mevcut olmasıdır. Diğer dezavantajlar, olası yapısal tamponlar ve güçlü ultrasantrifügasyon kuvvetlerinin yüksek tuz maruz proteinlere zarar olarak HDL alt sınıflar 27,28 ayırıcı stabilitelerini içerir. Bu plazma 29 1 mL başına HDL protein yakın 1 mg üreten HDL proteininin yüksek bir verimle sonuçlanır olarak rağmen DGUC yaygın olarak kullanılmaktadır. , Boyut dışlama jel filtrasyonu içerir FPLC yaklaşım, akış hızı (yaklaşık 6 saat) bağlı, daha az zaman gerektirir ve AGH dahil büyük (büyüklüğüne göre) apoB-içeren lipoproteinlerin gelen HDL&#39;yi ayıran hassas ve bunların alt sınıfları vardır HDL çok daha büyük ama benzer yoğunlukları var. çapı 75 nm yok - Yaklaşık 220 arasındaki bu protokol ayrıntılı yöntemler, plazma veziküller kullanarak belirtmek gerekir kiFPLC ile ayrılmış olduğunda, saptanabilir bir lipid ya da protein imza ortaya çıkarmaktadır. kurulumu ile ilgili olarak, nispeten küçük bir FPLC girişi gerektirir, 0.3 - kemirgen plazma ve küçük dondurulmuş alikotları için yararlıdır 1 mi. Hızlı kolorimetrik kolesterol deneyleri HDL veya diğer lipoprotein fraksiyonları dağılımını onaylamak için FPLC aşağıdaki de önemlidir. Fraksiyonu örnekleri ve lipoprotein sulandırır; Bununla birlikte, örnekler daha sonra, standart radyal boyut filtreler kullanılarak konsantre edilebilir (örneğin, 10 kDa kesim mw filtre). Mikro-dönüş sütunlarını kullanarak apoA-I IP HDL izolasyon üç yaklaşımın hızlı, ancak düşük girdi ile sınırlıdır (0,08-1 ul) hacmi ve düşük verim (yaklaşık 0.1 mg). ApoA-I IP zahmetli olabilir, bu yöntem, düşük hacimli hücre kültürü süpernatanları için idealdir. Bu yöntemlerin her biri güçlü ve zayıf yanları olsa da tandem kullanıldığında, bunlar azaltılabilir (örneğin, DGUC FPLC ardından). daha fazla saflıkta iki tandem yaklaşımları sonuçları kullanarakMiRNA ve Srna analizi için, HDL. Burada, FPLC tarafından takip DGUC tandem yöntemini kullanarak oldukça saf HDL izole etmek için gereken adımları ayrıntılı ve yüksek verimli sıralama veya real-time PCR kullanarak HDL-miRNA&#39;lar ve sRNAs ölçmek için kullanılan adımlar sıraladı. Bu protokol, HDL için tasarlanmış olmasına rağmen, bunların yoğunlukları ve boyutlarına göre LDL ve VLDL, dahil olmak üzere diğer lipoproteinlerin hakkında sRNAs miktarının büyük uygulanabilirliği vardır.

Ekstrasellüler kodlamayan küçük RNA&#39;lar (sRNAs) hastalığı biyomarkerlerin ve potansiyel terapötik hedeflerin yeni bir sınıfını temsil ve muhtemel hücre-hücre iletişimi 1 kolaylaştırır. Srna en çok çalışılan tip uzunluğu yaklaşık 22 NTS ve daha uzun habercisi formları ve primer transkript 2 işlenir mikroRNAlar (miRNA) &#39;dir. miRNA&#39;lar transkripsiyonel-sonrası protein çevirisinin ve mRNA degradasyon 2 indüksiyonu bastırılması vasıtasıyla gen ekspresyonunu düzenlemek için gösterilmiştir. Bununla birlikte, miRNA&#39;ların sRNAs birçok türleri sadece biri; sRNAs üst tRNA&#39;ların (tRNA türetilmiş sRNAs TDR), küçük nükleer RNA (Srna türetilmiş sRNAs, sndRNA), küçük çekirdekçik RNA&#39;lar (snoRNA türetilmiş sRNAs, snRNA), ribozomal RNA klivaj edilebilir (sRNAs RDR rRNA türetilmiş ) Y RNA&#39;lar (yDR) ve diğer çeşitli RNA&#39;lar 1. Bu yeni sRNAs birkaç örnek miRNA&#39;ların benzer işlev bildirilmiştir; Ancak, biyolojik fugen düzenlemesi roller 3-6 olasılığı olmasına rağmen, bu sRNAs birçok nctions tespit edilmesi gerekmektedir. İlginç olan, miRNA&#39;ların ve diğer sRNAs tükürük, plazma, idrar, safra içeren hücre dışı akışkanlar içinde stabil bir şekilde yer almaktadır. Ekstrasellüler sRNAs olasılıkla ekstrasellüler veziküllerin (EV), lipoproteinler ve / veya hücre dışı Ribonükleoprotein kompleksleri ile dernek aracılığıyla RNases korunur. Daha önce, bu lipoproteinlerin, yani, yüksek yoğunluklu lipoproteinler (HDL) plazma 7 taşıma miRNA&#39;lar bildirilmiştir. Bu çalışmada, HDL ardışık yoğunluk gradyanlı ultrasantrifüjleme yöntemi (DGUC), hızlı protein sıvı kromatografi (boyut dışlama kromatografisi, jel filtrasyon, FPLC) ve afinite kromatografisi (anti-apolipoprotein Al (apoA-l) imüno kullanılarak izole edildi ) 7. Gerçek zamanlı PCR bazlı, düşük yoğunluklu diziler ve bireysel MiRNA analizlerine kullanarak MiRNA düzeylerde HDL üzerindeki sayısal iyileşmesi izole edildisenin ve hiperkolesterolemik konular 7. Bu yaklaşımı kullanarak, biz miRNA&#39;lar profil ve oldukça saf HDL hazırlıkları belirli miRNA&#39;lar ölçmek için başardık. 2011 yılından bu yana afinite kromatografisi HDL saflığı artırır, ancak antikor doygunluk büyük ölçüde verim sınırlar ve maliyet açısından çok pahalı olabilir belirledik. Şu anda, bizim protokol aynı zamanda aşağı akım RNA izolasyonu ve Srna ölçümü için yüksek kaliteli, HDL örnekleri üreten FPLC, ardından DGUC bir iki adımlı sıralı tandem yöntemi önerir. Nedeniyle yüksek verimli örneğin sRNAs (sRNAseq), miRNA&#39;lar sıralanması, ve diğer non-miRNA Srna sınıfların artan farkındalık son gelişmeler için, sRNAseq cari state-of-the-art miRNA ve Srna profilleme. Bu nedenle, bizim protokol miktarının miRNA&#39;lar ve sRNAseq kullanarak HDL örneklerinde diğer sRNAs önerir. Bununla birlikte, HDL izole edilmiş toplam RNA da tek tek miRNA&#39;lar ve sRNAs ölçmek veya gerçek zamanlı PCR kullanılarak sRNAseq Sonuçları doğrulamak için kullanılabiliryaklaşırsa. Burada toplama, arıtma, ölçümü, veri analizi ve oldukça saf HDL-sRNAs doğrulanması için detaylı bir protokol açıklar. Bu yazıda genel amacı, insan plazmasından izole son derece saf HDL Srna ölçümü fizibilite ve süreci göstermektir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1033px;" width="1033">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:315px;height:21px;">Ultracentrifuge&#160;</td>
			<td style="width:207px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:205px;">A99839</td>
			<td style="width:307px;">Optima XPN-80</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:315px;height:21px;">Ultracentrifuge Rotor</td>
			<td style="width:207px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:205px;">331362</td>
			<td>SW-41Ti</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:315px;height:21px;">AKTA Pure FPLC System</td>
			<td style="width:207px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:205px;">29018224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:315px;height:21px;">3X FPLC Superdex 200 Increase Columns In-line</td>
			<td style="width:207px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:205px;">28990944</td>
			<td>10/300 gl</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:315px;height:21px;">SynergyMx</td>
			<td style="width:207px;">BioTek Instruments</td>
			<td style="width:205px;">7191000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:315px;height:21px;">Tabletop centrifuge</td>
			<td style="width:207px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:205px;">75004525</td>
			<td>Sorvall ST40R</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:315px;height:21px;">Refrigerated centrifuge</td>
			<td style="width:207px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:205px;">22629867</td>
			<td>5417R (purchased through USA Scientific)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:315px;height:21px;">Microfuge&#160;</td>
			<td style="width:207px;">USA Scientific</td>
			<td style="width:205px;">2631-0006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:315px;height:21px;">PippenPrep</td>
			<td style="width:207px;">Sage Science</td>
			<td style="width:205px;">PIP0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:315px;height:21px;">2100 Bioanalyzer&#160;</td>
			<td style="width:207px;">Agilent</td>
			<td>G2938B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:315px;height:21px;">High Sensitivity DNA Assay</td>
			<td style="width:207px;">Agilent</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:315px;height:21px;">Sequencing Library qPCR Quantification Kit</td>
			<td style="width:207px;">Illumina</td>
			<td>SY-930-1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:315px;height:21px;">ProFlex Thermal Cycler</td>
			<td style="width:207px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:205px;">4484073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:315px;height:21px;">QuantStudio 12k Flex</td>
			<td style="width:207px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:205px;">4471134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:315px;height:21px;">EpMotion Robot</td>
			<td style="width:207px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:205px;">960000111</td>
			<td>5070</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:315px;height:21px;">Ultra-clear centrifuge tubes</td>
			<td style="width:207px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:205px;">344059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:315px;height:21px;">Potassium Bromide</td>
			<td style="width:207px;">Fisher Chemicals</td>
			<td style="width:205px;">P205-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:315px;height:21px;">15 mL conical tube</td>
			<td style="width:207px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:205px;">339650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:315px;height:21px;">Micro-centrifugal filters 0.45&#181;m</td>
			<td style="width:207px;">Millipore</td>
			<td style="width:205px;">UFC30HV00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:315px;height:21px;">Micro-centrifugal filters 0.22&#181;m</td>
			<td style="width:207px;">Millipore</td>
			<td style="width:205px;">UFC30GV00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:315px;height:21px;">miRNAEasy Total RNA Isolation Kits</td>
			<td style="width:207px;">Qiagen</td>
			<td style="width:205px;">217004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:315px;height:21px;">Total Cholesterol colormetric kit</td>
			<td style="width:207px;">Cliniqa (Raichem)</td>
			<td style="width:205px;">R80035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:315px;height:21px;">10,000 m.w. cut-off centrifugation filter</td>
			<td style="width:207px;">Amicon</td>
			<td style="width:205px;">UFC801024</td>
			<td>purchased through Millipore</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:315px;height:21px;">PCR strip tubes</td>
			<td style="width:207px;">Axygen</td>
			<td style="width:205px;">PCR-0208-C</td>
			<td>purchased through Fisher</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:315px;height:21px;">microRNA RT kit</td>
			<td style="width:207px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:205px;">4366597</td>
			<td>For 1000 reactions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:315px;height:21px;">PCR master mix</td>
			<td style="width:207px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:205px;">4440041</td>
			<td>50 mL bottle</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:315px;height:21px;">Pierce BCA kit</td>
			<td style="width:207px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:205px;">23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:315px;height:21px;">Clean and Concentrator Kit</td>
			<td style="width:207px;">Zymo</td>
			<td style="width:205px;">D4014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:315px;height:21px;">Dialysis tubing</td>
			<td style="width:207px;">Spectrum Labs</td>
			<td style="width:205px;">132118</td>
			<td>purchased through Fisher</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:315px;height:21px;">bcl2fastq2</td>
			<td style="width:207px;">Illumina</td>
			<td style="width:205px;">n/a</td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:315px;height:21px;">Cutadapt</td>
			<td>https://github.com/marcelm/cutadapt</td>
			<td style="width:205px;">n/a</td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:315px;height:21px;">NGSPERL</td>
			<td>github.com/shengqh/ngsperl</td>
			<td style="width:205px;">n/a</td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:315px;height:21px;">CQSTools</td>
			<td>github.com/shengqh/CQS.Tools</td>
			<td style="width:205px;">n/a</td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:315px;height:21px;">Bowtie 1.1.2&#160;</td>
			<td>http://bowtie-bio.sourceforge.net</td>
			<td style="width:205px;">n/a</td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:315px;height:21px;">GeneSpringGX13.1.1</td>
			<td style="width:207px;">Agilent</td>
			<td style="width:205px;">n/a</td>
			<td>Software</td>
		</tr>
	</tbody>
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
</table>

isolation of high-density lipoproteins for non-coding small rna quantification

küçük kodlayıcı olmayan RNA&#39;lar çeşitliliği (Srna) hızla genişlemektedir ve gen regülasyonu dahil olmak üzere biyolojik süreçlerde, rolleri, ortaya çıkmaktadır. İlginç olan, sRNAs ayrıca hücrelerin dışında bulunan ve sabit bir şekilde tüm biyolojik sıvılar içinde mevcut bulunmaktadır. Bu nedenle, hücre dışı sRNAs hastalığı biyomarkerler yeni bir sınıfını temsil eder ve büyük olasılıkla hücre sinyal iletimi ve hücreler arası iletişim ağları dahil olmaktadır. biyolojik olarak potansiyellerini değerlendirmek için, sRNAs plazma, idrar ve diğer sıvıları belirlenebilir. Bununla birlikte, tam endokrin sinyaller olarak hücre dışı sRNAs etkisini anlamak için, taşıyıcıları taşınması ve hücre ve dokular dışı Srna havuzları katkıda biyolojik sıvılarda (örneğin, plazma), onları korumak ve hücreler ve yetenekli dokular olduğunu belirlemek önemlidir kabul ediyor ve hücre dışı Srna kullanan. Bu hedeflere ulaşmak için, hücre-dışı taşıyıcıların yüksek derecede saf popülasyonlarının izole edilmesi için önemlidirSrna profil ve ölçümü için. Daha önce lipoproteinler, özellikle yüksek yoğunluklu lipoproteinler (HDL), hücre ve HDL-miRNA&#39;ların arasında işlevsel microRNA (MiRNA) önemli ölçüde hastalık değişmiş taşıma olduğunu göstermiştir. Burada, detay yoğunluk-gradyan Ultrasantrifügasyon (DGUC) ve hızlı protein-sıvı kromatografisi (FPLC) ile tandem HDL izolasyonunu kullanan yeni bir protokol yüksek ikisini de kullanarak, aşağı profilleme ve miRNA&#39;ların dahil olmak üzere tüm sRNAs, ölçümü için son derece saf HDL elde etmek için -throughput sekanslama ve gerçek zamanlı PCR yaklaşımlar. Bu protokol HDL üzerinde sRNAs araştırılması için değerli bir kaynak olacaktır.

Bu protokol, yüksek verimli sekanslama veya gerçek zamanlı PCR (Şekil 1), son derece saf HDL sRNAs ölçümü sağlamak için birbirine bağlanmış edilmiş yöntemlerden dizisidir. fizibilite ve bu protokol etkisini göstermek için, HDL ikili DGUC ve FPLC yöntemi ile insan plazmasından saflaştırılmıştır. HDL (kolesterol dağılımı) karşılık gelen toplanan FPLC fraksiyonlar konsantre edildi ve toplam RNA HDL (toplam protein), 1 mg izole edilmiştir. Srna kütüphaneleri n = 4 sağlıklı insan deneklerden toplanan HDL ile üretilmiştir. Bütün insan kanı / plazma numuneleri aktif Kurumsal İnceleme Kurulu protokolü (# 070416) altında toplanmış ve Tıp Vanderbilt Üniversitesi tarafından onaylanan insan denekler bilgilendirilmiş onam alındı. Hazırlanan Srna kütüphaneleri Gelişmiş Genomics (VANTAGE) DNA dizi merkezi ve veri analizleri yapılmıştır Vanderbilt Technologies dizildiin-house boru hatlarını kullanarak. Veri görselleştirme yazılımları grafik oluşturulmuştur. DGUC sonra, HDL izolasyonu için bir ikinci yöntem (FPLC) gerçekleştirmek için ciddi bir ihtiyaç EVs muhtemel ortak saflaştırma kaynaklanmaktadır. AGH apoptotik cisimlerin 10 olmak üzere multiveziküler cisim (Eksozomlann) kaynaklanan zar türetilmiş kesecikler, plazma zarı (microvesicles) tomurcuklanma ve diğer işlemler, genel bir sınıf vardır. EVs, yani eksozomlar küçük HDL (Şekil 2A) ile benzer bir yoğunluğa sahip olduğu rapor edilmiştir ve bu nedenle, HDL yoğunluğu fraksiyonunda mevcut olabilir - DGUC 11,12 sonra (1.063 1.21 gr / ml). EVS ve diğer lipoproteinlerin (örneğin, LDL) çıkarmak için, DGUC-HDL&#39;den, FPLC boyutu diğer vesiküller ve parçacıklar ayrı HDL için kullanılmıştır; HDL (7-12 çapı nm) EVs (40 - çapı 220 nm) nedeniyle kolaylıkla boyutları farklılıkları (Şekil 2A, B) fraksiyone edilmiştir. HDL fraksiyonus dolayı kolesterol dağıtımı için aşikar idi ve DGUC-HDL FPLC fraksiyonlar bir araya toplanmış ve 10 kDa kesme santrifüj filtre ile konsantre edilmiştir. Konsantre HDL toplanmış ve aşağı RNA analizi (Şekil 2B) kullanılmıştır. Bu noktayı göstermek için, plazma önceden DGUC FPLC ve fosfolipidlerden dağılımını (fosfatidilkolin, PC) kullanılarak parçalandı; total kolesterol (TK), ve protein düzeyleri ölçülebilir ve fraksiyonları arasında çizilmiştir. Bilgisayar, TC ve proteinler seviyeleri, üç kolorimetrik kitler kullanılarak ölçüldü. ve VLDL / LDL fraksiyonları (14 - 18) - Tüm üç parametre açıkça HDL fraksiyonları (24 19) tanımlanmıştır. FPLC-kısımlara plazmada, protein ve yağ sinyalleri minimal tespit edilmiştir ya da (turuncu kutunun sol) VLDL (Şekil 3A) daha büyük boyutları vezikül karşılık gelen fraksiyonlarda bulunan tüm tespit edildi. HDL DGUC ayrılması göstermek için, DGUC-HDL ayrıca FPLC ve PC, TC ile parçalanmıştır ve proteinler düzeyleri quantif idiIED (Şekil 3B). Bu değerlerin konulması DGUC kullanılarak LDL küçük bir miktarının eş fraksiyonasyon göstermektedir ve oldukça saf HDL izole etmek için tandem DGUC-FPLC yaklaşımlara ihtiyaç güçlendirmektedir. EVs DGUC sırasında HDL ile birlikte fraksiyonlanması tahmin edilmektedir, ancak LDL (Şekil 3B) daha büyük boyutları mesaneye karşılık gelen fraksiyonlarda lipid ve protein bulundu hiçbiri az oldu. FPLC ile kısımlara zaman tahmin boyut aralığında EV lipid ve protein imzası minimal tespit edilebilir veya DGUC-VLDL ve DGUC-LDL yoktur (gösterilmeyen veri). RNA analizi için, toplam RNA, Srna kitaplığı üretimi için ikili saflaştınldı HDL 1 mg izole edilmiştir. Kısaca, adaptörler 3 &#39;ve 5&#39; miRNA&#39;ların ve TDRs (Şekil 4A) de dahil olmak üzere sRNAs terminal uçlarına lige edilmiştir. Bağlanan ürünler ters (RT) transkribe edilmiştir ve PCR Dow sırasında çoklayıcı örnekleri için tasarlanmış özel dizinleri barındıran PCR primerleri kullanılarak amplifıyenStream sekanslama reaksiyonları (Şekil 4A). Her bağdaştırıcı uzunluğu 61 nts olduğu; Bu nedenle, bağlanan MiRNA (uzunluğu yaklaşık 22 nts) uzunluğu 144 nts bir ürün üretir. Birçok olmayan miRNA sRNAs biraz daha uzun miRNA&#39;lar daha (örn, 30 - uzunluğunda 35 NTS). Bu nedenle, ürünün eden hedef uzunluğu uzunluğu 156 baz puan. Uzunluğu 177 bps toplanmıştır (Şekil 4A) - Amplifiye ürünler ebat bakımından seçilmiş bir otomatik DNA boyutu seçici ve 135 Tüm cDNA ürünleri kullanarak edildi. Boyutu seçilmiş kütüphanelerinin yetenekler Bioanalyzer (Şekil 4B) ile yüksek hassasiyetli DNA çipleri ile değerlendirildi. Bu boyutta Srna cDNA kütüphaneleri analizi sırasında etkileri &quot;köpüren&quot; mümkün nedeniyle boyut olarak biraz daha büyük çıktı. Çoğaltılmış çok katlı bir sıralama için, cDNA kütüphanelerinin denk molar konsantrasyonlarda bir araya getirilmiş, temizlenmiş, konsantre edilmiş ve Bioanalyzer (Şekil 4B) ile tekrar analiz edildi. birden fazla mesaj örnek daha sonra sequen edildiTek bir okuma 50 bp protokolü kullanılarak ced. In-house veri analizi boru hatları endekslerine dayalı örnekleri Demultiplex için kullanılan, adaptörler Döşeme, koşmak kalite kontrol ölçütleri, insan genomuna uyum ve açıklamalı sRNAs saymak. Uzunluğunda 22 NTS ve 34 - - HDL (Şekil 4C) üzerinde uzunluğu 35 NTS normalize dağılımı sRNAs 20 zenginleştirme göstermek, okur uzunluğu,&gt; 16 nts (Başına Milyon RPM okur). Hizalama ve dört HDL-Srna kütüphanelerin sayım analizi% 38 insan genomunun olan miRNA&#39;lar (Şekil 5A) açıklamalı bölgelerine hizalama okur bulundu. (% 37) eşit derecede bol sRNAs türetilmiş tRNA (TDRs) satın alındı. sRNAs türetilmiş çeşitli RNA (örn, Y, RNA), rRNA, smRNAs, snoRNAs, ve uzun kodlayıcı olmayan RNA&#39;lar (lincRNAs) HDL (Şekil 5A) da mevcuttu. sayısının toplam normalleşme sonra, her sınıf için en iyi 50 en bol mir okurUA&#39;lar, TDRs (Per miRNA, RPMM, Şekil 5B Haritalı Okur) (Başına TDRs, RPMT, Şekil 5C Haritalı Okur), ve diğer non-miRNA olmayan tDR sRNAs heatmaps tarafından organize edildi (Per Srna, RPM&#39;leri, Şekil 5D Haritalı okur) . Bu veriler sağlıklı kişilerde (Şekil 5B-D) genelinde en bol HDL-sRNAs (ör: HDL-miRNA&#39;lar) ve farklılıklar (örneğin, TDRs) benzerlik göstermektedir. Bu sonuçlar HDL tarafından sRNAs taşınması içine olağanüstü bir anlayış sağlamak için bu strateji ve protokolün gücünü göstermek. Bununla birlikte, Srna sıralama mutlak kantitatif için dayanıyordu olmamalıdır. ilgi sRNAs gerçek zamanlı PCR ile valide edilmelidir. Aynı şekilde, birçok araştırmacı sadece HDL bireysel miRNA&#39;ların ölçümü gerekebilir. Bu şekilde, toplam, HDL RNA, gerçek zamanlı PCR ile HDL-miRNA&#39;ların rölatif ölçümü her denekten izole edildi. sRNAseq tarafından HDL tespit daha bol miRNA&#39;lar beş rea kullanıldıl-time PCR her HDL örnek (Şekil 5E) kendi seviyelerini belirlemek için. RNA izolasyonu 13 içine HDL proteini girişinin 1.000 ug - (ΔCtArb RQV = 2) ve normalize sayısal değerler, rasgele temizlik 32 Ct kullanılarak hesaplandı. real-time PCR çalışmanın sonuçları bu protokol aynı zamanda HDL-miRNA&#39;lar tespit ve bireyler arasında farklılıklar miktarının değerli olduğunu göstermektedir. Topluca, sunulan şemadaki yöntemlerin kritik ayrıntıları tanımlamak ve yüksek verim sıralama ve gerçek zamanlı hem de PCR yaklaşımlarından sonuçları bu protokol teslimat temsil etmektedir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54488/54488fig1.jpg" /> Protokolün 1. Temsilcisi Flow-grafik Şekil. Saf HDL yoğunluk gradyan Ultrasantrifügasyon ve hızlı protein sıvı kromatografiden izole edilir<html> tomografi. Toplam HDL RNA sonra küçük RNA (Srna) sıralama için kullanılabilir. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54488/54488fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54488/54488fig2.jpg" /> HDL Şekil 2. izolasyonu. (A) lipoproteinler ve hücre dışı veziküller (EV) yoğunluğu ve çapı uymaktadır. Sıralı tandem HDL izolasyonu (B) şematik, plazma ayrımı, yoğunluk-gradyan Ultrasantrifügasyon (DGUC), hızlı protein içeren sıvı kromatografisi (FPLC), filtrasyon ve konsantrasyon. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54488/54488fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Güncelle / 54488 / 54488fig3.jpg &quot;/&gt; . Lipoproteinler EV, hücre dışı veziküllerin Şekil 3. Hızlı protein Sıvı Kromatografi (FPLC) Ayırma; VLDL, çok düşük yoğunluklu lipoproteinler; LDL, düşük yoğunluklu lipoproteinler; HDL, yüksek yoğunluklu lipoproteinler; FP, serbest protein; PC, fosfatidilkolin; ve TC, total kolesterol. Kırmızı çizgi, TC; Mavi çizgi, protein, ve Siyah çizgi, PC. Önce yoğunluk-gradyan Ultrasantrifügasyon (DGUC) ve DGUC sonra (B) HDL fraksiyonunun (A) insan plazmasından lipoproteinlerin ayrılması. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54488/54488fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/54488/54488fig4.jpg" /> Küçük RNA Kütüphaneleri Şekil 4. Nesil. Küçük RNA (Srna) kütüphane c (A) şematikonstruction ve boyut seçimi. miRNA, microRNA; tDR, sRNAs tRNA türevi; Srna, non-miRNA olmayan tDR sRNAs; RT, ters transkripsiyon; bp baz çifti; ve cDNA, klonlanmış DNA. öncesi ve yüksek hassasiyetli DNA çipleri ve Bioanalyzer kullanarak çoğullama sonra HDL-Srna kütüphanelerinin (B) analizi. HDL-Srna (C) Uzunluk dağıtım sıralama sonra okur. RPM, Million Başına okur; M, erkek denek; F kadın denekler; NT nükleotid. N = 4. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54488/54488fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/54488/54488fig5.jpg" /> HDL-sRNAs Şekil 5. Çeşitlilik. Srna sınıfları arasında HDL-sRNAs (A) Dağıtım. fraksiyon insan genomunda açıklamalı sRNAs hizalanmış okur. (BH) Heatmaps N = 4, HDL-Srna örnekler. <strong&gt; (B) Top 50 en bol HDL-mikroRNAlar (miRNA). Log 2 Günlük Haritalı miRNA, RPMM. (C) Top 50 en bol HDL-tRNA kökenli sRNAs (TGB) okur. 2 Per TDR, RPMT. (D) Top 50 en bol HDL-olmayan diğer miRNA ve non-tDR sRNAs (Srna) Haritalı okur yapın. 2 Günlük Srna Haritalı okur Log, RPMS. (E) HDL-miRNA&#39;lar real-time PCR miktar. M, erkek denek; F kadın denekler. Keyfi temizlik Ct tarafından belirlenen nispi Kantitatif Değer HDL protein girişinin 13 1.000 ug normalize, 32 =. N = 4. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54488/54488fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Lipoprotein ayrılması için 1. Antioksidanlar </td><td> 100x stok solüsyonu yapmak </td&gt; </tr><tr><td> EDTA </td><td> Etilendiamintetraasetik asit (0.5 M stok) </td></tr><tr><td> AZT </td><td> 3-amino-1,2,4-triazol: 42 mg / ml H2O </td></tr><tr><td> BHT </td><td> Butile hidroksitolüen: 25 mg / 100 uL EtOH </td></tr><tr><td> Trolox </td><td> (+) - 6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilkroman-2-karboksilik asit: 41.7 mg / 500 uL EtOH </td></tr><tr><td> 2. Bindirme Çözümleri </td><td></td></tr><tr><td> Çözüm 1. </td><td> 1.019 gr / ml, H2O içinde </td></tr><tr><td> Çözüm # 2 </td><td> 1.025 gr / ml KBr / H2O </td></tr><tr><td> Çözüm 3. </td><td> 1.063 gr / ml KBr / H2O </td></tr><tr><td> Çözüm 4. </td><td> 1.080 gr / ml KBr / H2O </td></tr><tr><td> 5. Çözüm </td><td> 1,255 gr / ml KBr / H2O </td></tr><tr><td> 3. FPLC tampon </td><td></td> &lt;/ Tr&gt; <tr><td> 1 L Tarif </td><td> 50 ml 3M NaCl; 20 mL 0.5 Tris-HCI, pH 7.6; % 10 sodyum azid 2 mi; 930 ml H2O </td></tr></tbody></table> Tablo 1. Özel Reaktifler. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> sahne </td><td> Sıcaklık (° C) </td><td> Zaman </td><td> Bisikletler </td></tr><tr><td> bir </td><td> 98 </td><td> 30 saniye </td><td> 1 </td></tr><tr><td> B </td><td> 98 </td><td> 10 s </td><td rowspan="3"> 25 </td></tr><tr><td></td><td> 60 </td><td> 30 saniye </td></tr><tr><td></td><td> 72 </td><td> 15 s </td></tr><tr><td> C </td><td> 72 </td><td> 10 dk </td><td> 1 </td></tr></tbody></table> Tablo 2.Kütüphane oluşturma amplifıkasyonda. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> astar boya </td><td> Sıra </td></tr><tr><td> primer 1.1 </td><td> AATGATACGGCGACCACCGAGAT </td></tr><tr><td> primer 2.1 </td><td> CAAGCAGAAGACGGCATACGA </td></tr></tbody></table> Tablo 3. PCR primeri. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> sahne </td><td> Sıcaklık (° C) </td><td> Zaman </td><td> Bisikletler </td></tr><tr><td> bir </td><td> 95 </td><td> 10 dk </td><td> 1 </td></tr><tr><td> B </td><td> 95 </td><td> 10 s </td><td rowspan="2"> 40 </td></tr><tr><td></td><td> 60 </td><td&gt; 30 s </td></tr></tbody></table> Tablo 4. Kütüphane Niceleme Amplifikasyon Adımlar.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of High-density Lipoproteins for Non-coding Small RNA Quantification at JoVE.com

Isolation of High-density Lipoproteins for Non-coding Small RNA Quantification

This protocol describes the isolation and quantification of high-density lipoprotein small RNAs.

Küçük RNA miktarının belirlenmesi Sigara kodlama için yüksek yoğunluklu lipoproteinler izolasyonu

The diversity of small non-coding RNAs (sRNA) is rapidly expanding and their roles in biological processes, including gene regulation, are emerging. Most ...

isolation-high-density-lipoproteins-for-non-coding-small-rna

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

11.2K Görüntüleme.  Vanderbilt University School of Medicine. This protocol describes the isolation and quantification of high-density lipoprotein small RNAs.

Video: Isolation of High-density Lipoproteins for Non-coding Small RNA Quantification

Isolation of Cognate RNA-protein Complexes from Cells Using Oligonucleotide-directed Elution

Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. They are composed of position-dependent, cis-acting RNA elements and unique combinations of RNA binding proteins. Defining the composition of a specific RNP is essential to achieving a fundamental understanding of gene regulation. The isolation of a select RNP is akin to finding a needle in a haystack. Here, we demonstrate an approach to isolate RNPs associated at the 5' untranslated region of a select mRNA in asynchronous, transfected cells. This cognate RNP has been demonstrated to be necessary for the translation of select viruses and cellular stress-response genes.
The demonstrated RNA-protein co-precipitation protocol is suitable for the downstream analysis of protein components through proteomic analyses, immunoblots, or suitable biochemical identification assays. This experimental protocol demonstrates that DHX9/RNA helicase A is enriched at the 5' terminus of cognate retroviral RNA and provides preliminary information for the identification of its association with cell stress-associated huR and junD cognate mRNAs.

This manuscript describes an approach to isolate select cognate RNPs formed in eukaryotic cells via a specific oligonucleotide-directed enrichment. We demonstrate the applicability of this approach by isolating a cognate RNP bound to the retroviral 5' untranslated region that is composed of DHX9/RNA helicase A.

Oligonükleotid yönelik elüsyon kullanılarak Hücreler Aynı Kökenli RNA-protein kompleksleri izolasyonu

Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. ...

Biyokimya

An Efficient Method for the Isolation of Highly Purified RNA from Seeds for Use in Quantitative Transcriptome Analysis

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as industrial materials. Gene expression profiles are powerful tools for investigating metabolic regulation in plant cells. Therefore, detailed, accurate gene expression profiles during seed development are required for crop breeding. Acquiring highly purified RNA is essential for producing these profiles. Efficient methods are needed to isolate highly purified RNA from seeds. Here, we describe a method for isolating RNA from seeds containing large amounts of oils, proteins, and polyphenols, which have inhibitory effects on high-purity RNA isolation. Our method enables highly purified RNA to be obtained from seeds without the use of phenol, chloroform, or additional processes for RNA purification. This method is applicable to Arabidopsis, rapeseed, and soybean seeds. Our method will be useful for monitoring the expression patterns of low level transcripts in developing and mature seeds.

We have succeeded in establishing a method for RNA isolation from plant seeds containing large amounts of oils, proteins, and polyphenols, which have inhibitory effects on high-purity RNA isolation. Our method is suitable for monitoring the expression of genes with low level transcripts in seeds.

Kantitatif Transkriptom analizinde kullanım için tohumlar yüksek oranda saf RNA&#39;nın izolasyonu için etkili bir yöntem

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as ...

Toeprinting Analysis of Translation Initiation Complex Formation on Mammalian mRNAs

Translation initiation is the rate-limiting step of protein synthesis and represents a key point at which cells regulate their protein output. Regulation of protein synthesis is the key to cellular stress-response, and dysregulation is central to many disease states, such as cancer. For instance, although cellular stress leads to the inhibition of global translation by attenuating cap-dependent initiation, certain stress-response proteins are selectively translated in a cap-independent manner. Discreet RNA regulatory elements, such as cellular internal ribosome entry sites (IRESes), allow for the translation of these specific mRNAs. Identification of such mRNAs, and the characterization of their regulatory mechanisms, have been a key area in molecular biology. Toeprinting is a method for the study of RNA structure and function as it pertains to translation initiation. The goal of toeprinting is to assess the ability of in vitro transcribed RNA to form stable complexes with ribosomes under a variety of conditions, in order to determine which sequences, structural elements, or accessory factors are involved in ribosome binding&#8212;a pre-cursor for efficient translation initiation. Alongside other techniques, such as western analysis and polysome profiling, toeprinting allows for a robust characterization of mechanisms for the regulation of translation initiation.

Toeprinting aims to measure the ability of in vitro transcribed RNA to form translation initiation complexes with ribosomes under a variety of conditions. This protocol describes a method for toeprinting mammalian RNA and can be used to study both cap-dependent and IRES-driven translation.

Çeviri başlatma karmaşık oluşumu memeli mRNA'ların Toeprinting analizi

Translation initiation is the rate-limiting step of protein synthesis and represents a key point at which cells regulate their protein output. Regulation ...

An Oligonucleotide-based Tandem RNA Isolation Procedure to Recover Eukaryotic mRNA-Protein Complexes

RNA-binding proteins (RBPs) play key roles in the post-transcriptional control of gene expression. Therefore, biochemical characterization of mRNA-protein complexes is essential to understanding mRNA regulation inferred by interacting proteins or non-coding RNAs. Herein, we describe a tandem RNA isolation procedure (TRIP) that enables the purification of endogenously formed mRNA-protein complexes from cellular extracts. The two-step protocol involves the isolation of polyadenylated mRNAs with antisense oligo(dT) beads and subsequent capture of an mRNA of interest with 3&#39;-biotinylated 2&#39;-O-methylated antisense RNA oligonucleotides, which can then be isolated with streptavidin beads. TRIP was used to recover in vivo crosslinked mRNA-ribonucleoprotein (mRNP) complexes from yeast, nematodes and human cells for further RNA and protein analysis. Thus, TRIP is a versatile approach that can be adapted to all types of polyadenylated RNAs across organisms to study the dynamic re-arrangement of mRNPs imposed by intracellular or environmental cues.

A tandem RNA isolation procedure (TRIP) for recovery of endogenously formed mRNA-protein complexes is described. Specifically, RNA-protein complexes are crosslinked in vivo, polyadenylated RNAs are isolated from extracts with oligo(dT) beads, and particular mRNAs are captured with modified RNA antisense oligonucleotides. Proteins bound to mRNAs are detected by immunoblot analysis.

Ökaryotik mRNA-Protein kompleksleri kurtarmak için bir Tandem oligonükleotid tabanlı RNA izolasyon yordamı

RNA-binding proteins (RBPs) play key roles in the post-transcriptional control of gene expression. Therefore, biochemical characterization of mRNA-protein ...

Structural Studies of Macromolecules in Solution using Small Angle X-Ray Scattering

Protein-protein interactions involving proteins with multiple globular domains present technical challenges for determining how such complexes form and how the domains are oriented/positioned. Here, a protocol with the potential for elucidating which specific domains mediate interactions in multicomponent system through ab initio modeling is described. A method for calculating solution structures of macromolecules and their assemblies is provided that involves integrating data from small angle X-ray scattering (SAXS), chromatography, and atomic resolution structures together in a hybrid approach. A specific example is that of the complex of full-length nidogen-1, which assembles extracellular matrix proteins and forms an extended, curved nanostructure. One of its globular domains attaches to laminin &#947;-1, which structures the basement membrane. This provides a basis for determining accurate structures of flexible multidomain protein complexes and is enabled by synchrotron sources coupled with automation robotics and size exclusion chromatography systems. This combination allows rapid analysis in which multiple oligomeric states are separated just prior to SAXS data collection. The analysis yields information on the radius of gyration, particle dimension, molecular shape and interdomain pairing. The protocol for generating 3D models of complexes by fitting high-resolution structures of the component proteins is also given.

Here, we present how Small Angle X-Ray Scattering (SAXS) can be utilized to obtain information on low-resolution envelopes representing the macromolecular structures. When used in conjunction with high-resolution structural techniques such as X-Ray Crystallography and Nuclear Magnetic Resonance, SAXS can provide detailed insights into multidomain proteins and macromolecular complexes in-solution.

Küçük açı x-ışını saçılması kullanarak çözüm yapısal oluştururlar çalışmaları

Protein-protein interactions involving proteins with multiple globular domains present technical challenges for determining how such complexes form and ...

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy

A comprehensive identification of RNA-binding proteins (RBPs) is key to understanding the posttranscriptional regulatory network in cells. A widely used strategy for RBP capture exploits the polyadenylation [poly(A)] of target RNAs, which mostly occurs on eukaryotic mature mRNAs, leaving most binding proteins of non-poly(A) RNAs unidentified. Here we describe the detailed procedures of a recently reported method termed click chemistry-assisted RNA-interactome capture (CARIC), which enables the transcriptome-wide capture of both poly(A) and non-poly(A) RBPs by combining the metabolic labeling of RNAs, in vivo UV cross-linking, and bioorthogonal tagging.

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture CARIC Strategy

A detailed protocol for applying the click chemistry-assisted RNA-interactome capture (CARIC) strategy to identify proteins binding to both coding and noncoding RNAs is presented.

Yakalama ve tıklama Kimya destekli RNA-interactome kullanarak RNA bağlanıcı proteinler tanımlaması (CARIC) strateji yakalama

A comprehensive identification of RNA-binding proteins (RBPs) is key to understanding the posttranscriptional regulatory network in cells. A widely used ...

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral RNAs. When bound to viral double-stranded RNAs (dsRNAs), PKR undergoes dimerization and subsequent autophosphorylation. Phosphorylated PKR (pPKR) becomes active and induces phosphorylation of the alpha subunit of eukaryotic initiation factor 2 (eIF2&#945;) to suppress global translation. Increasing evidence suggests that PKR can be activated under physiological conditions such as during the cell cycle or under various stress conditions without infection. However, our understanding of the RNA activators of PKR is limited due to the lack of a standardized experimental method to capture and analyze PKR-interacting dsRNAs. Here, we present an experimental protocol to specifically enrich and analyze PKR bound RNAs during the cell cycle using HeLa cells. We utilize the efficient crosslinking activity of formaldehyde to fix PKR-RNA complexes and isolate them via immunoprecipitation. PKR co-immunoprecipitated RNAs can then be further processed to generate a high-throughput sequencing library. One major class of PKR-interacting cellular dsRNAs is mitochondrial RNAs (mtRNAs), which can exist as intermolecular dsRNAs through complementary interaction between the heavy-strand and the light-strand RNAs. To study the strandedness of these duplex mtRNAs, we also present a protocol for strand-specific qRT-PCR. Our protocol is optimized for the analysis of PKR-bound RNAs, but it can be easily modified to study cellular dsRNAs or RNA-interactors of other dsRNA binding proteins.

We present experimental approaches for studying RNA-interactors of double-stranded RNA binding protein kinase RNA-activated (PKR) during the mammalian cell cycle using HeLa cells. This method utilizes formaldehyde to crosslink RNA-PKR complexes and immunoprecipitation to enrich PKR-bound RNAs. These RNAs can be further analyzed through high-throughput sequencing or qRT-PCR.

RNA Interactors Protein kinaz memeli hücre döngüsü sırasında RNA-harekete geçirmek, eğitim

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis of transcriptome and gene expression by qPCR and RNA sequencing. Comprehensive transcriptome and gene expression analysis of specific cell types in complex tissues and organs will be critical to understand cellular and molecular mechanisms by which genes are regulated and their association with tissue homeostasis and organ functions. In this article, we demonstrate the methodology for isolation of ribosome-bound RNA directly in vivo in the vascular endothelia of animal lungs as an example. The specific materials and procedures for tissue processing and RNA purification will be described, including the assessment of RNA quality and yield as well as real time qPCR for arteriogenic gene assays. This approach, known as translating ribosome affinity purification (TRAP) technique, can be utilized for characterization of gene expression and transcriptome analysis of certain cell types directly in vivo in any specific type in complex tissues.

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

We present an approach to purify ribosome-bound mRNA from vascular endothelial cells (ECs) directly in mouse brain, lung and heart tissues via EC-specific genetic tag of enhanced green fluorescence protein (EGFP)in ribosomes in combination with RNA purification.

Endotel hücrelerinden RNA yalıtım için Ribosome affinity arıtma (TRAP) çevirisi In vivo

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis ...

RNA Blot Analysis for the Detection and Quantification of Plant MicroRNAs

MicroRNAs (miRNAs) are a class of endogenously expressed non-coding, ~21 nt small RNAs involved in the regulation of gene expression in both plants and animals. Most miRNAs act as negative switches of gene expression targeting key genes. In plants, primary miRNAs (pri-miRNAs) transcripts are generated by RNA polymerase II, and they form varying lengths of stable stem-loop structures called pre-miRNAs. An endonuclease, Dicer-like1, processes the pre-miRNAs into miRNA-miRNA* duplexes. One of the strands from miRNA-miRNA* duplex is selected and loaded onto Argonaute 1 protein or its homologs to mediate the cleavage of target mRNAs. Although miRNAs are key signaling molecules, their detection is often carried out by less than optimal PCR-based methods instead of a sensitive northern blot analysis. We describe a simple, reliable, and extremely sensitive northern method that is ideal for the quantification of miRNA levels with very high sensitivity, literally from any plant tissue. Additionally, this method can be used to confirm the size, stability and the abundance of miRNAs and their precursors.

This method demonstrates use of the northern hybridization technique to detect miRNAs from total RNA extract.

Bitki MikroRNAlarının Saptanması ve Ölçülmesi için RNA Leke Analizi

MicroRNAs (miRNAs) are a class of endogenously expressed non-coding, ~21 nt small RNAs involved in the regulation of gene expression in both plants and ...

Isolation and Analysis of Plasma Lipoproteins by Ultracentrifugation

Analysis of plasma lipoproteins and apolipoproteins is an essential part for the diagnosis of dyslipidemia and studies of lipid metabolism and atherosclerosis. Although there are several methods for analyzing plasma lipoproteins, ultracentrifugation is still one of the most popular and reliable methods. Because of its intact separation procedure, the lipoprotein fractions isolated by this method can be used for analysis of lipoproteins, apolipoproteins, proteomes, and functional study of lipoproteins with cultured cells in vitro. Here, we provide a detailed protocol to isolate seven lipoprotein fractions including VLDL (d&#60;1.006 g/mL), IDL (d=1.02 g/mL), LDLs (d=1.04 and 1.06 g/mL), HDLs (d=1.08, 1.10, and 1.21 g/mL) from rabbit plasma using sequential floating ultracentrifugation. In addition, we introduce the readers how to analyze apolipoproteins such as apoA-I, apoB, and apoE by SDS-PAGE and Western blotting and show representative results of lipoprotein and apolipoprotein profiles using hyperlipidemic rabbit models. This method can become a standard protocol for both clinicians and basic scientists to analyze lipoprotein functions.

Several methods have been used for analyzing plasma lipoproteins; however, ultracentrifugation is still one of the most popular and reliable methods. Here, we describe a method regarding how to isolate lipoproteins from plasma using sequential density ultracentrifugation and how to analyze the apolipoproteins for both diagnostic and research purposes.